Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой мутантную ацетолактатсинтазу бактерий (AHAS I), в которой L-аминокислота в позиции 17, 30 и/или 33 в малой субъединице природной ацетолактатсинтазы из Escherichia coli заменена на другую L-аминокислоту или несколько L-аминокислот встроены в указанную позицию или позиции, и ингибирование валином по типу обратной связи в указанной субъединице ослаблено. Изобретение касается также фрагмента ДНК, кодирующего указанную ацетолактатсинтазу, которым трансформируют бактерию рода Escherichia для получения разветвленной L-аминокислоты. Изобретение позволяет получать разветвленные L-аминокислоты с высокой степенью эффективности. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот, таких как разветвленные L-аминокислоты. Более конкретно, настоящее изобретение касается использования нового фермента со снятым ингибированием L-валином по типу обратной связи, который участвует в биосинтезе разветвленных L-аминокислот. А именно, настоящее изобретение касается новой мутантной ацетолактатсинтазы (AHAS I) со снятым ингибированием L-валином по типу обратной связи из Е.coli, бактерии семейства Enterobacteriaceae, которая содержит этот фермент, и способа получения разветвленных L-аминокислот методом ферментации с использованием штаммов этих бактерий.

Описание предшествующего уровня техники

Обычно L-амнокислоты получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, выделенных из природных источников, или их мутантов. В большинстве случаев микроорганизмы модифицируют таким образом, чтобы увеличить промышленный выход L-аминокислот.

Описано много технологий для увеличения производственного выхода L-аминокислот, включая трансформацию микроорганизмов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие технологии увеличения производственного выхода включают увеличение активности ферментов, участвующих в биосинтезе аминокислот и/или снижение чувствительности целевых ферментов к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, выложенную заявку Японии 56-18596 (1981), заявку РСТ WO 95/16042 или патенты США US 5661012 и US 6040160).

Биосинтез изолейцина, лейцина и валина осуществляется через разветвленный метаболический путь, в котором общим для каждого продукта являются три стадии. Реакция с участием ацетолактатсинтазы (синоним: AHAS - Acetohydroxyacid synthase) является первым этапом биосинтеза, общим для каждого из этих продуктов. Эти реакции катализируются изоферментами и являются мишенями для ингибирования конечным продуктом валином; указанная регуляция играет главную роль для физиологического контроля этого пути метаболизма в бактерии. Реакция включает конденсацию активного ацетальдегида (происходящего из пирувата) с эфиром α-кетобутирата или пирувата, в результате чего образуется α-ацето-α-гидроксибутират (предшественник изолейцина) или α-ацетолактат (предшественник лейцина и валина) соответственно.

Было описано, что валин и его кето-кислотный предшественник α-кетоизовалериановая кислота ингибируют рост штамма Е.coli K12 и то, что изолейцин снимает это ингибирование (Tatum E.L., Fed. Proc. 8:511 (1946)). В настоящее время концепция о том, что ингибирование валином в основном является результатом блокирования синтеза α-ацето-α-гидроксибутирата является общепринятой. Изучение штамма E.coli K12 показало, что этот штамм содержит структурные гены для трех активностей AHAS, обозначаемых изоферментами AHAS I, AHAS II, и AHAS III. AHAS I и AHAS III оба ингибируются валином, тогда как AHAS II устойчив к этому ингибированию; однако AHAS II экспрессируется в клетках штамма Е.coli K12 необычным образом (Guardiola J. et al., Mol. Gen. Genet. 156:17-25 (1977)). Все изоферменты AHAS из энтеробактерий состоят из большой и малой субъединиц в составе терамера α₂β₂, при этом большие субъединицы обладают каталитической функцией, а малые субъединицы осуществляют регуляторную функцию. Малые субъединицы абсолютно необходимы для проявления чувствительности фермента к ингибированию валином по типу обратной связи. Изучение индивидуальных свойств субъединиц изоферментов AHAS I и AHAS III (Weinstock О. et al., J. Bacteriol. 174:5560-5566 (1992)) показало, что малые субъединицы специфически индуцируют каталитически компетентную конформацию целого фермента и стабилизируют переходное состояние.

На модели валин-связывающей области регуляторной малой субъединицы AHAS III из Е.coli были получены несколько малых субъединиц, укороченные на разную длину со стороны С-конца. Эти малые субъединицы с укороченными на различную длину С-концами индуцировали недостаточную чувствительность к валину у укороченных ферментов AHAS III (Mendel S. et al., J. Mol. Biol.10; 325(2):275-84 (2003)).

Однако в настоящее время отсутствуют сообщения, описывающие мутантную бактериальную ацетолактатсинтазу (AHAS I) со снятым ингибированием валином и использование мутантной ацетолактатсинтазы для целей увеличения продуцирования разветвленных L-аминокислот соответствующими штаммами-продуцентами L-аминокислот.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление новой мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы для получения штаммов-продуцентов разветвленных L-аминокислот, обладающих повышенной продуктивностью L-лейцина, L-изолейцина или L-валина, и предоставление способа получения L-лейцина, L-изолейцина или L-валина с использованием этих штаммов.

Эта цель была достигнута путем конструирования новой мутантной ацетолактатсинтазы из Е.coli. Мутантная ацетолактатсинтаза из Е.coli была сконструирована таким образом, что имеет мутацию в регуляторной субъединице ilvN, а именно мутацию Asn-17, Ala-30 и/или Ala-33. Было показано, что использование такой мутантной ацетолактатсинтазы может увеличить продукцию разветвленной L-аминокислоты при условии, если в штамм-продуцент разветвленной L-аминокислоты ввести несколько копий мутантного фермента. Так было осуществлено настоящее изобретение.

Целью настоящего изобретения является предоставление малой субъединицы мутантной ацетолактатсинтазы (AHAS I) из бактерий, причем L-аминокислота в позиции 17, 30 и/или 33 в малой субъединице ацетолактатсинтазы природного типа из Escherichia coli заменена на другую аминокислоту или несколько аминокислот встроены в указанную или указанные позиции, в результате чего фермент становится нечувствительным к ингибированию валином по типу обратной связи.

