Штамм бактерий bacillus thuringiensis, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий erwinia carotovora

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм получен путем многоступенчатой селекции из материала, выделенного из природных образцов, и депонирован во всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-9790. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790 обладает множественной пестицидной активностью, а именно: - инсектицидной активностью против личинок жесткокрылых насекомых (Coleoptera) - колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), большого мучного хрущака (Tenebrio molitor), щавелевого и калинового листоедов (Gastrophysa viridula, Galerucella viburni), - фунгицидной активностью против личинок жесткокрылых насекомых (Coleoptera) - колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), большого мучного хрущака (Tenebrio molitor), щавелевого и калинового листоедов (Gastrophysa viridula, Galerucella viburni), а также - способностью подавлять проявление вирулентных свойств фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora. Использование штамма позволяет расширить спектр биопрепаратов. 3 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к применению пестицидов - биологических средств борьбы с вредными насекомыми и возбудителями болезней растений грибного и бактериального происхождения. Защита сельскохозяйственных растений: овощных культур, картофеля, зерновых и фруктов, от болезней и вредных насекомых является серьезной экономической проблемой. Ежегодные потери сельского хозяйства достигают нескольких миллиардов рублей. К числу экономически значимых болезней растений относятся болезни, вызываемые микроскопическими грибами [1]. Пасленовые культуры (картофель, томаты, баклажаны и т.д.) часто повреждаются колорадским жуком [2]. Заселенность кустов пасленовых культур в разные годы и в разных климатических зонах может достигать 50-70%, а потери урожая составляют 25-35%. Для борьбы с колорадским жуком, в основном, используются химические инсектициды, однако их эффективность, по мере использования, снижается в результате возникновения у насекомых устойчивости к ним. Это заставляет либо повышать дозу применения препарата, либо проводить ротацию инсектицида. Кроме того, химические инсектициды небезопасны экологически, не обладают избирательностью действия и могут накапливаться в окружающей среде. Применение альтернативных биологических инсектицидов для борьбы с колорадским жуком не получило широкого распространения в практике сельского хозяйства.

Для борьбы с возбудителями болезней растений - грибного или бактериального происхождения широко используются химические средства («Альто», «Раксил», «Фундазол», «Фоликур»), эффективность пестидного действия которых не более 50-60%. Эти препараты (называемые химическими фунгицидами) индуцируют резистентность у возбудителей болезней, способны накапливаться в окружающей среде и вызывают фитотоксический эффект. Кроме того, после их применения необходим период ожидания, т.е. регламентировано время появления на обработанных участках людей и техники.

Серьезную опасность представляют химические фунгициды, применяемые для обработки готовой сельскохозяйственной продукции, поскольку известно отрицательное влияние таких химических препаратов на человека и животных. В качестве альтернативных средств защиты растений используют биологические препараты, основу которых составляют метаболиты бактериального происхождения, проявляющие антагонистическую активность по отношению к различным возбудителям.

Биологические препараты на основе микроорганизмов, продуцирующих антагонистические факторы, также используют для борьбы с фитопатогенными грибами, инфицирующими семенной материал. Известен биологический препарат «Бактофит», созданный на основе штамма Bacillus subtilis ИПМ 215. Препарат рекомендован для защиты различных растений от болезней [3]. Составляющий активное начало этого препарата штамм В. subtilis ИПМ 215 рассмотрим в качестве ближайшего аналога. Его пестицидная активность направлена против фитопатогенных грибов (Botrytis, Fusarium, Phoma) и бактерий, включающих различные виды родов Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia. Имеются сведения о том, что обработка фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora культурой Bacillus thuringiensis приводит к потере фитопатогенного эффекта, не оказывая летального действия [4].

Информации о штаммах, совмещающих инсектицидные и фунгицидные свойства (то есть обладающих множественной пестицидной активностью), не обнаружено.

Задача заявляемого изобретения:

получить штамм бактерий, совмещающий инсектицидные свойства с антагонистическим действием против возбудителей болезней растений грибного происхождения, способный также подавлять вирулентность фитопатогенных бактерий.

