Конъюгаты, содержащие антитело, специфическое для ed-в-домена фибронектина, и их применение для обнаружения и лечения опухолей

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложены варианты соединения, предназначенного для связывания с внешним доменом В (ED-B) фибронектина. Соединение включает антигенсвязываающий фрагмент одноцепочечного антитела L19 и цистеинсодержащий линкер для навешивания радиоактивной метки. Раскрыты варианты фармацевтической композиции для диагностики и лечения ангиогенных заболеваний на основе указанного соединения. Описано применение соединения для связывания с радиоактивным соединением. Раскрыт способ получения соединения в эукариотических клетках, в том числе в Pichia pastoris и набор для получения радиоактивно меченных агентов на основе соединения. Использование соединения обеспечивает его высокоспецифичное накопление в солидных опухолях, что может найти применение для диагностики и лечения опухолей. 6 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 5 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым способам диагностики и лечения опухолей с использованием новых пептидов для связывания радионуклидов.

Краткое описание предпосылок создания изобретения

Опухоли не могут превышать определенную массу без образования новых кровеносных сосудов (ангиогенез), и для многих опухолей выявлена корреляция между плотностью микрососудов и инвазивностью опухолей (Folkman, Nature Med., 1, 1995, с.27-31). Кроме того, с ангиогенезом связано большинство глазных болезней, приводящих к снижению зрения (Lee и др., Surv. Ophthalmol. 43, 1998, с.245-269; Friedlander M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1996, с.9764-9769). Молекулы, обладающие способностью осуществлять избирательный направленный перенос маркеров ангиогенеза, могут оказаться ценными с клинической точки зрения для диагностики и терапии опухолей и других заболеваний, которые характеризуются сосудистой пролиферацией, таких как диабетическая ретинопатия и связанная с возрастом дегенерация желтого пятна. В большинстве растущих плотных опухолей происходит экспрессия маркеров ангиогенеза наряду с увеличением сосудов опухоли, и поэтому они легкодоступны для специфических связующих веществ, которые вводят внутривенно (Pasqualini и др., Nature Biotechnol, 15, 1997, с.542-546; Neri и др. Nature Biotechnol, 15, 1997, с.1271-1275). Направленное прекращение неоваскуляризации может приводить к инфаркту и коллапсу опухоли (O′Reilly и др., Nature Med., 2, 1997, сс.689-692; Huang и др., Science, 275, 1997, с.547-550).

ED-B-домен фибронектина, состоящий из 91 аминокислоты, последовательность которых идентична у мышей, крыс и человека, при его встраивании путем альтернативного сплайсинга в молекулу фибронектина специфично накапливается вокруг связанных с неоваскуляризацией структур (Castellani и др., Int. J.Cancer 59, 1994, с.612-618) и может представлять собой мишень для вмешательства на молекулярном уровне. Так, в настоящее время с помощью флуоресценции установлено, что одноцепочечные Fv-фрагменты антитела к ED-B (scFv) избирательно накапливаются вокруг кровеносных сосудов опухоли у несущих опухоли мышей и что сродство к антителу, по-видимому, определяет особенности направленного переноса (Neri и др., Nature Biotechnol, 15, 1997, с.1271-1275; WO 97/45544).

Кроме того, антитела и фрагменты антител, которые специфически связываются с ED-B-доменом фибронектина, где связывание характеризуется величиной константы диссоциации, находящейся в субнаномолярном диапазоне, а также меченные с помощью радиоактивных атомов их производные, описаны в WO 99/58570. Уже изучено биораспределение в организме несущих опухоли мышей одного из таких высокоаффинных фрагментов человеческого антитела, а именно меченного с помощью ¹²⁵I фрагмента антитела, обозначенного как L19 (Tarli и др., Blood, т. 94, No.1, 1999, с.192-198). Радиоактивно-меченые конъюгаты, содержащие L19-антитела, и их применение для обнаружения и лечения ангиогенеза описаны в WO 01/62800.

Ранее описано рекомбинантное получение функционально активных одноцепочечных Fv-фрагментов антитела к ED-B-домену В-изоформы фибронектина в Pichia pastoris (Marty и др., Protein Expression and Purification 21, 2001, c.156-164).

Кроме того, описано введение радиоактивной метки ^99mTc в scFv-фрагмент антитела посредством С-концевого цистеинильного пептида (George и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, т.92, 1995, с.8358-8362 и Verhaar и др., J. Nuc. Med., т.37 (5), 1996, c.868-872).

Однако с точки зрения применения в клинических условиях все еще сохраняется потребность в создании фрагментов антител, которые обладают улучшенными фармакокинетическими характеристиками и которые легко можно метить с помощью радиоактивных изотопов, например, технеция или рения, поскольку эти радионуклиды наиболее предпочтительны в качестве радиоактивно-меченых фармацевтических агентов.

Объект изобретения

Таким образом, объектом изобретения являются фрагменты антител, которые обладают улучшенными фармакокинетическими характеристиками, в частности специфичностью в отношении мишени и/или стабильностью in vivo, и которые можно легко связывать с радиоактивными изотопами, например, технеция или рения.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям, содержащим пептид, который несет

аа) последовательность антигенсвязывающего центра антитела к внешнему домену В (ED-B) фибронектина, которая содержит гипервариабельные участки HCDR3 и/или LCDR3, представленные в таблице 1, или ее вариация, такая как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 5 аминокислот для HCDR3-области и вплоть до 6 аминокислот для LCDR3 -области, которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1;

аб) последовательность антигенсвязывающего центра антитела к внешнему домену В (ED-B) фибронектина, которая содержит гипервариабельные участки HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в таблице 1, или ее вариация, такая как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 3 аминокислот для HCDR1-области, вплоть 8 аминокислот для HCDR2-области, вплоть до 5 аминокислот для HCDR3-области, вплоть до 6 аминокислот для LCDR1-области, вплоть до 4 аминокислот для LCDR2-области и вплоть до 6 аминокислот для LCDR3-области; которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1;

ав) последовательность, которая представлена в Seq. Id. No.1 (LI 9) или вариацию Seq. Id. No.1, такую как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 30 аминокислот, и которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1; и

ба) аминокислотную последовательность Хаа₁-Хаа₂-Хаа₃-Cys (Seq. Id. No.2), где символы Xaa₁, Хаа₂, и Хаа₃ каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, или

бб) аминокислотную последовательность Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Cys-Xaa₄ (Seq. Id. No.3), где символы Xaa₁, Xaa₂, Хаа₃, и Хаа₄ каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, или

бв) аминокислотную последовательность (His)_n (Seq. Id. No.4), где n обозначает целое число от 4 до 6,

причем, С-конец последовательности, описанной в аа), аб) или ав), связан с N-концом одной из последовательностей, представленных в Seq. Id. No.2, Seq. Id. No.3 или Seq. Id. No.4, через пептидную связь.