Также целью настоящего изобретения является предоставление малой субъединицы мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы (AHAS I), описанной выше, причем аспарагин в позиции 17 ацетолактатсинтазы природного типа заменен на лизин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление малой субъединицы мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы (AHAS I), описанной выше, причем аланин в позиции 30 ацетолактатсинтазы природного типа заменен на пролин.

Также целью настоящего изобретения является предоставление малой субъединицы мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы (AHAS I), описанной выше, причем аланин в позиции 33 ацетолактатсинтазы природного типа заменен на последовательность из 12-и аминокислот, имеющую в своем составе сайт терминации трансляции.

Также целью настоящего изобретения является предоставление мутантной ацетолактатсинтазы из бактерий, включающей малую субъединицу, описанную выше.

Также целью настоящего изобретения является предоставление мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы, описанной выше, причем указанная природная ацетолактатсинтаза происходит из Escherichia coli.

Также целью настоящего изобретения является предоставление мутантной бактериальной ацетолактатсинтазы, описанной выше, которая включает делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одной или более позиций, кроме позиций 17, 30 и/или 33, причем фермент становится нечувствительным к ингибированию валином по типу обратной связи.

Также целью настоящего изобретения является предоставление фрагмента ДНК, кодирующего мутантную ацетальдегидсинтазу, описанную выше.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии семейства Enterobacteriaceae, которая содержит фрагмент ДНК, описанный выше, и обладает способностью к продукции разветвленных L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем указанная разветвленная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем активность мутантной ацетолактатсинтазы в этой бактерии увеличена.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем активность мутантной ацетолактатсинтазы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего мутантную ацетолактатсинтазу.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем активность мутантной ацетолактатсинтазы увеличена способом, выбранном из группы, включающей:

а) увеличение количества копий гена мутантной ацетолактатсинтазы,

б) модифицирование последовательности, контролирующей экспрессию гена таким образом, что экспрессия этого гена усиливается.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, описанной выше, причем количество копий гена увеличено путем встраивания нескольких копий гена мутантной ацетолактатсинтазы в хромосому бактерии.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения разветвленных L-аминокислот, включающего выращивание бактерии, описанной выше, в питательной среде и выделение разветвленных L-аминокислот из культуральной жидкости.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем бактерия обладает усиленной экспрессией генов, участвующих в метаболических путях биосинтеза разветвленных L-аминокислот.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, причем указанная разветвленная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.

Настоящее изобретение более подробно будет описано ниже.

<1> Мутантная ацетолактатсинтаза и мутантный ген ilvN.

Термин «бактериальная ацетолактатсинтаза» означает, что ацетолактатсинтаза присутствует в бактерии семейства Enterobacteriaceae, в коринебактериях, бактериях, принадлежащих к роду Bacillus и т.д.. Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, Erwinia, Providencia, и Serratia. Бактерии рода Escherichia являются предпочтительными.

Термин «активность ацетолактатсинтазы» означает способность фермента катализировать реакцию с образованием 2-ацето-2-гидроксибутирата и СО₂ из пирувата и 2-оксобутаноата. Ацетолактатсинтазная активность экстрактов может быть измерена с использованием метода F.C.Stormer и Н.Е.Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)).

Ацетогидроксибутаноатсинтаза I/ацетолактатсинтаза I (AHAS I) является гетеротетрамерным белком, состоящим из двух каталитических и двух регуляторных доменов (Weinstock О. et al., J. Bacteriol., 174(17), 5560-5566 (1992)). Общепринятым является то, что большая субъединица (са. 60-kDa) является каталитической, тогда как малая субъединица - регуляторной. AHAS I кодируется генами ilvB и ilvB.

Замена в малой субъединице ацетолактатсинтазы из Escherichia coli [EC 4.1.3.18] аминокислоты аспарагин в позиции 17 и/или аланин в позиции 30 на любую аминокислоту, предпочтительно на лизин в позиции 17, на пролин в позиции 30 приводит к формированию мутантного белка со снятым ингибированием валином по типу обратной связи. Также замена аланина в позиции 33 на любую аминокислоту, предпочтительно на последовательность из 12-и аминокислот, содержащих сайт терминации трансляции приводит к формированию укороченного белка из 45-и аминокислот ilvB33 (SEQ ID NO:11). Этот мутантный белок также устойчив к ингибированию валином по типу обратной связи.

Ацетолактатсинтаза, содержащая замену, или замены и/или вставку в позиции 17 вместо аспарагина, в позиции 30 вместо аланина и/или в позиции 33 вместо аланина в природном варианте ацетолактатсинтазы, может обозначаться как «мутантная ацетолактатсинтаза». Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную ацетолактатсинтазу, может обозначаться как «мутантный ген ilvB» или как «мутантный ген ацетолактатсинтазы». Ацетолактатсинтаза без замены или замен и/или без вставки может обозначаться как «природная ацетолактатсинтаза».

Ген ilvB (синоним - b3671) кодирует большую субъединицу ацетолактатсинтазы. Ген ilvB (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 3849119 по 3850807; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 16129170 в GenBank) расположен между генами ilvB и ivbL на хромосоме штамма Е.coli K-12.

Ген ilvB (синоним - b3670) кодирует малую субъединицу ацетолактатсинтазы Ген ilvB (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с номерами с 3848825 по 3849115; в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2, gi: 49175990 в GenBank) расположен между генами uhpA и ilvB на хромосоме штамма E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена ilvB и аминокислотная последовательность малой субъединицы ацетолактатсинтазы, которую кодирует ген ilνB, показана на SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно.

Мутантная ацетолактатсинтаза получается путем введения мутаций в природный вариант гена ilvB с использованием известных методов. Поэтому оперон ilvBN, состоящий из генов ivB и ilvB, может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены, кодирующие ацетолактатсинтазу из других микроорганизмов, могут быть получены подобным способом.

Мутантная ацетолактатсинтаза может включать делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одной или в нескольких позициях, кроме позиций 17, 30 и/или 33, при условии, что активность ацетолактатсинтазы при этом не снизится. Число «несколько» аминокислот различается в зависимости от позиции или типа аминокислотных остатков в трехмерной структуре белка. Это объясняется тем, что некоторые аминокислоты похожи друг на друга по структуре и функции, которую они выполняют в белке, и взаимная замена таких аминокислот не приводит к значительному изменению в трехмерной структуре или функции белка. Поэтому в качестве мутантной ацетолактатсинтазы может выступать белок, который имеет гомологию не менее чем 70%, предпочтительно не менее чем 80% и наиболее предпочтительно не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности ацетолактатсинтазы, при условии, что активность ацетолактатсинтазы при этом сохраняется.

