Агонисты рецептора пептида-1, подобного глюкагону, их получение и применение

Настоящее изобретение относится к агонисту рецептора подобного глюкагону пептида-1, которые могут найти применение для лечения заболеваний, связанных с нарушением гликометаболизма, таких как диабет типа II, нечувствительность к инсулину или ожирение.

В структурной формуле каждый из Ar₁ и Ar₂ независимо представляет собой замещенный фенил, и группы-заместители указанного замещенного фенила представляют собой одну, две или три группы, выбранные из C₁-С₆алкоксил, C₁-С₆-алканоиламино, который замещен гидроксилом (который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил); С₃-С₆-циклоалканоиламино, С₂-С₆-алкеноиламино; бензоиламино, бензилокси-С₁-С₆-алканоиламино; теноилокси, трет-бутоксиформамидо, адамантанформамидо и манделоиламино; Х представляет собой О; Y представляет собой О. Изобретение также относится к способу получения агониста и к его применению для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с нарушением гликометаболизма. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к группе агонистов рецептора пептида-1, подобного глюкагону (GLP-1R). В частности, настоящее изобретение относится к группе органических соединений с маленькой молекулой, имеющих замещенное пятичленное гетероциклическое кольцо, которые можно применять в качестве непетидных агонистов GLP-1R. Соединения настоящего изобретения можно применять в качестве лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением гликометаболизма, таких как диабет типа II, нечувствительность к инсулину, ожирение и т.д. Настоящее изобретение относится также к способу получения указанных агонистов GLP-1R.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сахарный диабет (DM) является обычным эндокринным метаболическим заболеванием с наследственной тенденцией. Он вызывается в основном абсолютной или относительной гиперсекрецией инсулина и вызывает нарушение метаболизма сахаридов, жиров, белков и затем витаминов, воды и электролитов. Проявления его включают в себя повышение гликемии и глюкозы в моче, а пациенты имеют симптомы полидипсии, полифагии, полиурии, ксеростомии и общей слабости. Распространенность заболевания сахарным диабетом составляет 1-5% и имеет тенденцию к постепенному увеличению. Сахарный диабет, рак и сердечно-сосудистые заболевания называют тремя распространенными по всему свету серьезными заболеваниями. Целью лечения сахарного диабета является исправление нарушения метаболизма углеводов, так чтобы ликвидировать эти симптомы, активировать восстановление функции панкреатических островков, повысить инсулинорезистентность, поддерживать лучшее состояние здоровья и физической силы и предупредить и лечить различные осложнения.

Сахарный диабет обычно делят на два типа: инсулинзависимый сахарный диабет (тип I, IDDM) и инсулиннезависимый сахарный диабет (тип II, NIDDM). Поскольку патогенезы для этих двух типов сахарного диабета являются различными, лекарственные средства для лечения их значительно различаются и являются соответственно следующими.

Сахарный диабет типа I вызывается вирусной инфекцией у наследственно восприимчивого человека, который индуцирует парадоксикальную реакцию островковых клеток посредством иммуномеханизма, так что панкреатические островки начинают повреждаться и даже полностью теряют свою функцию. Приблизительно 5% сахарного диабета является типом I. В настоящее время лекарственные средства для лечения сахарного диабета типа I в основном включают в себя экзогенный инсулин (в том числе человеческий инсулин и животный инсулин), лекарственные средства, обладающие инсулиноподобным действием, инсулиноподобный фактор-1 роста (IGF-1), новый, длительно действующий препарат инсулина, гипогликемические таблетки Jin Qi и т.д.

Сахарный диабет типа II очень редко вызывается прямым повреждением β-островковых клеток, которые снижают секрецию инсулина. И большинство случаев сахарного диабета типа II вызывается комбинацией факторов, которые могут включать в себя генетические признаки, образ жизни, содействие окружающей среды, метаболические нарушения, ожирение и так далее. При этом патологическом состоянии мышечные, печеночные и жировые ткани являются невосприимчивыми к инсулину, тем самым снижая поглощение глюкозы. Большинство больных диабетом страдают сахарным диабетом типа II. В настоящее время лекарственные средства для клинического лечения NIDDM в основном включают в себя сульфонилмочевины, бигуаниды, другие гипогликемические лекарственные средства и адъюванты и т.д.

Гипогликемические лекарственные средства типа сульфонилмочевин связываются с рецепторами на клеточной мембране β-островковых клеток с закрытием каналов калиевых ионов, тем самым блокируя вытекание ионов калия и индуцируя деполяризацию клеточных мембран, так что каналы кальциевых ионов открываются, позволяя внутриклеточным ионам кальция течь внутрь. Повышение концентрации внутриклеточных кальциевых ионов вызывает высвобождение инсулина. Гипогликемические лекарственные средства типа сульфонилмочевин можно разделить на два поколения в соответствии с временем их появления на практике. Первое поколение включает в себя толпропамид и второе поколение включает в себя глибенкламид (эвгликан), гликлазид (диамикрон), глипизид, гликвидон и т.д.

Бигуанидные гипогликемические лекарственные средства ингибируют аппетит, повышают связывание инсулина с рецепторами, активируют анаэробный гликолиз в клетках, ингибирует тканевое дыхание и ингибирует печеночный глюконеогенез. Бигуанидные гипогликемические лекарственные средства в основном включают в себя метформин, фенформин и буформин.

Другие гипогликемические лекарственные средства в основном включают в себя тиазолидиндионовые лекарственные средства (такие как троглитазон, розиглитазон, пиоглитазон и т.д.), β3-адренорецепторные регуляторы, агонисты рецептора глюкагона, агенты, препятствующие метаболизму жирных кислот, ингибиторы α-гликозидазы (такие как акарбоза, воглибоза, миглитол) и ингибиторы альдозаредуктазы и т.д.

