Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта in vitro

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии. Воздействуют аутокровью на нервные клетки в подготовленных переживающих срезах мозга. Фиксируют исходные параметры биэлектрической активности клеток, во время воздействия кровью и после отмывания. Затем определяют последствия воздействия по результатам сопоставления зарегистрированных параметров. При этом срезы погружают в аутокровь полностью на 120-420 минут. Способ расширяет арсенал средств для моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, конкретно к неврологии.

Известны способы моделирования геморрагического инсульта при помощи ультразвукового воздействия, инфузии аутологичной крови или ее отдельных компонентов, введения бактериальной коллагеназы в различные структуры мозга целого животного под давлением, а также аппликации крови на переживающие срезы нервных клеток мозга in vitro (1).

Прототипом предлагаемого способа принят способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта (1). Он заключается в том, что аутокровь воздействуют (апплицируют) на переживающие срезы нервных клеток мозга в течение 25-40 мин, затем отмывают срезы. Регистрируют исходные параметры вызванной биоэлектрической активности клеток в заданных структурах в процессе воздействия (аппликации) и после отмывания. Сопоставляя параметры активности клеток при аппликации с их исходными параметрами, определяют степень их повреждения. Сравнивания параметры активности клеток после отмывания с их исходными - определяют возможность их восстановления.

Однако недостатком прототипа является то, что в этой модели можно зарегистрировать изменения биоэлектрической активности только в начальный (25-40 мин) период времени действия целой крови или ее фракций. Для выяснения молекулярно-клеточных модификаций электрогенеза клеток и синаптических передач, подвергшихся действию крови, в последующие интервалы времени использование прототипа практически невозможно. При длительном воздействии крови в известной модели необходимо использование гепарина для избежания ее коагулирования. Но гепарин оказывает неспецифические влияния на нервную ткань. Несовершенство прототипа заключается и в том, что в нем отсутствует возможность исследования процессов набухания нервных клеток при действии крови из-за срока жизни.

Целью настоящего изобретения является моделирование геморрагического инсульта in vitro для исследования последствий геморрагического инсульта в более длительные периоды времени (до 10-12 час), определение длительности "терапевтического окна"¹ (¹ Под «терапевтическим окном» понимается интервал времени от момента кровоизлияния до того критического времени, после которого наступает необратимая гибель нервных клеток (2, 3).), изучение процессов набухания/воспаления нервных клеток.

Сущность предложенного способа моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта, включающего воздействие аутокровью на нервные клетки мозга, заключается в том, что переживающие срезы нервных клеток мозга (4) после приготовления помещают в стеклянные виалы с кровью (без гепарина) объемом 1 мл на заданный интервал времени. Затем срезы извлекают из виалы с кровью, отмывают перфузионной средой от крови и регистрируют биоэлектрическую активность клеток в заданных структурах. Сопоставляя параметры активности клеток с их контрольными значениями, которые получают на интактной группе срезов (n=4-6), определяют степень их повреждения и оценивают возможность их восстановления.

Феноменологически эту модель следует рассматривать как аналог обширного геморрагического инсульта, возникающего в целом организме согласно классификации сосудистых поражений головного мозга, то есть развитие патологических процессов в функционировании нервных клеток при действии крови, изливающейся в паренхиму мозга.

Предложенный способ моделирования поясняется таблицами.

Таблица 1
Параметры ФП в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс в контроле и после их инкубации в аутокрови без гепарина (1 мл) в течение 120 мин
Параметры ФП	Контрольные данные (мкВ)	После инкубации в аутокрови (мкВ)
ПД ЛОТ	280	410
АМПА ВПСП	240	80
НМДА ВПСП	90	0
ТПСПм	30	20

Как видно из представленных данных в таблице, кровь воздействует различным образом на отдельные механизмы электрогенеза нервных клеток срезов. Так, происходит увеличение почти на 50% амплитуды пресинаптических процессов, оцениваемых по величине ПД ЛОТ. Постсинаптические (АМПА и НМДА ВПСП), в отличие от пресинаптических процессов, угнетаются. Депрессия амплитуды АМПА ВПСП составляет 30% по сравнению с контролем. Активность НМДА ВПСП полностью блокируется. Активность ТПСПм снижается, но не блокируется.