Замена, делеция, вставка или добавление одной или нескольких аминокислотных остатков должны представлять собой консервативную мутацию или консервативные мутации таким образом, чтобы сохранялась активность фермента. Репрезентативная консервативная мутация является консервативной заменой. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gln, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gln, замену Cys на Ser или Ala, замену Gln на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gln, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr, замену Il на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gln, His или Arg, замену Met на Il, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Tyr, Met, Il или Leu, замену Ser на Thr or Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu.

В рамках настоящего изобретения ссылка на порядковый номер аминокислотного остатка, например, фраза «аминокислотные остатки в позициях 17, 30 и/или 33» означает места расположения этих остатков в аминокислотной последовательности белка ацетолактатсинтазы природного типа из Е.coli, показанной на SEQ ID NO:2. В ацетолактатсинтазе из Е.coli природного типа в позиции 17 расположен аспарагин, аминокислотный остаток в позиции 30 является аланином, аминокислотный остаток в позиции 33 - также аланин. Положение аминокислотного остатка может меняться. Например, если аминокислотный остаток введен в N-концевую часть, то аминокислотный остаток, в действительности локализованный в позиции 17, 30 и/или 33, становится позицией 18, 31 и/или 34. В этом случае аминокислотный остаток в первоначальной позиции 17, 30 и/или 33 является аминокислотным остатком в позиции 17, 30 и/или 33 согласно настоящему изобретению.

Для того чтобы идентифицировать L-аминокислоту в позиции 17, 30 и/или 33 ацетолактатсинтазы из Е.coli, необходимо сопоставить аминокислотную последовательность ацетолактатсинтазы из Е.coli (SEQ ID NO:2) с аминокислотной последовательностью ацетолактатсинтазы из интересующей бактерии и установить L-аминокислоты в позициях 17, 30 и/или 33 в ацетолактатсинтазе из интересующей бактерии.

Фрагмент ДНК, который кодирует главным образом тот же белок, что и мутантная ацетолактатсинтаза, описанная выше, может быть получен, например, путем модификации нуклеотидной последовательности ДНК, кодирующей ацетолактатсинтазу, например, посредством сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков в специфическом сайте удаляют, заменяют, вставляют или добавляют. Фрагмент ДНК, модифицированный как описано выше, может быть получен с помощью общеизвестных мутагенных воздействий. Такие воздействия включают обработку препарата ДНК, содержащего ген ilvN в условиях in vitro, гидроксиламином, или обработку микроорганизма, например бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и содержащей указанный мутантный ген ilvN, УФ-облучением или реагентами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или азотистой кислотой.

Замена, делеция, инсерция или добавление нуклеотидов, как описано выше, может также включать мутации, имеющие место в природе, которые (мутация или вариант), например, возникают на основе индивидуальных различий внутри вида или рода бактерий, которые содержат ацетолактатсинтазу.

Фрагмент ДНК, который кодирует главным образом тот же белок, что и мутантная ацетолактатсинтаза, описанная выше, может быть получен, например, выделением фрагмента ДНК, которая способна гибридизоваться с зондом, имеющим в своем составе полную нуклеотидную последовательность гена ilvN или его часть в жестких условиях и которая кодирует белок, обладающий активностью ацетолактатсинтазы из клеток, содержащих мутантную ацетолактатсинтазу, которые были подвергнуты мутагенному воздействию.

В рамках настоящего изобретения термин «жесткие условия» означает такие условия, при которых так называемые специфические гибриды, например гибриды, имеющие гомологию не менее чем 60%, предпочтительно не менее чем 70%, наиболее предпочтительно не менее чем 80% и еще более предпочтительно не менее чем 90% и в наибольшей степени предпочтительно не менее чем 95%, формируются, а неспецифические гибриды, например гибриды, имеющие более низкую гомологию, чем указано выше, не формируются. Например, показательными являются жесткие условия, при которых ДНК способна гибридизоваться при отмывке один или более раз, предпочтительно два или три раза при концентрации соли, эквивалентной обычным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, то есть 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Длительность отмывки зависит от типа мембраны, используемой для блотинга и, как правило, является той, что рекомендуют производители. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для мембраны Hybond™ N+ nylon (Amersham, США) в жестких условиях составляет 15 минут. Количество отмывок предпочтительно может составлять от 2-х до 3-х раз. Длина зонда может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от условий гибридизации и обычно составляет от 100 п.о. до 1000 п.о.

Уровень гомологии между аминокислотными последовательностями белков и между нуклеотидными последовательностями фрагментов ДНК может быть определен с использованием таких программ построения выравнивания, как BLAST search, FASTA search и Clustal W.

Программа BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) является эвристическим алгоритмом поиска, используемым программами blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, и tblastx; эти программы обрабатывают результаты своего поиска с использованием статистических методов, разработанных Karlin, Samuel and Stephen F Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Программа «FASTA search» описана W.R.Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Программа «Clustal W» описана Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).

Ген, который гибридизуется в условиях, описанных выше, включает гены, которые имеют стоп-кодон внутри кодирующей области, и гены, которые являются неактивными в связи с мутацией активного сайта. Однако такие затруднения могут быть легко устранены путем лигирования гена с коммерчески доступным экспрессирующим вектором и путем оценки ацетолактатсинтазной активности экспрессируемого белка.

<2> Бактерия согласно настоящему изобретению.

Бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом разветвленных L-аминокислот, принадлежит к семейству Enterobacteriaceae и содержит фрагмент ДНК, который кодирует мутантную ацетолактатсинтазу. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом разветвленных L-аминокислот семейства Enterobacteriaceae, в которой активность мутантной ацетолактатсинтазы повышена. Конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом разветвленных L-аминокислот семейства Enterobacteriaceae, причем продукция разветвленных L-аминокислот этой бактерией увеличена путем увеличения активности белка согласно настоящему изобретению. Бактерия согласно настоящему изобретению является бактерией-продуцентом разветвленных L-аминокислот, принадлежащей к роду Escherichia, причем продукция разветвленных L-аминокислот этой бактерией увеличена путем увеличения активности белка согласно настоящему изобретению, а именно мутантной ацетолактатсинтазы со снятым ингибированием валином по типу обратной связи в этой бактерии. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит фрагмент ДНК со сверхэкспрессированным геном ilvB в хромосоме или в плазмиде в бактерии и обладает повышенной активностью по продукции разветвленных L-аминокислот.

Согласно настоящему изобретению термин «бактерия, обладающая способностью к продукции разветвленной L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению разветвленной L-аминокислоты, такой как L-лейцин, L-изолейцин и L-валин в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Способность вырабатывать разветвленную L-аминокислоту может быть придана микроорганизму или усилена в нем путем селекционного выведения.

Фраза «бактерия, обладающая способностью к продукции разветвленной L-аминокислоты» в качестве применяемого здесь термина также означает бактерию, способную продуцировать и вызывать накопление разветвленной L-аминокислоты в питательной среде в больших количествах по сравнению с диким типом или родительским штаммом и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде разветвленные L-аминокислоты в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Показательными L-аминокислотами являются L-лейцин, L-изолейцин и L-валин.

Семейство Enterobacteriaceae включает бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и так далее. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnologylnformation) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbmpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea, предпочтительна.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, но не ограничивается только ею, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Фраза «активность мутантной ацетолактатсинтазы увеличена» означает, что удельная активность выше, чем в немодифицированном штамме, например диком штамме. Примеры увеличения активностей включают увеличение количества молекул мутантной ацетолактатсинтазы в расчете на одну клетку и увеличение специфической активности в расчете на одну молекулу мутантной ацетолактатсинтазы и так далее. Кроме того, в качестве примера, для сравнения может быть использован дикий штамм, например штамм Escherichia coli K-12. В результате усиления активности мутантной ацетолактатсинтазы увеличивается количество разветвленных L-аминокислот в культуральной жидкости.

Увеличение активности мутантной ацетолактатсинтазы в бактериальной клетке может быть достигнуто путем усиления экспрессии гена, кодирующего указанную мутантную ацетолактатсинтазу. Может быть использован любой ген, кодирующий мутантную ацетолактатсинтазу, полученный или выделенный из бактерии семейства Enterobacteriaceae или из коринеформной бактерии. Среди них гены, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, являются предпочтительными.

Трансформирование бактерии фрагментом ДНК, кодирующим белок, означает введение фрагмента ДНК в клетку бактерии, например путем общеизвестных методов с целью усиления экспрессии гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению и с целью увеличения активности белка в бактериальной клетке.

Способы усиления экспрессии гена включают увеличение количества копий гена. Введение гена в вектор, который способен функционировать в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает количество копий гена. Для этих целей предпочтительно могут быть использованы мультикопийные вектора, такие как pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b или подобные им. Усиление экспрессии гена может быть также достигнуто путем введения нескольких копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобными ей методами.

Также усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем помещения фрагмента ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Сила промотора определяется частотой инициации синтеза РНК. Способы оценки силы промотора и примеры сильных промоторов описаны Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). В качестве примера, промотор Р_R известен как сильный конститутивный промотор. В качестве других сильных промоторов известны P_L промотор, lac промотор, trp промотор, trc промотор фага лямбда и другие.

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в фрагмент ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Шайна-Дальгарно (SD-последовательность) вместо природной SD-последовательности, в случае, если природная SD-последовательность предшествует стартовому кодону mRNA, которая взаимодействует с 168-рРНК (Shine J. and Dalgamo L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71, 4, 1342-6).

Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением количества копий гена.

Методами получения плазмидной ДНК, гибридизации, ПЦР, приготовления плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook J. and Russell D. "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения ранее упомянутых фрагментов ДНК в бактериальную клетку, которая уже способна продуцировать разветвленную L-аминокислоту. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции разветвленной L-аминокислоты бактерии, уже содержащей указанные фрагменты ДНК.

В качестве родительского штамма используются бактерии-продуценты L-валина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Н-81 (VKPM В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (патент США US4391907), VKPM B-4411 (патент США US 5658766), VKPM В-7707 (Европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2) или подобные им. Также используются бактерии-продуценты L-лейцина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы Н-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM ВР-4706) (патент США US 5744331), VKPM B-7386 и VKPM B-7388 (патент РФ RU 2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W1485lip2/pMWdAR6 и AJ12631/pMWdAR6 (Европейский патент ЕР 0872547) или подобные им. Также используются штаммы бактерий-продуцентов L-изолейцина, принадлежащих к роду Escherichia, такие как штамм (NZ10) TDH6/pVIC40, pMWD5 (Hashiguchi К. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(4), 672-679 (1999)) или штамм AJ12919, описанный в Европейской патентной заявке ЕР 685555 A1, или подобные им штаммы.

<3> Способ согласно настоящему изобретению.

Способ согласно настоящему изобретению включает продукцию разветвленной L-аминокислоты, такой как L-лейцин, L-изолейцин и L-валин, путем выращивания бактерий согласно настоящему изобретению в питательной среде, обеспечивающего выработку разветвленной L-аминокислоты в культуральную жидкость и выделение разветвленной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка разветвленных L-аминокислот из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от способа ассимиляции выбранной бактерии может быть использован спирт, включая этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. При необходимости в питательную среду могут быть добавлены дополнительные питательные вещества. Например, если для роста бактерии необходимо присутствие пролина (ауксотрофность по пролину), то в питательную среду может быть добавлено значительное количество пролина.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, например при перемешивании культуральной жидкости на качалке, взбалтывании с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 42°С, предпочтительно в пределах от 37°С до 40°С; рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2; рН среды можно доводить аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1-го до 5-и дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие неограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Пример 1. Клонирование оперона ilvBN, кодирующего AHAS I из Е.coli

