Способ определения чувствительности больного с анемией хронических заболеваний к терапии анемического синдрома препаратами рекомбинантного человеческого эритропоэтина

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии, онкологии, терапии. У больного путем, например, стернальной пункции, получают пробу костного мозга, делают мазки и определяют: 1) долю всех клеток эритроидного ряд), 2) долю тех клеток эритроидного ряда, которые несут на своей поверхности рецепторы к эритропоэтину и, если обе доли равны или отличаются на 2,5% и менее, то делают вывод о чувствительности данного больного к терапии рекомбинантным человеческим эритропоэтином, а если они отличаются более чем на 2,5%, то делают вывод о нечувствительности данного больного к терапии анемии хронических заболеваний с помощью рекомбинантного человеческого эритропоэтина. Способ характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью: на изученной выборке (21 человек) они составили 100% и 80% соответственно. 1 табл.

 

Способ определения чувствительности больного с анемией хронических заболеваний к терапии анемического синдрома препаратами рекомбинантного человеческого эритропоэтина

Изобретение относится к медицине, конкретнее к гематологии, онкологии, терапии.

Анемия является обычным проявлением хронических заболеваний, в частности злокачественных новообразований (анемия злокачественных новообразований). Около 50% пациентов онкогематологических и онкологических клиник имеют анемию, особенно на поздних стадиях прогрессирования опухолевого роста [Румянцев А.Г., Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. Эритропоэтин: биологические свойства, возрастная регуляция эритропоэза, клиническое применение. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002.- С.231].

Центральное место в регуляции эритропоэза занимает эритропоэтин (ЭПО). ЭПО является физиологическим регулятором продукции эритроцитов и играет ключевую роль в приспособлении эритропоэза к метаболическим потребностям в кислороде. По своему биологическому действию ЭПО соответствует гормонам: 90% эритропоэтина вырабатывается в почках, 10% - в купферовских клетках печени, воздействует ЭПО на отдаленный орган - костный мозг.

Одним из средств для лечения анемии хронического заболевания (хронических заболеваний) (АХЗ) является рекомбинантный человеческий эритропоэтин (рч-ЭПО). Рч-ЭПО-терапия является очень дорогостоящей, однако в ряде случаев является неэффективной. Поэтому важна разработка способов, которые позволяют заранее определить, будет ли эффективным лечение данного больного АХЗ с помощью рч-ЭПО и рекомендовать данное лечение только тем больным, кому оно поможет, т.е. тем, кто окажется к нему чувствительным.

Наиболее близким, принятым за прототип, является способ определения чувствительности больного с АХЗ к терапии анемического синдрома препаратами рч-ЭПО, основанный на исследовании уровня эндогенного эритропоэтина в сыворотке крови больного (с-ЭПО). Суть способа состоит в том, что определяют концентрацию с-ЭПО в сыворотке крови больного и в случае ее снижения относительно так называемой адекватной концентрации с-ЭПО, делают вывод о чувствительности данного больного к терапии анемического синдрома препаратами рч-ЭПО. Если концентрация с-ЭПО выше адекватной, то введение экзогенного ЭПО такому больному не показано [Румянцев А.Г., Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. Эритропоэтин: биологические свойства, возрастная регуляция эритропоэза, клиническое применение. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. - С.247-250; Eur. J. Haematol., 1991 Apr.; 46 (4):198-201; Barosi G., Liberate N.L., Guamone R. Serum erythropoietin in patients with myelofibrosis with myeloid metaplasia // Br. J. Haematol. - 1993. - Vol.83.- P.365-369; Ariad C., Clifford D., Penfold G. [et al.]. Erythropoietin response in anaemic patients with multiply myeloma and other lymphoid malignancies infiltrating in the bone marrow // Eur. J. Haematol. - 1992. - Vol.49. - P.59-62].

Однако данный способ имеет недостаточно высокую чувствительность и специфичность.

Раскрытие изобретения

Предлагаемое изобретение разработано с целью повысить чувствительность и специфичность способа определения чувствительности больного к терапии АХЗ препаратами рч-ЭПО.

