Способ получения технического препарата лакказы

Способ включает глубинное культивирование штамма гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, на питательной среде, отделение биомассы гриба, мембранное концентрирование фильтрата. В составе питательной среды используют ростовые факторы в концентрации 0,1-1,02 мас.% и в качестве источника углерода пшеничную муку в концентрации 2,0-4,0 мас.%. Культивирование ведут при температуре 28-34°С, рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм^-3. Мембранное концентрирование осуществляют при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С. Активность лакказы составляет 140-200 ME. Способ позволяет получить технический ферментный препарат лакказы, обладающий высокой активностью.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к новым способам получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее эффективно настоящее изобретение может быть использовано в промышленном производстве жидкой формы технического препарата лакказы для использования в текстильной, деревообрабатывающей и других областях промышленности, где применяются технические формы фермента.

Лакказа (КФ 1.10.3.2 п-дифенол: кислород оксидоредуктаза), относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования каких-либо кислородных интермедиатов.

Применение технических форм ферментного препарата лакказы возможно в ряде областей промышленности. Например, известно использование лакказы для обработки целлюлозно-бумажной пульпы (Патент РФ №2001125920, С08В 11/145, 2004; патент США №6610172, D21H 021/20, 2003; Патент США №20010047852). Известно использование лакказы в текстильной промышленности для обработки льна, обесцвечивания и окрашивания хлопковых тканей (Патент РФ №96103261, D01C 1/04, 1998; патент РФ №94008821, D06L 1/14, D06M 16/00, 1995; патент США №6805718, D06P 001/32, D06M 016/00, 2004, патент РФ №2000119782, C12S 11/00, 2002; патент РФ №2148111, C12S 3/06, D01C 1/02, 2000; патент РФ №96107218, C12S 3/00, D21C 3/00, 1998), в косметической промышленности в качестве агента для окрашивания волос (Патент Франции №2112549, А61К 7/13, 2002; патент РФ №2203028, А61К 7/13, 2003; патент РФ №200112877, А61К 7/13, 2003; патент РФ №224501, А61К 7/13, 2004; патент РФ №2193392, А61К 7/13, 2002; патент РФ №22005339, А61К 7/13, 2003; патент РФ №2203028, А61К 7/13, 2003; патент РФ №2000121095, А61К 7/13, 2002), производстве моющих средств (Патент США №6815410, C11D 017/00, 2004); для биодеградации ксенобиотиков (Патент США №6395534, C12N 001/18, 2002); для создания антимикробных композиций (Патент США №20010025018, А61К 038/44, 2001; патент США №6592867, C12N 009/02-08, 2003), для очистки сточных вод (Патент РФ №2001128771, А61К 7/13, 2003).

Известны способы получения очищенных препаратов лакказы (Патент Германии №10043944 А2, C12N 9/08, 2003; патент США №5403723, C12N 009/08, С12Р 039/00, 1995), и в составе других ферментных препаратов (патент РФ №2021371, C12N 9/00-9/99, 1994; патент РФ №92016316, C12N 9/08, 1996). Однако они сложны, многоэтапны, так как включают в себя комбинацию разных методов очистки: высаливание, многоступенчатая хроматография на различных носителях и требуют для своего исполнения сложного и дорогостоящего аппаратурного и реактивного обеспечения.

Также известен способ получения лакказы из растений (патент ЕР №1119633 А2, C12N 15/82, 2002). Однако известно, что окислительно-восстановительный потенциал лакказ растений ниже, чем у грибов.

Таким образом, ни один известный способ получения лакказы, в том числе, в составе лигнолитического комплекса грибов, не дает возможности его промышленного применения для получения ферментного препарата лакказы.

