Введение дендритных клеток, подвергнутых частичному созреванию in vitro, для лечения опухолей

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения опухоли. Способ по изобретению включает введение дендритных клеток (ДК), индуцированных in vitro для начала созревания и характеризующихся способностью захватывать и процессировать антиген in vivo. Фармацевтическая композиция по изобретению содержит такие ДК в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для введения. Изобретение обеспечивает индукцию противоопухолевого иммунного ответа за счет эффективного захвата и процессинга ДК опухолевых антигенов в области локализации опухоли, секреции соответствующих цитокинов и контакта с Т-клетками в лимфатическом узле. 2 н. и 30 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов Америки под номером 60/431267, поданной 6 декабря 2002 г., полностью включенной в данное описание для всех целей.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дендритные клетки (DC) признаны в качестве носителей выбора активной иммунотерапии рака. Эксперименты на животных продемонстрировали потенциал иммунотерапии на основе DC как при защите мышей от бластомогенеза, так и при устранении укоренившихся опухолей. Эти успехи были, по меньшей мере, частично воспроизведены на людях в небольших клинических испытаниях. Переход от небольших испытаний на безопасность или с целью доказательства концепции к массовым испытаниям, в которых может быть продемонстрирована активность или эффективность, был задержан трудоемкими и обременительными особенностями получения DC (смотри ниже). Вследствие этого несколько компаний заинтересовались разработкой противораковой вакцины на основе DC, несмотря на широкие лечебные возможности таких препаратов.

Внутриопухолевая (IT) инъекция DC представляет собой особый вид иммунотерапии на основе DC. После инъекции DC захватывают антиген от апоптических или гибнущих раковых клеток и представляют антиген Т-клеткам после миграции в лимфоузлы. Действительно было обнаружено, что эффективность таких лечений на экспериментальных моделях на животных коррелирует со степенью апоптоза в опухоли (Candido et al., Cancer Res. 61:228-236, 2001), что наводит на мысль о том, что этот подход является абсолютно совместимым с лечением опухолей химиотерапевтическими средствами или облучением перед инъекцией DC. Кроме того, несколько групп продемонстрировали, что такая комбинированная терапия является особенно эффективной против укоренившихся опухолей (Nikitina et at., Int. J. Cancer 94:825-833, 2001; Tanaka et al., Int. J. Cancer 101:265-269, 2002; Tong et al., Cancer Res. 61:7530-7535, 2001).

Поскольку опухолевые клетки являются источником антигена, то внутриопухолевая инъекция (IT) устраняет необходимость как выбора, так и наработки опухолевых антигенов, поскольку они в настоящее время используются в большинстве терапевтических подходов in vitro, основанных на DC. Выбор опухолевого антигена зачастую движется потребностью компаний иметь запатентованную ситуацию, и еще должно быть доказано, что некоторые опухолевые антигены, идентифицированные до настоящего времени, обеспечивают значимый клинический эффект. Кроме того, использование таких опухолевых антигенов часто дает в результате моновалентную вакцину (моновакцину), которая может утрачивать свою действенность, если опухолевые клетки снижают экспрессию антигена, использованного при иммунизации. Конечно, необходимость производства опухолевого антигена в условиях, требуемых надлежащей производственной практикой (GMP), добавляет дополнительную стоимость классическим способам иммунизации, основанным на DC.

Инъекция DC внутрь опухоли подвергает дендритные клетки иммуносупрессивной среде опухоли. Опухоли, как известно, вырабатывают цитокины, которые инактивируют DC, или которые обладают способностью к искажению ответа Т-клеток по направлению к менее эффективному ответу Тh2-типа. Несколько групп использовали генетические модификации DC с целью преодоления этих супрессивных эффектов, в особенности посредством продуцирования цитокина интерлейкина-12 (IL-12; Nishioka et al., Cancer Res. 59:4035-4041, 1999; Melero et al., Gene Therapy 6:1779-1784, 1999) или экспрессии лиганда CD40 (Kikuchi et al., Blood 96:91-99, 2000). Кроме того, обнадеживающие результаты, описанные этими группами, демонстрируют целесообразность IT-инъекций DC в качестве терапевтического подхода.

Triozzi et at. (Cancer 89:2647-2654, 2000) описывает IT-инъекции DC у больных с метастатической меланомой или раком молочной железы. Авторы получили регрессию опухоли у 4 пациентов с меланомой и у двух пациентов с карциномой молочной железы. Биопсии регрессирующих поражений обнаруживали инфильтрирующие Т-клетки, дающие возможность предположить, что DC действительно активировали иммунный ответ против опухолевых клеток. В целом эти данные демонстрировали то, что IT-введение DC осуществимо на людях и могло принести существенную клиническую пользу. Однако наблюдалось существенное снижение экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса (МНС-антигенов II класса) и костимулирующих молекул В7-2 на инъецированных DC. Можно было бы ожидать, что снижение экспрессии этих критических молекул уменьшает иммуностимулирующий потенциал DC, но, как предусматривается в настоящем изобретении, этого можно избежать путем частичного созревания DC перед введением.

DC существуют в периферических тканях в незрелой форме готовыми захватывать и процессировать антиген. Эта форма является такой формой незрелой клетки, которая наиболее близко имитируется DC, образованными из моноцитов в присутствии GM-CSF и IL-4. Различные стимулы могут инициировать созревание DC, процесс, в течение которого клетки теряют свою способность эффективно захватывать антиген и повышают свои функции стимуляции Т-клеток. Этот процесс является сложным и, по меньшей мере, in vitro может отнимать вплоть до 48 часов до окончания. Другим следствием созревания является изменение миграционных свойств клеток. Например, созревание индуцирует несколько хемокиновых рецепторов, в том числе CCR7, которые направляют клетки к зонам Т-клеток дренирующих лимфоузлов, где зрелые DC активируют Т-клетки против антигенов, которые присутствуют на поверхности DC в контексте МНС-молекул I класса и II класса.

Индукция толерантности была связана с перекрестным представлением (ауто) антигенов дендритными клетками (Kurts et al., J. Exp. Med. 186:239-245, 1997), и в основу современной господствующей гипотезы положено то, что созревшая DC непрерывно поставляет антигены иммунной системе для поддержания толерантности (Kurts et al., J. Exp. Med. 184:923-930, 1996), предполагая, что созревание DC in vivo требуется для эффективной иммуностимуляции. Как стало сейчас очевидным, созревание DC может давать в результате или иммуностимулирующие, или иммуносупрессивные DC (Chakraborty et al., Clin. Immunol. 94:88-98, 1999). Точная природа стимула созревания, который производит каждый из двух результатов, не была объяснена, но является общепризнанным, что иммуностимулирующие DC продуцируют IL-12 и экспрессируют лиганд CD40 (Albert et al., Nature Immunol. 2:988-989, 2001; Lanzavecchia, Haematologica 84 Suppl. EHA 4:23-25, 1999). Следовательно, частично созревшие DC должны быть использованы для IT-инъецирования, особенно если известно, что стимул, используемый для созревания незрелых дендритных клеток, приводит к экспрессии лиганда CD40 и продуцированию IL-12.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предоставляет способ продуцирования противоопухолевого иммунного ответа, включающий введение клеточной популяции, содержащей дендритные клетки, подвергнутые частичному созреванию in vitro, так что частично созревшие дендритные клетки сохраняют способность захватывать антиген и могут индуцировать иммунный ответ после введения индивидууму. Способ предусматривает эффективный захват и процессинг опухолевых антигенов внутри опухоли и ложа опухоли, несмотря на общую иммуносупрессивную среду внутри опухоли. Можно было бы ожидать, что эта иммуносупрессивная среда мешает действию дендритных клеток путем негативного влияния на их иммуностимулирующие свойства. Кроме того, зрелые дендритные клетки не были бы введены в опухоли, поскольку эти клетки неэффективно процессируют антиген.