Суть предлагаемого способа определения чувствительности больного с АХЗ к терапии анемического синдрома препаратами рч-ЭПО (способа прогнозирования эффективности терапии анемического синдрома препаратами рч-ЭПО) состоит в том, что у больного путем, например, стернальной пункции получают пробу костного мозга, делают мазки и по ним определяют: 1) долю клеток эритроидного ряда (эритрокариоцитов), 2) долю тех клеток эритроидного ряда, которые несут на своей поверхности рецепторы к ЭПО, т.е. долю ЭПО-Р-положительных эритроидных клеток (ЭПО-Р + эритроидных клеток). Обе доли определяют по отношению ко всем клеткам костного мозга (ко всем клеткам в мазке). В случае, если эти доли равны или отличаются на 0,025 (2,5%) и менее, делают вывод о чувствительности данного больного к терапии АХЗ с помощью рч-ЭПО. Если доля эритроидных клеток, несущих рецепторы к ЭПО, более чем на 0,025 (2,5%) отличается от доли всех эритроидных клеток, делают вывод о нечувствительности данного больного к терапии АХЗ с помощью рч-ЭПО.

Авторами было проведено исследование 23-х пациентов с анемическим синдромом и лимфопролиферативными заболеваниями (неходжкинские злокачественные лимфомы, можественная миелома). У 12 больных (52,2%) были диагностированы лимфомы низкой степени злокачественности, у 5 (21,7%) - высокой степени злокачественности, у 6 (26,1%) - множественная миелома.

У всех 23 пациентов была определена концентрация с-ЭПО, доля всех эритроидных клеток в мазке костного мозга (в миелограмме), доля ЭПО-Р + эритроидных клеток. Было проведено лечение 21 пациента с помощью рч-ЭПО и после курса лечения оценена его эффективность. В таблице приведены указанные данные.

Подсчет доли эритроидных клеток в мазке костного мозга, окрашенного по Романовскому-Гимзе, проводили по стандартной методике на 400 клеток (подсчитывали долю эритроидных клеток по отношению ко всем клеткам мазка костного мозга).

Определение доли эритроидных клеток, несущих рецепторы к ЭПО, проводили методом иммуноцитохимического исследования мазков костного мозга с помощью козьих моноклональных антител против рецептора к эритропоэтину («SIGMA», США) и моноклональных антикозьих IgG, конъюгированных с щелочной фосфатазой («SIGMA», США). В качестве системы визуализации использовался субстрат-хромоген («DAKO»).

Определение доли эритроидных клеток, несущих рецепторы к ЭПО (по отношению ко всем клеткам мазка костного мозга) выполняли следующим образом. У больного забирали образец костного мозга из грудины. Костный мозг наносили на стекло. Цитологические мазки костного мозга замораживали в течение 2 часов при температуре ниже 18°С. Далее мазки размораживали в течение 30 минут при комнатной температуре и в течение 10 минут фиксировали в ацетоне. После фиксации на поверхность мазка наносили первичные козьи моноклональные антитела против рецептора к ЭПО и выдерживали в течение 1 часа в водяной камере согласно инструкции фирмы-производителя антител. Далее мазки промывали в течение 3 минут в фосфатном буфере (рН 7,6) и на поверхность мазка наносили моноклональные антикозьи IgG, конъюгированные с щелочной фосфатазой и выдерживали в течение 30 минут в водяной камере. Далее вновь промывали цитологические мазки в фосфатном буфере в течение 3 минут и наносили раствор субстрат-хромогена и выдерживали в течение 15 минут в водяной камере. Далее мазки промывали в течение 3 минут в дистиллированной воде и докрашивали в течение 15 минут гематоксилин-эозином. После удаления избытка гематоксилин-эозина мазки просушивали и производили подсчет эритроидных клеток, позитивных на наличие рецепторов к ЭПО под световым микроскопом. В случае, если доли всех эритроидных клеток и ЭПО-Р + эритроидных клеток отличались на 2,5% и менее, делали вывод о чувствительности данного больного к терапии АХЗ с помощью рч-ЭПО.