В последнее время развитие исследования по связанному с гликометаболизмом эндогенного пептидного гормона обусловило появление новой идеи для лечения сахарного диабета. Когда организм человека потребляет питательные материалы, энтероэндокринные клетки высвобождают энтеропептидный гормон, который в основном включает в себя подобный глюкагону пептид-1 (GLP-1) и глюкозазависимый инсулинотропный пептид (GIP), и регулирует метаболизм посредством воздействия на генерацию инсулина, желудочно-кишечную перестальтику и пролиферацию островковых клеток. GLP-1 секретируется энтеропанкреатическими клетками и активирует аденилатциклазу для синтеза цАМФ посредством очень специфического связывания с рецептором GLP-1β-островковых клеток, так чтобы далее активировать протеинкиназу. Метаболический сигнал (гликометаболизм) и киназный сигнал (связывание GLP-1) действуют совместно на уровне клеточной мембраны, в конце концов вызывая открытие каналов Са²⁺ и движение потока кальциевых ионов внутрь, так чтобы дополнительно стимулировать секрецию инсулина при ингибировании генерации глюкагона, посредством чего снижается уровень возникающей после приема пищи глюкозы в крови и поддерживается концентрация глюкозы в крови на постоянном уровне. Кроме того, GLP-1 имеет функцию нейрорегуляции и может замедлять желудочное опорожнение и снижать аппетит. Все они являются очень полезными для устранения сахарного диабета. Обычно GLP-1 стимулирует секрецию инсулина в зависимости от концентрации глюкозы в крови. Когда концентрация глюкозы в крови снижается, действие GLP-1 по стимуляции секреции инсулина снижается. Следовательно, действие GLP-1 по снижению глюкозы в крови является самоограниченным и не может вызвать гипогликемию. Таким образом, лекарственные средства с GLP-1-подобным действием являются очень желательными для лечения сахарного диабета. Агонисты GLP-1 R являются одним исследовательским фокусом интернациональных организаций по разработке лекарственных средств. В настоящее время исследования по GLP-1R в основном сфокусированы на полипептидных регуляторах. Например, АС 2993 Amylin Corporation применяют для клинического испытания в США (IND). AC 2993 является полипептидом из 39 аминокислот и обладает действием по активации секреции инсулина, как GLP-1. Поскольку полипептидные лекарственные средства являются неподходящими для перорального введения и легко разрушаются, непептидный регулятор GLP-1R является новым исследовательским направлением в настоящее время.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является разработка группы органических соединений с небольшой молекулой, являющихся производными пятичленных гетероциклических соединений, которые можно применять в качестве агонистов рецептора подобного глюкагону пептида-1 (GLP-1R), так чтобы подтвердить путь поиска ведущих соединений или лекарственных средств для лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета. Другой целью настоящего изобретения является предложение способа получения этих соединений.

Агонисты рецептора подобного глюкагону пептида-1 согласно настоящему изобретению имеют следующую структурную формулу:

где каждый из Ar₁ и Ar₂ независимо представляет собой замещенный фенил, и замещенные группы представляют собой одну, две или три группы, выбранные из C₁-C₆алкоксил; C₁-С₆-алканоиламино, который замещен гидроксилом (который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил); С₃-С₆циклоалканоиламино; С₂-С₆алканоиламино; бензоиламино; бензилоксиС₁-С₆алканоиламино; теноилокси; трет-бутоксиформамидо; адамантан формамидо и манделоиламино;

Х представляет собой О;

Y представляет собой О.

Когда Ar₁ представляет собой ,

R₅ представляет собой теноил и R₆ представляет собой C₁-C₆алкил; X₁ - это О; Х₂ - это O,

Ar₂ представляет собой ,

где R₂ представляет собой любую из одной из последующих групп: С₁-С₆алканоил; замещенный C₁-C₆алканоил, который замещен гидроксилом (который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил); С₂-С₆алкеноил; С₃-С₆-циклоалканоил; бензоил; бензилоксиС₁-С₆алканоил; трет-бутоксикарбонил; адамантан формоил; и манделоил; и Х₂ - это NH.

Получение соединений настоящего изобретения проводят посредством следующих стадий согласно химическому уравнению:

где каждый из Ar₁ и Ar₂ независимо представляет собой замещенный фенил и группами-заместителями являются одна, две или три группы, выбранные из следующей группы: трет-бутоксиформамидо и теноилокси; Х представляет собой О и Y представляет собой О,

или согласно следующему химическому уравнению:

где R₁, R₂ и R₃ представляют собой любые из следующих замещенных групп: C₁-C₆алкил; C₁-С₆алканоил; замещенный C₁-С₆алканоил, который замещен гидроксилом; С₂-С₆алкеноил; С₃-С₆циклоалканоил; бензоил; бензилоксиС₁-С₆алканоил; трет-бутоксикарбонил; теноил; адамантанформоил и манделоил; Х представляет собой О; Y представляет собой О; X₁ и Х₃ - это O; Х₂ это NH и Х₄ это Cl или ОН.

Соединение III получают конденсацией соединений I с соединениями II. Конденсацию проводят в следующих растворителях: дихлорметане, уксусном ангидриде, тетрагидрофуране, диметилфуране, дихлорэтане, толуоле, бензоле, воде, диоксане или смеси указанных выше растворителей. Если необходимо, в реакционную смесь можно добавить некоторые активаторы, такие как пиридин, N-метилморфолин, изобутилхлорформиат, триэтиламин, диэтилпропилэтиламин или DMAP и т.д. Согласно реакционным условиям соединений температура реакции обычно бывает от -78°С до комнатной температуры (например, для соединения Wang 462 и т.д.) или от 50 до 230°С нагреванием (например, для соединения Wang 520 и т.д.). Время реакции определяется в соответствии с определенными реагентами. Развитие реакции обычно определяют анализом ТСХ. После завершения реакции общие методы обработки включают в себя фильтрование с применением насоса, концентрирование реакционного раствора для удаления растворителя, экстракцию и выделение продукта колоночной хроматографией и т.д. Конечный продукт III подтверждают детектированием ЯМР.

Способ синтеза структурного звена замещенного пятичленного гетероциклического кольца настоящего изобретения относится к способам Organic Syntheses, CV 2, 55.