Соединения предпочтительно представляют собой одноцепочечные фрагменты антител, в частности scFv-фрагменты. Кроме того, соединения предпочтительно конъюгированы с радиоактивными изотопами, например, с радиоактивным изотопом технеция, таким как ^94mTc, ^99mTc, рения, таким как ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, или с другими изотопами, такими как ²⁰³Pb, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ^110mIn, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁸Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹²¹Sn, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Cm, ¹⁶⁶Но, ¹⁰⁵Rh, ¹⁷⁷Lu, ⁷²As и ¹⁸F.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей в качестве действующего вещества вышеуказанное соединение в сочетании с физиологически приемлемыми вспомогательными веществами, разбавителями и/или носителями.

Настоящее изобретение относится к применению пептида, который несет

аа) последовательность антигенсвязывающего центра антитела к внешнему домену В (ED-B) фибронектина, которая содержит гипервариабельные участки HCDR3 и/или LCDR3, представленные в таблице 1, или ее вариацию, такую как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 5 аминокислот для HCDR3-области и вплоть до 6 аминокислот для LCDR3-области, которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1;

аб) последовательность антигенсвязывающего центра антитела к внешнему домену В (ED-B) фибронектина, которая содержит гипервариабельные участки HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в таблице 1, или ее вариация, такая как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 3 аминокислот для HCDR1-области, вплоть 8 аминокислот для HCDR2-области, вплоть до 5 аминокислот для HCDR3-области, вплоть до 6 аминокислот для LCDR1-области, вплоть до 4 аминокислот для LCDR2-области и вплоть до 6 аминокислот для LCDR3-области; которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1;

ав) последовательность, которая представлена в Seq. Id. No.1 (L1 9) или вариацию Seq. Id. No.1, такую как делеция, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 30 аминокислот, и которая обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1; и

ба) аминокислотную последовательность Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Cys (Seq. Id. No.2), где символы Xaa₁, Хаа₂, и Хаа₃ каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, или

бб) аминокислотную последовательность Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Cys-Xaa₄ (Seq. Id. No.3), где символы Xaa₁, Хаа₂, Хаа₃, и Хаа₄ каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, или

бв) аминокислотную последовательность (His)_n (Seq. Id. No.4), где n обозначает целое число от 4 до 6, причем С-конец последовательности, описанной в аа), аб) или ав), связан с N-концом одной из последовательностей, представленных в Seq. Id. No.2, Seq. Id. No.3 или Seq. Id. No.4, через пептидную связь,

для связывания с радиоактивным изотопом, например радиоизотопом технеция или рения.

Фрагмент антитела L19 имеет следующую последовательность (Seq. Id. No.I):

(VH)
EVQLLESGGG	LVQPGGSLRL	SCAASGFTFS
SFSMSWVRQA	PGKGLEWVSS	ISGSSGTTYY
ADSVKGRFTI	SRDNSKNTLY	LQMNSLRAED
TAVYYCAKPF	PYFDYWGQGT	LVTVSS
(линкер)
GDGSSGGSGG	ASTG
(VL)
EIVLTQSPGT	LSLSPGERAT	LSCRASQSVS
SSFLAWYQQK	PGQAPRLLIY	YASSRATGIP
DRFSGSGSGT	DFTLTISRLE	PEDFAVYYCQ
OTGRIPPTFG	OGTKVEIK

Деления, инсерция и/или замена, затрагивающая вплоть до 30 аминокислот, представляет собой делецию, инсерцию и/ или замену 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот Seq. Id. No.1. Однако в гиперварибельных участках (CDR) заявляемого пептида, например пептида, который имеет последовательность, представленную в Seq. Id. No.1, вариация, такая как делеция, инсерция и/или замена аминокислот (ак), не должна превышать максимальное количество вариаций, указанных в таблице 1 (HCDR обозначает CDR тяжелой цепи; LCDR обозначает CDR легкой цепи).

Таблица 1
Участки	Длина CDR (ак)	Последовательность	Максимальное (предпочтительное) количество вариаций в положениях последовательности
HCDR1	5	SFSMS	3 (2, 1)
HCDR2	17	SISGSSGTTY YADSVKG	8 (7, 6, 5, 4, 3, 2, 1)
HCDR3	7	PFPYFDY	5 (4, 3, 2, 1)
LCDR1	12	RASQSVSSSF LA	6 (5, 4, 3, 2, 1)
LCDR2	7	YASSRAT	4 (3, 2, 1)
LCDR3	10	CQQTGRIPPT	6 (5, 4, 3, 2, 1)

CDR определяли согласно Е.A.Kabat с соавторами, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", изд-во U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes for Health, Bethesda, MD, 50-е изд., 1991.

Предпочтительными являются пептиды, которые содержат последовательность, представленную в Seq. Id. No.1 (LI 9), или вариацию Seq. Id. No.1, где деления, инсерция и/или замена затрагивает вплоть до 20 аминокислот.

Пептид, который несет вариацию CDR-последовательностей, указанную в таблице 1, и, в частности, вариацию Seq. Id. No.1, представляющую собой делецию, инсерцию и/или замену, и который обладает такой же функцией, что и пептид, имеющий последовательность Seq. Id. No.1, обозначен как пептид, который связывается с ED-B-доменом фибронектина, и это связывание характеризуется величиной константы диссоциации (K_d), находящейся в субнаномолярном диапазоне (т.е. менее 10^-9), измеренной с помощью BIAcore (см. WO 99/58570, пример 2 и таблица 2).

Предпочтительные аминокислотные последовательности Хаа₁-Хаа₂-Хаа₃-Cys (Seq. Id. No.2) представляют собой последовательности Gly-Gly-Gly-Cys (Seq. Id. No.5) и Gly-Cys-Gly-Cys (Seq. Id. No.6). Наиболее предпочтительной является последовательность Gly-Gly-Gly-Cys (Seq. Id. No.5).

Предпочтительные аминокислотные последовательности Хаа₁-Хаа₂-Хаа₃-Cys (Seq. Id. No.3) представляют собой последовательности Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No.7) и Gly-Cys-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No.8). Наиболее предпочтительной является последовательность Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No.7).

Из соединений, которые содержат аминокислотную последовательность (His)_n (Seq. Id. No.4), предпочтительными являются соединения, в которых n обозначает целое число 6.

Предпочтительными радиоактивными изотопами технеция или рения являются изотопы ^94mTc, ^99mTc, ¹⁸⁶Re и ¹⁸⁸Re. Наиболее предпочтительным радиоактивным изотопом является ^99mTc.

