Способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона
Владельцы патента RU 2352554:
ТИХООКЕАНСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК (ТИБОХ ДВО РАН) (RU)
Изобретение относится к способу получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома А), который используется в качестве активной субстанции лекарственных препаратов серии «Гистохром» и для производства активных добавок «Тимарин», «Хитохром-С», «Золотой рог». Способ характеризуется тем, что в качестве сырья используют консервированных плоских морских ежей, которых отделяют от консерванта декантацией, образовавшийся при этом консервант фильтруют и наносят на хроматографическую колонку, заполненную обезвоженным хитозаном в ОН- форме, затем хитозан, с адсорбировавшимся на нем эхинохромом А, промывают 96% этиловым спиртом, а расконсервированных плоских морских ежей заливают 96% этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент 1:(1,0-1,2) с добавлением неорганической кислоты в соотношении этиловый спирт: кислота 100:(1,0-1,5), при этом экстракцию осуществляют в течение 20-24 час при комнатной температуре до полного истощения сырья, затем полученный экстракт пропускают через ту же колонку, заполненную обезвоженным хитозаном в ОН- форме, далее хитозан, с адсорбированным на нем эхинохромом А, промывают последовательно 30-40% водным раствором этилового спирта и 96% этиловым спиртом, затем элюируют эхинохром А с колонки 96% этиловым спиртом с добавлением соляной кислоты (рН 2-3), полученный кислый элюат нейтрализуют пищевой содой до рН 4-5, фильтруют и упаривают до полного удаления растворителя, далее сухой остаток растворяют в хлороформе или ацетоне, фильтруют и снова упаривают, затем осадок кристаллизуют из этилового спирта и высушивают. Способ позволяет получать эхинохром А с высоким выходом. 4 ил.
Изобретение относится к фармакологическому производству и касается способа получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома А) из консервированных плоских морских ежей.
Эхинохром используется в качестве активной субстанции лекарственных препаратов серии «Гистохром», применяющихся для лечения острого инфаркта миокарда и ишемической болезни сердца, и для лечения воспалительных заболеваний сетчатки и роговицы глаз. Также эхинохром является активной субстанцией для производства биологически активных добавок «Тимарин», «Хитохром-С», «Золотой рог», предназначенных для профилактики атеросклероза, коронарной болезни сердца, улучшения липидного статуса крови, обеспечения антиоксидантной защиты организма.
Известен способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона путем экстракции сырья (плоских морских ежей) 4-8% раствором 30% серной кислоты в этиловом спирте, последующей жидкостной экстракции хлороформом в смеси с водой в объемном соотношении 1:1, концентрирования экстракта, последующей перекристаллизации целевого продукта из смеси растворителей 1,4-диоксан - гексан при объемном соотношении 5:1, промывки полученного кристаллосольвата гексаном и сушки в вакуумном сушильном шкафу [SU 1508535 A3, 27.08.1996]. Выход целевого продукта составляет 0,05-0,06% от веса исходного сырья.
Известен способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона, включающий обработку сырья соляной кислотой, экстракцию целевого продукта из морских ежей серным эфиром, отделение его в виде водорастворимых натриевых производных, хроматографическую очистку на силикагеле и дробную перекристаллизацию [Mathieson J.W., Thomson R.H. J. Chem. Soc.(C), 1971, №1,
p.153-160]. Выход целевого продукта составляет 0,01% от веса исходного сырья.
Основными недостатками известных способов являются низкий выход целевого продукта и использование высокотоксичного, взрывоопасного, из-за возможного накопления перекисных соединений, 1,4-диоксана в первом способе; опасного серного эфира - во втором способе, а также сложность и длительность процесса препаративной хроматографии на силикагеле и значительные потери целевого продукта.
Наиболее близким к заявляемому способу по технической сущности является способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона, включающий последовательную обработку свежевыловленных или дефростированных морских ежей водой, органическими растворителями, например спиртом этиловым, экстракцию целевого продукта из морских ежей раствором неорганической кислоты в органическом растворителе, например соляной кислоты в этиловом спирте, концентрирование полученного экстракта, жидкостную экстракцию кислого раствора хлорофоормом с водой в соотношении 1:1 по объему, упаривание хлороформного экстракта досуха, кристаллизацию целевого продукта из диоксана, сушку кристаллосольвата и последующую сублимацию эхинохрома при 220°С [RU 2283298 C1, 10.09.2006]. Выход целевого продукта составляет 0,028% от веса исходного сырья.
Основным недостатком способа-прототипа является низкий выход целевого продукта, обусловленный потерей эхинохрома при длительном хранении замороженного сырья, а также технологическими потерями при обработке сырья органическими растворителями для удаления липидов, в процессе жидкостной экстракции хлороформом значительная часть целевого продукта остается в кислом экстракте и промывной воде; при кристаллизации из 1,4-диоксана происходят потери эхинохрома в маточном растворе и при отмывке кристаллов, которые могут достигать 20% от общего содержания целевого продукта. При возгонке происходит частичное спекание целевого продукта с органическими и неорганическими примесями. Кроме этого, 1,4-диоксан токсичен и взрывоопасен вследствие накопления перекисных соединений, что требует дополнительной очистки и контроля содержания перекисей.
