Штамм streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini вкпм-s887 - продуцент блеомицина a2 и способ получения антибиотика блеомицина a2
Владельцы патента RU 2355758:
Государственное учреждение научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН (ГУ НИИНА им.Г.Ф.Гаузе РАМН) (RU)
Изобретение относится к новому штамму - продуценту антибиотика блеомицина и его использованию в биосинтезе противоопухолевого антибиотика блеомицина А2, эффективного при лечении плоскоклеточного рака и ряда других типов опухолей. Штамм-продуцент Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 получен в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, УФ-излучения и гамма-лучей 60Со на исходный штамм №1129 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих аминоэтилцистеин, карбамоилцистеин, канаванин, метилтреонин в качестве селективных агентов. Полученный штамм №7-99 депонирован в ВКПМ под номером S887. Штамм по сравнению с исходным штаммом обладает более чем в 10 раз повышенной продуктивностью. Продуцируемый штаммом продукт представляет собой однокомпонентный антибиотик - содержание антибиотического комплекса в культуральной жидкости штамма по изобретению составляет 140 мкг монокомпонентного блеомицина А2 в 1 мл. Чистота целевого продукта достигается хроматографией элюата с КБ-2 на сорбенте "Стиросорб MN-200», на котором сорбируются только примеси. Высокая активность нового штамма ВКПМ-S887 определяет перспективность его использования для промышленного производства блеомицина A2. 2 н.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к медицинской промышленности и касается нового штамма-продуцента противоопухолевого антибиотика блеомицина, широко используемого в терапии плоскоклеточного рака и ряда других типов опухолей.
Противоопухолевый антибиотик блеомицин, широко применяемый в медицинской практике (Bleocin, Nippon Kayaku, Japan и Blenoxan, Bristol Mayor׳s, USA) является смесью нескольких гликопептидных компонентов, наиболее терапевтически ценным из которых является блеомицин А2.
Известен штамм Streptoverticillium subsp. Bleomycini 1129 - продуцент антибиотического комплекса блеомицинов [1]. Недостатками данного штамма являются содержание в его культуральной жидкости нескольких близкородственных блеомицинов, что затрудняет выделение и очистку целевого антибиотика, а также низкая антибиотическая активность.
Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент однокомпонентного блеомицина А2 в результате многоступенчатого мутагенного воздействия метилнитрозогуанидина, УФ-излучения и гамма-лучей 60Со на исходный штамм №1129 с последующим отбором мутантов на средах, содержащих аминоэтилцистеин, карбамоилцистеин, канаванин, метилтреонин в качестве селективных агентов.
Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГУП ГосНИИгенетика под номером ВКПМ-S887.
Штамм ВКПМ-S887 обладает высокой продуктивностью однокомпонентного блеомицина А2 (140 мкг блеомицина А2 в 1 мл культуральной жидкости) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ВКПМ-S887. Температура 37°C; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал с десятидневной культуры штамма, выращенного на овсяном агаре. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (таблица):
Морфологические признаки. Гифы воздушного мицелия прямые или извилистые, цепочки спор прямые, расположены мутовчато, поверхность спор гладкая.
Физиолого-биохимические свойства. Аэроб растет при (24-37)°С; оптимум - 37°С, желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с лимонно-кислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует глюкозу, фруктозу, сахарозу, лактозу; умеренно - инозит, арабинозу, рафинозу, слабо - маннит; не использует ксилозу.
Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозонитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Micrococcus luteus и грамотрицательных бактерий Bacterium paracoli, Commomonas terrigena, дрожжей Saccharomyces cerevisiae; не действует на Escherichia coli. Специфических вирулентных фагов не выявлено, лизиса в процессе ферментации не происходит.