Подробное описание изобретения

Одноцепочечный фрагмент антитела L19 (Seq. Id. No.1) ранее метили с помощью ¹²⁵J для изучения биораспределения этого соединения в организме несущих опухоли мышей (Tarli и др., Blood, т.94, No.1, 1999, с.192-198). Эти результаты позволили установить, что можно осуществлять избирательный направленный перенос к кровеносным сосудам опухоли in vivo. При этом неожиданно было установлено, что фармакокинетические характеристики одноцепочечного фрагмента антитела L19 могут существенно улучшаться при его конъюгации с пептидом, указанным в ба), бб) или бв), и мечении с помощью радиоактивных изотопов технеция или рения. Изотоп ^99mTc представляет собой радиоактивный изотоп, выбранный для осуществления обычной применяемой в клинических условиях однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT) из-за его радиохимических характеристик (простота получения с помощью ⁹⁹Мо/^99mTc-генератора, способность испускать одиночные гамма-кванты с энергией 140 кэВ, способность обеспечивать сильный поток фотонов и способность быстро разлагаться (период полураспада 6 ч)), а также из-за его относительно невысокой стоимости. Для терапевтических целей наиболее предпочтительной является мечение с помощью химически аналогичных изотопов ¹⁸⁶Re и ¹⁸⁸Re (Hsieh В.Т. и др., Nucl. Med. BioL, 26 (8), 1993, с.967-972 и с.973-976, Zamora P.O. и др., Anticancer Res., 17 (3B), 1997, с.1803-1838).

Пептиды, предлагаемые в настоящем изобретении, являются производными рекомбинантного scFv-фрагмента антитела L19 (Seq. Id. No.1) к внеклеточному ED-B-домену фибронектина и их получают с помощью генетической инженерии согласно процессу, представленному на фиг.1. Получают следующие пептиды: L19 (Seq. Id. No.1)

L19His:

1	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51	ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101	PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151	CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201	TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKAAAL EHHHHHH

(Seq. Id. No.9)

AP38:

1	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51	ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101	PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151	CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201	TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC

(Seq. Id. No.10)

AP39:

1	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51	ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101	PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151	CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201	TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGGGC A

(Seq. Id. No.11)

L19-GlyCysGlyCys:

1	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51	ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101	PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151	CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201	TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC

(Seq. Id. No.12)

L19-GlyCysGlyCysAla:

1	EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFSMSWVRQA PGKGLEWVSS
51	ISGSSGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPF
101	PYFDYWGQGT LVTVSSGDGS SGGSGGASEI VLTQSPGTLS LSPGERATLS
151	CRASQSVSSS FLAWYQQKPG QAPRLLIYYA SSRATGIPDR FSGSGSGTDF
201	TLTISRLEPE DFAVYYCQQT GRIPPTFGQG TKVEIKGCGC A

(Seq. Id. No.13)

Получение пептидов подробно описано в приведенных ниже примерах (см. «Экспериментальный раздел»).

Фрагмент антитела L19 первоначально был получен путем экспрессии в Е.coli (см. WO 99/58570). Однако, как установлено, эта система является неудовлетворительной для крупномасштабного производства scFv-фрагментов антител. Была изучена другая система экспрессии, а именно система экспрессии, основанная на использовании дрожжей, в частности система экспрессии, основанная на применении Pichia pastoris. При создании настоящего изобретения установлено, что дрожжи, например, Pichia pastoris, как правило, пригодны для экспрессии обладающего высокой биологической активностью фрагмента антитела, например, фрагмента АР39, однако, высокий уровень экспрессии, обеспечивающий получение вплоть до 250 мг фрагмента антитела на 1 л культуры, что необходимо для экономичного получения биофармацевтического продукта, может быть достигнут только при использовании конститутивного экспрессионного вектора (например, pGAP) и его нельзя достичь при использовании индуцируемого ментолом вектора (например, pPIC9K). Еще одним преимуществом этой конститутивной системы экспрессии является ее простота и устойчивость процедур ферментации по сравнению с использованием индуцибельной системы экспрессии на основе дрожжей. При создании изобретения неожиданно было установлено, что правильное процессирование сигнальной последовательности фрагмента антитела, например, фрагмента АР39, происходило только тогда, когда применяли кассету экспрессии, в которой N-конец фрагмента был непосредственно слит с сайтом расщепления Кех2 из сигнальной альфа последовательности.

Пептиды можно применять для диагностических и терапевтических целей, в частности для диагностики и терапии инвазивных опухолей и метастазов опухолей. Предпочтительным применением в диагностических целях является применение для SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография) и PET (эмиссионная позитронная томография).

Описанные выше пептиды наиболее пригодны для мечения с помощью указанных выше радиоактивных изотопов, например радиоактивных изотопов технеция и рения, предпочтительно радионуклидов ^94mTc, ^99mTc, ¹⁸⁶Re и ¹⁸⁸Re. Для мечения пептидов пептиды сначала восстанавливают с помощью соответствующего восстановителя типа, например, хлорида олова(II) или трис(2-карбокиэтил)фосфина (ТКЭФ). Образовавшиеся восстановленные пептиды имеют свободные SH-группы, которые могут взаимодействовать с элюатом ^99mTc-генератора или элюатом ¹⁸⁸Re-генератора и хлоридом олова(II) с получением соединений, предлагаемых в настоящем изобретении (подробности см. ниже в экспериментальных примерах). Непрямое мечение осуществляют путем предварительной конъюгации хелатирующего лиганда и последующего образования комплекса с радиоактивными изотопами, например, индия, иттрия, лантанидов и т.д. Хелатирующий лиганд, как правило, является производным этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДТПК), циклогексил-1,2-диаминтетрауксусной кислоты (ЦДТК), этиленгликоль-O,O′-бис(2-аминоэтил)-N,N,N′,N′-диуксусной кислоты (HBED), триэтилентетраамингексауксусной кислоты (ТТГК), 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N′,N″-тетрауксусной кислоты (ДОТУ), 1,4,7-триазациклононан-N,N′,N″-триуксусной кислоты (НОТК) и 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-N,N′,N″,N″′-тетрауксусной кислоты (ТЕТК), и он является хелатирующим агентом либо для амино-, либо для тиольной групп пептидных соединений. Хелатирующие лиганды несут приемлемую для сочетания группу, например, активных сложных эфиров, малеимидов, тиокарбаматов или α-галогенированных ацетамидных фрагментов. Для конъюгации хелатирующих лигандов с аминогруппам, например ε-NH₂-группами остатков лизина, не требуется предварительное восстановление пептидных соединений. Меченные с помощью радиоактивного изотопа пептиды можно применять в целях радиодиагностики и радиотерапии.