Задача решена путем

получения штамма бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790, совмещающего инсектицидные и фунгицидные свойства, а также обладающего способностью к подавлению вирулентности фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Заявляемый штамм Bacillus thuringiensis ssp.morrisoni ГосНИИгенетика 16-Т281 выделен из природных образцов и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-9790.

1. Культивирование штамма.

В качестве питательных сред использовали NBY, ASC, SG, YM следующего состава, мас.%:

среда NBY:

питательный бульон «Difco» - 0,8;

дрожжевой экстракт « Difco» - 0,3;

вода - остальное.

среда ASC:

дрожжевой экстракт «Difco» - 0,5;

сахароза - 2,0;

лимонная кислота - 1,17;

Na₂SO₄ - 0,4;

(NH₄)₂HPO₄ - 0,42;

KCl - 0,076;

MgCl₂×6H₂O - 0,042;

вода - остальное.

среда SG:

сукцинат натрия - 0, 5;

глицерин - 1,5;

MgSO₄ - 0,02;

(NH₄)₂HPO₄ - 0,5;

KCl - 0,2;

вода - остальное.

среда YM:

гидролизные дрожжи - 4,5;

вода - остальное.

Для приготовления агаризованных питательных сред в жидкие среды дополнительно добавляли агар-агар (2,0 мас.%).

2. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки размером 1,2-1,5×2,5-3,0 мкм. При росте на богатых агаризованных средах (NBY, ASC, YM, SG) через 24 часа при 28-30°С штамм образует округлые колонии 3-6 мм в диаметре с гладкой поверхностью белого цвета. Через 72 часа роста на твердых питательных средах штамм образует крупные кристаллические включения квадратной и прямоугольной формы.

При культивировании в жидких питательных средах при 28-30°С со встряхиванием 250 об/мин наблюдают равномерный рост, кристаллообразование заканчивается к 72 часам роста.

3. Физиолого-биохимические признаки.

Культивирование штамма заявляемого штамма осуществляют в диапазоне температур 28-30°С при рН 6,8-7,2. Оптимальными являются температура для культивирования штамма 30°С и рН 7,0.

Штамм не сбраживает маннозу, сбраживает сахарозу, не разлагает салицин, разлагает эскулин, лецитиназу не образует, гидролизует крахмал, мочевину не расщепляет.

4. Фунгицидные свойства штамма.

Характеризуется широким спектром антагонистической активности и подавляет развитие следующих фитопатогенных грибов: Fusarium graminearum, Fusarium solani, Fusarium nivale, Phytophora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.

5. Инсектицидные свойства штамма.

Проявляет инсектицидную активность против личинок жесткокрылых насекомых (Coleoptera) - колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata), большого мучного хрущака (Tenebrio molitor), щавелевого и калинового листоедов (Gastrophysa viridula, Galerucella viburni).

6. Подавление вирулентных свойств фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Подавляет способность бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora вызывать развитие болезни картофеля - мокрая гниль, не оказывая антагонистического эффекта на развитие бактерий.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1.

Культивирование штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790.

Для культивирования штамма использовали стандартные стеклянные конические плоскодонные колбы Эрленмейера объемом 750 см³, которые заполняли 50 мл стерильной среды. Среду NBY готовили на дистиллированной воде, доводили значение рН до 7,0, разливали в колбы по 50 мл и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С в течение 30 мин. После стерилизации колбы с содержащейся в них средой охлаждали до +20°С. Стерильность и рН контролировали путем отбора соответствующих проб. Затем в колбы вносили по 2 мл посевного материала, приготовленного следующим образом: в стандартную пробирку с 5 мл стерильной питательной среды NBY помещали бактериальную культуру, собранную петлей с твердой агаризованной среды NBY, и инкубировали в течение 16 часов при температуре 30°С со встряхиванием 250 об/мин. Содержимое пробирки после светооптического контроля на отсутствие посторонней микрофлоры использовали как посевной материал.