Наиболее близким к предложенному способу является способ получения лакказы, изложенный в патенте РФ №2021371, C12N 9/00-9/99, 1994. В этом способе предусматривается культивирование штамма гриба белой гнили Panus tigrinus 8/18 в погруженных условиях на синтетической среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли и микроэлементы, при этом в качестве источника углерода используют мальтозу и дополнительно вносят в среду твин-80 и марганец сернокислый. В процессе культивирования осуществляют температурный сдвиг. Максимальное содержание лигнолитических ферментов достигается к 10-12 сут культивирования и составляет 6-8 ед./мл. Ферменты выделяют из фильтрата культуральной жидкости путем концентрирования ультрафильтрацией или высаливанием. Однако этот способ имеет низкую продуктивность по выходу фермента.

Целью изобретения является упрощение и повышение производительности процесса получения жидкой формы технического ферментного препарата лакказы с высокой активностью и стабильностью в процессе хранения.

Способ получения технического ферментного препарата лакказы характеризуется тем, что в качестве штамма-продуцента лакказы используют штамм гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, в составе питательной среды ростовые факторы (0,1-1,0 мас.% СВ) и пшеничную муку (2,0-4,0 мас.%) в качестве источника углерода, культивирование ведут при температуре 28-34°С, величине рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм^-3 за счет регулирования частоты вращения мешалки и скорости подачи аэрирующего воздуха, а мембранное концентрирование проводят при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С. Используемый штамм высшего базидиального гриба Trametes hirsuta (Wulfen.) Pilát (сем. Poliporaceae) депонирован в коллекции ООО ПКФ «БИГОР» под номером CF-28. Штамм характеризуется высокой скоростью роста и активным синтезом экстрацеллюлярной лакказы в условиях жидкофазного глубинного культивирования. На агаризованном сусле штамм образует колонии с хорошо развитым шерстисто-войлочным воздушным мицелием белого цвета. Гифы воздушного мицелия радиально ориентированы. Гифы трех типов: прямые ровные гифы (с диаметром 2-3 мкм), пряжек мало или отсутствуют; неровные узловатые темно-окрашенные гифы (диаметр гиф 1-2 мкм) с большим количеством пряжек; толстые гифы (диаметр 4-5 мкм) с большим количеством перегородок и одиночными пряжками. В глубинной культуре образует мицелиальные агломераты сферической или неправильной формы, 1-3 мм в диаметре (пеллеты), также присутствуют отдельные гифы, преимущественно двух типов: тонкие (1-2 мкм) и толстые (2,5-5 мкм). Культура гриба активно развивается в диапазоне температур от 24 до 36°С. Оптимум радиального роста колоний - 32°С. Аэроб. В глубинной культуре представляет собой густую светло-соломенно-желтую взвесь глобул от 1 до 8 мм в диаметре.

Изобретение обеспечивает возможность осуществления высокопродуктивного щадящего выделения и концентрирования препарата лакказы. Выбор метода и оптимальное соотношение параметров фильтрации позволяет сохранять его биологическую активность не только в процессе концентрирования, но и в течение длительного срока хранения. Стабильность ферментного препарата обеспечивается за счет стабилизирующих свойств структурных полимеров, концентрирующихся вместе с лакказой, и сохранением структуры и пространственной ориентации молекул лакказы при щадящей фильтрации через широкопористый фильтр, значительно превышающий по размеру пор диаметр глобулярной молекулы фермента.

Высокая продуктивность концентрирования лакказы обеспечивается использованием микрофильтрационных мембран (0,1-0,5 мкм) вместо используемых ранее ультрафильтрационных.

В результате получают жидкий технический ферментный препарат, обладающий лакказной активностью 140-200 ME и сроком хранения в течение не менее 2 месяцев при температуре в диапазоне 4-30°С с потерей активности не более 5%.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Выращивание посевного материала проводили в термостатированной комнате при температуре 28°С и частоте вращения качалки 180 об·мин^-1 на среде следующего состава, мас.%: глюкоза - 2,0; аммоний сернокислый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,12; кукурузный экстракт - 1,0; пеногаситель пропинол - 0,05; вода водопроводная - остальное. Длительность выращивания посевного материала: первый пассаж - 144 ч, второй пассаж - 96 ч, третий и последующие - 48 ч.