У образовавшихся меченных с помощью радиоактивного изотопа пептидов в экспериментах на животных были обнаружены неожиданные преимущества. Например, экскреция через почки до 70% или более, например, 80,63% меченого пептида, например, меченного с помощью ^99mTc АР39 (Seq. Id. No.11) у бестимусных происходит в течение 24 ч, в то время как экскреция через почки L19 (Seq. Id. No.1), меченного с помощью ¹²⁵I, у бестимусных мышей составляла в течение 24 ч только 67,79%. Соотношение распределения в опухоли и крови меченого пептида, например, меченного с помощью ^99mTc АР39, составляло 5:1 или более, предпочтительно 8:1 или более, например, примерно 10:1, через 5 ч, в то время как это соотношение в случае L19, меченного с помощью ¹²⁵I, составляло только примерно 3:1. Это является неожиданным также при сравнении с другими scFv-фрагментами антител, меченными с помощью ^99mTc, для которых часто характерны менее предпочтительные характеристики распределения. Например, Verhaar и др., J. Nuc. Med., т.37 (5), 1996, с.868-872 установили, что для меченного с помощью ^99mTc scFv-фрагмента антитела соотношение распределения в опухоли и крови через 24 ч составляло только 4:1, и через 24 ч почки аккумулировали 9%, что является очень высоким показателем по сравнению с данными, полученными для пептидов, предлагаемых в настоящем изобретении, например, при использовании меченного с помощью ^99mTc АР39 аккумуляция почками составила 1,3% (см. пример 13).

Кроме того, стабильность in vivo меченых пептидов, предлагаемых в изобретении, например, меченного с помощью ^99mTc АР39, существенно выше, по сравнению со стабильностью in vivo L19, меченного с помощью ¹²⁵I. При создании изобретения установлено, что через 2 ч после инъекции пептида, например, меченного с помощью ^99mTc АР39, только 10% или менее, например, 3% радиоактивности в сыворотке приходится на долю метаболита, в то время как через 2 ч после инъекции L19, меченного с помощью ¹²⁵I, 49% радиоактивности в сыворотке приходится на долю метаболитов, которые могут представлять собой свободный йод. Улучшенная стабильность in vivo пептидов, например, меченного с помощью ^99mTc АР39, проявляется также в его более продолжительной способности связываться с мишенью, т.е. с ED-B. При создании настоящего изобретения установлено, что через 2 ч после инъекции пептида, например, меченного с помощью ^99mTc АР39, 50% или более, например, 74% радиоактивной метки, присутствующей в сыворотке, обладает способностью связываться с ED-B, в то время как через 2 ч после инъекции L19, меченного с помощью ¹²⁵I, только 27% радиоактивной метки, присутствующей в сыворотке, может связываться с ED-B. Соединения, предлагаемые в изобретении, обладают также высокой способностью накапливаться в опухоли. Например, у Tc-99m-АР39 и In-111-MX-ДТПК-ε-HN(Lys)-AP39 обнаружена высокая способность накапливаться в опухоли, составляющая 10,7% (Tc-99m) или 12,9% (In-111) от инъецируемой дозы на грамм (ИД/г) через 1 ч после инъекции (p.i.). Таким образом, поглощение опухолью является существенно более высоким по сравнению с уровнями, которые известны для других фрагментов антител, меченных с помощью In-111 или Tc-99m (см., например, Kobayashi и др., J. Nuc. Med., т. 41 (4), 2000, с.755-762; Verhaar и др., J. Nuc. Med., т.37 (5), 1996, с.868-872).

Соединения можно применять для диагностических и терапевтических целей. Их обычно вводят пациенту парентерально, более предпочтительно с помощью внутривенной инъекции. Для человека доза предпочтительно составляет 0,1-1 мг на человека при использовании в радиодиагностике и 0,1-100 мг на человека при использовании для радиотерапии.

Способы получения и мечения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, более подробно проиллюстрированы в приведенных ниже примерах, которые даны только с целью иллюстрации и никоим образом не ограничивают объем изобретения.

Экспериментальный раздел

Пример 1: Получение производных L19

В качестве исходного продукта использовали рекомбинантное антитело (scFv L19, краткое обозначение L19) к внеклеточному домену В (ED-B) сплайсингового варианта фибронектина. scFv L19 выделяли путем отбора из спектра синтетических человеческих антител с помощью фагового проявления (Neri и др., Nature Biotechnol. 15, 1997, с.1271; Pini и др., J. Biol. Chem. 273, 1998, с.21769). Этот фрагмент рекомбинантного антитела находится в форме так называемого одноцепочечного фрагмента антитела (scFv) и состоит из VH- и VL-области, связанной линкерной последовательностью (см. Seq. Id. No.1). Этот scFv L19 обладает очень высокой аффинностью в отношении ED В (К_d:5,4×10^-11M).

С помощью методов генной инженерии получали различные производные L19 (см. фиг.1). Для модификации L19 кодирующую scFv ДНК амплифицировали с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием праймеров, кодирующих дополнительные последовательности, и клонировали в экспрессионных векторах.

Производные L19:

L19: без дополнительных концевых модификаций.

L19 His: С-концевой домен His₆ (His-метка), предназначен для хелатной

хроматографии на Ni и для связывания с радиоизотопами.

АР38: С-концевой домен GlyGlyGlyCys, предназначен для связывания (через Cys) субстанций, которые можно применять в терапии и диагностике (например, радиоизотопов).

АР39: С-концевой домен GlyGlyGlyCysAla, предназначен для связывания (через Cys) субстанций, которые можно применять в терапии и диагностике (например, радиоизотопов).

L19-GlyCysGlyCys: С-концевой домен GlyCysGlyCys, предназначен для связывания (через Cys) субстанций, которые можно применять в терапии и диагностике (например, радиоизотопов).

L19-GlyCysGlyCysAla: С-концевой домен GlyCysGlyCysAla, предназначен для связывания (через Cys) субстанций, которые можно применять в терапии и диагностике (например, радиоизотопов).

Рекомбинантное получение производных L19

Описанные производные L19 получали в прокариотических и эукариотических системах экспрессии.

а) Получение L19 в E.coli

Последовательности ДНК, кодирующие различные производные L19 (АР38, АР39, L19-GlyCysGlyCys, L19-GlyCysGlyCysAla, L19, L19His), клонировали в прокариотическом экспрессионном векторе (pDN5, Pini и др., J. Immunol. Methods 206, 1997, с.171, Pini и др., J. Biol. Chem. 273, 1998, с.21769; рЕТ, фирмы Novagen) с использованием индуцируемого ИПТГ (изопропилтиогалактозид) промотора и маркера, обусловливающего устойчивость к ампициллину. Для обеспечения секреции рекомбинантного протеина в периплазму этот вектор применяли для получения кассеты экспрессии, в которой N-конец scFv слит с сигнальной последовательностью Pel В. Это обеспечивало создание стабильных штаммов-продуцентов после трансформации Е.coli (TG1, BL21DE3 и НВ2151) экспрессионным вектором с последующим отбором по признаку устойчивости к ампициллину. Для получения scFv эти штаммы культивировали в присутствии 1% глюкозы на фазе роста (37°С) для подавления промотора. Экспрессию scFv в культурах индуцировали, добавляя ИПТГ и осуществляя инкубацию при 30°С в течение промежутка времени до 16 ч. Растворимый и связывающийся с антигеном scFv можно выделять из полного экстракта штаммов Е.coli, из фракции периплазмы или, что, как установлено, является особенно эффективным с точки зрения очистки и выхода, из супернатанта культуры. Получение осуществляли во встряхиваемых колбах и ферментерах объемом до 10 л.