Штамм выращивали при 28-30°С при встряхивании (250 об/мин) в течение 72 часов. В процессе культивирования осуществляли контроль на отсутствие посторонней микрофлоры светооптическим методом или путем визуального контроля за морфологией колоний, выросших после высева культуральной жидкости штамма на чашки с агаризованной питательной средой NBY. Через 72 часа методом световой микроскопии оценивали наличие и размер кристаллов. А также определяли титр КОЕ (колонии образующих единиц - бактериальных клеток и спор), который на среде NBY составлял 2-4×10⁹ КОЕ/мл.

Пример 2.

Оценка фунгицидной активности заявляемого штамма.

Оценку фунгицидной активности штамма ВКПМ В-9790 проводили в лабораторных условиях стандартным методом лунок. Для этого в центр чашек Петри с агаризованной картофельно-сахарозной средой, следующего состава, мас.%: сахароза - 2,0; агар-агар - 2,0; картофельный отвар - остальное; выкладывали диски этого агара с мицелием тест-культур фитопатогенных грибов Fusarium graminearum, Fusarium solani, Fusarium nivale, Phytophora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum.

Затем на эти же чашки в вырезанные в агаризованной среде лунки диаметром 8 мм вносили по 150 мкл культуральной жидкости, содержащей 2-4×10⁹ КОЕ/мл культуры штамма ВКПМ В-9790, выращенного как в примере 1. Через 72 часа совместного культивирования при температуре 25°С определяли величину фунгицидной активности заявляемого штамма по зоне подавления роста тест-культур грибов (таблица 1). Полученные результаты свидетельствовали о широком спектре фунгицидной активности штамма ВКПМ В-9790, который в большей степени угнетал развитие фитопатогенных грибов: Fusarium graminearum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum и был менее активен в отношении культур Fusarium nivale, Fusarium solani, Phytophora infestans.

Таблица 1
Спектр фунгицидной активности штамма Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790
Тест-культуры грибов	Фунгицидная активность, мм*
Fusarium graminearum	20
Fusarium nivale	16
Fusarium solani	12
Phytophthora infestans	12
Rhizoctonia solani	20
Sclerotinia sclerotiorum	22
*диаметр зоны ингибирования роста культур грибов от начала подавления роста до края чашки Петри.

Пример 3.

Оценка инсектицидной активности заявляемого штамма

Оценку в лабораторных условиях инсектицидности для жесткокрылых насекомых - Coleoptera (колорадского жука - Leptinotarsa decemlineata, щавелевого листоеда - Gastrophysa viridula, калинового листоеда - Galerucella viburni) заявляемого штамма В-9790 проводили на личинках насекомых 1-2 возраста. Штамм В-9790 выращивали в среде YM, как в примере 1. Полученную культуральную жидкость штамма разводили дистиллированной водой. Стандартные по размеру листья картофеля, щавеля или калины с черенками длиной 1-2 см замачивали в стерильных чашках Петри в соответствующих разведениях культуральной жидкости заявляемого штамма. После подсушивания черенки листьев обматывали влажным ватным тампоном и переносили в сухие стерильные чашки Петри. На поверхность этих листьев помещали по 30 личинок колорадского жука или других жесткокрылых насекомых. Опыты проводили при комнатной температуре в трех повторностях. Токсичность заявляемого штамма оценивали через 72 часа инкубации.

Оценку инсектицидной активности для непарного шелкопряда (Lymantria dispar, Lepidoptera) и большого мучного хрущака (Tenebrio molitor, Coleoptera) проводили стандартным методом путем внесения разведений культуральной жидкости заявляемого штамма в соответствующие диеты.

Таблица 2
Инсектицидная активность штамма ВКПМ В-9790
Количество культуральной жидкости, вызывающей 50%-ную гибель личинок (Летальная концентрация - LC50), %
непарный шелкопряд	колорадский жук	большой мучной хрущак	щавелевый листоед	калиновый листоед
>25,0	0,17	18,80	0,06	0,07

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о высокой инсектицидной активности заявляемого штамма против личинок листоедов и колорадского жука, промежуточной активности против личинок большого мучного хрущака и практически отсутствию активности против личинок непарного шелкопряда.

