Способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани hep-2

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к области клеточной биологии и экспериментальной онкологии, и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса. Хорионический гонадотропин человека (ХГч) используют для стимуляции патологических процессов и дезорганизации культуры клеток карциномы гортани Нер-2. Изобретение позволяет воздействовать на опухолевые линии типа Нер-2, исключая лимфоцитарное опосредование, а также воздействия гормона через специфические рецепторы и при этом получать признаки дегенерации опухоли в условиях культуры клеток. 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к клеточной биологии и экспериментальной онкологии и может использоваться для разработки новых методов подавления опухолевого процесса как in vitro, так и in vivo.

Хорионический гонадотропин человека (ХГч), как признают многие исследователи [4], обусловливает нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в период эмбриогенеза. В связи с этим было предложено стимулировать эти процессы во многих патологически измененных органах. Так, до сих пор гормон с успехом применяли при лечении фиброзов и циррозов, при этом возрастала митотическая активность гепатоцитов и происходила резорбция соединительной ткани. Считается, что митотический сигнал в данном случае опосредован лимфоцитами. Достоверно известно, что ХГч способен подавлять стимулированную митогеном реакцию бласттрансформации лимфоцитов [5]. Кроме того, гормон способен вызывать миграцию полипотентных стволовых клеток костного мозга в центральные органы иммуногенеза и Т- и В-лимфоцитов в кровоток, но тормозить при этом антителообразование [4]. Замечено, что ХГч обнаруживается не только в сыворотке крови больных с хорионэпителиомой и пузырным заносом, но и с другими опухолями не трофобластического происхождения.

Установлено, что на клетках гемопоэтического ряда (в том числе и при гемобластозах) имеются специфические рецепторы к ХГч [1,5]. После воздействия гормона на такие опухоли последние подвергаются регрессу. Аналогичным ХГч действием обладает и синтетический полипептидный фрагмент β-субъединицы хорионического гонадотропина, состоящий из 18 аминокислотных остатков. В связи с этим рядом авторов было предложено использовать гормон для влияния на лейкозы и саркому Капоши. В отличие от цитостатиков, которые обладают первично повреждающим действием на геном не только опухолевых клеток, но и нормальных, ХГч действует на геном опухолевых клеток только опосредованно, подавляя пролиферацию и дифференцировку этих клеток, тем самым приводит к дезорганизации и дегенерации карциномы.

Культура Нер-2 не является лимфоцитарной, к тому же нет никаких указаний на то, что у карциномы гортани и сходных с ней унифицированных раков длительных сроков культивирования могут быть специфические рецепторы к ХГч. Однако замечено, что даже у опухолей, изначально чувствительных к гормональным воздействиям по неизвестным причинам через несколько пассажей, последняя может резко снижаться. Так, спонтанный рак молочной железы крыс РМК-1, бывший в первых генерациях очень чувствительным к синестролу (95% торможения роста), овариэктомии (60% торможения) и тиофосфамиду (98% торможения), к 10-й генерации полностью утерял эти свойства (13% торможения роста при лечении синестролом и стимуляция роста под влиянием овариэктомии) [6]. Также в условиях монослойной культуры клетки простаты утрачивали способность реагировать на тестостерон. Более того, в культуре клеточные линии могут резко понижать степень дифференцировки. Есть данные о том, что лейкозы в культуре спонтанно приобретали фибробластоподобные черты, причем такое превращение сопровождалось значительным обеднением ультраструктуры клеток: уменьшалось число митохондрий, свободных рибосом, в таких клетках были гораздо слабее выражены гранулярный ретикулум и аппарат Гольджи. И тем не менее, при заражении животных такие клетки давали опухолевый процесс. Некоторые авторы называют эти процессы унификацией. Можно предположить, что Нер-2 в этом отношении является той культурой, которая через 60 лет от начала культивирования сохранила наименее специфические механизмы рецепции митотического сигнала. А это значит, что механизм рецепции митотического сигнала и подавление митотической активности у унифицированных опухолей, таких как Нер-2, будет являться наиболее общим, в связи с чем можно экстраполировать его и на другие раки. К тому же, в условиях культуры клеток исключается воздействие данного гормона на опухоль со стороны иммунологически активных лимфоцитов, что показано в экспериментах И.М. Солопаевой на лимфосаркоме Плисса in vivo [8]. До настоящего времени действие препарата ХГч на культуру Нер-2 неизвестно.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала препаратов, способных подавлять пролиферативную активность и вызывать дезорганизацию и патологические изменения в опухолях типа Нер-2.

Эксперименты выполнены на культуре карциномы гортани Нер-2. Культивирование велось по общепринятым методам работы с монослойными культурами. Клетки поддерживались на пластиковых флаконах 25 см2, 50 мл («Orange Scientific», Бельгия) в смеси из 95% питательной среды Игла MEM и 5% сыворотки эмбрионов коровы производства ООО «Биолот». В культуры добавляли пенициллин в дозе 50 ЕД/мл и стрептомицин в дозе 100 мкг/мл. Для контроля чистоты работ проводили периодические пассажи без антибиотиков. Все манипуляции с культурой и средами выполняли в строго стерильных условиях в операционной под защитой ламинарбокса с горизонтальным потоком воздуха; пересевы выполняли в утренние часы. Для посева новой генерации монослой обрабатывали версеном по щадящему методу, клетки легким встряхиванием переводили во взвесь в небольшое мерное количество свежей теплой (37°C) среды. После подсчета в камере Горяева суспензию разводили до концентрации 50000 клеток в миллилитре, и после добавления определенного количества сыворотки и антибиотиков засевали в новые флаконы, а для цитологического исследования - на половинки покровных стекол, помещенные в пенициллиновые флаконы. Для этого в каждый флакон с помещенной в него половинкой покровного стекла вносили 1 мл клеточной взвеси. В этот же момент ампулу с ХГч разводили оффицинальным физиологическим раствором. В опытные флаконы микропипеткой вносили 50 мкл гормона (50 МЕ/мл смеси), а в контрольные флаконы вносили такое же количество физиологического раствора, но без гормона.

Для цитологического исследования ровно через 24 и 48 часов контрольные и опытные препараты фиксировали в жидкости Карнуа 10 минут, а затем окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином с последующим заключением в глицерин-желатиновую смесь. Для достоверности изучались препараты из разных серий поставленного эксперимента. При этом участки монослоя изучались при помощи светового микроскопа «Микмед-2» (увеличение 15×40). Не мене чем на 6000 клеток подсчитывали число митозов с обязательным выделением патологических форм, а также количество поликариоциотов. Отмечались изменения клеточного пласта, формы клеток. В случае необходимости участок рассматривали более детально под увеличением 15×100 с использованием масляной иммерсии.

Примеры.

Пример 1.

20 октября 2006 года был произведен очередной пересев культуры на покровные стекла. Через 24 часа стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследовано 6280 клеток, причем митотически делящихся всего 160 (25,47‰), из них патологических форм 31 (4,9‰). Количество поликариоцитов составило 106 (16,87‰). Доля патологических митозов в препарате - 19,37%.

Пример 2.

15 октября 2006 г.был произведен пересев культуры на покровные стекла. В ряд тест-флаконов внесено по 50 ME гормона. Через 48 часов стекло с клетками фиксировали в жидкости Карнуа, а потом окрашивали железным гематоксилином Вейгарта и эозином. Препарат заключали в глицерин-желатиновую смесь. Исследована 6351 клетка, причем митотически делящихся было 253 (39,8‰), из них патологических форм 86 (13,5‰). Количество поликариоцитов составило 162 (25,5‰). Доля патологических митозов в препарате - 33,99%.

Результаты исследований приведены в таблицах 1 и 2. Как видно из таблиц, митотическая активность контрольных культур (фиг.1) с течением времени возрастает от 27,29±1,36‰ до 45,55±1,34‰. Число патологических митозов в них также держится в пределах среднестатистической для этой культуры нормы [2]. Такой показатель, как симпластообразование, для оценки жизнеспособности опухолевой культуры в литературе встречается редко. Похожие данные отмечены для цитопатического действия различных штаммов вируса полиомиелита [2]. Наличие таких постклеточных структур, существенно отличных по морфологии от исходной линии, в данном случае можно считать признаками дезорганизации клеточной культуры.

Культуры после воздействия хорионического гонадотропина имеют характерный вид: помимо возрастания количества поликариоцитов (фиг.2), которые ряд авторов расценивают как одну из патологических форм клеточного деления [2], изменения митотического индекса, распадаются клеточные комплексы - «островки роста», что является похожим на слабые радиационные поражения [3]. Клетки округляются, но одновременно с этим у них появляются тонкие псевдоподии. Это бывает, когда клетка совершает перемещение по поверхности.

Таблица 1

Показатели митотической активности клеток культуры через 24 часа после введения хорионического гонадотропина человека
ПоказателиКонтроль, М±mОпыт, М±mПроцент отличийДостоверность
Митотический индекс27,29±1,36‰24,67±1,83‰9,6>0,05
Нормальные митозы20,65±0,58‰16,1±0,93‰22,0≤0,003
Патологические митозы6,54±1,02‰8,55±2,363‰23,5>0,05
Процент патологических митозов23,6±5,317%34,27±4,509%45,2<0,01
Поликариоциты16,2±0,315‰26,53±1,69‰63,8<0,001
Таблица 2

Показатели митотической активности клеток культуры через 48 часов после введения хорионического гонадотропина человека
ПоказателиКонтроль, М±mОпыт, М±mПроцент отличийДостоверность
Митотический индекс45,55±1,34‰37,72±1,08‰17,2<0,01
Нормальные митозы35,91±1,12‰24,55±1,0‰31,6<0,01
Патологические митозы9,63±0,36‰13,17±0,82‰36,7<0,05
Процент патологических митозов21.01±0,84%34,92±1,93%65,9<0,05
Поликариоциты14,19±1,61‰25,4±1,88‰79,0<0,01

Наряду с этим возрастает доля патологических митозов на 45 - 65% от исходного уровня. Митотический индекс при этом снижается в рамках от 9% до 17%.

Причины таких изменений еще не до конца определены. Будучи гормоном, определяющим нормальную пролиферацию и дифференцировку клеток в эмбриогенезе, ХГч ответственен за эти же процессы и во взрослом организме. Отсутствие у клеточной культуры Нер-2 специфических рецепторов, характерных только для гонадотропинов, еще не является преградой для проявления таких эффектов. Так, по данным Peter Petrusz, Madhabananda et al., [7], при помощи авторадиографических и гистохимических методов ХГч удалось обнаружить «...в желтом теле яичников, в интерстициальных клетках, в некоторых развивающихся фолликулах, а также в стенке (преимущественно в гладкомышечных клетках) мелких артериол стромы яичников...». Кроме того, по данным этих же авторов, гормон способен проникать через клеточную стенку не только в цитоплазму, но и в ядро.

Следовательно, помимо доказанного ранее лимфоцитарно-опосредованного действия на опухоль гормон способен оказывать действие на процессы экспрессии некоторых генов, определяющих в том числе дифференцировку и пролиферацию клеток. Такое воздействие возможно через активацию системы антионкогенов, которые способны привести клетку к апоптозу или же затормозить митотический процесс через его нарушение, создав различные летальные формы клеточного деления, что и показано в данном техническом решении.

Литература

1. Биологическое действие хорионического гонадотропина и его синтетического пептидного фрагмента на клеточную линию HL-60./ Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Макаров Е.В., Сухих Г.Т. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

2. Блюмкин В.Н., Жданов В.М. Влияние вирусов на хромосомный аппарат и деление клеток. М.: Медицина, 1973 - 266 с.

3. Влияние γ-облучения в различных режимах на образование клеточных комплексов в популяции клеток культуры HeLa. / Г.А. Бажутова, Г.С. Календо, А. С. Ягубов и др. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №4.

4. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в биологии и медицине. - Н.Новгород: Изд.-во ННГУ, 2000. - 191 с.

5. Синтетический пептид - фрагмент бета-субъединицы хорионического гонадотропина угнетает митогенстимулированную пролиферацию лимфоцитов человека in vitro. / Валуйских А.Н., Ромашкова Ю.А., Данилкович А.В., Фрезе К.В., Сухих Г.Т., Макаров Е.В. // Бюл. эксп. Биол. и мед., - 1997, №3.

6. Химиотерапия злокачественных опухолей. А.К.Белоусова, Н.Н.Блохин, В.И.Борисов и др. / Под ред. Н.Н.Блохина. М.:Медицина, 1977, с.320, ил.

7. Рецепторы клеточных мембран для лекарств и гормонов: междисциплинарный подход: Пер. с англ./ Под ред. Р.У. Штрауба, Л. Болисс.- М.: Медицина, 1983, - 368 с., ил.

8. Солопаева И.М. (RU); Новиков В.В. (RU); Иванова Н.Л. (RU); Аксенова Т.В. (RU) Средство для торможения митотической активности клеток лимфосаркомы Плисса.

Способ модуляции патологических процессов и дезорганизации в культуре клеток карциномы гортани Нер-2, предусматривающий использование хорионического гонадотропина человека.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к способу получения трипептидов Ac-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH и Boc-D-2Nal-D-4ClPhe-D-3Pal-OH, которые представляют собой промежуточные соединения в синтезе аналогов рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), путем сочетания с подходящими гептапептидами, в частности с гептапептидами P1-Ser(P 2)-NMeTyr(P3)-D-Lys(Nic)-Leu-Lys(iPr,P 4)-Pro-D-AlaNH2 и P 1-Ser(P2)-NMeTyr(P 3)-D-Asn-Leu-Lys(iPr,P4)-Pro-D-AlaNH 2.

Изобретение относится к области медицины и касается высокостабильного фармацевтического компонента, включающего пептид паратиреоидного гормона человека или его производное и уксусную кислоту, содержащуюся в количестве, меньшем ее химического эквивалента по отношению к пептиду паратиреоидного гормона человека или его производному.

Изобретение относится к новым антагонистам LHRH и комплексам между этими антагонистами и VВ12. .

Изобретение относится к пептидным соединениям, а именно к декапептидам формулы I: Х-Х1-X2-Х3-Ser-Tyr-Х6 -Leu-X8-Pro-X10 (I), где Х- ацил; X1=D-Nal; Х2=D-Cpa; Х3=D-Рal; Х6=D-Cit; D-Hei, D-Orn, D-Lys, D-Neu; Х8= Orn, Arg, Lys, L-Neu ; X10= D-AlaNH2, Neu является остатком формулы IX или IV; Z - группа -O- или -S-, п = 1-6.

Изобретение относится к новым соединениям формулы (1): и к его фармацевтически приемлемым солям; где В, X, А или V отсутствуют, если Z1, Z 2, Z3 или Z4 соответственно представляют N и независимо Н, атом галогена, азидо, R2, CH2R 2, SR2, OR2 или NR1R2, когда Z1, Z2, Z 3 или Z4 представляют С; где в каждом NR1R2, R 1 и R2 вместе с N могут образовывать необязательно замещенное пиперидиновое, пирролидиновое, пиперазиновое или морфолиновое кольцо; Z1 представляет собой N и Z2, Z и Z4 представляют С, или Z1 и Z 3 представляют N и Z2 и Z 4 представляют С; W вместе с N и Z образуют необязательно замещенное тиазольное, имидазольное или пиримидиновое кольцо, которое конденсировано с необязательно замещенным кольцом, выбранным из группы, состоящей из: или U представляет NR1R 2, NR1-(CR1 2)n-NR 3R4, где в NR3 R4, R3 и R 4 вместе с N могут образовывать необязательно замещенное пиперидиновое, пирролидиновое, пиперазиновое или морфолиновое кольцо; R1 и R3 независимо представляют Н или С1-6алкил; каждый R 2 представляет Н или С1-10алкил, каждый необязательно замещенный атомом галогена, или С 3-6циклоалкил, арил, гетероарил или пиридиновое, пирролидиновое, пиперазиновое или морфолиновое кольцо, где каждое кольцо необязательно замещено; или R2 необязательно замещен пиперидином, пирролидином, пиридином, пиперазином, пиразином, морфолином или бензимидазолом; R4 представляет Н или С1-10алкил; каждый R 5 представляет заместитель в любом положении в кольце W; и является Н, OR2, амино, алкокси, амидо, атомом галогена или циано; или R5 представляет С1-6алкил, -CONHR1 -, каждый необязательно замещенный атомом галогена; или два смежных R5 связаны с образованием 5-6-членного кольца, необязательно замещенного гетероциклического кольца, выбранного из пиперидинового, пирролидинового, пиперазинового или морфолинового кольца; n равно 1-6; и каждая, необязательно замещенная, часть может быть замещена одним или несколькими галогенами, OR2, NR1R 2, карбаматом, С1-10алкилом, каждый, необязательно замещенный атомом галогена, С=O, циано, нитро, COR2, NR2COR 2, сульфониламидами; NR2SOOR 2; SR2, SOR2 , COOR2, CONR2 2, OCOR2, OCOOR2 или OCONR2 2.

Изобретение относится к новым соединениям общей формулы (I), в которой X1 представляет фенил, 9-членный бициклический гетероарил, содержащий S или О в качестве гетероатомов, или 5-членный гетероарил, содержащий S или О в качестве гетероатомов, каждый из которых необязательно замещен одним или более заместителями, выбранными из галогена или C1-6алкила, который необязательно замещен одним или более галогенами; и Х 2 представляет фенил, который необязательно замещен одним или более заместителями, выбранными из галогена, или 5-членный гетероарил, содержащий S или О в качестве гетероатомов; и Ar представляет фенилен, который необязательно замещен одним или более заместителями, выбранными из галогена; или C 1-6алкила, фенила, С1-6алкокси, каждый из которых необязательно замещен одним или более галогенами; и Y1 представляет О или S; и Y 2 представляет О; и Z представляет -(СН 2)n-, где n равно 1, 2 или 3; и R 1 представляет водород или С1-6алкокси; и R2 представляет водород, C 1-6алкил; или к их фармацевтически приемлемым солям или любым таутомерным формам, стереоизомерам, смесям стереоизомеров, включая рацемические смеси.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунотерапии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении сарком мягких тканей. .

Изобретение относится к области медицины и фармацевтики и касается средства, обладающего противоопухолевым действием, содержащего в качестве активного вещества 7-(диэтиламидо)-этилтионфосфат 2,3-дигидрокверцетина, и способа его получения путем взаимодействия дигидрокверцетина с тетраэтилдиамидоэтилфосфитом в среде диоксана с последующей обработкой порошковой серой.

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам широкого спектра действия, применяемым для лечения онкологических заболеваний. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в комплексном лечении рака прямой кишки при выведенной двуствольной колостоме. .

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии. .
Изобретение относится к медицине, в частности к гинекологии, и может быть использовано при лечении женского бесплодия. .
Наверх