б) Получение производных L19 в Pichia pastoris

Последовательности ДНК, кодирующие L19His, AP38, АР39, L19-GlyCysGlyCys и L19-GlyCysGlyCysAla, амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в Е.coli и в экспрессионных векторах рР1С9К и pGAP (фирма Invitrogen) для получения в дрожжах Pichia pastoris. Для экспрессии гетерологичных генов рР1С9К содержит индуцируемый метанолом промотор (АОХ1), а pGAP содержит конститутивный промотор фермента глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH). Кроме того, эти векторы содержат соответственно ген, обусловливающий устойчивость в генетицину, и ген, обусловливающий устойчивость к зеоцину, для селекции/амплификации чужеродного гена и сигнальную последовательность (из α-фактора дрожжей) для экспрессии и секреции рекомбинантного продукта. Применяемая для экспрессии АР39 кассета экспрессии кодировала слитый протеин (сигнал □-фактора + производное L19), в котором у сигнальной последовательности был элиминирован только сайт расщепления Кех2 и не были элиминированы все остальные сайты расщепления, необходимые для процессинга, встречающегося в естественных условиях □-фактора. Стабильно трансфектированные клоны Pichia pastoris (РР) получали введением путем электропорации линеаризированных векторов в штаммы Pichia pastoris (например, рР1С9К-АР39 трансформировали штамм GS115, a pGAP-AP39 трансформировали штамм Х33) и последующего отбора с использованием генетицина или зеоцина. Эти клоны можно использовать для получения указанных производных L19 в виде растворимого секреторного протеина. Клоны культивировали при 30°С в BMGY-среде или в основной минеральной среде. При использовании клонов, основой которых является pPIC, добавляли метанол для усиления индукции в процессе фазы экспрессии. Рекомбинантный продукт имел правильно процессированные концы и высокую антигенсвязывающую активность. Возможный выход (неочищенного биологически активного продукта/л супернатанта культуры) зависел от условий культивирования и контроля процесса: например, для pPIC9K-AP39/GSl15 (во встряхиваемой колбе выход составлял 5 мг/л, в ферментере 10-15 мг/л); для pGAP-AP39/X33 (во встряхиваемой колбе выход составлял 30-40 мг/л, в ферментере 100-250 мг/л).

Производные L19 очищали из супернатанта культур Pichia pastoris или Е.coli с помощью аффинной хроматографии (загруженная протеином А колонка, фирма Streamline Pharmacia или загруженная антигеном ED В колонка) с последующей гель-фильтрацией. Очищенная, содержащая АР39 фракция, которую применяли для дальнейшего процессинга, имела гомодимерную структуру (где субъединицы ковалентно связаны с основной частью) и обладала высокой антигенсвязывающей активностью.

Пример 2а

Синтез восстановленного АР38 [восстановленный L19-(Gly)₃-Cys-OH]

К раствору, содержащему 240 мкг (4,29 нмоля) S-S-димерного АР38 в 156 мкл ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) 10% глицерина, добавляли 50 мкл раствора ТКЭФ (14,34 мг ТКЭФ×HCl/5 мл водного Na₂HPO₄, 0,1М, рН 7,4). Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. SH-мономерный АР38 очищали с помощью гель-фильтрации с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР). Анализ с помощью ДСН-ПААГ выделенного продукта позволил установить количество S-S-димерного АР38, трансформированного в SH-мономерный АР38. Выход: 79,4 мкг/220 мкл ЗФР (33,1%).

Пример 26

Синтез Tc-99m-AP38 [Tc-99m-L19-(Gly)₃-Cys-OH]

2,37 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 79,4 мкг восстановленного АР38 в 220 мкл ЗФР, и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₄-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 50 мкл элюата Tc-99m-генератора (24 ч) и 10 мкл раствора SnCI₂ (5 мг SnCl₂/1 мл 0,1М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 0,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Tc-99m АР38 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	39,7%
Радиохимическая чистота:	92,5% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	17,7 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	88,7%

Пример 3а

Синтез восстановленного АР39 [восстановленный L19-(Gly)_3-Cys-Ala-OH]

К раствору, содержащему 240 мкг (4,29 нмоля) S-S-димерного АР39 в 135 мкл ЗФР/10% глицерина, добавляли 50 мкл раствора ТКЭФ (14,34 мг ТКЭФ×HCl/5 мл водного Na₂HPO₄, 0,1М, рН 7,4). Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. SH-мономерный АР39 очищали с помощью гель-фильтрации с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР). Анализ с помощью ДСН-ПААГ выделенного продукта позволил установить количество S-S-димерного АР39, трансформированного в SH-мономерный АР39. Выход: 135,9 мкг/180 мкл ЗФР (56,2%).

Пример 3б

Синтез Tc-99m-AP39 [Tc-99m-L19-(Gly)₃-Cys-Ala-OH]

4,2 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 135,9 мкг восстановленного АР39 в 180 мкл ЗФР, и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₄-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 100 мкл элюата Tc-99m-генератора (24 ч) и 10 мкл раствора SnCl₂ (5 мг SnCl₂/1 мл 0,1М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 0,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Tc-99m АР39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	50,1%
Радиохимическая чистота:	91,5% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	21,4 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	96,4%

Пример 4

Синтез Re-188-AP38 [Re-188-L19-(Gly)₃-Cys-ОН]

2,37 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 112 мкг восстановленного АР38 в 310 мкл ЗФР, и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₄-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 100 мкл элюата Re-188-генератора и 50 мкл раствора SnCl₂ (5 мг SnCl₂/l мл 0,1 М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 1,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Re-188 AP38 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	28,3%
Радиохимическая чистота:	91,1% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	15,3 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	89,9%

Пример 5

Синтез Re-188-AP39[Re-188-L19-(Gly)₃-Cys-Ala-OH]

2,37 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 112 мкг восстановленного АР39 в 303 мкл ЗФР, и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₄-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 100 мкл элюата Re-188-генератора и 50 мкл раствора SnCl₂ (5 мг SnCl₂/1 мл 0,1М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 1,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Re-188 AP39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	33,5%
Радиохимическая чистота:	92,3% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	18,5 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	92,5%

Пример 6а

Синтез восстановленного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH

К раствору, содержащему 240 мкг (4,29 нмоля) S-S-димерного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH в 160 мкл ЗФР/10% глицерина, добавляли 75 мкл раствора ТКЭФ (14,34 мг ТКЭФ х HCl/5 мл водного раствора Na₂HPO₄, 0,1М, рН 7,4). Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. SH-мономерный L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР). Анализ с помощью ДСН-ПААГ выделенного продукта позволил установить количество S-S-димерного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH, трансформированного в SH-мономерный L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH. Выход: 80,4 мкг/210 мкл ЗФР (33,5%).