В настоящем изобретении разработаны и синтезированы новые агонисты рецептора подобного глюкагону пептида-1 (GLP-1R). Агонисты GLP-1R настоящего изобретения обладают хорошей способностью связываться с GLP-1R, активируют синтез цАМФ, их можно применять для получения лекарственных средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением гликометаболизма, таких как диабет типа II, нечувствительность к инсулину, ожирение и т.д. Они позволяют преодолеть недостаток известного уровня техники, заключающийся в том, что полипептидные регуляторные лекарственные средства являются неподходящими для перорального введения и легко разлагаются. Соединения настоящего изобретения имеют относительно простую структуру и легко могут быть получены.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 показан результат обнаружения экспрессии репортерного гена для соединений настоящего изобретения, которое применяют для оценки активности указанных соединений по стимуляции для GLP-1R. На фиг.1 относительная активность люциферазы, индуцированная 30 нМ положительным стандартом GLP-1, принята за 100%.

На фиг.2 показано влияние соединения 2f на концентрацию цАМФ в 293/GLP-1R-клетках.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение будет далее объясняться со ссылкой на следующие конкретные примеры, но они никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.

Способ получения соединений в нижеследующих примерах получения 1-3 в основном включает в себя три нижеследующие методики проведения реакций.

Методика 1

Соединения I и II, ацетат натрия и уксусный ангидрид смешивают, смесь нагревают до плавления (150-230°С) и выдерживают в расплавленном состоянии в течение 1 часа. Затем к реакционной смеси добавляют этанол и смесь охлаждают. Продукт разделяют кристаллизацией с последующим фильтрованием. Жидкий остаток концентрируют для полного удаления растворителей и продукт выделяют колоночной хроматографией.

Методика 2

Соединение I растворяют в дихлорметане и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением трифторуксусной кислоты и повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной системы и удаления полностью трифторуксусной кислоты субстрат растворяют в дихлорметане и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С. Затем по порядку добавляют пиридин и ацилхлорид, температуру повышают до комнатной температуры и реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и продукт выделяют колоночной хроматографией.

Методика 3

Соединение I растворяют в дихлорметане и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением трифторуксусной кислоты и повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью с последующим концентрированием реакционной системы и удалением полностью трифторуксусной кислоты. Затем соединение II растворяют в тетрагидрофуране (ТГФ) и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С. Затем по порядку добавляют N-метилморфолин (NMM) и CICOOⁱBu. Продукт реакции соединения I с трифторуксусной кислотой растворяют в тетрагидрофуране и затем переносят в указанную выше смесь шприцем для реакции смеси при комнатной температуре. Анализ реакционной смеси проводят ТСХ. После завершения реакции реакционный раствор концентрируют и продукт выделяют колоночной хроматографией.

Соединения wang 520, wang 337, wang 405, wang 450, wang 520-1 и wang 462-1 получают методикой реакции 1, соединения wang 420, wang 462, wang 524, wang 516, wang 488, wang 568, wang 502, wang 530, wang 504, wang 866, 2f, wang 582, wang 538 и wang 496 получают методикой реакции 2 с применением соединения wang 520 и соединения wang 516-1 и wang 591 получают методикой 3 с применением соединения wang 520.

В нижеследующих примерах получения ЯМР измеряют прибором Mercury-Vx 300M, изготовленным Varian cooperation. Показателями ЯМР являются δ Н/С 7,26/7,77 м.д. (CDCl₃); δ Н/С 2,50/39,51 м.д. (ДМСО-d₆) и δ Н/С 3,31/49,15 м.д. (метил-d₃-овый спирт-d). Агенты предоставлены Changhai Chemistry Agents Cooperation. Продукты очищают в основном колоночной хроматографией. Для разделения применяют силикагель 200-300 меш, силикагель для колоночной хроматографии является плотной и полой моделью (ZLX-11), полученной branch factory of Qingdao Haiyang Chemical plant.

Пример 1

Соединение II (466 мг, 1,78 ммоль), соединение I (576 мг, 1,96 ммоль), ацетат натрия (146 мг, 1,78 ммоль) и 2 мл уксусного ангидрида смешивают при комнатной температуре с последующим нагреванием смеси до 170°С до тех пор, пока смесь не расплавиться, и смесь сохраняют в расплавленном состоянии в течение 1 часа. Затем в образовавшуюся смесь добавляют 2 мл этанола и охлаждают ее до комнатной температуры. Таким образом образованное желтое твердое вещество отделяют и фильтруют. Жидкий остаток концентрируют и растворитель полностью удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (5:1, об./об.), получая при этом 556 мг продукта, соединения wang 520 (выход 60%).

¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,54 (с, 9Н), 3,95 (с, 3Н), 6,79 (ушир., 1Н), 7,16 (с, 1Н), 7,20 (дд, J=4,8 Гц, 3,9 Гц, 1Н), 7,25 (д, J=9,9 Гц, 1Н), 7,53 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,63 (дд, J=8.4 Гц, 2,1 Гц, 1Н), 7,69 (дд, J=4,8 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,02 (дд, J=3,9 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,06 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,17 (д, J=1,5 Гц, IH).

¹³C ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 28,17, 55,79, 81,23, 115,28, 117,92, 119,11, 123,09, 125,74, 128,02, 129,29, 129,41, 132,18, 132,75, 133,29, 133,71, 134,99, 141,57, 143,46, 151,37, 152,08, 159,93, 163,13, 167,46.

Соединение II (466 мг, 1,78 ммоль), соединение I (576 мг, 1,96 ммоль), ацетат натрия (146 мг, 1,78 ммоль) и 2 мл уксусного ангидрида смешивают при комнатной температуре с последующим нагреванием смеси до 200°С до тех пор, пока смесь не расплавиться, и смесь сохраняют в расплавленном состоянии в течение 1 часа. Затем в образовавшуюся смесь добавляют 2 мл этанола и охлаждают ее до комнатной температуры. Жидкость концентрируют и растворитель полностью удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (1:1, об./об.), получая при этом 158 мг соединения wang 462-1.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, wang 520-1) δ 1,50 (с, 9Н), 3,88 (с, 3Н), 7,27 (с, IH), 7,33-7,37 (2Н), 7,69 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,01 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,07 (д, J=3,9 Гц, 1Н), 8,13 (d, J=4.8 Гц, 1Н), 8,22-8,26 (2Н), 9,93 (с, 1Н).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃, wang 462-1) δ 2,22 (с, 3Н), 3,91 (с, 3Н), 7,07 (д, J=8,7 Гц, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 7,21 (м, 1Н), 7,42 (м, 1Н), 7,66 (д, J=8,1 Гц, 2Н), 7,71 (д, J=4,8 Гц, 1Н), 7,99 (д, J=8,7 Гц, 1Н), 8,05 (м, 1Н), 8,10 (d, J=8,4 Гц, 2Н), 8,19 (м, 1Н).