В колонке 7 таблицы указан фактический результат лечения. Знаком (+) обозначено эффективное лечение, знаком (-) обозначено неэффективное и малоэффективное лечение. В колонке 8 указана чувствительность, а в колонке 9 - нечувствительность пациента к лечению с помощью рч-ЭПО, определенные способом-прототипом. Те случаи, когда результат определения совпал с фактическим результатом лечения, обозначены цифрой «1», когда не совпал - цифрой «0». В колонке 10 указана чувствительность, а в колонке 11 - нечувствительность пациента к лечению с помощью рч-ЭПО, определенные предлагаемым способом. Те случаи, когда результат определения совпал с фактическим результатом лечения, также обозначены цифрой «1», когда не совпал - цифрой «0».

Определим чувствительность способа как отношение количества пациентов, которые отнесены способом к чувствительным к лечению препаратами рч-ЭПО, к тому количеству пациентов, лечение которых действительно оказалось эффективным; а специфичность - как отношение количества пациентов, которые отнесены способом к нечувствительным к лечению препаратами рч-ЭПО, к тому количеству пациентов, лечение который действительно оказалось неэффективным или малоэффективным.

Чувствительность способа-прототипа на обследованной выборке составила 14/15=94%, его специфичность - 0/5=0%

Чувствительность предлагаемого способа на обследованной выборке составила 16/16=100%, его специфичность - 4/5=80%

Наблюдение 1. Больная К., 62 лет наблюдалась в гематологическом отделении МУЗ ГКБ №2 в течение 4 лет с диагнозом В-мелкоклеточная лимфома из плазматических клеток IV с поражением костного мозга. Анемический синдром средней степени тяжести. Cor anaemicum, НК I. Исходно по поводу основного заболевания пациентка получила 3 курса полихимиотерапии по протоколу VMCP-VBAD (винкристин, мелфалан, циклофосфан, преднизолон - винкристин, кармустин, адриабластин, дексаметазон). На момент первичного обследования пациентку беспокоила выраженная слабость, сердцебиение, одышка при незначительной физической нагрузке, повышенная утомляемость, головокружение, снижение аппетита, боль в костях. При объективном осмотре: состояние средней степени тяжести, кожные покровы и видимые слизистые бледные, чистые. Язык обложен белым налетом. Дыхание везикулярное, проводится во все отделы, хрипы в легких не выслушиваются, ЧДД - 19 в 1 минуту. Тоны сердца учащены, приглушены, ритмичные.

Результаты исследования концентрации с-ЭПО у больных с АХЗ, доли всех эритроидных клеток и доли ЭПО-Р + эритроидных клеток в мазках костного мозга, эффективности лечения
№ б-го	Уровень с-ЭПО у больного, (mIU/ml)	Уровень Нв у больного, (г/л)	Адекватная конц-ция с-ЭПО для данного б-го, (mIU/ml)	Доля всех эритрокариоцитов в миело-грамме, (%)	Доля ЭПО-Р + эритрокариоцитов, (%)	Эффективность лечения, (+/-)	Прототип	Предлагаемый способ
Чувствительность к лечению	Нечувствитель ность к лечению	Чувствительность к лечению	Нечувствительность к лечению
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	90,8	106	>100	24	24	+	1		1
2	30,5	85	>180	20,5	0,75	-		0		1
3	17,1	110	>100	7,25	7,25	+	1		1
4	15,8	108	>100	31,75	31,5	+	1		1
5	12,8	73	>300	13,25	8	-		0		1
6	52,6	97	>100	11,75	5	-		0		1
7	3	104	>100	38,5	38,25	+	1		1
8	52,6	98	>100	11,5	0,5	-		0		1
9	186	63	>300	5	5	+	1		1
10	35,4	91	>100	18,75	18,5	+	1		1
11	37,2	104	>100	0,25	0,25	-		0		0
12	28,7	93	>100	6,25	6	4-	1		1
13	79,45	97	>100	14	14	+	1		1
14	263	61	>300	3	0,25	Не лечили
15	129	105	>100	35,5	35,75	+	0		1
16	11,3	103	>100	20	20	+	1		1
17	880	86	>180	5	1	Не лечили
18	13,9	99	>100	51,75	51,75	+	1		1
19	18,27	75	>300	55	55	+	1		1
20	11,5	78	>300	52	52,75	+	1		1
21	36,2	93	>100	58	58	+	1		1
22	44,1	85	>180	26,5	27,5	+	1		1
23	11,2	110	>100	54,5	53,25	+	1		1