Пример 6б

Синтез Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH

2,37 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 80,4 мкг восстановленного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH в 210 мкл ЗФР, и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₂-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 50 мкл элюата Tc-99m-генератора (24 ч) и 10 мкл раствора SnCl₂ (5 мг SnCl₂/1 мл 0,1 М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 0,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Tc-99m L19-Gly-Cys-Gly-Cys-OH очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	37,7%
Радиохимическая чистота:	91,5% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	19,7 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	89,7%

Пример 7а

Синтез восстановленного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH

К раствору, содержащему 240 мкг (4,29 нмоля) S-S-димерного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH в 155 мкл ЗФР/10% глицерина, добавляли 75 мкл раствора ТКЭФ (14,34 мг ТКЭФ×HCl/5 мл водного раствора Na₂HPO₄ 0,1M, рН 7,4). Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение 1 ч при комнатной температуре. SH-мономерный L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР). Анализ с помощью ДСН-ПААГ выделенного продукта позволил установить количество S-S-димерного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH, трансформированного в SH-мономерный L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH.

Выход: 81,2 мкг/215 мкл ЗФР (33,8%).

Пример 7б

Синтез Tc-99m-L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH

2,37 мг динатрий-L-тартрата помещали в пузырек, куда далее добавляли 81,2 мкг восстановленного L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH в 215 мкл ЗФР и раствор разбавляли 100 мкл водного Na₂HPO₄-буфера (1М, рН 10,5). Добавляли 50 мкл элюата Tc-99m-генератора (24 ч) и 10 мкл раствора SnCl₂ (5 мг SnCl₂/1 мл 0,1М HCl). Реакционную смесь встряхивали в течение 0,5 ч при 37°С. Меченный с помощью Tc-99m L19-Gly-Cys-Gly-Cys-Ala-OH очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	35,6%
Радиохимическая чистота:	93,5% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	19,1 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	88,7%

Пример 8а

Синтез восстановленного АР39 для специфической конъюгации хелаторов типа ЭДТК, ЦДТК, ТЕТК, ДТПК, ТТГК, HBED, ДОТУ, НОТК и DO3A с SH-группой цистеина

50 мкл раствора ТКЭФ (14,34 мг ТКЭФ×HCl/5 мл водного раствора Na₂HPO₄, 0,1М, рН 7,4) добавляли к раствору, содержащему 400 мкг (7,1 нмоля) АР39 в 450 мкл ЗФР. Реакционную смесь осторожно встряхивали в течение 1 ч при 37°С. Восстановленный АР39 очищали с помощью гель-фильтрации с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: натрий ацетатный буфер, 0,1М, рН 5,0). Анализ с помощью ДСН-ПААГ выделенного продукта доказал полную трансформацию АР39 в восстановленный АР39. Выход: 140 мкг/200 мкл ЗФР (35%).

Пример 8б

Синтез МХ-ДТПК-малеимида(1,4,7-триаза-2-(N-малеимидоэтилен-пара-амино)бензил-1,7-бис(карбоксиметил)-4-карбоксиметил-6-метилгептан)

512 мг (1 ммоль) {[3-(4-аминофенил)-2-(бискарбоксиметиламино)пропил][2-(бискарбоксиметиламино)пропил]амино}уксусной кислоты (фирма Macrocyclics Inc. Даллас, шт. Техас, США) и 707 мг (7 ммолей) триэтиламина растворяли в 3 мл безводного ДМФ. Добавляли по каплям 400 мг (1,5 ммоля) 2,5-диоксопирролидин-1-илового эфира 3-(2,5-диоксо-2,5-дигидропиррол-1-ил)пропионовой кислоты (фирма Aldrich) в 1 мл безводного ДМФ. Раствор перемешивали в течение 5 ч при 50°С. Медленно добавляли 30 мл диэтилового эфира. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 30 мин. Осадок собирали фильтрацией. Неочищенный продукт очищали с помощью ОФ-ЖХВР (ацетонитрил: вода: трифторуксусная кислота / 3:96,9:0,1→99,9:0:0,1). Выход: 61% (405 мг, 0,61 ммоля). MC-ESI: 664=M⁺+1.

Пример 8в

Синтез In-111-МХ-ДТПК-малеимид-S(Cys)-АР39-R

(R обозначает восстановленный)

140 мкг (5 нмолей) AP39-R в 200 мкл натрий-ацетатного буфера (0,1М, рН 5) подвергали взаимодействию с 50 мкл растворенного 1,4,7-триаза-2-(N-малеимидоэтилен-пара-амино)бензил-1,7-бис(карбоксиметил)-4-карбоксиметил-6-метилгептана (0,25 мг ДТПК-малеимида в 500 мкл натрий ацетатного буфера, 0,1М, рН 5) в течение 3 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергали диализу (2×1 ч) каждый раз в противотоке 200 мл натрий ацетатного буфера (0,1М, рН 6), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).

Добавляли 80 мкл раствора [In-111]InCl₃(HCl, 1н., 40 МБк, фирма Amersham Inc.) и реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Меченный с помощью In-111 ДТПК-малеимид-S(Cys)-АР39-R очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	54%
Радиохимическая чистота:	94% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	6,2 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	86%

Пример 9

Синтез In-11l-MX-ДТПК-ε-HN(Lys)-AP39

200 мкг (3,6 нмоля) невосстановленного АР39 в 111 мкл ЗФР разбавляли 300 мкл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5) и подвергали диализу (2×1 ч) в противотоке 200 мл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Добавляли 50 мкл раствора 1,4,7-триаза-2-(пара-изотиоцианат)бензил-1,7-бис(карбоксиметил)-4-карбоксиметил-6-метилгептана (МХ-ДТПК) (0,33 мг МХ-ДТПК, растворенного в 500 мкл натрий боратного буфера, 0,1М, рН 8,5) и реакционную смесь выдерживали в течение 3 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергали диализу (2×1 ч и 1×17 ч (в течение ночи)) каждый раз в противотоке 200 мл натрий ацетатного буфера (0,1М, рН 6,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).

Добавляли 80 мкл раствора [In-111]InCl₃ (HCl, 1 н., 40 МБк, фирма Amersham Inc.) и реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Меченный с помощью In-111 МХ-ДТПК-ε-NH(Lys)-АР39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	70%
Радиохимическая чистота:	85% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	7,6 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	74%

Пример 10

Синтез In-111-ДОТУ-С-бензил-пара-HCS-ε-НМ(Lys)-АР39

200 мкг (3,6 нмоля) невосстановленного АР39 в 114 мкл ЗФР разбавляли 300 мкл натрий боратного буфера (0,1М, рН 8,5) и подвергали диализу (2×1 ч) в противотоке 200 мл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Добавляли 50 мкл раствора 1,4,7,10-тетраза-2-(пара-изотиоцианат)бензилциклодекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (бензил-пара-SCN-ДОТУ, фирма Macrocyclics Inc., Даллас, шт. Техас, США) (1,5 мг бензил-пара-SCN-ДОТУ, растворенного в 5 мл натрий боратного буфера, 0,1М, рН 8,5) и реакционную смесь выдерживали в течение 3 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергали диализу (2×1 ч и 1×17 ч (в течение ночи)) каждый раз в противотоке 200 мл натрий-ацетатного буфера (0,1М, рН 6,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).