Введение частично созревших дендритных клеток может быть непосредственно внутрь существующей опухоли. Кроме того, введение может быть внутрь ложа опухоли, тканевую область в опухоли и вокруг нее или до, или после лечения, т.е. хирургического удаления или резекции опухоли, перед, одновременно или после химиотерапии, лучевой терапии или их комбинировании, и тому подобное. Частично созревшие дендритные клетки могут также быть введены в лимфатический узел или лимфатическую область, которая непосредственно дренирует опухоль или область, окружающую опухоль. Кроме того, частично созревшие дендритные клетки могут быть введены внутрь кровеносного сосуда или внутрь лимфатической области, которая поставляет кровь или лимфу непосредственно внутрь опухоли или ложе опухоли, или орган, пораженный опухолью или с опухолью. Более того, частично созревшие дендритные клетки могут быть введены вообще в кровеносную или лимфатическую систему, так что клетки будут доставляться внутрь опухолевой области.

Дендритные клетки, или их предшественники, пригодные в данном изобретении, могут быть получены, например, из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфоузлов, пуповинной крови или периферической крови и т.п. Дополнительно дендритные клетки могут быть получены от индивидуума, который должен быть подвергнут лечению, или от здорового индивидуума, HLA-совместимого с индивидуумом, который должен быть подвергнут лечению. Дендритные клетки, или их предшественники, могут сохраняться при низких температурах перед контактом с фактором созревания и быть приготовлены в виде композиции для введения индивидууму.

Дендритные клетки, используемые в способах данного изобретения, частично подвергают созреванию in vitro. Подходящие агенты для индукции созревания дендритных клеток, например, включают, но не ограничиваются перечисленным, бациллу Кальметта-Герена (BCG) (БЦЖ), гамма-интерферон (IFNy), липополисахарид (LPS), фактор некроза опухоли α (TNFα), соединение имидазохинолин, например, соединение имидазохинолин-4-амин, такое как 4-амино-2-этоксиметил-α,α-диметил-1Н-имидазол[4,5-с]хинолин-1-этанол (обозначенное R848), или 1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин и его производные (заявка WO 00/47719, полностью включенная в данное описание посредством ссылки), синтезированный двунитевой полирибонуклеотид, например, poly[l]:poly[C(12)U] и ему подобные, агонисты Toll-подобного рецептора (TLR), такие как TLR-3, TLR-4, TLR-7 и/или TLR-9, последовательность нуклеиновых кислот, содержащую неметилированные CpG-мотивы, известные для индукции созревания DC, и им подобные, или их сочетание.

BCG (БЦЖ), используемая в данном изобретении, может содержать целую BCG, элементы клеточной стенки BCG, происходящие из BCG липоарабидоманнаны или другие компоненты BCG. В определенных вариантах воплощения изобретения BCG представляет собой термоинактивированную BCG или обработанную формалином BCG. Обычно сочетание BCG и IFNy используют для частичного созревания дендритных клеток, хотя альтернативно может быть использована одна BCG. Эффективное количество BCG составляет обычно приблизительно 10⁵ до 10⁷ КОЕ (колониеобразующих единиц) на миллилитр среды культуры тканей, а эффективное количество IFNy обычно составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 единиц на миллилитр среды культуры тканей. В другом варианте воплощения активирующим агентом дендритных клеток является имидазохинолин R898. Типично эффективное количество R898, агониста TLR-4, которое является эффективным, составляет от приблизительно 1 до приблизительно 50 мкг/мл, более типично используют от 5 до 10 мкг/мл среды культуры тканей. Имидазохинолин может быть использован один или может быть скомбинирован, например, с эффективным количеством BCG и/или IFNy.

Настоящее изобретение также включает композиции, причем композиция содержит дендритные клетки, частично созревшие in vitro в присутствии агента созревания дендритных клеток, скомбинированные с физиологически приемлемым носителем, буфером и/или наполнителем для введения индивидууму с опухолью. Частично созревшие дендритные клетки, используемые в композициях изобретения, типично имеют повышенную экспрессию костимулирующих молекул, таких как, но не ограничивающихся перечисленным, CD80, CD86 или CD54. Клетки могут экспрессировать или могут не экспрессировать маркер клеточной поверхности CD83, но все-таки могут поглощать и процессировать антиген. Типично композиция будет содержать от приблизительно 10² до приблизительно 10¹⁰, но может содержать больше частично созревших дендритных клеток. После частичного созревания дендритные клетки могут сохраняться при низких температурах в течение периода времени перед введением индивидууму. Клетки, используемые для производства частично созревших дендритных клеток, которые содержатся в композиции данного изобретения, могут быть выделены от пациента, имеющего опухоль, или частично созревшие дендритные клетки могут быть произведены из клеток, которые были выделены от индивидуума, который имеет HLA-совместимость к пациенту.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дендритные клетки представляют собой разнообразную популяцию антигенпредставляющих клеток, обнаруженных в различных лимфоидных и нелимфоидных тканях. (См. Liu, Cell 106:259-62 (2001); Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-96 (1991)). Дендритные клетки включают лимфоидные дендритные клетки селезенки, эпидермальные клетки Лангерганса и вуалевые клетки в циркулирующей крови. Собирательно, дендритные клетки классифицируют как группу, основанную на их морфологии, высоких уровнях экспрессии поверхностных МНС-белков II класса и отсутствии определенных других поверхностных маркеров, экспрессирующихся на Т-клетках, В-клетках, моноцитах и естественных клетках-киллерах. В частности, дендритные клетки моноцитарного генеза (называемые также моноцитарными дендритными клетками) обычно экспрессируют CD11c, CD80, CD86 и являются HLA-DR⁺, но являются CD14^-.

Напротив, моноцитарные предшественники дендритных клеток (типично моноциты) обычно являются CD14⁺. Моноцитарные предшественники дендритных клеток могут быть получены из любой ткани, где они находятся, в частности из лимфоидных тканей, таких как селезенка, костный мозг, лимфоузлы и тимус. Моноцитарные предшественники дендритных клеток также могут быть выделены из кровеносной системы. Периферическая кровь является полностью готовым источником моноцитарных предшественников дендритных клеток. Пуповинная кровь является другим источником моноцитарных предшественников дендритных клеток. Моноцитарные предшественники дендритных клеток могут быть выделены из различных организмов, в которых может быть вызван иммунный ответ. Такие организмы включают животных, например, в том числе принадлежащих к человеческому роду и не принадлежащих к человеческому роду животных, таких как приматы, млекопитающие (в том числе собаки, кошки, мыши и крысы), птицы (в том числе цыплята), а также их трансгенные разновидности.