Известно, что океаническое сырье не подлежит длительному хранению вследствие процессов окисления и разрушения лабильных соединений, таких как липиды, витамины и антиоксиданты, без заморозки или иных способов консервации.
Задачей изобретения является разработка способа получения эхинохрома А из консервированного сырья.
Задача решена тем, что в способе получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома А) из морских ежей, включающем экстракцию и очистку целевого продукта, согласно изобретению, в качестве сырья используют консервированных плоских морских ежей, которых отделяют от консерванта декантацией, образовавшийся при этом консервант фильтруют и наносят на хроматографическую колонку, заполненную обезвоженным хитозаном в ОН- форме, затем хитозан, с адсорбировавшимся на нем эхинохромом А, промывают 96% этиловым спиртом, а расконсервированных плоских морских ежей заливают 96% этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент 1:(1,0-1,2) с добавлением неорганической кислоты в соотношении этиловый спирт: кислота 100:(1,0-1,5), при этом экстракцию осуществляют в течение 20-24 час при комнатной температуре, до полного истощения сырья. Затем полученный экстракт пропускают через ту же колонку с обезвоженным хитозаном в ОН- форме, далее хитозан, с адсорбированным на нем эхинохромом А, промывают последовательно 30-40% водным раствором этилового спирта и 96% этиловым спиртом, затем элюируют эхинохром А с колонки 96% этиловым спиртом с добавлением соляной кислоты (рН 2-3). Полученный кислый элюат нейтрализуют пищевой содой до рН 4-5, фильтруют и упаривают до полного удаления растворителя, далее сухой остаток растворяют в хлороформе или ацетоне, фильтруют и снова упаривают, затем осадок кристаллизуют из этилового спирта и высушивают.
Технический результат заключается в повышении выхода целевого продукта в 2,5-2,7 раза по сравнению с выходом эхинохрома по способу-прототипу, а также в обеспечении безопасности процесса.
В заявляемом способе в качестве сырья используют консервированных 96% этиловым спиртом с добавлением аскорбиновой кислоты морских ежей, хранившегося от полугода до двух лет.
Сырье отделяют от консервирующего раствора методом декантации. Консервант, содержащий комплекс липидов и антиоксидант эхинохром, фильтруют и пропускают через хроматографическую колонку, наполненную измельченным в порошок обезвоженным хитозаном в ОН- форме и уравновешенную 96% этиловым спиртом.
Эхинохром селективно связывается с хитозаном, а сопутствующие примеси вымываются с колонки потоком элюента - 96% этанолом. Обедненный консервант и элюат регенерируют перегонкой. Этиловый спирт возвращают в технологический процесс.
Сырье - морские ежи, освобожденные от консервирующего раствора, экстрагируют 96% этанолом с добавлением разрешенной в пищевой промышленности кислоты (соляной, фосфорной). Соотношение сырья и экстрагента 1:(1,0-1,2), что обеспечивает полное покрытие экстрагентом различных по размеру морских ежей. Соотношение этилового спирта и кислоты 100:(1-1,5). При этом соотношении происходит разложение кальциевых и магниевых солей эхинохрома, что обеспечивает возможность его экстракции из сырья.
Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 20-24 часов. Полученный экстракт, содержащий эхинохром, фильтруют и пропускают через ту же колонку с хитозаном, через которую пропускали консервирующий раствор. Эхинохром из экстракта адсорбируется на хитозане. Обедненный экстракт регенерируют перегонкой и возвращают в технологический процесс. Экстракцию проводят не менее трех раз, до полного истощения сырья.
Колонку, с адсорбированным на хитозане эхинохромом, промывают последовательно 30-40% водным раствором этилового спирта и 96% этиловым спиртом. Эхинохром элюируют с колонки 96% этиловым спиртом, с добавлением соляной кислоты (рН 2-3). Полученный кислый элюат нейтрализуют содой пищевой (кислый углекислый натрий) до рН 4-5, фильтруют и упаривают до полного удаления растворителя.
Сухой остаток растворяют в хлороформе или ацетоне, фильтруют и снова упаривают. Полученный мелкий порошок кристаллизуют из этилового спирта и сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Выход эхинохрома А составляет 0,073-0,075% от веса исходного сырья. Целевой продукт не содержит примесей.
Для подтверждения чистоты продукта был проведен анализ образцов эхинохрома А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
ВЭЖХ проводили на хроматографе LaChrom (Hitachi Merck), снабженным УФ-детектором L-7400, термостатом L-7300, насосом L-7100, интегратором D-7500. Для анализа использовали колонку ZORBAX Eclipse XDB-C18 (Agilent) 4.6×75 mm, 3.5 µm. Детектирование проводили при λ=270 нм, скорость подачи растворителей 1 мл/мин, температура термостата 30°С. Элюцию проводили смесью растворителей А (ацетонитрил + 1% СН3СООН) - В (вода + 1% СН3СООН); градиент (10% А + 90% В) → (90% А + 10% В).