Добавляли 80 мкл раствора [In-111]InCl₃ (HCl, 1н., 40 МБк, фирма Amersham Inc.) и реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Меченный с помощью In-111 ДОТУ-С-бензил-пара-NCS-ε-HN(Lys)-АР39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	74%
Радиохимическая чистота:	94% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	12,3 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	73%

Пример 11

Синтез Y-88-МХ-ДТПК-ε-НМ(Lys)-АР39

200 мкг (3,6 нмоля) невосстановленного АР39 в 115 мкл ЗФР разбавляли 300 мкл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5) и подвергали диализу (2×1 ч) в противотоке 200 мл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Добавляли 50 мкл раствора МХ-ДТПК (0,33 мг МХ-ДТПК, растворенного в 500 мкл натрий-боратного буфера, 0,1М, рН 8,5) и реакционную смесь выдерживали в течение 3 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергали диализу (2×1 ч и 1×17 ч (в течение ночи)) каждый раз в противотоке 200 мл натрий ацетатного буфера (0,1М, рН 6,0), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).

Добавляли 100 мкл раствора [Y-88]YCl₃ (HCl, 1 н., 75 МБк, фирма Oak Ridge National Lab.) и реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Меченный с помощью Y-88 МХ-ДТПК-ε-НК(Lys)-АР39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	65%
Радиохимическая чистота:	93% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	10,2 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	72%

Пример 12

Синтез Lu-177-ДОТУ-C-бензил-пара-NCS-ε-HN(Lys)-AP39

200 мкг (3,6 нмоля) невосстановленного АР39 в 110 мкл ЗФР разбавляли 300 мкл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5) и подвергали диализу (2×1 ч) в противотоке 200 мл натрий-боратного буфера (0,1М, рН 8,5), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США). Добавляли 50 мкл раствора бензил-пара-SCN-ДОТУ (1,5 мг растворенного в 5 мл натрий-боратного буфера, 0,1М, рН 8,5) и реакционную смесь выдерживали в течение 3 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергали диализу (2×1 ч и 1×17 ч (в течение ночи)) каждый раз в противотоке 200 мл натрий-ацетатного буфера (0,1М, рН 6,0), используя устройство типа Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (фирма Pierce Inc., Рокфорд, шт. Иллинойс, США).

Добавляли 200 мкл раствора [Lu-177]LuCl₃ (HCl, 1н., 80 МБк, фирма NRH-Petten, Нидерланды) и реакционную смесь выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Меченный с помощью Lu-177 ДОТУ-С-бензил-пара-NCH-ε-НМ(Lys)-АР39 очищали гель-фильтрацией с использованием колонки NAP-5 (фирма Amersham, элюент: ЗФР).

Радиохимический выход:	74%
Радиохимическая чистота:	95% (ДСН-ПААГ)
Удельная активность:	19 МБк/нмоль
Иммунореактивность:	71%

Пример 13

Распределение в органах и экскреция Tc-99m-АР39, экспрессируемого в Pichia pastoris, после однократной внутривенной (i.v.) инъекции несущим опухоль бестимусным мышам

Субстанцию, предлагаемую в изобретении, вводили внутривенно в дозе примерно 74 кБк животным (вес тела примерно 25 г), несущим карциному линии F9 (тератокарцинома). Дозу радиоактивности в различных органах и радиоактивность в экскрементах оценивали с помощью γ-счетчика в различные моменты времени после введения субстанции. Кроме того, на основе данных о концентрации субстанции, предлагаемой в изобретении, в опухоли и крови в различные моменты времени рассчитывали соотношение в опухоли и крови.

Данные о биораспределении Tc-99m-АР39 в организме бестимусных мышей, несущих F9 (тератокарцинома) (средние значения ± СКО, n=3), представлены в таблице 2:

Таблица 2
	% дозы/г ткани	% дозы/г ткани	% дозы/г ткани
	1 ч p.i.	5 ч p.i.	24 ч p.i.
Селезенка	1,97±0,018	0,53±0,07	0,31±0,08
Печень	1,91±0,046	0,77±0,07	0,26±0,01
Почка	19,21±0,70	4,35±0,082	1,32±0,10
Легкое	3,43±1,01	1,41±0,032	0,96±0,23
Желудок без содержимого	1,55±0,043	1,35±0,22	0,48±0,10
Кишечник с содержимым	1,42±0,10	1,26±0,34	0,29±0,05
Опухоль	10,72±3,21	5,13±1,45	3,48±1,28
Кровь	3,03±0,32	0,57±0,11	0,11±0,01

Данные об экскреции Tc-99m-АР39 из организма бестимусных мышей, несущих F9 (тератокарцинома) (средние значения ± СКО, n=3), представлены в таблице 3:

Таблица 3
	% дозы
	24 ч p.i.
Моча	80,63±3,33
Кал	3,94±0,17

Данные о соотношении Tc-9mт-АР39 в опухоли/крови у бестимусных мышей, несущих F9 (тератокарцинома) (средние значения ± СКО, n=3), представлены на фиг.2

Результаты данного исследования свидетельствуют об очень высокой способности субстанции, предлагаемой в изобретении, накапливаться в плотных опухолях в сочетании с очень высокой способностью к экскреции.

Пример 14

Распределение в органах In-111-МХ-ДТПК-ε-HN(Lys)-АР39 после однократной i.v.-инъекции несущим опухоль бестимусным мышам

Субстанцию, предлагаемую в изобретении, вводили внутривенно в дозе примерно 48 кБк животным (вес тела примерно 25 г), несущим карциному линии F9 (тератокарцинома). Дозу радиоактивности в различных органах и радиоактивность в экскрементах оценивали с помощью γ-счетчика в различные моменты времени после введения субстанции.