Таким образом, эти данные демонстрируют, что при действии крови на клетки срезов не возникает блокада основных механизмов биоэлектрической активности в течение 120 мин. Следовательно, можно полагать, что интервал времени длительностью 120 мин, определяемый между началом действия крови на мозговую ткань и ее прекращением, является «терапевтическим окном», в течение которого активность нервных клеток может быть восстановлена активацией эндогенных механизмов или применением терапевтических средств.

Таблица 2
Параметры ФП в переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс в контроле и после их инкубации в аутокрови без гепарина (1 мл) в течение 420 мин
Параметры ФП	Контрольные данные (мкВ)	После инкубации в аутокрови (мкВ)
ПД ЛОТ	300	150
АМПА ВПСП	250	20
НМДА ВПСП	100	0
ТПСПм	30	0

Как видно из представленных данных в таблице, кровь в течение 420 мин воздействует одинаковым образом на отдельные механизмы электрогенеза нервных клеток срезов. Наблюдается выраженная депрессия возбуждающих механизмов электрогенеза (ПД ЛОТ, АМПА, НМДА ВПСП), активность тормозных механизмов (ТПСПм, ГАМК-эргические) блокируется. Кроме того, было обнаружено, что в срезах, которые инкубировались в целой крови 420 мин, не увеличивались амплитуды ПД ЛОТ, АМПА и НМДА ВПСП при двукратном увеличении силы электрического раздражения нервных клеток срезов. Это свидетельствует о серьезных ухудшениях основных механизмов электрогенеза в срезах. Другим существенным наблюдением является тот факт, что срезы после инкубации в крови такой длительности сильно набухали, что было определено по их взвешиванию до и после инкубации в аутокрови. Это указывает на развитие процессов воспаления в нервной ткани.

Таким образом, эти данные демонстрируют, что при действии крови на клетки срезов прогрессивно развивается угнетение и блокада основных механизмов биоэлектрической активности в течение 420 мин. Следовательно, можно полагать, что интервал времени длительностью 420 мин, определяемый между началом действия крови на мозговую ткань и ее прекращением, является крайним пределом «терапевтического окна», после которого для восстановления активности нервных клеток необходимо экстренное применение эффективных терапевтических средств.

Во всех протестированных по предлагаемому методу срезах получали стабильные результаты, что свидетельствует о высоком 100% уровне надежности данной модели геморрагического инсульта. Кроме того, проведенные исследования позволяют проследить динамику развития депрессии и последующей блокады отдельных механизмов биоэлектрической активности в мозге при геморрагическом инсульте. Данный метод позволяет измерить интервал времени, когда происходят необратимые нарушения отдельных механизмов электрогенеза и, соответственно, предпринять экзогенное воздействие для восстановления активности этих механизмов.

Таким образом, предлагаемый способ отличается от прототипа in vitro тем, что позволяет проследить динамику развития депрессии и последующей блокады отдельных механизмов биоэлектрической активности в мозге при геморрагическом инсульте, позволяет измерить интервал времени, когда происходят необратимые нарушения отдельных механизмов электрогенеза («терапевтическое окно»). Способ дает возможность провести в отмеченные интервалы времени скрининг высокоэффективных фармакологических препаратов для защиты нервных клеток после развития последствий геморрагического инсульта.

Литература

1. Мокрушин А.А., Хама-Мурад А.Х., Павлинова Л.И., Смирнова Г.П. Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта. МКИ⁶ G09В ²³/₀₀ // Заявка на изобретение ФИПС, №20051337371/14 с решением о выдаче патента от 11.01.2007. Прототип.

2. Гусев Е. И., Скворцова В. И., Журавлева Е.Ю., Яковлева Е.В. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной ишемии // Журн. неврол. и психиатр. 1999а. Вып.5, С.55-61.

3. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Коваленко А.В., Соколов М.А. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной церебральной ишемии //Журн. неврол. и психиатр. 19996. Вып.2. С.65-70.

4. Мокрушин А.А., Мусящикова С.С.Анализ формирования вызванных потенциалов в нейронах обонятельной коры мозга крыс // Известия АН СССР, Сер. биол. №4, 1989, С.556-565.

Способ моделирования и исследования последствий геморрагического инсульта in vitro путем воздействия аутокровью на нервные клетки в подготовленных переживающих срезах мозга, фиксации исходных параметров биоэлектрической активности клеток во время воздействия кровью и после отмывания и определения последствий воздействия по результатам сопоставления зарегистрированных параметров, отличающийся тем, что погружают срезы в аутокровь полностью на 120-420 мин.