Способ приготовления питательной среды для накопления токсинов кишечной палочки

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в биологической промышленности для получения вакцин против эшерихиозов животных. Способ предусматривает следующее. Смешивают и растворяют в дистиллированной воде кислотный гидролизат крови, аутолизат пекарских дрожжей, пептон, натрий хлорид, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калия хлорид. Нагревают смесь до кипения. Полученную смесь кипятят 5-7 минут. После чего доводят pH среды до 7,2-7,6. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 20-30 мин. 1 табл.

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биологической промышленности для получения вакцин против эшерихиозов животных.

Для культивирования кишечной палочки используют различные питательные среды, однако для получения вакцин против заболеваний животных, обусловленных кишечной палочкой (эшерихиозов) используют мясо-пептонный бульон (МПБ) или бульон Хоттингера (патент РФ №2043771, патент РФ №2070819).

Мясо-пептонный бульон готовится из мясной воды, к которой добавляют 1% пептона и 0,5% поваренной соли. Мясную воду получают путем проварки в 2-4-кратном объеме водопроводной воды мяса или фарша крупного рогатого скота или лошадей в течение 1 ч с последующей фильтрацией (Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований. / Под ред. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной. - М.: Медицина, 2005. - С.480).

Бульон Хоттингера готовится по прописи (Розанов Н.И. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. - М.: Гос. из-во с.-х. литературы. - 1952. - С.88-89):

Панкреотический перевар мясного фарша - 100 мл

Хлористый натрий - 5 г

Двузамещенный фосфорнокислый натрий - 0,2 г

Вода водопроводная - 900 мл.

На данных средах кишечная палочка дает хороший рост, однако свои токсигенные свойства может реализовывать только на бульоне Хоттингера, поскольку для синтеза экзотоксинов требуется наличие свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов, которые можно получить только путем гидролиза белков. Между тем, для выработки таких факторов патогенности кишечной палочки как шига-токсины (8ТХ1 и STX2), некротизирующий токсин и сидерофоры требуются дополнительно другие компоненты, такие как микроэлементы и стимуляторы роста, которые отсутствуют в МПБ и бульоне Хоттингера. Поэтому разрабатываются питательные среды с включением компонентов нивелирующих эти недостатки, в частности используется гидролизат крови.

Известен способ приготовления гидролизата крови (патент РФ №РФ №2186497, МПК А23К 1/4, 1/18), который содержит аминокислоты (г/л) - аспарагиновую (1,55-2,61), глутаминовую (2,46-3,43), серин (1,24-1,62), глицин (1,0-1,33), гистидин (0,81-1,42), треонин (2,10-3,38), аланин (2,48-3,09), пролин (0,57-0,69), аргинин (1,74-2,05), тирозин (0,16-0,68), метионин (0,11-0,27), валин (1,08-1,58), изолейцин (0,77-1,20), лейцин (1,77-2,48), фенилаланин (1,55-1,94), лизин (2,29-2,78) и минералы (мг/л) - кальций (500-700), железо (50-70), цинк (1,2-2), марганец (0,6-1,0), медь (0,53-0,8), селен (0,001-0,002), кобальт (0,15-0,23).

Известно техническое решение получения питательной среды для культивирования эшерихий (патент РФ №2142506), включающий смешивание и растворение пептона, натрия хлорида и гидролизата в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипения, доведение рН до 7,2-7,6, фильтрование, розлив на порции и автоклавирование. В состав данной среды входят (мас.%): солевой раствор Хенкса 30-50, аминокровин 5-20, гемогидролизат 5-9, гидролизат казеина 9-20, пептон 0,6-1,5, хлористый аммоний 0,08-0,18, хлористый натрий 0,09-0,18, дистиллированная вода - остальное.

Существенным недостатком данной среды является дороговизна используемых компонентов и дублирование компонентов (аминокровин, гемогидролизат, гидролизат казеина) содержащих одни и те же химические вещества, а именно низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. Применение данной среды для промышленного производства трудновыполнимо.

Техническим решением задачи является снижение стоимости и повышение качества питательной среды.

Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для накопления токсинов кишечной палочки, включающем смешивание и растворение пептона, натрия хлорида и гидролизата в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипения, доведение рН до 7,2-7,6, фильтрование, розлив на порции и автоклавирование, согласно изобретению в качестве гидролизата используют кислотный гидролизат крови и дополнительно содержит аутолизат пекарских дрожжей, двузамещенный фосфорнокислый натрий и калия хлорид при следующем соотношении компонентов (мас.%):

Кислотный гидролизат крови	9-11
Аутолизат пекарских дрожжей	9-11
Пептон	0,9-1,1
Пария хлорид	0,4-0,6
Двузамещенный фосфорнокислый натрий	0,05-0,15
Калия хлорид	0,01-0,03
Дистиллированная вода	до 100,

затем полученную смесь кипятят 5-7 мин и стерилизуют автоклавированием при давлении не менее 1 атм в течение 20-30 мин.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в качестве основного источника аминного азота и микроэлементов использован кислотный гидролизат крови, который получен по ранее разработанному авторами способу (Патент РФ №РФ №2186497), в качестве дополнительного азотного питания использован ферментативный пептон (производится НПО «Питательные среды»), а стимулятора роста - аутолизат пекарских дрожжей, который получен по Н.И.Розанову (Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. - М.: Гос. из-во с.-х. литературы, 1952. - С.91). Введение в состав среды натрия хлорида, калия хлорида и двузамещенного фосфорнокислого натрия обеспечивает оптимальные осмотические и буферные условия для бактерий.