В конкретных вариантах воплощения изобретения моноцитарные предшественники дендритных клеток и/или незрелые дендритные клетки могут быть получены от здорового субъекта, или от субъекта, нуждающегося в иммуностимуляции, например, ракового больного, или другого субъекта, для которого клеточная иммуностимуляция может быть полезной или желательной (то есть, субъекта, имеющего бактериальную или вирусную инфекцию, и т.п.). Предшественники дендритных клеток и/или незрелые дендритные клетки также могут быть получены от здорового индивидуума с HLA-совместимостью для частичной активации и введения субъекту с HLA-совместимостью, нуждающегося в иммуностимуляции.

Предшественники дендритных клеток и незрелые дендритные клетки

Способы получения клеточных популяций, обогащенных предшественниками дендритных клеток и незрелых дендритных клеток, из различных источников, в том числе крови и костного мозга, известны специалистам в данной области. Например, предшественники дендритных клеток и незрелые дендритные клетки могут быть выделены путем взятия гепаринизированной крови, путем афереза или лейкафереза, путем приготовления лейкоцитарных пленок, реакции розеткообразования, центрифугирования, центрифугирования в градиенте плотности (например, с использованием фиколла (такого как FICOLL-PAQUE^®), перколла - PERCOLL^® (частицы коллоидного кремнезема (диаметром 15-30 мм), покрытые недиализуемым поливинилпирролидоном (PVP)), сахарозы и т.п.), дифференциального лизиса клеток, фильтрации и т.п. В конкретных вариантах воплощения изобретения популяция лейкоцитов может быть приготовлена, например, путем сбора крови субъекта, дефибринирования для удаления тромбоцитов и лизиса эритроцитов. Предшественники дендритных клеток и незрелые дендритные клетки необязательно могут быть обогащены моноцитарными предшественниками дендритных клеток путем, например, центрифугирования в градиенте PERCOLL^®, пэннинга с иммобилизованными антителами и т.п.

Предшественники дендритных клеток и незрелые дендритные клетки необязательно могут быть приготовлены в закрытой, асептической системе. Как используют здесь, термин «закрытая, асептическая система» или «закрытая система» относится к системе, в которой воздействие нестерильного, атмосферного или циркулирующего воздуха или других нестерильных условий сводят к минимуму или устраняют. Закрытые системы для выделения предшественников дендритных клеток и незрелых дендритных клеток, как правило, исключают центрифугирование в градиенте плотности в открытых сверху пробирках, перенос клеток на открытом воздухе, культивирование клеток в чашках для культуры тканей или открытых колбах и тому подобное. В типичном варианте воплощения изобретения закрытая система обеспечивает асептический перенос предшественников дендритных клеток и незрелых дендритных клеток из исходного сосуда для сбора в укупориваемый сосуд для культуры тканей без воздействия нестерильного воздуха.

Другим опубликованным способом выделения предшественников дендритных клеток является использование обработанного в промышленных условиях пластикового субстрата (например, бус или намагниченных бус) для селективного удаления адгезивных моноцитов и других «предшественников недендритных клеток» (см., например, патенты США № 5994126 и 5851756). Адгезивные моноциты и предшественники недендритных клеток отбрасывают, тогда как неадгезивные клетки сохраняют для культивирования ex vivo и созревания. В другом способе, аферезные клетки культивировали в пластиковых культуральных мешках, в которые пластмассовые, т.е. полистирольные или стирольные бусы с микроносителем, добавляли для увеличения площади поверхности мешка. Клетки культивировали в течение достаточного периода времени для адгезии определенных клеток к бусам, а неприлипшие клетки смывали с мешка. (Maffei, et al., Transfusion 40:1419-1420 (2000); заявка WO 02/44338, включенная в описание изобретения путем ссылки).

В определенных других вариантах воплощения изобретения, моноцитарные предшественники дендритных клеток выделяют адгезией к субстрату, связывающему моноциты, как раскрыто в заявке WO 03/010292, раскрытие которой включено в описание изобретения путем ссылки. Например, популяцию лейкоцитов (например, выделенная лейкаферезом) можно контактировать с субстратом для адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток. При контактировании популяции лейкоцитов с субстратом моноцитарные предшественники дендритных клеток в популяции лейкоцитов предпочтительно прилипают к субстрату. Другие лейкоциты (в том числе другие потенциальные предшественники дендритных клеток) демонстрируют сниженную аффинность связывания с субстратом, тем самым позволяя моноцитарным предшественникам дендритных клеток предпочтительно накапливаться на поверхности субстрата.

Подходящие субстраты включают, например, субстраты, имеющие большое соотношение площади поверхности к объему. Субстрат может быть, например, в виде частиц или волокон. Подходящие субстраты в виде частиц включают, например, стеклянные частицы, пластмассовые частицы, пластмассовые частицы, покрытые стеклом, покрытые стеклом полистирольные частицы, и другие бусы, подходящие для абсорбции белка. Волокнистые субстраты, подходящие для использования в данном изобретении, включают микрокапиллярные трубки и микроворсовые мембраны и тому подобное. Субстрат в виде частиц или волокон обычно дает возможность элюировать прилипшие моноцитарные предшественники дендритных клеток без существенного снижения жизнеспособности прилипших клеток. Субстрат в виде частиц или волокон может быть, по существу, непористым для облегчения элюции моноцитарных предшественников дендритных клеток или дендритных клеток с субстрата. «По существу непористым» субстратом является субстрат, в котором, по меньшей мере, большая часть пор, присутствующих в субстрате, является меньшей по размеру, чем клетки для минимизации включения клеток в субстрат.

Адгезия моноцитарных предшественников дендритных клеток к субстрату может необязательно быть увеличена путем добавления среды для связывания. Подходящая среда для связывания включает культуральную среду моноцитарных предшественников дендритных клеток (например, AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® и тому подобное), дополненную, по отдельности или в произвольной комбинации, например, цитокинами (например, гранулоцитарно/макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF), интерлейкином 4 (IL-4) или интерлейкином 13 (IL-13)), плазмой крови, сывороткой (например, сывороткой человека, такой как аутологичная или аллогенная сыворотка), очищенными белками, такими как сывороточный альбумин, двухвалентными катионами (например, ионами кальция и/или магния) и другими молекулами, которые способствуют специфической адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток к субстрату или предотвращают адгезию немоноцитарных предшественников дендритных клеток к субстрату. В конкретных вариантах воплощения изобретения плазма крови или сыворотка могут быть термоинактивированы. Термоинактивированная плазма может быть аутологичной или гетерологичной по отношению к лейкоцитам.

После адгезии моноцитарных предшественников дендритных клеток к субстрату неприсоединенные лейкоциты отделяют от комплексов моноцитарные предшественники дендритных клеток/субстрат. Любые подходящие способы могут быть использованы для отделения несвязавшихся клеток от комплексов. Например, смеси несвязавшихся лейкоцитов и комплексов может быть предоставлена возможность осаждения, и несвязавшиеся лейкоциты и среду декантируют или сливают. Альтернативно, смесь может быть отцентрифугирована, и супернатант, содержащий несвязавшиеся лейкоциты, декантируют или сливают с осажденных центрифугированием комплексов.