Систолический шум на верхушке сердца проводится во все точки аускультации. АД - 160/90 мм рт.ст., ЧСС - 80 в 1 минуту. Живот при пальпации мягкий, безболезненный. Нижний край печени - по краю реберной дуги, размеры по Курлову: 9×8×7 см. Селезенка не пальпируется. Симптом Пастернацкого отрицателен с обеих сторон.

По данным общего анализа крови: нормохромная, гипорегенераторная анемия средней степени тяжести - Er - 2,6×10¹²/л, Hb - 81 г/л, ЦП (цветовой показатель)- 0,93, Ht (гематокрит) - 24%, Rt - 1⁰/₀₀, Le - 3,3×10⁹/л.

По данным миелограммы: доля всех клеток эритроидного ряда - 3,5%, доля ЭПО-Р + клеток эритроидного ряда в костном мозге 0,75%, основные ростки кроветворения сужены, 63,5% клеток костного мозга в мазке - атипичные лимфоидные элементы.

По данным биохимического исследования крови содержание железа в сыворотке крови (Fe) - 15,0 мкмоль/л, общая железосвязывающая способность сыворотки (ОЖСС) - 57,0 мкмоль/л, коэффициент насыщения транс-феррина (КНТ) - 26%, уровень ферритина в сыворотке крови - 43,8 нг/мл, концентрация с-ЭПО понижена относительно адекватной - 16,7 mIU/ml (адекватная концентрация с-ЭПО составляет более 100 mIU/ml). По данным ЭКГ - признаки дистрофических изменений в миокарде.

Таким образом, у пациентки имелся анемический синдром средней степени тяжести с выраженной клинической симптоматикой.

С целью коррекции анемического синдрома пациентка получала терапию рч-ЭПО по 8000 ME подкожно 2 раза в неделю в течение 1 месяца и препарат железа 200 мг в сутки перорально. Через 1 месяц терапии препаратом рч-ЭПО сохранялись жалобы на незначительную слабость, сердцебиение, снижение аппетита, прочих жалоб не отмечалось. Общий анализ крови: анемия средней степени тяжести - Er 2,7×l0¹²/л, Hb - 89 г/л, ЦП - 1,0, Ht -27%, Rt - 12‰, Le - 5,5×10⁹/л.

Таким образом, хотя, согласно способу-прототипу, терапия препаратом рч-ЭПО должна была быть эффективной, на самом деле она не дала выраженного эффекта в связи с тем, что разница между долей всех эритроидных клеток и долей ЭПО-Р + эритроидных клеток превышала 2,5%.

Наблюдение 2. Больной Д., 34 лет. Наблюдался в гематологическом отделении МУЗ ГКБ №2 с диагнозом: В-крупноклеточная анапластическая лимфома IV с поражением желудка, костного мозга. Состояние после субтотальной резекции желудка. Вторичная анемия тяжелой степени. Анемическое сердце. Недостаточность кровообращения I. Диагноз был установлен в октябре 2003 года на основании гистологического и иммуногистохимического исследования препаратов желудка, исследования миелограммы. Исходно по поводу основного заболевания пациент получил 1 курс полихимиотерапии по протоколу CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон) и 1 по протоколу СНОЕР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон). При первичном осмотре пациента беспокоила выраженная слабость, сердцебиение, ощущение перебоев в работе сердца, одышка при незначительной физической нагрузке, повышенная утомляемость, головокружение, сонливость и снижение памяти, отрыжка, изжога. При объективном осмотре: состояние больного тяжелое, пациент истощен, кожные покровы и видимые слизистые бледные, чистые. Язык обложен белым налетом. Периферические лимфоузлы не пальпируются. Дыхание везикулярное, проводится во все отделы, учащено, хрипы в легких не выслушиваются, ЧДД - 21 в 1 минуту. Тоны сердца значительно учащены, резко приглушены, ритмичные. Систолический шум на верхушке сердца, проводится во все точки аускультации. АД - 120/80 мм рт.ст., ЧСС - 106 в 1 минуту. Живот при пальпации мягкий, умеренно болезненный в эпигастральной области. Нижний край печени выступает на 3 см из-под реберной дуги, размеры по Курлову: 12×9×7 см³. Селезенка не пальпируется. Симптом Пастернацкого отрицателен с обеих сторон.