Опреон ilvBN клонировали на векторе pMIV5JS как продукт ПЦР размером 2439 п.о. Конструирование вектора описано ниже в Примере-ссылке 1. Хромосому штамма MG1655 использовали в качестве матрицы для ПЦР. Синтетические олигонуклеотиды ilvBX60 (SEQ ID NO:3) и ilvBR64 (SEQ ID NO:4) использовали в качестве праймеров. Праймер ilvBX60 содержит на своем 5'-конце сайт рестрикции XbaI, а праймер ilvBR64 содержит на своем 5'-конце сайт рестрикции SalI. Температурный профиль ПЦР был следующим: денатурация в течение 5 минут при температуре 94°С; профиль для 30-и последующих циклов: 30 с при 94°С, 30 с при 59°С, 2 мин при 72°С; стадия элонгации: 7 мин при 72°С. Продукт ПЦР размером 2449 п.о. очищали в агарозном геле, обрабатывали рестриктазами XbaI и SalI и клонировали в вектор pMIV5JS, который предварительно обрабатывали теми же рестриктазами. В качестве реципиентного штамма для клонирования использовали штамм B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH. Конструирование штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH описано ниже в Примере-ссылке 2. Полученная в результате плазмида pMIV-P_ivbL-ilvBN (Фиг.1) комплементировала AHAS^- фенотип штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH.

Пример 2. Выведение мутантных штаммов Е.coli, обладающих изоформой I ацетолактатсинтазы (IlvBN^ValR), устойчивой к ингибированию валином по типу обратной связи.

Штамм B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-P_ivbL-ilvBN, описанный в Примере 1, содержит только один оперон, кодирующий AHAS (оперон ilvBN). Спонтанные мутанты, устойчивые к ингибированию валином, отбирали на чашках с минимальной средой, дополненной валином в концентрации 1 г/л. Активность ацетолактатсинтазы и ферментов, устойчивых к ингибированию L-валином, определяли в неочищенных экстрактах по методу F.C.Stomer and H.E.Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Для получения неочищенных лизатов клетки выращивали на минимальной среде М9 до достижения ими конца логарифмической фазы роста, отмывали 100 мМ буфером КН₂PO₄/K₂HPO₄, дополненным 100 мМ KCl, рН 7.0. Неочищенные клеточные лизаты приготавливали путем обработки клеток в том же буфере ультразвуковым излучением. Плазмиды, выделенные из отобранных мутантов, устойчивых к ингибированию валином, использовали для ретрансформации AHAS-дефицитного штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH. В результате была получена плазмида pMIV-P_ivbL-ilvBN^ValR33, которая обеспечивает рост AHAS-дефицитного реципиентного штамма, устойчивого к ингибированию валином.

Эта плазмида содержит оперон, кодирующий AHAS I, устойчивый к ингибированию валином. Измеряли остаточную активность AHAS в присутствии 10 мМ L-валина. Остаточная активность AHAS = активности в присутствии 10 мМ L-валина (нмоль/мин мг)·100%/активность в отсутствии L-валина (нмоль/мин мг). Активность AHAS измеряли по методу F.C.Stormer and H.E.Umbarger (Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592 (1964)). Результаты измерения активности AHAS для этого штамма представлены в Табл.1.

Пример 3. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего AHAS I Е.coli, устойчивую к ингибированию валином.

Для секвенирования фрагмента ДНК, несущего ilvBN и клонированного

в pMIV-P_ivbL-ilvBN33 использовали пять олигонуклеотидов: ML74 (SEQ ID NO:5), LattRS1 (SEQ ID NO:6), ilvbS31 (SEQ ID NO:7), ilvbS32 (SEQ ID NO:8) и ilvbS33 (SEQ ID NO:9). Стратегия секвенирования представлена на Фиг.2.

Полученная нуклеотидная последовательность показана в Перечне последовательностей как ilvBN33 (SEQ ID NO:10). Сравнение этой последовательности с помощью расчетных программам выявило прямой повтор фрагмента из 34 нуклеотидов в области кодирования малой субъединицы. Мутантный ген назвали ilvN33 (Фиг.3). Реконструирование аминокислотной последовательности исходя из нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК выявило четыре аминокислотные замены и более раннюю терминацию трансляции, приводящие к синтезу белка IlvN33, укороченного на 45 аминокислот (SEQ ID NO:11).

Пример 4. Интеграция оперона P_ivbL-ilvBN^ValR33 в хромосому штамма, дефицитного по AHAS, с последущим вырезанием маркера cat.

1. Интеграция генов cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33 в хромосому.

Для интеграции mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33 в хромосому бактерии использовали стандартную процедуру. Вектор pMIV-P_ivbL-ilvBN^ValR33 вводили в клетки B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMH10. Mu-транспозазу, кодируемую плазмидой рМН10 (производная плазмиды pACYC177, содержащая ген Km^R, гены А и В фага Mu, кодирующие Mu-транспозазу, ген cts62, кодирующий Mu репрессор, и репрессор гена cI857 фага лямбда) (Европейский патент ЕР 1149911) индуцировали инкубацией в течение 20-и минут при температуре 44°С сразу после трансформации.

Клоны, устойчивые к хлорамфиниколу (Cm^R), отбирали при температуре 30°С на чашках с LB агаром, содержащим хлорамфиникол в концентрации 20 мг/л. После удаления обоих плазмид путем выращивания этих клонов на агаре LB, получили клоны Cm^RKm^SАр^S, способные расти на минимальной среде без добавок.

В результате получили штамм B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33, содержащий интегрированную кассету mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33 в неустановленном локусе хромосомы.

2. Удаление маркера устойчивости к хлорамфиниколу из штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33.

Для удаления маркера устойчивости к хлорамфиниколу из штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH, клетки mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33 трансформировали плазмидой pMW118-int-xis (Ар^R) (заявка РСТ WO 2005/010175). Клоны Ар^R выращивали на чашках с агаром LB, содержащим ампициллин в концентрации 150 мг/л при температуре 30°С. Несколько тэнов клонов Ар^R были пикетированы и протестированы на устойчивость к хлорамфиниколу. Плазмиду pMW118-int-xis удаляли из клеток путем инкубации на чашках с LB агаром при температуре 42°С. В результате получали штамм B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu:P_ivbL-ilvBN^ValR33, содержащий интегрированную в неустановленный локус хромосомы кассету mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33. Измеряли остаточную активность AHAS в присутствии 10 мМ L-валина. Результаты измерения активности AHAS для этого штамма представлены в Табл.1.