В другом способе моноцитарные предшественники дендритных клеток могут быть выделены из клеточной популяции, обогащенной лейкоцитами, приготовленной путем использования устройства для тангенциальной фильтрации в потоке, как описано в международной заявке на патент PCT/US03/19428, поданной 19 июня 2003, включенной в изобретение путем ссылки. Устройство для тангенциальной фильтрации в потоке, пригодное для выделения популяции клеток, обогащенной моноцитарными предшественниками дендритных клеток, может содержать отделение для удаления, имеющее модуль с перпендикулярным потоком, камеру для фильтрата и фильтр, расположенный между ними. Фильтр находится в контакте с жидкостью с одной стороны, ретентатная поверхность, с камерой с перпендикулярным потоком, а с другой стороны, - фильтратная поверхность, с камерой для фильтрата. Камера с перпендикулярным потоком имеет входное отверстие, приспособленное для введения образца компонентов крови, включающих лейкоциты, внутрь камеры с перпендикулярным потоком и параллельно к ретентатной поверхности фильтра. Также является предусмотренным выходное отверстие в камере с перпендикулярным потоком, расположенное по центру в области камеры напротив ретентатной поверхности фильтра. Фильтр, подходящий для использования в приспособлении для тангенциальной фильтрации в потоке, обычно имеет средний размер пор от приблизительно 1 до приблизительно 10 микрон. Фильтр может иметь средний размер пор от приблизительно 3 до приблизительно 7 микрон. Также могут быть включены приспособления для обеспечения заданной скорости ввода пробы во входное отверстие камеры с перпендикулярным потоком и приспособления для управления скоростью фильтрации фильтрата через фильтр и внутрь камеры для фильтрата. Приспособления, контролирующие скорость фильтрации, ограничивают скорость фильтрации до скорости меньшей, чем беспрепятственная скорость фильтрации для фильтра. Проба, содержащая компоненты крови, может быть приготовлена с помощью исходного устройства, такого как устройство для лейкафереза, или контейнера, содержащего пробу, собранную с устройства для лейкафереза.

Моноцитарные предшественники дендритных клеток и популяции клеток, обогащенные ради предшественников, можно культивировать ex vivo для дифференциации и частичного созревания и/или размножения. Как используют здесь, выделенные незрелые дендритные клетки, предшественники дендритных клеток и другие клетки относятся к клеткам, которые при помощи рук человека существуют отдельно от их естественной среды и по этой причине не являются естественным продуктом. Выделенные клетки могут существовать в очищенном виде, в полуочищенном виде или в ненативной среде. Вкратце, дифференциация ех vivo обычно включает культивирование моноцитарных предшественников дендритных клеток или популяций клеток, имеющей предшественники дендритных клеток, в присутствии одного или нескольких агентов дифференциации. Подходящие агенты дифференциации могут включать, например, клеточные факторы роста (например, цитокины, такие как (GM-CSF), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-13 (IL-13) и/или их комбинации). В определенных вариантах воплощения изобретения моноцитарные предшественники дендритных клеток дифференцируются с образованием незрелых дендритных клеток, полученных из моноцитов.

Предшественники дендритных клеток могут быть культивированы и дифференцированы в подходящих условиях культивирования. Подходящая среда для культуры тканей включает, но не ограничивается перечисленным, AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® и т.п. Среда для культуры тканей может быть дополнена сывороткой, аминокислотами, витаминами, цитокинами, такими как GM-CSF и/или IL-4, IL-7, IL-13, двухвалентными катионами и тому подобное, для активации дифференциации клеток. В конкретных вариантах воплощения изобретения предшественники дендритных клеток можно культивировать в среде, не содержащей сыворотку. Условия культивирования могут при желании исключать любые продукты животного происхождения. Типичная комбинация цитокинов, используемая со средой для культуры дендритных клеток, содержит приблизительно 500 единиц/мл каждого из GM-CSF и IL-4, IL-7 или IL-13. Предшественники дендритных клеток при дифференциации с образованием незрелых дендритных клеток являются фенотипически сходными с клетками Лангерганса кожи. Незрелые дендритные клетки типично являются CD14^- и CD11c⁺, экспрессируют низкие уровни CD86 и CD83 и обладают способностью захватывать растворимые антигены посредством специфического эндоцитоза.

Агенты созревания дендритных клеток могут включать, например, но не ограничиваются перечисленным, BCG, IFNy, LPS, TNFα, соединение имидазохинолин, например, соединение имидазохинолин-4-амин, такое как 4-амино-2-этоксиметил-α,α-диметил-1Н-имидазол[4,5-с]хинолин-1-этанол (обозначенное R848) или 1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин и их производные (заявка WO 00/47719, полностью включенная в данное описание посредством ссылки), синтезированный двунитевой полирибонуклеотид, например, poly[l]:poly[C(12)U] и тому подобные, агонисты Toll-подобного рецептора (TLR), такие как TLR-3, TLR-4, TLR-7 и/или TLR-9, последовательность нуклеиновых кислот, содержащую неметилированные CpG-мотивы, известные для индукции созревания DC и тому подобное, или их сочетание. Эффективные количества BCG обычно находятся в пределах от приблизительно 10⁵ до 10⁷ КОЕ (колониеобразующих единиц) на миллилитр среды для культуры тканей. Эффективные количества IFNy обычно находятся в пределах от приблизительно 100-1000 ЕД на миллилитр среды для культуры тканей. Бацилла Кальметта-Герена (BCG) является авирулентным штаммом M.bovis. Как используют здесь, BCG относится к целой BCG, также как и к элементам клеточной стенки, происходящим из BCG липоарабидоманнанам и другим компонентам BCG. BCG при желании инактивируют, например, термоинактивированная BCG, обработанная формалином BCG и т.п. Эффективное количество соединения имидазохинолина, например, соединение имидазохинолин-4-амин, такое как 4-амино-2-этоксиметил-α,α-диметил-1Н-имидазол[4,5-с]хинолин-1-этанол (обозначенное R848), может быть от приблизительно 1 до приблизительно 50 мкг/мл культуральной среды, более типично используют от 5 до приблизительно 10 мкг/мл культуральной среды. Соединение имидазохинолин может быть использовано одно или может быть скомбинировано, например, с BCG и/или IFNy или дополнительно с агонистом TLR.

Незрелые DC обычно контактируют с эффективными количествами агента созревания дендритных клеток, например, BCG и IFNy, в течение от приблизительно одного часа до приблизительно 10 часов. Обычно, по меньшей мере, 24-х часовой период инкубации необходим для полного созревания. Более типично от 48 до приблизительно 72 часов инкубации. Незрелые дендритные клетки можно культивировать и подвергнуть частичному созреванию в подходящих условиях для созревания культуры. Подходящая среда для культуры тканей включает AIM-V^®, RPMI 1640, DMEM, X-VIVO 15^® и т.п. Среда для культуры тканей может быть дополнена аминокислотами, витаминами, цитокинами, такими как GM-CSF и/или IL-15, двухвалентными катионами и тому подобное, для активации созревания клеток. Типичная комбинация цитокинов содержит приблизительно 500 единиц/мл GM-CSF и 100 нг/мл IL-15.