Соединение II (1,46 г, 9,6 ммоль), соединение I (1,9 г, 10,7 ммоль), ацетат натрия (0,8 г 9,8 ммоль) и 2,8 мл уксусного ангидрида смешивают при комнатной температуре с последующим нагреванием смеси до 170°С до тех пор, пока смесь не расплавиться, и смесь сохраняют в расплавленном состоянии в течение 1 часа. Затем в образовавшуюся смесь добавляют 5 мл этанола и охлаждают ее до комнатной температуры. Таким образом образованное желтое твердое вещество отделяют и фильтруют, получая при этом 2,0 г продукта, соединение wang 337 (выход 62%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 2,35 (с, 3Н), 3,97 (с, ЗН), 7,13 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 7,20 (с, 1Н), 7,50-7,56 (2Н), 7,59-7,65 (2Н), 8,12-8,15 (3Н).

Соединение II (262 мг, 1,0 ммоль), соединение I (200 мг, 1,1 ммоль), ацетат натрия (82 мг, 1,0 ммоль) и 1 мл уксусного ангидрида смешивают при комнатной температуре с последующим нагреванием смеси до 170°С до тех пор, пока смесь не расплавится, и смесь сохраняют в расплавленном состоянии в течение 1 часа. Затем в образовавшуюся смесь добавляют 5 мл этанола и охлаждают ее до комнатной температуры. Таким образом образованное желтое твердое вещество отделяют и фильтруют. Жидкий остаток концентрируют и растворитель полностью удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (6:1, об./об.), получая при этом 235 мг продукта, соединения wang 405 (выход 58%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,97 (с, 3Н), 7,20 (дд, J=4,8 Гц, 3,9 Гц, 1Н), 7,24 (с, 1Н), 7,26 (д, J=7,8 Гц, 1Н), 7,51-7,57 (2Н), 7,60-7,70 (3Н), 8,02 (дд, J=3,6 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 8,14-8,19 (3Н).

Соединение II (262 мг, 1,0 ммоль), соединение I (250 мг, 1,1 ммоль), ацетат натрия (82 мг, 1,0 ммоль) и 4 мл уксусного ангидрида смешивают при комнатной температуре с последующим нагреванием и выдерживанием смеси при 210-230°С в течение 1 часа. Затем в образовавшуюся смесь добавляют 5 мл этанола и охлаждают ее до комнатной температуры. Таким образом образованное желтое твердое вещество отделяют и фильтруют, получая при этом 100 мг продукта, соединения wang 450 (выход 22%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,97 (с, 3Н), 7,21 (дд, J=4,8 Гц, 3,9 Гц, 1Н), 7,30 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,37 (с, 1Н), 7,70 (д, J=5,1 Гц, 1Н), 7,73 (дд, J=9,9 Гц, 1,5 Гц, 1Н), 8,02 (д, J=3,9 Гц, 1Н), 8,09 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 8,33 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,40 (д, J=9,3 Гц, 2Н).

Пример 2

Соединение I (50 мг, 0,1 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (2:1, об./об.), получая при этом 38 мг продукта, соединения wang 420 (выход 90%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,94 (с, 3Н), 7,20-7,24 (м, 2Н), 7,27 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 7,66 (дд, J=8,1 Гц, 1,5 Гц, 1Н), 7,71 (дд, J=4,8 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 7,76 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,03 (дд, J=3,6 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 8,07 (д, J=1,5 Гц, 1Н), 8,14 (d, J=8,7 Гц, 2Н), 8,20 (ушир., 2Н).

Соединение I (50 мг, 0,1 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (27 мкл, 0,39 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (1,5:1, об./об.), получая при этом 26 мг продукта, соединения wang 462 (выход 56%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 2,19 (с, 3Н), 3,88 (с, 3Н), 7,12 (с, 1Н), 7,20-7,24 (м, 2Н), 7,55 (д, J=1,5 Гц, 1Н), 7,60 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,71 (дд, J=4,8 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 7,77 (ушир., 1Н), 7,97 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,03 (дд, J=3,9 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 8,07 (д, J=1,5 Гц, 1Н).

¹³С ЯМР (75 МГц, CDCl₃) δ 24,66, 55,84, 155,64, 119,55, 120,54, 123,35, 126,15, 128,43, 129,59, 129,87, 132,37, 133,12, 133,52, 134,26, 135,41, 141,85, 143,13, 151,63, 160,63, 163,28, 167,60, 168,99.

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (5:1, об./об.), получая при этом 15 мг продукта, соединения wang 524 (выход 36%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 3,90 (с, 3Н), 7,22 (д, J=5,4 Гц, 1Н), 7,33, (д, J=8,4 Гц, 2Н), 7,39-7,44 (1Н), 7,50-7,58 (2Н), 7,83 (д, J=8,4 Гц), 7,98 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,04-8,22 (7Н), 10,74 (с, 1Н).

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (25 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (4:1, об./об.), получая при этом 25 мг продукта, соединения wang 516 (выход 62,5%).

¹Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 1,57 (м, 2Н), 1,63-1,77 (м, 4Н), 1,80-1,89 (м, 2Н), 2,84 (м, 1Н), 3,89 (с, 3Н), 7,31 (м, 2Н), 7,40 (д, J=8,4 Гц,1Н), 7,86 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,94 (дд, J=8,4 Гц, 1,8 Гц, 1Н), 8,03 (дд, J=3,9 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,07 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,10 (дд, J=4,8 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,18 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 10,35 (с, 1Н).

¹³С ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) δ 25,62, 30,00, 55,97, 115,74, 118,71, 119,04, 123,52, 125,27, 128,51, 128,77, 129,24, 131,19, 132,78, 133,34, 135,43, 135,50, 140,86, 144,42, 151,04, 159,24, 162,91, 166,93, 175,11.