Пример 5. Замена нативного промотора оперона ilvBN^ValR33 на искусственную область регуляции.

1. Модификация регуляторной области оперона ilvBN^ValR33

Модификация регуляторной области оперона ilvBN^ValR33, то есть замена области нативного промотора оперона ilvBN на промотор P_L, произведена методом, описанным Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) и названным «Red-зависимая интеграция». Согласно этой процедуре синтезировали праймеры для ПЦР ilvB-attR1 (SEQ ID NO:12) и ilvB-PLSD (SEQ ID NO:13). Олигонуклеотид ilvB-attR1 (SEQ ID NO:12) гомолгичен области, предшествующей гену ilvB и области, примыкающей к гену, обуславливающему устойчивость к антибиотику, которая присутствовала в хромосомной ДНК штамма BW25113 cat-P_L-yddG. Олигонуклеотид ilvB-PLSD (SEQ ID NO:13) гомологичен как области ilvB, так и области, следующей за промотором P_L, который присутствовал на хромосоме штамма BW25113 cat-P_L-yddG. Полученный штамм BW25113 cat-P_L-yddG описан подробно ранее (Европейский патент ЕР 1449918 А1, патент РФ 2222596). Фрагмент ДНК хромосомы штамма BW25113 cat-P_L-yddG использовали в качестве матрицы для ПЦР. Температурный профиль ПЦР был следующим: денатурация в течение 3 минут при температуре 95°С; температурный профиль для двух первых циклов: 1 мин при 95°С, 30 с при 34°С, 40 с при 72°С; температурный профиль для 20 последних 30-и циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; стадия элонгации: 5 мин при 72°С.

В результате получали продукт ПЦР (SEQ ID NO:14), очищали его в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33, который содержит плазмиду pKD46 с температурочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит в своем составе фрагмент ДНК фага λ размером 2,154 п.о. (31088-33241) (инвентарный № J02459 в GenBank), содержащий гены системы λ, ответственные за Red-гомологичную рекомбинацию (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33.

Электрокомпетентные клетки приготавливали следующим образом: штамм Е.coli B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu:P_ivbL-ilvBN^ValR33 выращивали в течение ночи при температуре 30°С в LB среде, содержащей ампициллин (100 мг/л), выросшую культуру разводили в 100 раз в 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Клетки выращивали с аэрацией при температуре 30°С до достижения ими оптической плотности OD₆₀₀≈0.6 и затем придавали им электрокомпетентность путем концентрирования в 100 раз и трехкратной отмывки ледяной деионизированной водой. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл суспензии клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при температуре 37°С в течение 2.5 часов, после этого рассеивали на чашки с L-агаром и выращивали при температуре 37°С для отбора Cm^R рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46, проводили два пассажа на L-агаре при температуре 42°С и полученные колонии тестировали на чувствительность к ампициллину.

2. Проверка модификации регуляторной области ilvBN

Получили клон B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33, содержащий кассету mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33 с мутантным опероном BN^ValR33, кодирующим AHAS I, устойчивую к ингибированию валином по типу обратной связи, под контролем промотора фага лямбда P_L, маркироанный геном устойчивости Cm. Замену нативной регуляторной области ilvBN на промотор P_L, промаркированный геном устойчивости Cm, проверяли в ПЦР. Для проверки с помощью ПЦР использовали праймер MR74 (SEQ ID NO:15), специфический к правому сайту фага Mu, и праймер, специфичный к гену ацетилтрансферазы хлорамфиникола Cm-test2 (SEQ ID NO:16). Условия ПЦР-верификации были следующие: денатурация в течение 3 мин при температуре 94°С; температурный профиль для 30-и циклов: 30 с при температуре 94°С, 30 с при температуре 55°С, 1 мин при температуре 72°С; стадия элонгации: 7 мин при температуре 72°С. Продукт ПЦР, полученный в результате реакции, где в качестве матрицы использовали клетки B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_ivbL-ilvBN^ValR33, имел длину 586 п.о, (SEQ ID NO:17). Продукт ПЦР, полученный в реакции с клетками штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-P_L-ilvBN^ValR33 в качестве матрицы, имел в длину 879 п.о. (SEQ ID NO:18). Остаточную активность AHAS в штамме B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu:cat-P_L-ilvBN^ValR33 измеряли в присутствии 10 мМ L-валина. Результаты измерения активности AHAS для этого штамма представлены в Табл.1.

Пример 6. Накопление L-валина штаммами Е.coli с валин-устойчивой AHAS I

Оба штамма Е.coli B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33 и B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu:cat-P_L-ilvBN^ValR33 выращивали в течение 18-ти часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем клетки с поверхности чашки размером приблизительно 0.5 см² вводили в среду для ферментации (2 мл) и выращивали в пробирках с аэрацией в течение 72 часов при температуре 32°С. Среда для ферментации только для ауксотрофного AHAS-дефицитного штамма B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH была, кроме того, дополнена каждая отдельно изолейцином и валином в концентрации 100 мг/мл. Накопленные количества L-валина измеряли с помощью ТСХ. Результаты измерения представлены в Табл.2.

Состав среды для ферментации был следующим, г/л:

Глюкоза	60.0
(NH4)2SO4	18.0
КН2PO4 3Н2О	2.0
MgSO4 7H2O	1.0
СаСО3	25.0
Тиамин	0.02
Мамено	4.0

Как видно из Табл.2, экспрессия валин-устойчивой AHAS I приводила к продукции валина. Оперон P_ivbL-ilvBN^ValR33 контролируется путем аттенуации транскрипции и циклической АМФ. Замена нативной регуляторной области оперона ilvBN^ValR33 (включающая элиминирование гена, кодирующего лидерный пептид (ivbL)) в штамме Е.coli B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::P_ivbL-ilvBN^ValR33 на промотор фага лямбда P_L увеличивала продукцию L-валина в 1.5 раза.

Пример 7. Новые штаммы Е.coli с мутациями, приводящими к устойчивости AHAS I к валину, и модифицированной экспрессией оперона ilvBN.