Частичное созревание незрелых дендритных клеток может быть проконтролировано методами, известными в области дендритных клеток. Маркеры клеточной поверхности могут быть обнаружены анализами, хорошо известными в данной области, такими как проточная цитометрия, иммуногистохимия и т.п. Клетки могут также быть проконтролированы на продуцирование цитокинов (например, методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), другим иммунным анализом или путем использования олигонуклеотидной матрицы). У DC, культивированных и частично созревших в соответствии с настоящим изобретением в присутствии агента созревания дендритных клеток, такого как GM-CSF и IL-4, уровни фосфорилированной JAK2 (активированная Янус-киназа 2) могут быть измерены для определения инициации созревания методами, хорошо известными в данной области. Индукция экспрессии маркеров клеточной поверхности и цитокинов, также как и фосфорилирование сигнальных молекул, например, jak2, также являются известными в качестве индикатора того, что дендритные клетки будут обуславливать индукцию иммунного ответа после введения этих клеток индивидууму.

Незрелые дендритные клетки подвергают созреванию только в течение периода времени до частичного созревания дендритных клеток. Полностью созревшие DC теряют способность захватывать антиген и обнаруживают повышение экспрессии костимулирующих поверхностных клеточных молекул и различных цитокинов. Конкретно, зрелые DC экспрессируют более высокие уровни МНС - антигенов I и II классов, чем незрелые дендритные клетки и созревшие дендритные клетки, как правило, определяются как CD80⁺, CD83⁺, CD86⁺ и CD14^-. Интенсивная экспрессия МНС ведет к увеличению плотности антигена на поверхности DC, в то время как увеличение экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 усиливает сигнал активации Т-клеток с помощью аналогов костимулирующих молекул, таких как CD28 на Т-клетках. Частично созревшие дендритные клетки, используемые в данном изобретении, обычно включают такие дендритные клетки, которые, как только оказываются под воздействием агента созревания дендритных клеток, демонстрируют увеличение экспрессии костимулирующих молекул, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, CD80, CD86 и/или CD54. Клетка может экспрессировать или может не экспрессировать CD83, но сохраняет способность поглощать и процессировать антиген. Кроме того, частично созревшие дендритные клетки могут продуцировать TNFα, IL-6, IL-10 и или IL-12, которые обычно не продуцируются незрелыми дендритными клетками.

Полностью созревшие дендритные клетки не являются предпочтительными для данного изобретения, поскольку они не эффективно процессируют антиген. Кроме того, незрелые дендритные клетки, используемые в предшествующих способах, являются нежелательными, поскольку известно, что иммуносупрессивная среда, обычно обнаруживаемая внутри опухоли, содержащая существенные концентрации цитокинов, препятствует процессингу антигена незрелыми дендритными клетками. В данном изобретении частичное созревание незрелых дендритных клеток ингибирует цитокиновые рецепторы на поверхности клетки, превращая их в менее чувствительные или реагирующие на любые иммуносупрессивные эффекты цитокинов, которые присутствуют во внутриопухолевом пространстве, и обеспечивает клетками, которые могут эффективно процессировать опухолевые антигены, присутствующие во внутриопухолевом пространстве. Как только частично созревшие дендритные клетки созреют внутри опухоли, что измеряемо по образованию, например, TNFα и IL-12, и экспрессии хемокинового рецептора CCR7, клетки могут мигрировать в лимфоузлы, где клетки будут контактировать с Т-клетками для стимуляции иммунного ответа на опухолевые антигены.

Кроме того, в соответствии с другим аспектом изобретения, DC могут сохраняться, например, при низких температурах, или перед созреванием, или после частичного созревания перед введением пациенту. Агенты для сохранения при низких температурах, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются перечисленным, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль, альбумин, декстран, сахарозу, этиленгликоль, i-эритрит, D-рибит, D-маннит, D-сорбит, i-инозит, D-лактозу, холинхлорид, аминокислоты, метанол, ацетамид, глицеринмоноацетат и неорганические соли. Контролируемая медленная скорость охлаждения может быть критической. Различные криопротекторы и различные типы клеток обычно имеют различные оптимальные скорости охлаждения. Нагрев фазы слияния там, где вода превращается в лед, обычно должен быть минимальным. Процедура охлаждения может быть осуществлена с использованием, например, программируемой морозильной камеры или процедуры с использованием метанольной бани. Программируемые аппараты для замораживания позволяют определять оптимальные скорости охлаждения и обеспечивать стандартное воспроизводимое охлаждение. Программируемые аппараты для замораживания с контролируемой скоростью замораживания, такие как Cryomed или Planar, позволяют настраивать режим замораживания до желаемой кривой скорости охлаждения.

После полного замораживания моноцитарные клетки-предшественники, незрелые DC или частично созревшие DC, могут быть быстро перемещены в сосуд для длительного хранения при низких температурах. В типичном варианте воплощения изобретения, пробы могут криогенно храниться в жидком азоте (-196°С) или в его парах (-165°С). Соображения и процедуры манипуляции, сохранения при низких температурах и длительного хранения гемопоэтических стволовых клеток, в частности из костного мозга или периферической крови, являются в значительной степени применимыми для клеток данного изобретения. Такое обсуждение может быть найдено, например, в следующих ссылках, включенных в данное описание посредством ссылки: Taylor et al., Cryobilogy 27:269-78 (1990); Gorin, Clinics in Haematology 15:19-48 (1986); Bone-Marrow Conservation, Culture and Transplantation, Proceedings of a Panel, Moscow, Jul. 22-26, 1968, International Atomic Energy Agency, Vienna, pp.107-186.

Замороженные клетки предпочтительно быстро оттаивают (например, на водяной бане, поддерживаемой при 37-41°С) и охлаждают немедленно после оттаивания. Может быть желательной обработка клеток для предотвращения агглютинации клеток при оттаивании. Для предотвращения агглютинации могут быть использованы различные процедуры, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, добавление перед замораживанием и/или после замораживания ДНКазы (Spitzer et at., Cancer 45:3075-85 (1980)), добавление низкомолекулярного декстрана и цитрата, гидроксиэтилированного крахмала (Stiff et al., Criobiology 20:17-24 (1983)), и т.п. Криопротекторы, если токсичны для человека, должны быть удалены перед терапевтическим использованием частично созревших DC после оттаивания. Один способ, которым удаляют криопротектор, представляет собой разбавление до ничтожной концентрации. После того как замороженные, частично созревшие DC были оттаяны и восстановлены, они могут быть введены, как описано здесь для незамороженных частично созревших DC.