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (4:1, об./об.), получая при этом 25 мг продукта, соединения wang 488 (выход 64%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 0,80 (м, 2Н), 0,85 (м, 2Н), 1,84 (м, 1Н), 3.88 (с, 3Н), 7,28 (с, 1Н), 7,32 (дд, J=5,1 Гц, 3,9 Гц, 1Н), 7,39 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,85 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 7,92 (дд, J=8,4 Гц, 1,5 Гц, 1Н), 8,04 (м, 1Н), 8,05 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,11 (дд, J=4,8 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,18 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 10,68 (с, 1Н).

¹³С ЯМР (75 МГц, ДМСО-d₆) δ 7,78, 14,83, 55,97, 115,71, 118,73, 118,93, 123,53, 125,32, 128,54, 128,81, 129,32, 131,22, 132,80, 133,36, 135,46, 135,53, 140,88, 144,24, 151,05, 159,29, 162,91, 166,96, 172,44.

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (4:1, об./об.), получая при этом 26 мг продукта, соединения wang 568 (выход 57%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,95 (с, 3Н), 4,13 (с, 2Н), 4,68 (с, 2Н), 7,18 (с, 1Н), 7,19-7,26 (м, 2Н), 7,39-7,50 (м, 5Н), 7,63 (дд, J=6,9 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 7,69 (дд, J=4,8 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 7,74 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,01 (дд, J=3,6 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 8,10 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=1,5 Гц, 1Н), 8,56 (с, 1Н).

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (4:1, об./об.), получая при этом 22 мг продукта, соединения wang 502 (выход 56%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 1,81-1,94 (м, 2Н), 2,12-2,28 (м, 4Н), 3,29 (м, 1Н), 3,89 (с, 3Н), 7,31 (с, 1Н), 7,33 (м, 1Н), 7,40 (д, J=7,5 Гц, 1Н), 7,87 (д, J=8,1 Гц, 2Н), 7,94 (д, J=8,1 Гц, 2Н), 8,04-8,08 (2Н), 8,12 (д, J=5,1 Гц, 1Н), 8,19 (с,1Н), 10,20 (с, 1Н).

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (4:1, об./об,), получая при этом 24 мг продукта, соединения wang 530 (выход 57%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 1,20-1,48 (6Н), 1,65-1,81 (4Н), 2,39 (м, 1Н), 3,89 (с, 3Н), 7,32 (с, 1Н), 7,34 (м, 1Н), 7,41 (д, J=8,4 Гц, 1Н), 7,87 (д, J=8,1 Гц, 2Н), 7,95 (d, J=8,1 Гц, 1Н), 8,04 (м,1Н), 8,08 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,12 (д, J=4,8 Гц, 1Н), 8,20 (м, 1Н), 10,31 (с, 1Н).

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (23 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (6:1, об./об.), получая при этом 4 мг продукта, соединения wang 504 (выход 10%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,34 (с, 9Н), 3,94 (с, 3Н), 7,15 (с, 1Н), 7,20 (дд, J=4,8 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,23 (с, 1Н), 7,58 (ушир., 1Н), 7,64-7,69 (2Н), 7,72 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,02 (дд, J=3,6 Гц, 1,5 Гц, 1Н), 8,08 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,11 (д, J=1,8 Гц, 1Н).

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (27 мкл, 0,2 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением CH₂Cl₂, получая при этом 40 мг продукта, соединения wang 554 (выход 89%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,83 (с, 3Н), 6,28 (с, 1Н), 7,05 (с, 1Н), 7,16 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,20 (дд, J=5,1 Гц, 3,6 Гц, 1Н), 7,39-7,41 (2Н), 7,50-7,55 (3Н), 7,60 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,71 (дд, J=5,1 Гц, 1,2 Гц, 1Н), 7,92 (д, J=8,4 Гц, 2Н), 7,99 (д, J=1,2 Гц), 8,03 (дд, J=3,6 Гц, 0,9 Гц, 2Н), 8,24 (с, 1Н), 8,42 (с, 1Н).

Соединение I (52 мг, 0,1 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты промежуточное соединение реакции растворяют в 2 мл дихлорметана и смесь охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 40 мкл (0,6 ммоль) пиридина, добавлением соединения II (10 мкл, 0,03 ммоль) и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ. Реакционный раствор концентрируют и растворители удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением CH₂Cl₂, получая при этом 19 мг продукта, соединения wang 866 (выход 44%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 3,89 (с, 6Н), 7,33 (дд, J=4,8 Гц, 3,9 Гц, 2Н), 7,36 (с, 2Н), 7,41 (д, J=8,4 Гц, 2Н), 7,93-7,96 (2Н), 7,96 (д, J=8,7 Гц, 4Н), 8,04 (дд, J=3,3 Гц, 0,9 Гц, 2Н), 8,12 (дд, J=4,8 Гц, 0,9 Гц, 2Н), 8,17(д, J=8,7 Гц, 4Н), 8,20 (д, J=1,8 Гц, 2Н), 11,66 (с, 2Н).

Согласно тому же самому способу соединение 2f получают с применением продукта реакции 1 экв. соединения

с трифторуксусной кислотой и 1,5 экв. ацетилхлорида (выход 56%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,41 (т, J=6,9 Гц, 3Н), 2,24 (с, 3Н), 4,18 (кв., J=6,9 Гц, 2Н), 7,11 (с, 1Н), 7,19 (м, 1Н), 7,45 (м, 2Н), 7,62-7,70 (4Н), 8,02 (м, 1Н), 8,08 (д, J=9,0 Гц, 2Н).

Согласно тому же способу соединение wang 582 получают с применением продукта реакции 1 экв. соединения wang 520 с трифторуксусной кислотой и 1,5 экв. диамантанформилхлорида (выход 38%).

¹Н ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,76 (6Н), 1,99 (6Н), 2,12 (3Н), 3,95 (с, 3Н), 7,14-7,23 (2Н), 7,54 (с, 1Н), 7,61-7,70 (2Н), 7,73 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,02 (дд, J=3,9 Гц, 1Н), 8,09 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 8,12 (д, J=1,8 Гц, 1Н).