Способ приготовления питательной среды для накопления токсинов кишечной палочки осуществляется следующим образом.

Кислотный гидролизат крови предварительно разводят дистиллированной водой 1:4 и устанавливают с помощью 10% раствора гидроксида натрия рН 7,2-7,6, после чего добавляют аутолизат пекарских дрожжей в объеме 10%, пептон - 1%, натрия хлорид - 0,5%, натрия фосфорнокислого двузамещенного - 0,1%, калия хлорида - 0,02% и доводят объем до 100% дистиллированной водой. Данную среду кипятят в течение 5-7 мин, при необходимости доводят рН до 7,2-7,6, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин.

Готовый питательный бульон это прозрачная, светло-коричневого цвета жидкость с легким хлебным запахом. В этой питательной среде кишечная палочка дает обильный рост и продукцию токсинов.

Оценку токсинообразования на заявляемой среде проводили в сравнении с токсинообразованием на питательной среде, приведенной в патенте РФ №2142506. Для этого производили посевы штаммов токсигенных кишечных палочек на среды и через 24, 48 и 72 ч роста культуральные среды исследовали на токсичность с помощью инфузорий рода стилонихиа по разработанному нами методу (патент РФ №2262529).

Результаты опыта показали (таблица), что как на питательной среде по патенту РФ №2142506, так и заявляемой среде кишечная палочка интенсивно росла и продуцировала токсины. Однако интенсивность токсинообразования на авторской среде была более выраженной во все временные интервалы, что проявлялось более высоким процентом гибели стилонихий.

Процент гибели стилонихий после их контакта с культурой кишечной палочки, выращенной на бульоне по патенту №2142506 (аналог) и заявляемой среде
Время инкубации, ч	Количество погибших инфузорий, %
	Е.coli 196	Е.coli 173	Е.coli 174(9)	Контроль
Аналог	Заявляемая среда	Аналог	Заявляемая среда	Аналог	Заявляемая среда	Аналог	Заявляемая среда
24	10,1±0,5	13,6±0,9	19,6±2,3	26,6±2,4	29,5±5,6	47,1±6,1	3,0±0,1	0
48	12,6±1,9	17,3±1,7	21,8±3,1	32,0±2,1	39,7±4,7	54,6±4,7	5,0±0,2	0
72	14,7±2,4	24,0±1,8	25,4±3,3	39,5±3,5	47,1±6,2	61,7±6,3	5,0±0,3	0,5±0,1

Результаты проведенного опыта позволяют заключить, что для синтеза токсинов эшерихиям требуется не столько массированное количество азотистых веществ, как это в аналоге (аминокровин, гемогидролизат, гидролизат казеина, пептон), сколько оптимальное содержание аминного азота (аминокислоты в составе гидролизата), стимуляторов роста (минералы, содержащиеся в гидролизате, и биологически активные вещества - в аутолизате пекарских дрожжей) и буферных солей, как это в заявляемой среде.

Таким образом, заявляемая питательная среда создает лучшие условия для роста и токсинопродуцирования болезнетворных кишечных палочек и, следовательно, является более предпочтительной для использования при производстве вакцинных препаратов.

Пример конкретного осуществления способа приготовления питательной среды для накопления токсинов кишечной палочки

К 100 мл кислотного гидролизата крови добавляем 400 мл дистиллированной воды и с помощью 10% раствора гидроксида натрия устанавливаем рН до 7,2-7,6. В полученный раствор вносим 100 мл аутолизата пекарских дрожжей, 10 г пептона, 5 г натрия хлорида, 1 г двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,2 г калия хлорида, перемешиваем и добавляем до 1000 мл дистиллированную воду. Смесь кипятим в течение 5-7 мин, контролируем рН (7,2-7,6), фильтруем, разливаем во флаконы и стерилизуем автоклавированием при 1 атм в течение 30 мин.

Количественные значения ввода ингредиентов подобраны экспериментальным путем, при этом учитывались затраты на производство среды и ее ростовые свойства. В случае ввода в питательную среду гидролизата крови в объеме 5-8%, аутолизата дрожжей 5-8% и пептона 0,5-0,8% кишечная палочка росла хорошо, так же, как на мясо-пептонном бульоне, однако токсинообразование было слабым, таким же, как на МПБ. При вводе в питательную среду гидролизата крови в объеме 15-20%, аутолизата дрожжей 15-20% и пептона 1,5-2% рост бактерий был интенсивным, токсинобразование выраженное, однако, стоимость данной среды значительно возрастала, и, кроме того, она приобретала очень темный цвет, что затрудняло проведение контроля роста бактерий.

Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации ввода основных питательных компонентов среды - кислотного гидролизата крови, аутолизата пекарских дрожжей и пептона.

Способ приготовления питательной среды для накопления токсинов кишечной палочки, включающий смешивание и растворение пептона, натрия хлорида и гидролизата в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипения, доведение рН до 7,2-7,6, фильтрование, розлив на порции и автоклавирование, отличающийся тем, что в качестве гидролизата используют кислотный гидролизат крови и дополнительно вносят аутолизат пекарских дрожжей, двузамещенный фосфорнокислый натрий и калия хлорид при следующем соотношении компонентов, мас.%:

кислотный гидролизат крови	9-11
аутолизат пекарских дрожжей	9-11
пептон	0,9-1,1
натрия хлорид	0,4-0,6
двузамещенный фосфорнокислый натрий	0,05-0,15
калия хлорид	0,01-0,03
дистиллированная вода	до 100,

затем полученную смесь кипятят 5-7 мин и стерилизуют автоклавированием при давлении не менее 1 атм в течение 20-30 мин.