Ведение in vivo частично созревших дендритных клеток

Предоставляют способы введения частично созревших дендритных клеток или популяции клеток, обогащенной такими клетками и содержащей такие клетки, субъекту, имеющему опухоль. В конкретных вариантах воплощения изобретения такие способы выполняют путем получения предшественников дендритных клеток или незрелых дендритных клеток, дифференциации и частичного созревания таких клеток в присутствии агента созревания дендритных клеток, такого как BCG и IFNy или любого другого агента созревания, типа упомянутых выше. Частично созревшие дендритные клетки могут быть приготовлены с физиологически приемлемыми носителями, наполнителями, буферами и/или разбавителями с использованием способов и композиций, хорошо известных специалистам в данной области. Частично созревшие дендритные клетки могут быть введены непосредственно субъекту, который нуждается в иммуностимуляции. Обычно суспендируют от приблизительно 10² до приблизительно 10¹⁰ клеток в фармацевтически приемлемом носителе. Клетки инъецируют или прямо в опухоль, или в область рядом с опухолью, смежную с опухолью, или в циркуляторный или лимфатический контакт с опухолью, или ложе опухоли для обеспечения клеткам доступа к опухолевым антигенам.

К примеру, но не для ограничения, клетки могут быть введены непосредственно в опухоль, в ложе опухоли после хирургического удаления или резекции опухоли, периопухолево, в дренирующий лимфоузел, непосредственно контактирующий с опухолью, в кровеносный сосуд, или в лимфатический проток, ведущий в опухоль или питающий опухоль или орган, пораженный опухолью, например, воротную вену, или в легочную вену, или артерию и т.п. Введение частично созревших дендритных клеток настоящего изобретения может быть или одновременным с другими лечениями, или после других лечений опухоли, таких как химиотерапия или лучевая терапия. Кроме того, частично созревшие дендритные клетки настоящего изобретения могут быть введены совместно с другим агентом, который действует в качестве адъюванта по отношению к созреванию дендритной клетки и/или процессингу антигена внутри опухоли или области рядом, или прилегающей к опухоли. Кроме того, дендритные клетки могут быть также приготовлены или скомбинированы в виде медленно высвобождающегося матрикса для имплантации в область опухоли, или вокруг опухоли, или ложе опухоли, так, что клетки медленно высвобождаются внутрь опухоли или ложе опухоли для контакта с опухолевыми антигенами.

Частично созревшие дендритные клетки настоящего изобретения могут быть введены любым способом, подходящим для технологии приготовления и способа введения. Например, клетки можно комбинировать с фармацевтически приемлемым носителем и вводить с помощью шприца, катетера, канюли и т.п. Как указано выше, клетки могут быть приготовлены в виде медленно высвобождающегося матрикса. При введении таким образом лекарственная форма может быть введена посредством способа, подходящего для используемого матрикса. Другие методы и способы введения, применимые в данном изобретении, являются хорошо известными специалистам в данной области.

Композиции данного изобретения могут быть использованы в чистом виде при лечении индивидуума. Кроме того, композиции могут быть использованы в сочетании с любым другим способом лечения опухоли. Например, способы данного изобретения могут быть использованы в комбинации с хирургической резекцией опухоли, химиотерапией (цитотоксическими лекарствами, апоптическими агентами, антителами и т.п.), лучевой терапией, криотерапией, брахитерапией, иммунотерапией (введением антиген-специфических зрелых активированных дендритных клеток, NK-клеток, специфических к опухолевым антигенам антител, и так далее), и т.п. Любой из этих способов и все эти способы также могут быть использованы в любой комбинации. Комбинированное лечение может быть одновременным или последовательным и может быть применено в любом порядке, как определено лечащим врачом.

В другом варианте воплощения изобретения дендритные клетки и реципиентный субъект имеют один и тот же МНС(HLA)-галлотип. Способы определения HLA-гаплотипа субъекта являются известными в данной области. В родственном варианте воплощения изобретения частично созревшие дендритные клетки являются аллогенными по отношению к реципиентному субъекту.

Аллогенные клетки являются обычно совместимыми для, по меньшей мере, одной МНС-аллели (например, совместное использование, по меньшей мере, одной, но не всех МНС-аллелей). В менее типичном варианте воплощения изобретения дендритные клетки и репициентный субъект являются полностью аллогенными относительно друг друга, но все имеют, по меньшей мере, одну общую МНС-аллель.

Примеры

Нижеследующие примеры предоставляют исключительно как иллюстративные для различных аспектов данного изобретения и они ни в коем случае не должны быть истолкованы как ограничение изобретения.

Пример 1

В данном примере моноцитарные предшественники дендритных клеток, выделенные тангенциальной фильтрацией в потоке, культивировали при концентрации 10⁶ моноцитов/мл в X-VIVO 15^®, дополненной 2% сывороточным альбумином человека (HAS) и 500 ЕД/мл GM-CSF, в колбах или в контейнерах для клеток. Через 5 дней DC из колб и контейнеров или оставляли необработанными (iDC), или подвергали частичному созреванию в течение 4 часов в присутствии BCG (при разведении 1:400) и y-интерферона (IFNy, 500 ЕД/мл), (pmDC). Клетки собирали, промывали и смешивали в течение 48 часов с равным числом облученных, флуоресцентномеченных опухолевых клеток РКН67-А549. После инкубации клетки отмывали, окрашивали с помощью специфичных к CD11c, меченных фикоэритрином (РЕ) моноклональных антител и анализировали с помощью проточной цитометрии. Значения, представленные в таблице 1, представляют процент клеток CD11c⁺ в пределах DC-щели, которые также были положительными в отношении РКН67-антигена (MFI = значение интенсивности флуоресценции). Контроли включали в себя DC, смешанные с клетками РКН67-А549 непосредственно перед анализом.

Таблица 1
Обработка	% клеток CD11c+ PKH67+	MFI
iDC-колба	87,6	235,2
pmDC-колба	90,7	610,2
iDC-контейнер	72,8	403,5
pmDC-контейнер	91,3	557,5

Эти данные показывают, что в этом анализе частично созревшие дендритные клетки лучше захватывают антиген, чем незрелые дендритные клетки, как определено по процентному содержанию клеток, которые захватывают антиген, или по количеству материала, задержанного опухолевыми клетками.

В другом примере проводили лейкаферез у пациента после операции по удалению опухолевого роста. Из продукта лейкафереза очищали моноциты путем тангенциальной фильтрации в потоке. Очищенные моноциты дифференцировали, как описано выше, и подвергали частичному созреванию экспонированием убитой нагреванием и фиксированной в формалине BCG (5×10⁶ кое/мл) и IFNy (500 ЕД/мл). Частично созревшие дендритные клетки готовили для введения и инъецировали внутрь ложа опухоли индивидуума при ультразвуковом контроле направления. Обнаружили, что дендритные клетки, выделенные из индивидуума, способны к индуцированию опухолеспецифичного Т-клеточного цитотоксического ответа при измерении in vitro. Кроме того, обнаружили, что время рецидива опухоли было предотвращено или существенно замедлено.

Пример 2

В этом примере клетки раковой опухоли кишечника человека трансплантировали мышам для образования опухолевых ксенотрансплантатов хорошо известными способами. После внедрения опухолей животных делили на группы и животным каждой из групп вводили внутрь опухоли или плацебо, незрелые дендритные клетки, или частично созревшие дендритные клетки. Затем измеряли размер опухоли и сравнивали для каждой группы.