Глубинную культуру используют для засева ферментационного аппарата объемом 30 л с рабочим объемом 20 л стерильной питательной средой следующего состава, мас.%: мука пшеничная - 2,0; нитрат аммония - 0,4; фосфат калия однозамещенный - 0,06; кукурузный экстракт - 1,0; вода водопроводная - остальное. Количество вносимого посевного материала составляет 2 л. Культивирование ведут при температуре 28°С, перемешивании 250 об·мин^-1, аэрации 1,0 л·л^-1·мин^-1, избыточном давлении в аппарате 0,2 ати, рН 4,0. Продолжительность ферментации - 68 ч.

Активность лакказы в культуральной среде определяли спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина в качестве субстрата.

Полученная культуральная жидкость имеет активность 16 ME.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют на барабанном вакуум-фильтре со скоростью W - 2,5-2,9 л·м²·мин^-1 и разрежением 0,05-0,07 МПа. Далее фильтрат подвергают микрофильтрации на установке с трубчатыми керамическими элементами на мембранах с размером пор 0,14 мкм при среднем давлении 2,0-3,0 МПа. Коэффициент сжатия составляет К=10. Активность полученного препарата - 145 ME. Общие потери на стадии концентрирования составляют не более 10%. Через 2 месяца хранения активность препарата составляет 95% от исходной - 138 ME.

Пример 2.

Культивирование штамма-продуцента осуществляют аналогично изложенному в примере 1.

После завершения процесса культивирования биомассу отделяют на фильтр-прессе с перепадом давления на фильтрующей перегородке не более 0,05 МПа и размере пор тканевого фильтрующего материала в пределах 10 мкм. Активность полученного культурального фильтрата - 20 ME. Далее фильтрат подвергают микрофильтрации на установке с трубчатыми керамическими элементами на мембранах с размером пор 0,2 мкм при среднем давлении 3,0-4,0 МПа. Полученный жидкий препарат имеет активность 174 ME. Кратность концентрирования - 10. Общие потери на стадии концентрирования составляют не более 13%. Полученный жидкий концентрат хранится при условиях, аналогичных примеру 1. Через 2 месяца хранения активность препарата составляет 97% от исходной - 169 ME.

Таким образом, использование данного способа дает возможность получать жидкий концентрированный ферментный препарат лакказы с высокой производительностью и не требует при выделении продукта использовать какие-либо дополнительные химические вещества синтетического или природного происхождения.

Предлагаемый способ по сравнению с наиболее близким аналогом позволяет упростить и повысить производительность процесса получения жидкой формы технического ферментного препарата лакказы с высокой активностью и стабильностью в процессе хранения.

Способ может быть использован для производства этого фермента в промышленности.

Способ получения технического препарата лакказы, предусматривающий культивирование штамма гриба белой гнили на питательной среде, содержащей источники азота, углерода, минеральных солей, отделение биомассы гриба, мембранное концентрирование полученного фильтрата, отличающийся тем, что в качестве продуцента лакказы используют штамм гриба Trametes hirsuta (Wulfen) Pilat, ООО ПКФ «БИГОР» CF-28, в составе питательной среды используют ростовые факторы 0,1-1,0 мас.% СВ и пшеничную муку 2,0-4,0 мас.% в качестве источника углерода, культивирование ведут при температуре 28-34°С, величине рН 4,0-4,5, концентрации растворенного кислорода не менее 1,5-2,0 мг·дм³ за счет регулирования частоты вращения мешалки и скорости подачи аэрирующего воздуха, а мембранное концентрирование проводят при размерах пор мембранного элемента 0,1-0,5 мкм, перепаде давления 1,0-4,0 МПа и температуре 20-40°С.