Данные о биораспределении In-111-MX-ДТПК-ε-HN(Lys)-AP39 в бестимусных мышах, несущих F9 (тератокарцинома) (средние значения ±СКО, т=3), представлены в таблице 4:

Таблица 4
	% дозы/г ткани
	1 ч p.i.	3 ч p.i.	24 ч p.i.
Селезенка	1,94±0,49	1,28±0,13	1,18±0,24
Печень	2,61±1,32	2,59±0,36	2,26±0,75
Легкое	1,52±1,57	2,36±0,30	0,76±0,21
Желудок без содержимого	1,44±0,81	1,40±0,31	0,65±0,28
Кишечник с содержимым	5,05±5,26	1,07±0,34	0,67±0,11
Опухоль	12,90±4,81	7,44±1,34	4,33±0,84
Кровь	5,55±1,89	1,80±0,20	0,11±0,02

Данные о соотношении In-111-МХ-ДТПК-ε-НМ(Lys)-АР39 в опухоли/крови у бестимусных мышей, несущих F9 (тератокарцинома) (средние значения ± СКО, n=3), представлены в таблице 5.

Таблица 5
	1 ч p.i.	3 ч p.i.	24 ч p.i.
Соотношение в опухоли/крови	2,76±2,00	4,16±0,75	36,36±3,78

Результаты данного исследования свидетельствуют об очень высокой способности субстанции, предлагаемой в изобретении, накапливаться в плотных опухолях в сочетании с очень хорошим биораспределением и соотношением в опухоли/крови.

Пример 15

Визуализация с использованием Tc-99m-АР39. экспрессируемого в Pichia pastoris, после однократной i.v.-инъекции несущим опухоль бестимусным мышам

Субстанцию, предлагаемую в изобретении, вводили внутривенно в дозе примерно 9,25 МБк животным (вес тела примерно 25 г), несущим карциному линии F9 (тератокарцинома). В различные моменты времени после введения субстанции осуществляли визуализацию с помощью гамма-камеры.

Результаты плоскостной сцинтиграфии несущих F9 (тератокарциному) бестимусных мышей с использованием Tc-99m-АР39 представлены на фиг.3 и 4. На фиг.3 представлена сцинтиграмма, полученная через 5 ч после инъекции субстанции, а на фиг.4 представлена сцинтиграмма, полученная через 24 ч после инъекции субстанции.

Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что использование субстанции, предлагаемой в изобретении, открывает большие возможности для визуализации плотных опухолей.

1. Соединение, предназначенное для связывания с доменом ED-B фибронектина, которое представляет собой фрагмент одноцепочечного меченного радиоактивным изотопом антитела и включает пептид, который содержит антигенсвязывающий сайт для внешнего домена В (ED-B) фибронектина, выбранный из группы, включающей:
аа) последовательность, содержащую гипервариабельные участки HCDR3 и/или LCDR3, представленные в таблице 1, из последовательности Seq. Id. No.1;
аб) последовательность, содержащую гипервариабельные участки HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные в таблице 1, из последовательности Seq. Id. No.1;
ав) последовательность, которая представлена в Seq. Id. No.1 (L1 9);
и первичную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей:
ба) последовательность, представленную в Seq. Id. No.2,
бб) последовательность, представленную в Seq. Id. No.3,
бв) последовательность, представленную в Seq. Id. No.4;
причем С-конец последовательности, описанной в аа), аб) или ав), связан с N-концом одной из последовательностей, представленных в Seq. Id. No.2, Seq. Id. No.3 или Seq. Id. No.4, через пептидную связь.

2. Соединение по п.1, где аминокислотная последовательность Seq. Id. No.2 представляет собой последовательность Gly-Gly-Gly-Cys (Seq. Id. No.5) или Gly-Cys-Gly-Cys (Seq. Id. No.6).

3. Соединение по п.1, где аминокислотная последовательность Seq. Id. No.3 представляет собой последовательность Gly-Gly-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No.7) или Gly-Cys-Gly-Cys-Ala (Seq. Id. No.8).

4. Соединение по п.1, где значение n в аминокислотной последовательности Seq. Id. No.4 равно 6.

5. Соединение по п.1, дополнительно конъюгированное с радиоактивным изотопом и предназначенное для диагностики и лечения ангиогенных заболеваний.

6. Соединение по п.5, конъюгированное с радиоактивным изотопом, выбранным из радиоактивного изотопа технеция, такого как ^94mТс, ^99mTc, рения, такого как ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, или других изотопов, таких как ²⁰³Pb, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ^110mIn, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁸Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹²¹Sn, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁰⁵Rh, ¹⁷⁷Lu, ⁷²As и ¹⁸F.

7. Соединение по п.6, где радиоактивный изотоп представляет собой ^99mТс или ¹⁸⁸Re.

8. Соединение по п.1, где пептид находится в восстановленной форме.

9. Фармацевтическая композиция, предназначенная для диагностики ангиогенных заболеваний, включающая в качестве действующего вещества терапевтически эффективное количество соединения по одному из пп.1-8 в сочетании с физиологически приемлемыми вспомогательными веществами, носителями и/или разбавителями.

10. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения ангиогенных заболеваний, включающая в качестве действующего вещества терапевтически эффективное количество соединения по одному из пп.1-8 в сочетании с физиологически приемлемыми вспомогательными веществами, носителями и/или разбавителями.

11. Композиция по пп.9 и 10, отличающаяся тем, что до 70% или более которой экскретируется у мышей через 24 ч через почки.

12. Композиция по любому из пп.9-11, отличающаяся тем, что через 5 ч после введения мышам соотношение ее распределения в опухоли/крови составляет 5:1 или более.

13. Композиция по п.9, предназначенная для применения в диагностике.

14. Композиция по п.10, предназначенная для применения в терапии.

15. Применение соединения по пп.1-4 для связывания с радиоактивным изотопом.

16. Применение по п.15, где радиоактивный изотоп выбирают из радиоактивного изотопа технеция, такого как ^94mТс, ^99mTc, рения, такого как ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, или других изотопов, таких как ²⁰³Pb, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc, ^110mIn, ¹¹¹In, ⁹⁷Ru, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁸Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹²¹Sn, ¹⁶¹Tb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁰⁵Rh, ¹⁷⁷Lu, ⁷²As и ¹⁸F.

17. Применение по п.16, где радиоактивный изотоп представляет собой ^99mТс или ¹⁸⁸Re.

18. Способ получения соединения по одному из пп.1-4, отличающийся тем, что пептид экспрессируют в эукариотических клетках.

19. Способ по п.18, отличающийся тем, что эукариотические клетки представляют собой клетки дрожжей.

20. Способ по п.18, отличающийся тем, что эукариотические клетки представляют собой клетки Pichia pastoris.

21. Способ по п.18, отличающийся тем, что пептид экспрессируется конститутивно.

22. Способ по п.18, отличающийся тем, что N-конец пептида связывают непосредственно с сайтом расщепления Кех2 из α-сигнальной последовательности.

23. Набор для получения меченных с помощью радиоактивных изотопов фармацевтических агентов, включающий соединение по одному из пп.1-8 и вспомогательные вещества.
Приоритет по пунктам:

03.01.2002 по пп.1-5, 7-12, 15, 18-22;

25.02.2002 по пп.1-5, 7-12, 15, 18-22;

02.01.2003 по пп.6, 13-14, 16-17, 23.