Согласно тому же способу соединение wang 538 получают с применением продукта реакции 1 экв. соединения wang 520 с трифторуксусной кислотой и 1,5 экв. бензилацетилхлорида (выход 58%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 3,78 (с, 2Н), 3,92 (с, 3Н), 7,16 (с, 1Н), 7,19-7,24 (2Н), 7,34-7,74 (6Н), 7,59 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 7,62 (м, 1Н), 7,70 (д, J=4,8 Гц, 1Н), 8,02 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,13 (м, 1Н).

Согласно тому же способу соединение wang 496 получают с применением продукта реакции 1 экв. соединения wang 520 с трифторуксусной кислотой и 1,5 экв. хлорацетилхлорида (выход 70%).

¹H ЯМР (300 МГц, ДМСО-d₆) δ 3,89 (с, 3Н), 4,36 (с, 2Н), 7,34 (с, 1Н), 7,41 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,88 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,93-7,98 (2Н), 8,05 (м, 1Н), 8,12 (д, J=7,5 Гц, 2Н), 8,22 (м, 1Н), 8,89 (м, 1Н), 10,95 (с, 1Н).

Пример 3

Соединение I (40 мг, 0,08 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с последующим добавлением 1 мл трифторуксусной кислоты и постепенным повышением температуры до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют ТСХ до тех пор, пока соединение I не прореагирует полностью. После концентрирования реакционной смеси и удаления полностью трифторуксусной кислоты соединение II (19 мкл, 0,16 ммоль) растворяют в 2 мл тетрагидрофурана и раствор охлаждают на низкотемпературной бане при -20°С с перемешиванием в течение 10 мин при такой температуре. Затем по порядку добавляют N-метилморфолин (NMM) (53 мкл, 0,48 ммоль) и CICOOⁱBu (21 мкл, 0,16 ммоль) с перемешиванием в течение 0,5 часа при -20°С. Продукт реакции соединения I с трифторуксусной кислотой растворяют в 1 мл тетрагидрофурана и затем переносят шприцем в указанную выше смесь для реакции при комнатной температуре в течение приблизительно 15 часов. Реакционный раствор концентрируют и растворители полностью удаляют, получая при этом неочищенный продукт. Неочищенный продукт хроматографируют на колонке с силикагелем с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (5:1, об./об.), получая при этом 12 мг продукта, соединения wang 516-1 (выход 30%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,74 (с, 3Н), 1,87 (с, 3Н), 3,18 (д, J=7,8 Гц, 2Н), 3,95 (с, 3Н), 5,42 (м, 1Н), 7,19 (с, 1Н), 7,20-7,27 (2Н), 7,63 (2Н), 7,65 (д, J=1,8 Гц, 1Н), 7,70 (д, J=8,4 Гц, 2Н), 8,02 (дд, J=3,6 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 8,09 (д. J=9,0 Гц, 2Н), 8,16 (д, J=2,1 Гц, 1Н).

Согласно тому же способу соединение wang 591 получают с применением продукта реакции 1 экв. соединения wang 520 с трифторуксусной кислотой и 2,0 экв. соединения Boc-Ala-OH (выход 18%).

Пример 4

Соединение wang 568 (11 мг, 0,02 ммоль) растворяют в 2 мл дихлорметана и охлаждают при -78°С в течение 10 минут с последующим добавлением 0,2 мл раствора BCl₃/н-гексан (1 М) для продолжения реакции в течение 30 минут при -78°С. Затем температуру повышают до -18°С для реакции в течение 4 часов. Добавляют 2 мл эфира для гашения реакции с перемешиванием в течение 30 минут при комнатной температуре с последующим добавлением 5 мл воды. Водную фазу и органическую фазу разделяют. Водную фазу экстрагируют дихлорметаном и органические фазы объединяют, сушат безводным MgSO₄ и концентрируют. Неочищенный продукт подвергают колоночной хроматографии с применением смеси петролейный эфир/этилацетат (1/2, об./об.), получая при этом соединение wang 477 (1,5 мг, выход 17%).

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 1,86 (ушир., 1Н), 3,95 (с, 3Н), 4,26 (с, 2Н), 7,18 (с, 1Н), 7,20 (dd. J=8,7 Гц, 4,8 Гц, 1Н), 7,23 (д, J=3,3 Гц, 1Н), 7,63 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,71 (ДД, J=5,1 Гц, 1,5 Гц, 1Н), 7,75 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,02 (д, J=3,6 Гц, 1Н), 8,08 (д, J=8,7 Гц, 2Н), 8,14 (м, 1Н), 8,57 (ушир., 1Н).

Соединение wang 591 (3 мг) растворяют в 1,5 мл дихлорметана и охлаждают на ледяной бане в течение 5 минут с последующим добавлением 0,15 мл трихлоруксусной кислоты. Затем температуру постепенно повышают до комнатной температуры и анализ реакционной смеси проводят ТСХ. После исчезновения исходного вещества растворитель и трифторуксусную кислоту удаляют откачкой, получая при этом 2 мг продукта, соединения wang 605 (выход 65%).

¹H ЯМР (300 МГц, метил-d₃-овый спирт-d) δ 1,63 (д, J=7,2 Гц, 3Н), 3,95 (с, 3Н), 4,09 (м, 1Н), 7,265 (с, 1Н), 7,267 (д, J=8,7 Гц, 1Н), 7,29 (д, J=8,1 Гц, 1Н), 7,81 (дд, J=8,7 Гц, 2,1 Гц, 1Н), 7,87 (д, J=9,0 Гц, 2Н), 7,91 (дд, J=5,1 Гц, 1,2 Гц,1Н), 8,01 (дд, J=3,6 Гц, 0,9 Гц, 1Н), 8,16 (д, J=9,3 Гц, 2Н), 8,25 (д, J=2,1 Гц, 1Н).