Общий анализ крови: нормохромная, арегенераторная анемия тяжелой степени - Er - 2,2×10¹²/л, Hb - 69 г/л, ЦП - 1,0, Ht - 25%, Rt - 1‰, Le - 5,9×10⁹/_л.

По данным миелограммы: доля клеток эритроидного ряда составляет - 24,75%, эритроидный ряд несколько омоложен. Доля ЭПО-Р + эритроидных клеток в костном мозге составило 22,6%.

Показатели феррокинетики в пределах нормы: содержание железа в сыворотке составляет 35,1 мкмоль/л, ОЖСС - 69,8 мкмоль/л, КНТ - 50%, уровень ферритина в сыворотке крови - 143,2 нг/мл. Концентрация с-ЭПО значительно ниже адекватной - 8,3 mIU/ml (адекватной является концентрация с-ЭПО более 100 mIU/ml). По данным электрокардиографии - признаки дистрофических изменений в миокарде.

Таким образом, у пациента имелся анемический синдром тяжелой степени, выраженные признаки гипоксического поражения центральной нервной системы и миокарда. Из-за анемии тяжелой степени проведение очередного курса полихимиотерапии было отложено.

С целью коррекции анемического синдрома пациент получал терапию препаратом рч-ЭПО по 8000 ME подкожно 2 раза в неделю в течение 1 месяца. По окончании курса отмечались жалобы на незначительную слабость и сердцебиение. Прочих жалоб, связанных с гипоксией, не отмечалось. При объективном осмотре: состояние пациента относительно удовлетворительное. Кожные покровы и видимые слизистые чистые, незначительная бледность. Дыхание везикулярное, хрипы в легких не выслушиваются, ЧДД - 16 в 1 минуту. Тоны сердца ритмичные, слабый систолический шум на верхушке сердца. ЧСС - 80 в 1 минуту. По остальным органам и системам - без существенной динамики.

Общий анализ крови: анемия легкой степени тяжести, нормохромная, норморегенераторная - Er 3,8×10¹²/л, Hb - 117 г/л, ЦП - 0,93, Ht - 35%, Rt - 22‰, Le - 5,8×10⁹/_л. По данным миелограммы - доля всех эритроидных клеток костного мозга 25%.

После повышения уровня гемоглобина был начат очередной курс полихимиотерапии. Эффект от терапии рч-ЭПО сохранялся на протяжении всех остальных курсов полихимиотерапии. Данное клиническое наблюдение демонстрирует эффективность коррекции анемического синдрома тяжелой степени препаратом рч-ЭПО у больного неходжкинской лимфомой высокой степени злокачественности. Лечение данного пациента с помощью рч-ЭПО было показано и на основании способа прототипа, и на основании предлагаемого способа. Уровень гемоглобина повысился с 69 до 117 г/л, уровень ретикулоцитов с 1‰ до 22‰. У больного значительно уменьшился спектр и выраженность жалоб, связанных с гипоксическим поражением центральной нервной системы и миокарда. Больной хорошо переносил проводимую терапию и избежал проведения заместительных гемотрансфузий.

Способ определения чувствительности больного с анемией хронических заболеваний к терапии анемического синдрома препаратами рекомбинантного человеческого эритропоэтина, отличающийся тем, что на мазках костного мозга больного определяют по отношению ко всем клеткам костного мозга долю эритроидных клеток, а также долю тех эритроидных клеток, которые несут рецепторы к эритропоэтину и, если обе доли равны или отличаются на 2,5% и менее, делают вывод о чувствительности данного больного к терапии препаратами рекомбинантного человеческого эритропоэтина.