Вкратце, карциномы кишечника человека СТ26 внедряли самкам мышей Balb/с путем инъецирования 100000 опухолевых клеток в правый бок под кожу. Лечение начинали на 15-й день, время при котором все мыши имели пальпируемые опухоли размерами, варьирующими между 10 мм² и 45 мм².

Дендритные клетки готовили из костного мозга бедренной кости самок мышей Balb/c исходя из стандартных протоколов. Вкратце, клетки костного мозга после лизиса эритроцитов инкубировали с мышиными GM-CSF (200 ЕД/мл) и IL-4 (200 ЕД/мл) в RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, в течение 13-14 дней, с добавлением свежей среды с цитокинами через 3 и 7 дней. Для получения частично созревших дендритных клеток клетки подвергали 400-кратному разбавлению инактивированными бациллами Кальметта-Герена (BCG), которые имели активность 0,5-1×10⁶ колониеобразующих единиц на миллилитр перед инактивацией, и до 500 единиц мышиного гамма-интерферона (IFNy) на миллилитр. Клетки инкубировали в течение 8 часов, а затем наслаивали поверх 14,5% метризамида и центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 1750 об./мин. Интерфазу собирали, и клетки промывали и замораживали с сохранением жизнеспособности в 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) в емкости с жидким азотом. После оттаивания при 37°С клетки дважды отмывали и ресуспендировали при концентрации 1 миллион клеток на 50 микролитров.

Мышей, несущих опухоль, лечили циклофосфамидом (50 мг/кг) при внутрибрюшинном введении на 15 день и 17. Инъекцию дендритных клеток в опухоль (или имитирующую инъекцию 50 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора, незрелых DC, или созревших в течение 8 часов DC) проводили на 16, 17, 18 и 21 дни. Рост опухоли измеряли через день в течение 60 дней.

В группе, которой внутрь опухоли вводили забуференный фосфатом физиологический раствор, все 4 мыши имели опухоль, большую, чем 100 мм², на 40-й день или перед 40-м днем. В отличие от этого мыши, которым вводили внутрь опухоли незрелые дендритные клетки, имели уменьшенный рост опухоли, а 2 из 4-х мышей имели опухоли размерами меньше, чем 100 мм² на 40-й день. Три из 4-х мышей, которым вводили частично созревшие DC, имели на 40-й день опухоли размерами меньше, чем 100 мм², а двое из этих животных на 50-й день не имели пальпируемых опухолей.

Пример 3

В этом примере клетки раковой опухоли кишечника человека вводили мышам для образования опухолевых ксенотрансплантатов хорошо известными способами. После первого инъецирования опухолевых клеток животным вводили вторую дозу опухолевых клеток. Через 15 дней животных делили на группы, и животным каждой из групп вводили внутрь опухоли или плацебо, незрелые дендритные клетки, или частично созревшие дендритные клетки. Затем измеряли размер опухоли и сравнивали для каждой группы.

Вкратце, карциномы кишечника человека СТ26 внедряли самкам мышей Balb/c путем инъецирования 100000 опухолевых клеток в правый бок под кожу с последующим инъецированием 100000 опухолевых клеток в левый бок на 3-й день. Лечение начинали на 15-й день, время при котором все мыши имели пальпируемые опухоли на правом боку размерами, варьирующими между 10 мм² и 45 мм².

Дендритные клетки готовили из костного мозга бедренной кости самок мышей Balb/c исходя из стандартных протоколов. Вкратце, клетки костного мозга после лизиса эритроцитов инкубировали с мышиными GM-CSF (200 ЕД/мл) и IL-4 (200 ЕД/мл) в RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, в течение 13-14 дней, с добавлением свежей среды с цитокинами через 3 и 7 дней. Для получения частично созревших дендритных клеток клетки подвергали 400-кратному разбавлению инактивированными бациллами Кальметта-Герена (BCG), которые имели активность 0,5-1×10⁶ колониеобразующих единиц на миллилитр перед инактивацией, и до 500 единиц мышиного гамма-интерферона на миллилитр. Затем клетки наслаивали поверх 14,5% метризамида и центрифугировали в течение 15 минут при 4°С и 1750 об./мин. Интерфазу собирали, и клетки промывали и замораживали с сохранением жизнеспособности в 10% диметилсульфоксиде (ДМСО) в емкости с жидким азотом. После оттаивания при 37°С клетки дважды отмывали и ресуспендировали при концентрации 1 миллион клеток на 50 микролитров.

Мышей, несущих опухоль, лечили циклофосфамидом (50 мг/кг) при внутрибрюшинном введении на 15-й день и 17-й. Инъекцию дендритных клеток в опухоль на правом боку (или имитирующую инъекцию 50 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора, незрелых DC, или созревших в течение 8 часов DC, или DC, созревших в течение 24 часов) проводили на 16, 17, 18 и 21 дни. Рост опухоли измеряли через день в течение 60-ти дней.

В группе, которой внутрь опухоли вводили забуференный фосфатом физиологический раствор, все 5 мышей имели на правом боку опухоли размерами больше, чем 100 мм² перед 35 днем, а 3/5 животных имели на левом боку опухоли > 100 мм² на 40-й день или перед 40-м днем. В отличие от этого, мыши, которым вводили внутрь опухоли незрелые дендритные клетки (только в правый бок), имели уменьшенный рост опухоли: одна мышь не имела пальпируемой опухоли ни на одном из боков на 60-й день, а 4 из 5 мышей имели опухоли < 100 мм² на обоих боках на 40-й день. Три из 5 мышей, которым вводили частично созревшие в течение 8 часов DC, имели полностью рассосавшиеся обе опухоли к 50-тому дню. В группе, которой вводили DC, которые частично созревали в течение 24 часов, рост опухоли был уменьшен еще больше. У трех из 5-ти мышей опухоли полностью рассосались с обеих сторон к 50-тому дню, у одного животного полностью рассосалась опухоль на левом боку и частично ликвидировалась опухоль на правом боку (< 100 мм² на 40-й день) и у одного животного частично ликвидировались обе опухоли (< 50 мм² с обеих сторон на 40-й день).

Пример 4

В этом примере использовали опухолевые клетки человека для образования ксенотрансплантантных опухолей у мышей, как описано выше. Дифференцированные незрелые дендритные клетки подвергали частичному созреванию путем воздействия на клетки агентом созревания дендритных клеток, имидазохинолином R898 или R898, в сочетании с BCG и IFNy. Частично созревшие дендритные клетки, незрелые дендритные клетки и плацебо вводили в опухоль, и сравнивали размеры опухолей в каждой группе.

Вкратце, опухоли внедряли мышам как в примере 2. Дендритные клетки готовили как в примерах 2 и 3, но частичного созревания клеток достигали путем экспонирования клеток 5 мкг/мл иммуномодулятора (агента созревания дендритных клеток) R848, или 5 мкг/мл иммуномодулятора R848 вместе с BCG и гамма-интерфероном в концентрациях в соответствии с примерами 2 и 3 в течение 8 часов.