Пример 4. Эксперименты испытания на биологическую активность

1. Испытание на экспрессию репортерного гена

После того как GLP-1R связывается с GLP-1 или агонистами, его звено Gasubunt активируется для стимуляции аденилатциклазы, которая делает возможным повышение концентрации внутриклеточного цАМФ. Поскольку промоторная область гена проинсулина имеет цАМФ-восприимчивый элемент, после связывания цАМФ с его элементом восприимчивости транскрипция гена проинсулина активируется, с тем чтобы повысить восприимчивость β-островковых клеток к глюкозе и усилились экспрессию и секрецию инсулина (Diabetes, 2000, vol. 49:1156-1164). В модели скрининга применяют штамм эмбриональных почечных клеток человека, который стабильно тансфицируют вектором экспрессии гена GLP-1R и вектором экспрессии репортерного гена люциферазы при регуляции элемента цАМФ-восприимчивости для детектирования его восприимчивости к соединению-кандидату (Cell Biology, 1992, Vol.89:8641-8645; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987, Vol.84: 3434-3438). При скрининге соединений-кандидатов соединение, которое может побуждать репортерный ген люциферазы к экспрессии, обладает активностью по активации GLP-1.

1.1. Экспериментальный материал и инструменты

Штамм клеток: штамм НЕК 293/GLP-IR+Luc, который стабильно экспрессирует GLP-1R и люциферазу (National New Medicaments Screening Center).

Фетальная бычья сыворотка (GIBCO/BRL Cooperation).

Система анализа люциферазы Steady-glo™ (Promega Cooperation).

Стандартный GLP-1 (Sigma Cooperation).

G418 (Invitrogen Cooperation).

Инкубатор с диоксидом углерода Forma (Forma Cooperation).

Прибор подсчета Victor 2 (Wallac Cooperation).

Соединение-кандидат: соединения wang 524, wang 520, wang 462, 2f, wang 516, wang 516-2, wang 502 и wang 504.

1.2 Экспериментальный способ

Клетки НЕК 293/GLP-IR+Luc в количестве 20000 клеток/100 мкл/лунку инокулируют в 96-луночный планшет и культивируют при 37°С на протяжении ночи с культуральной средой DMEM, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку и 500 мкг/мл G418. Соединения-кандидаты wang 516-2, wang 502 и wang 504 соответственно разводят до 2 мМ, 1 мМ, 0,3 мМ, 0,1 мМ, 0,03 мМ, 0,01 мМ и 0,003 мМ и другие соединения-кандидаты разводят постепенно от 30 мМ за 8 раз применением отношения 1:3 для получения градиента концентраций (т.е. 30 мМ, 10 мМ, 3 мМ, 1 мМ, 0,3 мМ, 0,1 мМ, 0,03 мМ и 0,01 мМ) с последующим добавлением их в указанный выше 96-луночный планшет в количестве 1 мкл/лунку. Клетки затем культивируют при 37°С в атмосфере с 5% CO₂ в течение 6 часов. Активность люциферазы детектируют согласно описанию набора системы для анализа люциферазы Steady-glo™ и подсчет проводят прибором для подсчета Victor 2. За положительный контроль выбирают 30 нМ стандартный GLP-1.

1.3 Экспериментальный результат

Экспериментальный результат репортерного гена для соединений-кандидатов является таким, как показан на фиг.1 и в таблице 1.

Фиг.1 показывает, что соединение wang 520 при конечной концентрации 30 мкМ имеет самую лучшую относительную активность (94%), которая значительно повышена по сравнению с активностью соединения 2f.

Кроме того, соединения, как показано в таблице 1, имеют дозовую зависимость от активности GLP-1R, где средняя эффективная доза (ЕС₅₀) соединений wang 520, wang 516, wang 554, wang 488, wang 516-2, wang 502 и wang 504 меньше чем 10 мкМ. Такой результат дает ориентацию для определения лучшей структуры для взаимодействия соединений с GLP-1R.

Таблица 1
Номер соединения	EC50/мкМ
wang 524	46,5
wang 520	4,6
wang 462	11,6
wang 516	6,85
2f	13,0
wang 866	54,41
wang 554	5,24
wang 488	6,73
wang 516-2	6,06
wang 502	3,31
wang 504	4,87

2. Определение концентрации внутриклеточного цАМФ

Поскольку определение концентрации внутриклеточного цАМФ непрямым детектированием экспрессии репортерного гена является непрямым способом, функциональный повторный скрининг непосредственно проводят набором для цАМФ-детектирования для того, чтобы убедиться, что соединение может несомненно повысить концентрацию внутриклеточного цАМФ.

2.1 Экспериментальный материал и инструменты

Набор для детектирования цАМФ (Applied Biosystems Cooperation).

Инкубатор с диоксидом углерода Forma (Forma Cooperation).

Прибор подсчета Victor 2 (Wallac Cooperation).

Штамм НЕК 293/GLP-IR+Luc, который стабильно экспрессирует GLP-1R и люциферазу (National new medicaments screening center).

Соединение-кандидат: соединение 2f.

Стандартный цАМФ (предоставлен в наборе, Applied Biosystems Cooperation).

2.2 Экспериментальный способ

Клетки НЕК 293 инокулируют в 96-луночный планшет в количестве 20000 клеток/100 мкл/лунку и культивируют при 37°С на протяжении ночи. Соединение 2f разводят до 1,00Е-03М, 1,00Е-04М, 1,00Е-05М, 1,00Е-06М и 1,00Е-07М диметилсульфоксидом с последующей инокуляцией в указанный выше 96-планшет в количестве 1 мкл/лунку и культивированием при 37°С в атмосфере с 5% СО₂ в течение 1 часа. Концентрацию внутриклеточного ц-АМФ детектируют согласно описанию набора c-AMP-Screen Direct TM system kit.

2.3 Экспериментальный результат

Результат определения концентрации внутриклеточного цАМФ показан на фиг.2. Как показано на фиг.2, с повышением концентрации соединения 2f концентрация цАМФ, который продуцируется при этой стимуляции, показывает экспоненциальное повышение. Это указывает на то, что соединение 2f обладает некоторым действием на сигнальный перенос GLP-1R в качестве агониста GLP-1R. Когда концентрация соединения 2f повышается до 30 мкМ и 100 мкМ, концентрация цАМФ проявляет тенденцию к снижению, которая вызывается цитотоксическим действием высокой концентрации соединения 2f.