Пример 4.

Подавление заявляемым штаммом вирулентных свойств фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Продемонстрирована способность штамма ВКПМ В-9790 подавлять вирулентность бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora. Для этого клубни картофеля промывали с мылом, обрабатывали 30%-ным спиртом и после подсушивания нарезали на ломтики толщиной 4-5 мм. Бактерии Erwinia carotovora ssp.carotovora выращивали на агаризованной среде NBY в течение 24 часов при 28°C, затем суспендировали в физиологическом растворе до концентрации 10⁸ КОЕ/мл. Заявляемый штамм ВКПМ В-9790 выращивали в течение 24 часов в среде YM до концентрации 2-4×10⁹ КОЕ/мл.

Оценку способности заявляемого штамма подавлять вирулентные свойства бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora осуществляли следующими способами:

1 вариант - культуральные жидкости штаммов ВКПМ В-9790 и Erwinia carotovora ssp.carotovora смешивали в равных количествах и по 10 мкл наносили на ломтик картофеля, в контроле на ломтики картофеля наносили отдельно по 10 мкл культуральной жидкости штаммов ВКПМ В-9790, Erwinia carotovora ssp.carotovora и физиологического раствора.

2 вариант - ломтик картофеля погружали в культуральную жидкость заявляемого штамма (10 мл) и высушивали. Затем на этот же ломтик наносили 10 мкл культуры Erwinia carotovora ssp.carotovora. В контроле вместо культуральной жидкости Erwinia carotovora ssp.carotovora использовали физиологический раствор. Ломтики картофеля с нанесенными на них культурами переносили в чашки Петри. Эффект оценивали через 24 часа инкубирования при температуре 30°С в термостате этих чашек путем измерения величины зоны мацерации, образовавшейся на ломтиках картофеля в результате проявления вирулентных свойств бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3
Способность штамма Вас.thuringiensis ВКПМ В-9790 подавлять вирулентность бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora
Вариант	Зона мацерации картофеля (см) при нанесении на картофель компонентов
E.carotovora ssp.carotovora	E.carotovora ssp.carotovora+Вас.thuringiensis В-9790	E.carotovora ssp.carotovora + физ. раствор	Вас.thuringiensis ВКПМ В-9790
1	1,6	0	1,8	0
2	2,8	0	2,7	0

Как следует из результатов, представленных в таблице 3, заявляемый штамм предотвращает появление на ломтиках картофеля зон мацерации, обусловленных вирулентностью развивающихся на них бактерий Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Пример 5.

Отсутствие антагонистического эффекта штамма ВКПМ В-9790 на бактерии Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Заявляемый штамм и бактерии Erwinia carotovora ssp.carotovora выращивали, как указано в примере 4. На поверхность агаризованной среды NBY наносили 0,15 мл суточной культуры Erwinia carotovora ssp.carotovora и инкубировали в течение 4 часов при 30°С. В 8 мм лунки, сделанные в этой агаризованной среде, вносили 150 мкл суточной культуры заявляемого штамма. Наличие антагонистического эффекта или его отсутствие оценивали через 24 часа по наличию или отсутствию зоны подавления роста Erwinia carotovora ssp.carotovora. Заявляемый штамм не оказывал подавляющего действия на бактерии Erwinia carotovora ssp.carotovora.

Источники информации

1. Мюллер Э., Леффлер В. Микология. Перевод с нем. М.: Мир, 1995. С.141.

2. Патент РФ 2204598.

3. Патент РФ 2083109.

4. Appl. and Env. Microbiol. 2004, V.70, No.2, p.954-960.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis ВКПМ В-9790, проявляющий фунгицидную активность, инсектицидную активность против личинок колорадского жука и личинок листоедов и подавляющий вирулентные свойства фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora.