Количественное определение токсина ботулизма

Изобретение относится к области медицины. Способ определения количеств вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение (а именно токсина ботулизма типа А или В, в частности бунгаротоксина и α-бунгаротоксина), включает в себя следующие стадии: (i) определение минимального напряжения V_m, необходимого для индуцирования сокращения мышечной ткани, указанная мышечная ткань является соединенной с электрическим стимулятором посредством двигательного нерва и предпочтительно погружена в оксигенированный физиологический буфер, содержащий глюкозу; (ii) добавление образца, содержащего вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение; (iii) электрическое стимулирование, при напряжении, по меньшей мере, равном V_m, мышечной ткани через определенные интервалы времени; (iv) сравнение эффекта, индуцируемого образцом, с эффектом, индуцируемым эталонным веществом, и тем самым определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа, определение активного токсина ботулизма при более низких его концентрациях. 1 н. и 13 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Настоящее изобретение относится к способу определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, содержащегося в образце.

Определение количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, содержащегося в образце, как правило, осуществляется посредством измерения летальной дозы LD₅₀ для этого вещества на мышах или крысах. Этот способ, в частности, используется в настоящее время для определения количества активного токсина ботулизма. Такие способы определения LD₅₀ предполагают большое количество погибших животных.

Настоящее изобретение предлагает новый способ, который сохраняет жизнь значительному количеству животных, по сравнению с обычными способами определения LD₅₀.

Соответственно в соответствии с настоящим изобретением предусматривается способ для определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце, который включает в себя следующие стадии:

(i) определения минимального напряжения V_m, необходимого для индуцирования сокращения мышечной ткани, где указанная мышечная ткань является соединенной с электрическим стимулятором посредством двигательного нерва;

(ii) добавления образца, содержащего вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение;

(iii) электрического стимулирования при напряжении, по меньшей мере, равном V_m, мышечной ткани через определенные интервалы времени;

(iv) сравнения эффекта, индуцируемого образцом, с эффектом, индуцируемым эталонным веществом, и тем самым определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце.

Под веществом, пресинаптически блокирующим нервно-мышечное соединение, в настоящей заявке должно пониматься вещество, которое предотвращает и/или ингибирует передачу химических сообщений и сигналов, участвующих в пресинаптической нервно-мышечной активности. Примеры веществ, пресинаптически блокирующих нервно-мышечное соединение, представляют собой вещества, которые ингибируют синтез или высвобождение ацетилхолина (ACH); они включают в себя известные биологические токсины (такие как нейротоксины ботулизма и бунгаротоксины) и химические вещества (такие как гемихолин или триэтилхолин, которые ингибируют синтез ACH, аминогликозидные антибиотики, которые ингибируют высвобождение ACH, или тубокурарин и подобные соединения). Предпочтительные вещества, пресинаптически блокирующие нервно-мышечное соединение, в соответствии с настоящим изобретением будут представлять собой нейротоксины ботулизма и бунгаротоксины (среди бунгаротоксинов, предпочтительным является α-бунгаротоксин).

Под нейротоксинами ботулизма (или токсинами ботулизма) в настоящей заявке подразумеваются комплексы нейротоксина ботулизма (либо типа A, B, C, D, E, F либо G), а также нейротоксины ботулизма высокой чистоты (либо типа A, B, C, D, E, F либо G). Токсин ботулизма типа A включает в себя все типы токсина ботулизма типа A, включая A1, A2 и A3.

Под комплексом нейротоксина ботулизма (либо типа A, B, C, D, E, F либо G) в настоящей заявке должен пониматься нейротоксин ботулизма (либо типа A, B, C, D, E, F либо G), ассоциированный, по меньшей мере, еще с одним нетоксичным белком.

Под нейротоксином ботулизма высокой чистоты (либо типа A, B, C, D, E, F либо G) в настоящей заявке подразумевается нейротоксин ботулизма (либо типа A, B, C, D, E, F либо G) вне комплексов, содержащих, по меньшей мере, еще один белок. Другими словами, нейротоксин ботулизма высокой чистоты (типа A, B, C, D, E, F либо G) не содержит значительных количеств какого-либо иного белка, полученного из Clostridium spp, кроме нейротоксина ботулизма (типа A, B, C, D, E, F либо G).

Под мышечной тканью в настоящей заявке подразумевается образец мышечных волокон, содержащий одно или несколько мышечных волокон.

Предпочтительно мышечная ткань погружается в буфер, такой как физиологический буфер. Такой буфер может содержать источник энергии. Источник энергии может представлять собой источник энергии на основе АТФ, например, один или несколько источников из следующих: АТФ, сахар, такой как глюкоза и/или креатин (включая креатин фосфат), жирную кислоту, аминокислоту, гликоген и пировиноградную кислоту. Буфер может быть оксигенированным, в особенности для более продолжительных анализов.

В предпочтительном варианте осуществления буфер представляет собой оксигенированный физиологический буфер, содержащий глюкозу.

Буфер, в который погружают мышечную ткань, предпочтительно будет содержать, по меньшей мере, 10 мМ глюкозы (например, 11 мМ). Предпочтительно также буфер будет насыщаться кислородом (например, посредством барботирования через буфер кислорода или смеси 95/5 O₂/CO₂). Кроме того, буфер предпочтительно будет содержать от 100 до 200 мМ NaCl, от 1 до 5 мМ KCl, от 10 до 15 мМ NaHCO₃, от 0,5 до 2 мМ MgCl₂ и от 1 до 5 мМ CaCl₂. pH буфера предпочтительно будет составлять примерно 7,4.

Предпочтительно способ будет таким, что электрическое стимулирование стадии (iii) осуществляется при напряжении, по меньшей мере, равном сверхмаксимальному напряжению V_SM. ПОД сверхмаксимальным напряжением понимается минимальное напряжение для получения максимального судорожного отклика мышечной ткани.

В соответствии с первым вариантом настоящего изобретения (в дальнейшем вариант A) индуцируемый эффект, используемый для сравнения на стадии (iv) способа, представляет собой время до паралича мышечной ткани (также называемое в настоящей заявке "время жизни"). В соответствии с подвариантами время до паралича может определяться на основе (вариант A1) расстояния (амплитуды) сокращения мышцы (паралич наступает, когда расстояние сокращения равно нулю) или (вариант A2) на основе частоты судорожных сокращений мышцы (паралич наступает, когда частота сокращений равна нулю).

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения (в дальнейшем вариант B) индуцируемый эффект, используемый для сравнения на стадии (iv) способа, представляет собой изменение скорости сокращения мышечной ткани.

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения (в дальнейшем вариант C) индуцируемый эффект, используемый для сравнения на стадии (iv) способа, представляет собой изменение расстояния (амплитуды) сокращения мышечной ткани.

В соответствии еще с одним вариантом настоящего изобретения (в дальнейшем вариант D) индуцируемый эффект, используемый для сравнения стадии (iv) способа, представляет собой изменение силы сокращения мышечной ткани.

В соответствии с дополнительным вариантом настоящего изобретения (в дальнейшем вариант E) индуцируемый эффект, используемый для сравнения на стадии (iv) способа, представляет собой изменение потенциала концевой пластинки или потенциала миниатюрной концевой пластинки мышечной ткани.

Сочетания вариантов A (включая их подварианты), B, C, D и E могут использоваться специалистом в данной области для достижения улучшения точности полученныхрезультатов. Например, специалист в данной области может предположить сочетание подварианта A1 и подварианта A2.

Предпочтительно вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение, будет представлять собой нейротоксин ботулизма. В частности, нейротоксин ботулизма может выбираться из нейротоксина ботулизма типа A, нейротоксина ботулизма типа B и нейротоксина ботулизма типа F. Более предпочтительно нейротоксин ботулизма будет выбираться из нейротоксина ботулизма типа A и нейротоксина ботулизма типа B. В особенно предпочтительном способе нейротоксин ботулизма будет представлять собой нейротоксин ботулизма типа A, в частности комплекс нейротоксина ботулизма типа A (подобный активным компонентам коммерческих продуктов Dysport® или Botox®).

В общем способ будет более чувствительным при более низких концентрациях (например, от 0 до 100 единиц LD₅₀/мл, а предпочтительно от 0 до 50 или от 0 до 10 единиц LD₅₀/мл), хотя он может не работать, когда в образце присутствуют высокие концентрации веществ, пресинаптически блокирующих нервно-мышечное соединение (мышечная ткань остается парализованной несмотря на электрическое стимулирование). Как следствие образец, который должен анализироваться, предпочтительно будет приготавливаться, по меньшей мере, в двух или трех разбавлениях (например, неразбавленный, разбавленный в 10 раз и разбавленный в 100 раз), на которых будет осуществляться способ по настоящему изобретению; таким путем могут также определяться более высокие концентрации веществ, пресинаптически блокирующих нервно-мышечное соединение. Однако чувствительность способа, описываемого ранее, может быть улучшена, как рассмотрено ниже.

В соответствии с предпочтительным способом осуществления настоящего изобретения мышечная ткань будет состоять из куска межреберной мышцы, полученной от мыши или крысы. Предпочтительно этот кусок будет иметь размеры, по меньшей мере, 2 мм на 10 мм. Мышечная ткань может, например, иметь размер, соответствующий секции межреберной мышцы между 2 ребрами.

В соответствии с другим предпочтительным способом осуществления настоящего изобретения каждое электрическое стимулирование будет всегда состоять в приложении напряжения V_S, которое, по меньшей мере, равно минимальному напряжению V_m, которое необходимо для индуцирования сокращения мышечной ткани, V_S является большим или равным напряжению, которое слегка превышает V_m. Напряжение, которое слегка превышает V_m, может быть равно V_m плюс 3 вольта, V_m плюс 2 вольта или V_m плюс 1,5 вольта. Например, прикладываемое напряжение стимулирования может быть выбрано как V_m плюс 1 вольт.

Дополнительные возможные особенности настоящего изобретения включают в себя использование видеокамеры, объединенной с видеомагнитофоном. Полученные фильмы могут затем анализироваться и эффект вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, оцениваться точно. Количество вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, присутствующего в образце, затем может быть получено из эффекта, наблюдаемого для образца, по сравнению с тем, который наблюдается для эталона.

Альтернативно для варианта D, обсуждаемого выше, преобразователь силы в смещение, используемый для измерения силы сокращения мышечной ткани, может быть связан с автоматической электронной системой обработки данных в реальном времени.

Для уменьшения разброса результатов электрический стимулятор будет посылать через заданные интервалы времени выбранное напряжение V_S, которое каждый раз будет оказывать определенное воздействие. Использование усредненного эффекта, наблюдаемого в этих условиях, даст возможность для осуществления более точного определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, присутствующего в образце.

Один из способов увеличения чувствительности способа заключается в осуществлении способа в течение более продолжительного периода времени, дающее возможность получения большего количества данных (например, в течение периода, по меньшей мере, от 5, 10 или 30 минут и до 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 часов или даже больше). Например, для варианта D способа способ мог бы осуществляться до тех пор, пока не будет измерено уменьшение силы сокращения мышечной ткани в определенной пропорции (например, уменьшение на 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 или 90%).

Для осуществления этого предпочтительного способа осуществления время жизни мышечной ткани должно быть увеличено по сравнению с более общим способом, объяснявшимся ранее.

В одном из конкретных подходов, предназначенных для увеличения указанного времени жизни, к мышечной ткани регулярным образом подводятся кислород и глюкоза (или другой источник АТФ).

Один из способов для достижения этого заключается в замене через регулярные интервалы времени ванны с оксигенированным физиологическим буфером, содержащим глюкозу (или другой источник АТФ), на новую, для восполнения потребленного кислорода и глюкозы (или другого источника АТФ), (где указанные интервалы времени предпочтительно составляют не меньше, чем 1 минуту и не больше чем 24 часа, например каждые 1, 2, 5, 10, 15 или 60 минут). Другой способ состоит в использовании ванны, в которой непрерывно барботируется кислород, что позволяет поддерживать концентрацию кислорода в ванне постоянной; кроме того, глюкоза (или другой источник АТФ) может добавляться через регулярные интервалы времени для восполнения глюкозы (или другого источника АТФ), потребленной мышечной тканью.

Альтернативно может использоваться система с проточной ванной, которая имеет преимущества поддержания постоянных уровней глюкозы (или другого источника АТФ) и, необязательно, кислород, что позволяет поддерживать концентрацию кислорода в ванне постоянной; кроме того, глюкоза (или другой источник АТФ) может добавляться через регулярные интервалы времени для восполнения глюкозы (или другого источника АТФ), потребленной мышечной тканью.

Альтернативно может использоваться система с проточной ванной, которая имеет преимущества поддержания постоянных уровней глюкозы (или другого источника АТФ) и необязательно кислорода. В этой системе оксигенированный физиологический буфер, содержащий глюкозу (или другой источник АТФ), закачивается на одном краю емкости, в которой погружена мышечная ткань, и откачивается на другом краю.

Другие средства для увеличения времени жизни мышечной ткани включают в себя использование стимулирования последовательностями импульсов, которое уменьшает деградацию образца. Под стимулированием последовательностями импульсов подразумеваются стимулирования, продолжающиеся в течение времени t_s, отделенные друг от друга периодами, продолжающимися время t_p, в течение которых стимулирование не осуществляется. Время t_s предпочтительно будет составлять от 50 мкс до 500 мс, более предпочтительно от 100 мкс до 250 мс, и еще более предпочтительно от 100 мкс до 1 мс (например, 200 мкс или примерно 200 мкс); время t_p будет предпочтительно равно от 0,1 до 10 с, более предпочтительно от 0,5 и 2 с (например, 1 с или примерно 1 с); отношение t_s/t_p предпочтительно будет составлять от 1:2 до 1:50000, более предпочтительно от 1:5 до 1:20000, еще более предпочтительно от 1:500 до 1:10000 (например, примерно интервалы времени;

(iv) сравнения эффекта, индуцируемого смесью, с эффектом, индуцируемым определенным количеством указанного вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, и тем самым определения количества нейтрализующих антител к веществу, пресинаптически блокирующему нервно-мышечное соединение, в образце.

Все варианты, указанные ранее, для способа определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце являются применимыми при соответствующих измененияхк способу по настоящему изобретению для определения количества нейтрализующих антител к веществу, пресинаптически блокирующему нервно-мышечное соединение, в образце.

Термин "примерно" относится к некоторому интервалу вокруг рассматриваемого значения. Как используется в настоящей заявке на патент, "примерно X" означает интервал от X минус 10% до X плюс 10%, а предпочтительно интервал от X минус 5% до X плюс 5%.

Если они не определяются иным образом, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, как и то, которое обычно понимается специалистом в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Подобным же образом все публикации, заявки на патенты, все патенты и все другие ссылки, рассмотренные здесь, включаются в качестве ссылок.

Следующие далее примеры представлены для иллюстрации того, что представлено выше, и не должны ни в коем случае рассматриваться как ограничивающие рамки настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

Фиг.1 показывает относительное расстояние (амплитуда) сокращения межреберного препарата крысы, измеренное как функция времени, при различных концентрациях Dysport® (0, 1,10 и 50 ед.), в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. Ось X показывает время (с), в то время как ось Y показывает расстояние (нормированное на начальную величину сокращения).

Фиг.2 изображает время жизни межреберного препарата крысы, измеренное по расстоянию сокращения, для различных концентраций Dysport" (0, 1, 10 и 50 ед.), в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. Приведенные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка средней, n=4-5. Ось X показывает концентрацию Dysport (единицы LD₅₀/мл), в то время как ось Y показывает время (с).

Фиг.3 представляет время жизни межреберного препарата крысы, измеренное по частоте сокращений, для различных концентраций Dysport® (0, 1, 10 и 50 ед.), в соответствии с процедурой, описанной в примере 1. Приведенные данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка средней, n=4-5. Ось X показывает концентрацию Dysport (единицы LD₅₀/мл), в то время как ось Y показывает время (с).

Фиг.4 изображает секцию ткани между 2 ребрами, прикрепленную к преобразователю силы в смещение, в статичной установке ванны.

Фиг.5 изображает время (часы), занимаемое измерениями максимальной силы сокращений секции между 2 ребрами, экспонируемыми либо для плацебо либо для 500, 1000, 1500 или 3000 ед. токсина, с использованием непосредственного применения способа примера 3 в статичной системе (применяются следующие количества экспериментов n: плацебо: n=4; 500 ед.: n=8; 1000 ед.: n=5; 1500 ед.: n=11). Столбики ошибок иллюстрируют ± стандартная ошибка средней. Ось X показывает % уменьшения максимальной силы сокращений, в то время как ось Y показывает время (часы).

Фиг.6 изображает время (часы), занимаемое измерениями максимальной силы сокращений секции между 2 ребрами, экспонируемыми либо для плацебо либо для 3, 6 или 12 ед./мл токсина, с использованием способа погружения примера 3 в статичной системе (применяются следующие количества экспериментов n: плацебо: n=3; 3 ед./мл: n=5; 6 ед./мл: n=2; 12 ед./мл: n=2). Столбики ошибок иллюстрируют ± стандартная ошибка средней. Ось X показывает % уменьшения максимальной силы сокращений, в то время как ось Y показывает время (часы).

ПРИМЕРЫ

В следующих далее примерах 1 единицаSpeywood или 1 ед. соответствует медианной внутрибрюшинной дозе LD₅₀ токсина ботулизма для мышей.

Пример 1: Образец, содержащий токсин ботулизма

Используемые материалы

a) Используемые буферные растворы:

Модифицированный буфер Рингера, индентифицируемый далее как "буфер Рингера-Лилли", приготавливают посредством разведения следующих компонентов в воде:

NaCl	138,8 мМ
KCl	4 мМ
NaHCO3	12 мМ
KH2PO4	1 мМ
MgCl2	1 мМ
CaCl2	2 мМ

Непосредственно перед использованием, к раствору, приготовленному ранее, добавляют глюкозу (11 мМ) и барботируют газовую смесь из 95% O₂ и 5% CO₂ через буферный раствор с получением буфера Рингера-Лилли.

Фосфатный солевой буферный раствор (PBS), упоминаемый в дальнейшем, приготавливают посредством растворения таблетки, поставляемой Sigma, которая при добавлении к 200 мл воды обеспечивает следующие характеристики буфера:

Фосфатный буфер	0,01 М
KCl	0,0027 M
NaCl	0,137 M
pH при 25°С	7,4

b) Выделение ткани:

Крыс Wistar (примерная масса 275 г) забивают путем скручивания шеи после экспонирования под CO₂ (приблизительно 3 мин с индуцированием потери сознания). Грудную клетку каждого животного иссекают, помещают в буфер Рингера-Лилли и переносят на место эксперимента (время переноса: приблизительно 15 мин). Затем грудную клетку разделяют на две секции посредством осторожного рассечения вдоль позвоночного столба. Ткани хранят в оксигенированном буфере до осуществления экспериментальных процедур.

c) Определение минимального напряжения V_m, необходимого для индуцирования мышечных сокращений:

Каждый межреберный препарат (половину грудной клетки) помещают в чашку Петри, содержащую буфер Рингера-Лилли. Для каждого препарата, по одному межреберному нерву осторожно иссекают для получения приблизительно 1-2 мМ нервного пучка. После иссечения препарат может быть восстановлен в свежем оксигенированном буфере Рингера-Лили, в течение приблизительно 15-20 минут перед возвращением в чашку Петри, содержащую 10 мл оксигенированного буфера Рингера-Лилли. Затем иссеченный межреберный нерв соединяется посредством присасывающегося электрода со стимулятором (Grass Instruments Model S48), при этом обратный контактный электрод помещают в среду. Определяют минимальное напряжение V_m, необходимое для индуцирования мышечных сокращений. Если не достигается стимулирования ниже 10 В, иссекают другой нерв, и препарат восстанавливают перед продолжением.

Способ для определения количества токсина ботулизма, содержащегося в образце

Нерв стимулируют импульсным напряжением (5-9 В, 1 Гц), причем напряжение всегда выбирают на 1 В больше, чем пороговое напряжение V_m, необходимое для достижения стимулирования и мышечного сокращения. Видеомикроскопию секции осуществляют с помощью стереомикроскопа Nikon SMZ800, оснащенного видеокамерой JVC TKC1481EG, соединенной с объединенным ТВ/видеомагнитофоном.

Dysport® (активный компонент: токсин ботулизма типа A) добавляют в PBS непосредственно над межреберным препаратом (слегка погруженным в 10 мл буфера). Для дозы 50 единиц Speywood (ед.) на мл, 500 ед. токсина добавляют в чашку с культурой (10 мл буфера), с получением конечной концентрации 50 ед./мл. Для 10 дозы ед./мл, 100 ед. добавляют в чашку с культурой, с получением конечной концентрации 10 ед./мл. Для дозы 1 ед./мл 10 ед. добавляют в чашку с культурой, с получением конечной концентрации 1 ед./мл. Для плацебо (которое имеет такую же композицию, как и Dysport®, за исключением того, что токсин ботулизма отсутствует), все содержание флакона (в 0,2 мл PBS) добавляют в чашку с культурой.

Анализ данных

Полученные видеоклипы преобразуют в файлы MPEG. Чтобы помочь последующему анализу, каждый фильм разделяют на 2-минутные отрезки, и эти отрезки замедляют до 1/2 от их начальной скорости,используя программное обеспечение Adobe® Premiere® 5.1. Затем осуществляют анализ путем подсчета количества судорог за период 10 с (20 с на клипах с половинной скоростью) и усреднения количества судорог по этому 10-секундному периоду времени, для получения значения частоты дрожи. Расстояние сокращения может также измеряться посредством просмотра фильма с наложенной масштабной линейкой (с произвольными единицами - с номиналом шкалы 6-7 точек), данные усредняются с получением расстояния сокращения в течение каждого 10 с периода или альтернативно, указанное расстояние сравнивают с начальным расстоянием сокращения.

Эксперименты повторяют определенное количество раз (0 ед./мл: n=5; 1 ед./мл: n=5; 10 ед./мл: n=4; 50 ед./мл: n=4) и результаты усредняют.

Результаты

Из фиг.1 видно, что относительное расстояние сокращения (то есть расстояние сокращения в присутствии токсина, деленное на расстояние сокращения в отсутствие токсина) уменьшается более или менее быстро, как функция концентрации Dysport®.

Как можно также увидеть на фиг.2, которая изображает результаты относительно времени жизни расстояния (амплитуды) сокращений (то есть времени, которое должно пройти от момента, когда добавляется токсин, до точки, когда расстояние сокращения становится нулевым), может наблюдаться зависимое от дозы уменьшение расстояния мышечного сокращения, как функция концентрации Dysport®.

Время жизни частоты сокращений (то есть время, которое должно пройти от момента, когда добавляется токсин, до точки, когда частота сокращений становится нулевой) также уменьшается под действием Dysport® зависимым от дозы образом, как показано на фиг.3.

Пример 2: Образец, содержащий α-бунгаротоксин

Используя ту же процедуру, как описано для примера 1, вместо Dysport® исследуют α-бунгаротоксин при концентрации 21 мкМ (n=3). Среднее время жизни судорожных сокращений для препарата α-бунгаротоксина составляет 225 с (±стандартная ошибка средней 93, n=3) и 238 с (±стандартная ошибка средней 93, n=3), измеренное по расстоянию сокращения и частоте сокращений, соответственно.

Пример 3: Система с увеличенным временем жизни

Приготовление материалов

a) Используемые буферные растворы:

Модифицированный буфер Рингера или "буфер Рингера - Лилли", используемый в этом примере, является таким же, как и для примера 1.

Желатиновый фосфатный буфер (GPB), используемый в этом примере, получают путем разведения следующих компонентов в 1 литре воды:

Желатин 2 г

NaHPO₄, 2H₂O 10 г,

b) Выделение ткани:

Самцов крыс Wistar (приблизительно 230-300 г) забивают посредством скручивания шеи после экспонирования под CO₂ (приблизительно 3 минут для индуцирования потери сознания). Грудную клетку у животного иссекают, помещают в буфер Рингера -Лилли и переносят на место эксперимента (время переноса: приблизительно 20 минут). Затем грудную клетку разделяют на две секции посредством осторожного рассечения вдоль позвоночного столба и грудины. Две половинки грудной клетки хранят приблизительно в 300 мл непрерывно оксигенируемого буфера Рингера - Лилли в течение, по меньшей мере, 30 минут, перед экспериментальными процедурами.

c) Определение минимального напряжения V_m, необходимого для индуцирования мышечных сокращений:

Одну половинку грудной клетки помещают в чашку Петри, содержащую приблизительно 10 мл буфера Рингера - Лили, и межреберный нерв осторожно иссекают с получением приблизительно 1-2 мм нервного пучка. Затем этот нерв соединяют посредством присасывающегося электрода со стимулятором (Grass Instruments Model S48), при этом обратный электрод помещают в среду. Определяют минимальное напряжение V_m, необходимое для индуцирования мышечного сокращения. Если стимулирование не может быть достигнуто ниже 10 в (1 Гц, длительность 200 мкс), иссекают другой нерв. Секцию между 2 ребрами, содержащую иссеченный нерв, иссекают из половинки грудной клетки, обеспечивая, насколько это возможно, избыток мышечной ткани в виде возможных остатков на каждой стороне 2 ребер, для прикрепления в дальнейшем преобразователя силы в смещение.

d) Прикрепление к преобразователю силы в смещение:

Обращаясь к системе со статической ванной, изображенной на фиг.4, по три металлических зажима прикрепляются к нестимулируемой мышечной ткани по каждую сторону от двух ребер. Одна сторона секции (5) между 2 ребрами прикрепляется к фиксированному основанию (4) посредством трех зажимов, в то время как другая сторона закрепляется на свободном основании (8). Фиксированное основание надежно фиксируется на месте, в то время как свободное основание прикрепляют к преобразователю силы в смещение (1; Grass Instruments Model FT03) посредством хлопчатобумажной нити (7) длиной приблизительно 4 см. Фиксированная ткань погружается приблизительно в 500 мл буфера Рингера-Лилли, и обратный электрод (2) помещают в буфер. Иссеченный межреберный нерв соединяют посредством (положительного) присасывающегося электрода (3) со стимулятором. Система, изображенная на фиг.4, также содержит вход (6) для газообразной смеси CO₂/O₂.

Способ определения количества токсина ботулизма, содержащегося в образце

Секции ткани между 2 ребрами стимулируют примерно в течение 90 минут при 15 В, длительность 200 мкс, используя стимулирование последовательностью импульсов (1 импульс/секунда в течение первых 5 секунд из каждого 30 секундного периода).

Необходимая концентрация токсина устанавливается в GPB непосредственно перед нанесением. Доставка токсина осуществляется посредством одного из двух способов:

A) Прямое нанесение: секцию между 2 ребрами открывают для границы раздела воздух/жидкость посредством удаления некоторого количества буфера в ванне с тканью. Используя шприц Hamilton, токсин наносят непосредственно на отрытую ткань капельным способом, покрывая мышцу раствором токсина. Ткань оставляют открытой в течение дополнительных 15 минут, чтобы сделать возможным поглощение токсина перед покрытием ее исходным буфером Рингера. Если это необходимо, какие-либо удаленные, иссеченные нервы повторно соединяют с пипеточным электродом.

B) Погружение: используя шприц Hamilton, токсин наносят непосредственно в ванну с тканью, рядом с секцией между 2 ребрами (но не непосредственно на нее).

Данные о силе сокращений, полученные с преобразователя силы в смещение, сначала усиливают посредством усилителя с датчиком деформации Grass Instruments AC/DC (Model PI22), а затем сигналы регистрируются с использованием программного обеспечения Grass Poly VIEW™.

Анализ данных

Исходя из полученных графиков, измеряют время, которое должно пройти для уменьшения на определенный процент начальной максимальной измеренной силы сокращений (после добавления токсина/плацебо). Эксперименты повторяют определенное количество раз (способ непосредственного нанесения: плацебо: n=4; 500 ед.: n=8; 1000 ед.: n=5; 1500 ед.: n=11; способ погружения: плацебо: n=3; 3 ед./мл: n=5; 6 ед./мл: n=2, 12 ед./мл: n=2). Из-за большого времени жизни ткани, когда она экспонируется для плацебо и низких уровней токсина, значения, иллюстрируемые при 90% уменьшении силы судорожных сокращений, представляют собой результаты оценок, основанных на экстраполяции данных в предположении постоянного коэффициента наклона.

Результаты

A) Способ непосредственного нанесения

Со временем постепенное уменьшение измеренной силы сокращений регистрируется у всех образцов, включая образцы после добавления плацебо, как видно на фиг.5. После добавления плацебо 50% уменьшение максимальной силы сокращений наблюдается приблизительно через 12 часов. Для сравнения сила сокращений уменьшается быстрее в тех образцах тканей, которые экспонируются для 1500 ед. токсина, при этом 50% уменьшение достигается приблизительно через 5 часов.

B) Способ погружения

Уменьшение измеряемой силы сокращений регистрируется после добавления плацебо, при этом 50% уменьшение максимальной силы сокращений наблюдается приблизительно через 20 часов, как видно на фиг.6. Погружение ткани в раствор 3 единицы/мл токсина дополнительно увеличивает скорость уменьшения силы сокращений, при этом 50% уменьшение силы сокращений достигается через 13 часов стимулирования. При более высоких концентрациях токсина по-прежнему очевидна зависимость реакции от дозы.

Как можно увидеть, повторяемое, зависимое от дозы индуцируемое токсином подавление мышечного сокращения наблюдается при использовании способов доставки токсина как непосредственного нанесения, так и погружения.

1. Способ ex vivo определения количества вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце, который включает в себя следующие стадии:

(i) отбор мышечной ткани, которую удается электрически стимулировать при напряжении ниже 10 В для индукции сокращения мышечной ткани, где указанная мышечная ткань соединена с электрическим стимулятором через двигательный нерв;

(ii) добавление образца, содержащего вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение;

(iii) электрическое стимулирование мышечной ткани через определенные интервалы времени при напряжении, по меньшей мере, равном V_m, путем стимуляции электрическими импульсами, которая включает в себя периоды стимулирования в течение времени t_s, отделенные друг от друга периодами времени t_p, во время которых стимулирование не осуществляется, где время t_s составляет от 50 мкс до 500 мс, время t_p составляет от 0,1 до 10 с, и отношение t_g/t_p составляет от 1:2 до 1:50 000;

(iv) сравнение эффекта, индуцируемого образцом, с эффектом, индуцируемым эталонным веществом, на основании которого определяют количество вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце.

2. Способ по п.1, согласно которому концентрация вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце составляет от 0 до 100 единиц LD₅₀/мл.

3. Способ по п.1 или 2, согласно которому концентрация вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце составляет от 0 до 50 единиц LD₅₀/мл.

4. Способ по п.1, согласно которому концентрация вещества, пресинаптически блокирующего нервно-мышечное соединение, в образце составляет от 0 до 10 единиц LD₅₀/мл.

5. Способ по п.1, согласно которому индуцируемый эффект представляет собой изменение скорости сокращения мышечной ткани.

6. Способ по п.1, согласно которому индуцируемый эффект представляет собой изменение амплитуды сокращения мышечной ткани.

7. Способ по п.1, согласно которому индуцируемый эффект представляет собой изменение силы сокращения мышечной ткани.

8. Способ по п.1, согласно которому индуцируемый эффект представляет собой изменение потенциала концевой пластинки или потенциала миниатюрной концевой пластинки мышечной ткани.

9. Способ по п.1, согласно которому вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение, представляет собой токсин ботулизма.

10. Способ по п.9, согласно которому токсин ботулизма выбран из токсина ботулизма типа А, токсина ботулизма типа В и токсина ботулизма типа F.

11. Способ по п.9, согласно которому токсин ботулизма представляет собой токсин ботулизма типа A.

12. Способ по п.1, согласно которому вещество, пресинаптически блокирующее нервно-мышечное соединение, представляет собой бунгаротоксин.

13. Способ по п.12, согласно которому бунгаротоксин представляет собой α-бунгаротоксин.

14. Способ по п.1, согласно которому мышечная ткань представляет собой кусок межреберной мышцы, полученной от мыши или крысы.