Штамм ВКПМ-S887 поясняется следующим примером:
Пример 1. Споровым материалом с мицелием культуры Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887, выращенной в течение (7-10) суток на овсяной агаровой среде, засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) и выращивают (18-24) часа при 37°С на качалке при (220-240) об/мин. Состав посевной среды, %:
| Глюкоза | 1,0 |
| Соевая мука | 1,5 |
| Глицерин | 3,0 |
| Натрий хлористый | 0,3 |
| Мел | 0,5 |
| Вода | Водопроводная |
| рН до стерилизации | 6,8 |
Выросшим мицелием в количестве (3-5) % засевают питательную среду (100 мл в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл) следующего состава, %;
| Глицерин | 1,0 |
| Соевая мука | 2,0 |
| Кукурузный экстракт | 0,5 |
| Цинк сернокислый | 0,1 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | 0,3 |
| Вода | Водопроводная |
| рН до стерилизации | 6,8 |
Ферментацию проводят на качалке при (200-220) об/мин, 28°С в течение 144 час. Антибиотическую активность культуральной жидкости определяют методом тонкослойной хроматографии с биологическим проявлением по Bacillus subtilis ATCC 6633. Содержание блеомицина А2 в культуральной жидкости продуцента к концу ферментации составляет 140 мкг/мл.
Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является более чем в 10 раз повышенная продуктивность и однокомпонентность антибиотика, а именно, содержание многокомпонентного антибиотического комплекса в культуральной жидкости штамма-прототипа 10 мкг/мл, в заявленном штамме 140 мкг монокомпонентного блеомицина А2 в 1 мл. Высокая активность нового штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 определяет перспективность его использования для создания нового лекарственного препарата блеомицина на основе промышленного производства блеомицина A2.
Блеомицин выделяют из культуральной жидкости, полученной в результате биосинтеза штамма-продуцента ВКПМ-S887, сорбцией на карбоксильной смоле КБ-2 в солевой форме. Смолу промывают 0,5 М раствором уксусной кислоты и антибиотик десорбируют 0,25 н. раствором соляной кислоты. После повторной сорбции на карбоксильном катионите КБ-2 в солевой форме блеомицин элюируют 0,15-молярным водным буферным раствором уксуснокислого аммония с рН 6,5 и проводят дальнейшую очистку на сорбенте "Стиросорб MN-200». Полученный таким образом раствор антибиотика обеззоливают, концентрируют и блеомицин А2 осаждают ацетоном из водно-метанольного раствора при рН (4,0-4,5) в форме гидрохлорида. Общий выход блеомицина А2 не менее 70%.
Блеомицин А2, полученный на основе биосинтеза нового мутантного штамма Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887, представляет собой белый порошок, хорошо растворимый в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и не растворим в других органических растворителях. По физико-химическим свойствам, антибактериальной и противоопухолевой активности и токсичности полностью соответствует стандартному образцу блеомицина А2. Брутто-формула: C55H84N17O21S3·4НС1. Мол. масса 1561 а.е.м.
УФ-спектр: λmax (вода)нм=243; 290.
Мол. масса основания (метод MALDI-TOF-MS)=1417 (М+2Н) и 1439 (M+Na++H);
| Культурально-морфологические признаки штамма | ||||
| Агаровая среда | Рост воздушного мицелия* | Цвет мицелия | Растворимый | |
| Воздушного | Субстратного | Пигмент | ||
| №1 Гаузе | ++ | Белый (Д3) до розоватого (Г2) | Бесцветный | Нет |
| Овсяная | +++ | Белый (Д3) | Бесцветный | Нет |
| Чапека | +++ | Белый (Д3), До розоватого (Г3) | Бесцветный | Нет |
| Глюкозо-аспарагиновая | +++ | Белый (Д3) до розоватого (Г3) | Бесцветный | Нет |
| Линденбайна (глицерин-нитратная) | ++ | Белый (Д3) | Бесцветный | Нет |
| Глюкозо-нитратная №2 Гаузе | ++ | Белый (Д3) | Бесцветный | Нет |
| Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) | Меланоидные пигменты не образуются | |||
| */+++ - хороший; ++ - умеренный; |
ЛИТЕРАТУРА
1. SU, авторское свидетельство, №563818.
1. Штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ-S887 - продуцент антибиотика блеомицина А2.
2. Способ получения антибиотика блеомицина A2 путем биосинтеза штамма-продуцента, сорбции антибиотика из нативного раствора, элюции антибиотика с последующим его выделением, концентрацией и осаждением, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Streptomyces griseocarneus subsp. bleomycini ВКПМ- S887, сорбцию примесей проводят на сорбенте "Стиросорб MN-200", раствор антибиотика обеззоливают, концентрируют и осаждают ацетоном в форме гидрохлорида.