Нативную регуляторную область оперона ilvBN заменяли на промотор фага лямбда P_L тем же методом, который описан в Примере 5. Для этой цели штамм В7 ΔilvIH ΔilvGM (см. Пример-ссылку 2, Раздел 5), несущий единственную AHAS I, использовали в качестве исходного штамма для такой модификации. Полученный штамм В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBN был валин-чувствительным. Новые валин-устойчивые спонтанные мутации AHAS I получали из этого штамма. Штаммы с улучшенным ростом на среде с валином (1 г/л) охарактеризовывали (Табл.3).

Также получали валин-устойчивые мутации, которые проявляли устойчивость к изолейцину. Получали варианты со специфической активностью, которая превышала специфическую активность в диком штамме. Как видно из Табл.4, экспрессия валин-устойчивой AHAS 1 приводила к продукции валина. Среда для ферментации содержала 6% глюкозы. Определяли нуклеотидные последовательности мутантных оперонов для двух лучших мутантов ilvBN ValRl и ilvBN ValR4. Установили, что IlvBN ValR 1 содержит одну точечную мутацию в IlvN: A30P Ala-Pro (кодон gcc оказался заменен на кодон ссс) и IlvBN ValR4 также содержит одну точечную мутацию в IlvN: N17K Asn-Lys (кодон аас оказался замененным на кодон aag). В обоих случаях такие замены были редкими.

Пример 8. Накопление L-лейцина штаммами Е.coli с валин-устойчивой AHAS I.

Кассету cat-P_L-ilvBN ValR4 вводили в штамм-продуцент L-лейцина Е.coli 57 (патент RU 2140450, VKPM В-7386). Для этой цели штамм Е.coli 57 инфицировали фагом P1_vir, вырощенным на донорском штамме В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBNValR4. Трансдуктанты отбирали на чашках с L-агаром, дополненных хлорамфиниколом (20 мкг/мл).

Оба штамма Е.coli 57 и 57 cat-P_L-ilvBNValR4 выращивали, как описано в

Примере 6. Накопленные количества L-лейцина измеряли с помощью ТСХ.

Результаты представлены в Табл.5.

Как видно из Табл.5, штамм 57 cat-P_L-ilvBNValR4 накапливал большее количество L-лейцина.

Пример-ссылка 1. Конструирование плазмиды pMIV5JS.

PMIV-5JS сконструировали согласно следующей схеме. Сначала сконструировали плазмиду рМ12 путем интеграции in vivo Mu-производной интеграционной кассеты в плазмиду pMWl, которая является производной от плазмиды pMW119 (Фиг.4). Синтезировали две концевые олигонуклеотидные последовательности, комплементарные друг другу (SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20). Терминатор thrL получили путем отжига этих синтетических олигонуклеотидов в прямом (SEQ ID NO:19) и обратном (SEQ ID NO:20) направлениях. Терминатор thrL фланкировали сайтами HindIII и PstI, Затем сконструировали плазмиду рМ12-ter(thr) путем вставки синтетической терминаторной последовательности Ter(thr) в плазмиду рМ12, которая предварительно была обработана рестриктазами HindIII Mph1103I (Фиг.5).

Интегративную кассету intJS конструировали следующим образом (Фиг.6):

а) методом ПЦР амплификации получили фрагмент ДНК LattL размером 0.12 тыс. п.о. с использованием праймера upstream (SEQ ID NO:21) (сайт для BglII подчеркнут) и фосфорилированного праймера downstream (SEQ ID NO:22). В качестве матрицы использовалась плазмида pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB (заявка РСТ WO 2005/010175);

б) методом ПЦР амплификации с использованием фосфорилированного праймера upstream (SEQ ID NO:23) и праймера downstream (SEQ ID NO:24) (сайт для PstI подчеркнут) получили фрагмент ДНК Cm^R размером 1.03 тыс. п.о. В качестве матрицы использовали плазмиду pACYC184;

в) методом ПЦР амплификации с использованием праймера upstream (SEQ ID NO:25) (сайт для PstI подчеркнут) и праймера downstream (SEQ ID NO:26) (сайт для SacI выделен подчеркнут) получили фрагмент ДНК LattR размером 0.16 тыс. п.о. В качестве матрицы использовали плазмиду pMW118-attL-tet-attR-ter_rrnB.

г) фрагменты ДНК LattL and Cm^R лигировали, и полученный в результате этого фрагмент ДНК LattL-Cm^R размером 1.15 тыс. п.о. очищали;

д) фрагменты ДНК LattL-Cm^R и LattR расщепляли рестриктазой PstI, лигировали, и полученный в результате фрагмент ДНК LattL-Cm^R-LattR размером 1.31 тыс. п.о. очищали;

е) двухцепочечный фрагмент ДНК размером 70 п.о., содержащий несколько клонированных сайтов (MCS) получали путем отжига двух синтезированных олигонуклеотидов: нуклеотида, имеющего последовательность, показанную на SEQ ID NO:27 и другого нуклеотида, имеющего последовательность, комплементарную последовательности, показанной на SEQ ID NO:27;

ж) фрагменты ДНК LattL-Cm^R-LattR и MCS расщепляли рестриктазой SacI, лигировали, и полученную в результате кассету LattL-Cm^R-LattR-MCS размером 1.38 тыс. п.о. очищали;

Для получения плазмиды pMIV-5JS на конечной стадии фрагмент ДНК LattL-Cm^R-LattR-MCS расщепляли рестриктазами BglII и HindIII и клонировали в плазмиду pM12-ter(thr), предварительно обработанную рестриктазами BamHI и HindIII (Фиг.7).

Пример-ссылка 2. Конструирование штамма с инактивированными генами ацетолактатсинтазы.

1. Делеция оперона ilvBN

Делеция оперона ilvBN была создана посредством метода, впервые разработанного Datsenko и Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) и названного как «Red-зависимая интеграция». Согласно этой процедуре синтезировали праймеры для ПЦР ilvBN1 (SEQ ID NO:28) и ilvBN2 (SEQ ID NO:29), гомологичные как области, прилегающей к оперону ilvBN, так и к гену, обуславливающему устойчивость к хлорамфиниколу в матричной плазмиде. Плазмиду pMW-attL-Cm-attR (заявка РСТ WO 05/010175) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Условия проведения ПЦР были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при температуре 95°С; температурный профиль для двух первых циклов: 1 мин при 95°С, 30 с при 34°С, 40 с при 72°С; температурный профиль для последних 30-и циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; стадия элонгации: 5 мин при 72°С.