На фиг.1 представлена ВЭЖХ-хроматограмма консерванта морских ежей, в котором присутствуют пики, соответствующие эхинохрому А (15,55) и сопутствующих примесей.
На фиг.2 представлена ВЭЖХ-хроматограмма спиртового экстракта морских ежей, в котором присутствуют пики, соответствующие эхинохрому А (15,55) и сопутствующих примесей.
На фиг.3 представлена ВЭЖХ-хроматограмма элюата, полученного при промывке спиртом колонки с адсорбированным на хитозане экстрактом, в котором присутствуют пики примесей. Пик эхинохрома А отсутствует, т.к. эхинохром А полностью связывается с хитозаном, образуя комплексную соль.
На фиг.4 представлена ВЭЖХ-хроматограмма элюата, полученного при экстракции эхинохром А, адсорбированного на хитозане, подкисленным спиртом. На хроматограмме отчетливо проявляется пик эхинохрома А (15,55). Пики примесей отсутствуют, следовательно эхинохром А, полученный заявляемым способом, является хроматографически чистым.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Сырье - консервированный морской еж в количестве 100 кг загружают в реактор. Консервант сливают. В хроматографическую колонку объемом 10 литров (соотношение высоты и диаметра 10:1) загружают 5 кг измельченного обезвоженного хитозана в ОН- форме и промывают 96% этиловым спиртом. Консервант в количестве 100 л пропускают через хитозан и отправляют на регенерацию.
Расконсервированных морских ежей экстрагируют 96% этиловым спиртом с добавлением фосфорной кислоты (соотношение сырье: экстрагент 1:1). Экстрагент получают смешиванием 100 л этанола 96% и 5 л 20% фосфорной кислоты. Экстракцию проводят до полного истощения сырья (не менее трех раз) при комнатной температуре в течение 22 час. Полученные экстракты объединяют, пропускают через колонку с хитозаном, упаривают и возвращают в технологический процесс.
Колонку с сорбированным эхинохромом А промывают 10 л 30% водного раствора этилового спирта и 10 л 96% этилового спирта. Эхинохром А с хитозана элюируют 96% этиловым спиртом с добавлением соляной кислоты (10 л 96% этанола и 1 л 18% соляной кислоты).
Регенерация колонки: хитозан промывают 20 л 96% этилового спирта.
Полученный элюат нейтрализуют пищевой содой до рН 4-5 и упаривают до полного удаления растворителя. Полученный остаток растворяют в 0,5 л хлороформа, фильтруют, снова упаривают и перекристаллизовывают из 96% этанола. Полученный кристаллосольват сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Выход эхинохрома составляет 75 г.
Пример 2
Сырье - консервированный плоский морской еж в количестве 50 кг обрабатывают и экстрагируют, как описано в примере 1 (соотношение сырье: экстрагент 1:1,2). Экстрагент получают смешиванием 60 л 96% этилового спирта с 4,5 л 18% соляной кислоты. Хроматографическую очистку проводят, как описано в примере 1. Для выделения эхинохрома А используют 3 кг хитозана, промывают колонку 6 л 40% водного раствора этилового спирта и 6 л 96% этанола. Целевой продукт элюируют с хитозана 6 л 96% этанола с добавлением 0,6 л 18% соляной кислоты. Упаренный элюат растворяют в 0,5 л ацетона, фильтруют, снова упаривают и перекристаллизовывают из 96% этанола. Полученный кристаллосольват сушат в вакуумном сушильном шкафу до постоянного веса. Выход эхинохрома составляет 73 г.
Способ получения 2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этил-1,4-нафтохинона (эхинохрома А) из морских ежей, включающий экстракцию и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве сырья используют консервированных плоских морских ежей, которых отделяют от консерванта декантацией, образовавшийся при этом консервант фильтруют и наносят на хроматографическую колонку, заполненную обезвоженным хитозаном в ОН- форме, затем хитозан с адсорбировавшимся на нем эхинохромом А, промывают 96%-ным этиловым спиртом, а расконсервированных плоских морских ежей заливают 96%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:(1,0-1,2) с добавлением неорганической кислоты в соотношении этиловый спирт:кислота 100:(1,0-1,5), при этом экстракцию осуществляют в течение 20-24 ч при комнатной температуре до полного истощения сырья, затем полученный экстракт пропускают через ту же колонку, заполненную обезвоженным хитозаном в ОН- форме, далее хитозан с адсорбированным на нем эхинохромом А промывают последовательно 30-40%-ным водным раствором этилового спирта и 96%-ным этиловым спиртом, затем элюируют эхинохром А с колонки 96%-ным этиловым спиртом с добавлением соляной кислоты (рН 2-3), полученный кислый элюат нейтрализуют пищевой содой до рН 4-5, фильтруют и упаривают до полного удаления растворителя, далее сухой остаток растворяют в хлороформе или ацетоне, фильтруют и снова упаривают, затем осадок кристаллизуют из этилового спирта и высушивают.