Режим лечения был идентичен режиму в примере 3. Ни одна из мышей, инъецированных внутриопухолево забуференным фосфатом физиологическим раствором, не сдерживала рост опухоли. Только у одной из пяти мышей, которых лечили частично созревшими с R848 DC, полностью останавливался рост опухоли, как это произошло у 3 из 5 мышей, которым вводили внутриопухолево частично созревшими с R848 DC с BCG и IFNy. Девяти мышам примеров 3 и 4, которые имели полностью рассосавшиеся опухоли, вводили приблизительно через 30 дней после рассасывания опухоли в правый бок 1 миллион опухолевых клеток. Ни одно из животных не показывало заметный рост опухоли, проявляя иммунологическую защиту против опухолевых клеток СТ26.

Пример 5

В этом примере дендритные клетки, приготовленные как в вышеприведенных примерах, характеризовали на экспрессию поверхностных молекул. Вкратце, мышиные дендритные клетки, приготовленные как в экспериментах 2-4, характеризовали на экспрессию молекул клеточной поверхности после окрашивания флуоресцентными антителами и анализа проточной цитометрии. Результаты представлены в виде процентного содержания клеток, позитивных в отношении фенотипических поверхностных маркеров, и средней интенсивности флуоресценции для конкретных поверхностных маркеров в таблицах 2 и 3.

Таблица 2
	Процент позитивных клеток
лечение	CD11c	MHC-II	CD80	CD86	CD54	CD40
Незрелые	66,9	68,1	62,2	28,1	62,6	1,4
R848 (8 часов)	60,7	76,4	73,4	31,3	96,6	1,5
BCG/IFN( 8 часов)	59,5	85,5	84,9	66,0	96,0	2,0
BCG/IFN/R848 (8 часов)	58,4	88,8	82,4	61,8	96,6	2,6
BCG/IFN (24 часа)	66,3	91,5	90,0	84,4	95,3	3,3

Таблица 3
	Средняя интенсивность флуоресценции
лечение	МНС-II	CD80	CD86	CD54	CD40
Незрелые	395,7	50,0	30,7	53,8	3,0
R848 (8часов)	515,5	54,7	30,0	90,0	8,0
BCG/IFN (8 часов)	751,1	79,1	74,6	120,3	7,2
BCG/IFN/R848 (8 часов)	757,8	79,3	66,4	132,9	13,9
BCG/IFN (24 часа)	876,8	97,9	99,0	126,9	11,4

Пример 7

Пациента, диагносцированного с солидной опухолью, лечат с помощью химиотерапии, лучевой терапии, криотерапии или брахитерапии и затем частично созревшими дендритными клетками, вводимыми внутриопухолево. После лечения опухоль рассасывается, и пациент защищен от рецидива опухоли.

Предшествующие результаты представлены для иллюстрации, но не для ограничения объема заявленного изобретения. Другие варианты изобретения будут полностью очевидны специалистам в данной области и охватываются прилагаемой формулой изобретения. Все публикации, патенты, заявки на патент и другие ссылки, процитированные здесь, также полностью включены в данное описание путем ссылки.

1. Способ продуцирования противоопухолевого иммунного ответа, отличающийся тем, что дендритные клетки, индуцированные in vitro для инициирования созревания, характеризующиеся способностью захватывать и процессировать антиген in vivo, вводят индивидууму с опухолью.

2. Способ по п.1, где дендритные клетки получают из кожи, селезенки, костного мозга, тимуса, лимфатических узлов, пуповинной крови или периферической крови.

3. Способ по п.2, где дендритные клетки получают от индивидуума, которого будут лечить.

4. Способ по п.2, где дендритные клетки получают от здорового индивидуума, HLA-совместимого с индивидуумом, которого будут лечить.

5. Способ по п.1, где дендритные клетки являются частично созревшими в присутствии агента созревания дендритных клеток.

6. Способ по п.5, где агентом созревания дендритных клеток является бацилла Кальметта-Герена (BCG), y-интерферон (IFNy), липополисахарид (LPS), фактор некроза опухоли a (TNFα), соединение имидазохинолин, искусственный двунитевой полирибонуклеотид, агонист Toll-подобного рецептора (TLR), последовательность нуклеиновых кислот, содержащая неметилированные CpG-мотивы, известные для индукции созревания дендритных клеток, или любая их комбинация.

7. Способ по п.6, где BCG включает целую BCG, элементы клеточной стенки BCG, происходящие из BCG липоарабидоманнаны или компоненты BCG.

8. Способ по п.6, где BCG является термоинактивированной BCG или BCG, обработанной формалином.

9. Способ по п.6, где эффективное количество BCG составляет от приблизительно 10⁵ до 10⁷ КОЕ на миллилитр среды культуры тканей, а эффективное количество IFNy составляет от приблизительно 100 до приблизительно 1000 единиц на миллилитр среды культуры тканей.

10. Способ по п.6, где соединение имидазохинолин представляет собой соединение имидазохинолин-4-амин.

11. Способ по п.10, где соединение имидазохинолин-4-амин означает 4-амино-2-этоксиметил-α,α-диметил-1Н-имидазол[4,5-с]хинолин-1-этанол или 1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин, или их производное.

12. Способ по п.6, где синтетический двунитевой полирибонуклеотид означает poly[l]:poly[C(12)U].

13. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят прямо в опухоль.

14. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят в ложе опухоли после хирургического удаления или резекции опухоли.

15. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят в область тканей, окружающих опухоль.

16. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят в лимфатический узел, непосредственно дренирующий область опухоли.

17. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят непосредственно в кровеносный сосудистый проток, который доставляет кровь или лимфу к опухоли или к органу, пораженному опухолью.

18. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят в кровеносную систему, так что клетки доставляются к опухоли или к органу, пораженному опухолью.

19. Способ по п.1, где частично созревшие дендритные клетки вводят в качестве адъюванта для лучевой терапии, химиотерапии или их комбинации.

20. Способ по п.19, где частично созревшие дендритные клетки вводят перед, одновременно с, или после лучевой терапии, химиотерапии или их комбинации.

21. Композиция, содержащая дендритные клетки, индуцированные in vitro для инициирования созревания, характеризующиеся способностью захватывать и процессировать антиген in vivo, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для введения.

22. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки демонстрируют увеличенную экспрессию костимулирующих молекул CD80, CD86 и/или CD54 и сохраняют способность захватывать и процессировать антиген.

23. Композиция по п.21, содержащая от приблизительно 10² до приблизительно 10¹⁰ частично созревших дендритных клеток.

24. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки сохранялись при низких температурах после частичного созревания.

25. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки выделялись из пациента, которому они должны быть введены.

26. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки были HLA-совместимы с индивидуумом, которому они должны быть введены.

27. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят непосредственно в опухоль.

28. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят в ложе опухоли после хирургического удаления или резекции опухоли.

29. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят в область тканей, окружающих опухоль.

30. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят в лимфатический узел, непосредственно дренирующий область опухоли.

31. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят непосредственно в кровеносный сосудистый проток, который доставляет кровь или лимфу к опухоли, ложу опухоли или к органу, пораженному опухолью.

32. Композиция по п.21, где частично созревшие дендритные клетки вводят в кровеносную систему, так что клетки доставляются к опухоли, ложу опухоли или к органу, пораженному опухолью.