Испытание на лигандсвязывающую активность

Для определения активности соединения по связыванию с лигандом получают клетки, которые имеют высокую экспрессию GLP-1R, в качестве лиганда применяют GLP-1R, меченый ¹²⁵I, при добавлении к соединению-лиганду. Когда соединение-кандидат конкурентным образом связывает ¹²⁵I-меченый GLP-1, изотопные метки на клеточной мембране уменьшаются. В соответствии с этим можно оценить сродство соединения-кандидата к лиганду (J. Mol. Endocrinol. 2000 Vol.25:321-35; J. Biomol Screen, 2000 Vol. 5:377-84).

3.1 Экспериментальный материал и инструменты

Штамм клеток НЕК 293/GLP-IR+Luc (National New Medicaments Screening Center).

Меченое соединение: ¹²⁵I-меченый GLP-1 (Amersham Biosciences Cooperation).

Рабочая станция Wallac MicroBata (Perkin Elmer Cooperation).

Коллектор клеток TomTech (TomTec Cooperation).

Буферный раствор для испытания: 20 мМ трис-HCI (рН 7,4) (Shanghai Shenggong biological engineering technology LTD), 100 мМ NaCl (Shanghai Chemical agents Cooperation), 15 мМ NaF (Shanghai Chemical agents Cooperation), 2 мМ деоксипиридоксин (Sigma Cooperation), 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторид (Sigma Cooperation), апротинин (Shanghai Chemical agents Cooperation) (1 мкг/мл) и лейпептин (Shanghai chemical agents Cooperation) (1 мкг/мл).

Промывочный раствор: 20 мМ трис-HCl (рН 7,4), 100 мМ NaCl и 15 мМ NaF.

Сцинтилляционная жидкость (Wallac Cooperation).

Соединение-кандидат разводят диметилсульфоксидом при градиенте концентрации 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 1000 нМ, 10000 нМ и 100000 нМ.

3.2 Экспериментальный способ

10⁵ клеток НЕК 293/GLP-IR+Luc в логарифмической стадии роста инкубируют вместе с ¹²⁵I-меченым GLP-1-положительным пептидом (конечная концентрация 40 пМ) в 200 мкл буферного раствора для испытания при 25°С в течение 4 часов при добавлении в немеченый положительный пептид или соединение-кандидат. Клетки собирают коллектором клеток с последующей промывкой три раза промывочным раствором. К ним добавляют сцинтилляционную жидкость и клетки каждой лунки посчитывают счетчиком Microbata.

3.3 Экспериментальный результат

Результат эксперимента связывания рецептора показан в таблице 2. Как показано в таблице 2, соединение 21 имеет лучшую аффинность для GLP-1 R, а аффинности соединений wang 520 и wang 516 являются немного слабее и другие соединения по существу не связывают рецептор в диапазоне испытываемых концентраций.

Таблица 2
Номер соединения	ЕС50/мкМ
Wang 524	>100 мкМ
Wang 450	>100 мкМ
Wang 405	>100 мкМ
Wang 327	>100 мкМ
Wang 520	60-100 мкМ
Wang 462	>100 мкМ
Wang 866	>100 мкМ
Wang 516	40-80 мкМ
Wang 420	>100 мкМ
2f	31 мкМ

1. Агонист рецептора подобного глюкагону пептида-1, имеющий следующую структурную формулу:

где каждый из Ar₁ и Ar₂ независимо представляет собой замещенный фенил, и группы-заместители указанного замещенного фенила представляют собой одну, две или три группы, выбранные из C₁-С₆алкоксил, C₁-С₆-алканоиламино, который замещен гидроксилом (который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил); С₃-С₆-циклоалканоиламино, С₂-С₆-алкеноиламино; бензоиламино, бензилоксиС₁-С₆алканоиламино; теноилокси, трет-бутоксиформамидо, адамантанформамидо; и манделоиламино; Х представляет собой О; Y представляет собой О.

2. Агонист рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.1, отличающийся тем, что когда Ar₁ представляет собой ,

R₅ представляет собой теноил, и R₆ представляет собой C₁-С₆алкил; и X₁ представляет собой О, и

Х₂ представляет собой О,

Ar₂ представляет собой ,

где R₂ представляет собой любую одну из следующих групп-заместителей: C₁-С₆алканоил; замещенный C₁-С₆алканоил, который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил; С₂-С₆-алкеноил; С₃-С₆-циклоалканоил; бензоил; бензилоксиС₁-С₆алканоил; трет-бутоксикарбонил; адамантанформоил и манделоил; и Х₂ представляет собой NH.

3. Антагонист рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.1, имеющий следующую структурную формулу:

4. Способ получения агониста рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.1, отличающийся тем, что указанное соединение получают замещением продукта реакции соединения и трифторуксусной кислоты с соединением R₁COX₄, где R₁, R₂ и R₃ это одна из следующих групп-заместителей: C₁-С₆алкил; C₁-С₆алканоил; замещенный C₁-С₆алканоил, который содержит группы-заместители, включающие в себя гидроксил; С₂-С₆-алкеноил; С₃-С₆-циклоалканоил; бензоил; бензилоксиС₁-С₆алканоил; трет-бутоксикарбонил; теноил; адамантанформоил; и манделоил;

Х это О;

Y это О;

X₁ и Х₃ это О;

и Х₂ это NH;

и Х₄ это Cl или ОН.

5. Способ получения агониста рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.4, отличающийся тем, что растворителем, применяемым в реакции замещения является дихлорметан, тетрагидрофуран, диметилфуран, дихлорэтан, толуол, бензол, вода, диоксан или любая их смесь.

6. Способ получения агониста рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.4, отличающийся тем, что температурой реакции является температура от -78°С до комнатной температуры.

7. Способ получения агониста рецептора подобного глюкагону пептида-1 по п.4, отличающийся тем, что в качестве активатора в реакции замещения применяют пиридин, триэтиламин, диэтилпропилэтиламин, DMAP, N-метилморфолин или изобутилхлорформиат.

8. Применение соединений по п.1 в качестве агониста рецептора подобного глюкагону пептида-1 для получения лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с нарушением гликометаболизма, таких как диабет типа II, нечувствительность к инсулину или ожирение, и т.д.