Полученный таким образом продукт ПЦР размером 1713 п.о. очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655, содержащий плазмиду pKD46 с температурочувствительной репликацией. Плазмида pKD46 (Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит в своем составе фрагмент ДНК размером 2,154 п.о. (31088-33241) фага λ (инвентарный № J02459 в GenBank), содержащий гены λ системы Red-гомологичной рекомбинации (гены γ, β, ехо). Под контролем промотора P_araB, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма Е.coli MG1655.

Электрокомпетентные клетки были приготовлены следующим образом: ночную культуру Е.coli MG1655/pKD46 выращивали при температуре 30°С в LB-среде, дополненной ампициллином (100 мг/л), разводили в 100 раз в 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) с ампициллином и L-арабинозой (1 мМ). Полученную культуру выращивали с аэрацией при температуре 30°С до достижения ею оптической плотности OD₆₀₀≈0.6 и затем придавали клеткам свойство электрокомпетентности путем их концентрироания в 100 раз и трехкратной отмывки ледяной деионизированной водой. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеточной суспензии и ≈100 нг продукта ПЦР. Клетки после электропорации инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при температуре 37°С в течение 2.5 часов и после этого рассеивали на чашки с L-агаром и выращивали при температуре 37°С для отбора Cm^R-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 2 пассажа на L-агаре проводили при температуре 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.

2. Проверка делении оперона ilvBN методом ПЦР.

Мутанты с делецией оперона ilvBN, маркированные геном устойчивости к хлорамфиниколу Cm проверяли методом ПЦР. Локус-специфические праймеры ilvBNC5 (SEQ ID NO:30) и ilvBNC6 (SEQ ID NO:31) использовали в ПЦР для проверки. Условия для ПЦР-верификации были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при температуре 94°С; температурный профиль для 30-и циклов был следующий: 30 с при 94°С, 30 с при 53°С, 1 мин при 72°С; стадия элонгации: 7 мин при температуре 72°С. Продукт ПЦР, полученный в результате реакции, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы родительского ilvBN⁺ штамма MG1655, был в длину 2275 п.о., а продукт ПЦР, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы мутантного штамма MG1655 ΔilvBN::cat, имел длину 1995 п.о. (Фиг.8).

3. Деления оперона ilvIH

Удаление опреона ilvIH проводили с использованием того же подхода, что и для удаления оперона ilvBN, описанного в Разделе 1. Согласно этой процедуре синтезировали праймеры для ПЦР ilvIH1 (SEQ ID NO:32) и ilvIH2 (SEQ ID NO:33), гомологичные областям, прилегающим к оперону ilvIH и гену, обуславливающему устойчивость к хлорамфиниколу в матричной плазмиде. Плазмиду pMW-attL-Cm-attR (заявка РСТ WO 05/010175) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Условия для ПЦР были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при температуре 95°С; температурный профиль для первых двух циклов: 1 мин при 95°С, 30 с при 34°С, 40 с при 72°С; температурный профиль для последних 30-и циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; стадия элонгации: 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР размером 1713 п.о. очищали в агарозном геле и использовали для электроапорации в штамм Е.coli MG1655/pKD46. Рекомбинанты, устойчивые к хлорамфиниколу, отбирали после элктроапорации и проверяли посредством ПЦР с использованием локус-специфических праймеров ilvIHC3 (SEQ ID NO:34) и ilvIHC4 (SEQ ID NO:35). Условия для ПЦР-верификации были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при 94°С; температурный профиль для 30-и циклов: 30 с при 94°С, 30 с при 53°С, 1 мин 20 с при 72°С; стадия элонгации: 7 мин при 72°С. Продукт ПЦР, полученный в результате реакции, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы родительского IlvIH⁺ штамма MG1655B-7 ΔilvBN::cat, имел в длину 2491 п.о., а продукт ПЦР, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы мутантного штамма MG1655B-7 ΔilvBN::cat ΔilvIH::cat, имел в длину 1823 п.о. В результате получили штамм MG1655 ΔilvIH::cat.

4. Делеция оперона ilvGM

Удаление опреона ilvIH проводили с использованием того же подхода, что и для удаления оперона ilvBN, описанного в Разделе 1. Согласно этой процедуре синтезировали праймеры для ПЦР ilvGM1 (SEQ ID NO:36) и ilvGM2 (SEQ ID NO:37), гомологичные областям, прилегающим к оперону ilvGM и гену, обуславливающему устойчивость к хлорамфиниколу в матричной плазмиде. Плазмиду pMW-attL-Cm-attR (заявка РСТ WO 05/010175) использовали в качестве матрицы для ПЦР. Условия для ПЦР были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при температуре 95°С; температурный профиль для первых двух циклов: 1 мин при 95°С, 30 с при 34°С, 40 с при 72°С; температурный профиль для последних 30-и циклов: 30 с при 95°С, 30 с при 50°С, 40 с при 72°С; стадия элонгации: 5 мин при 72°С.

Полученный продукт ПЦР размером 1713 п.о. очищали в агарозном геле и использовали для электроапорации в штамм Е.coli MG1655/pKD46. Рекомбинанты, устойчивые к хлорамфиниколу, отбирали после элктропорации и проверяли посредством ПЦР с использованием локус-специфических праймеров ilvGMC3 (SEQ ID NO:38) и ilvGMC4 (SEQ ID NO:39). Условия для ПЦР-верификации были следующие: стадия денатурации в течение 3 мин при 94°С; температурный профиль для 30-и циклов: 30 с при 94°С, 30 с при 54°С, 1 мин 30 с при 72°С; стадия элонгации: 7 мин при 72°С. Продукт ПЦР, полученный в результате реакции, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы родительского штамма MG1655, имел в длину 2209 п.о., а продукт ПЦР, в которой в качестве матрицы использовали фрагмент ДНК из хромосомы мутантного штамма MG1655 ΔilvGM::cat, имел в длину 1941 п.о. В результате был получен штамм MG1655 ΔilvGM::cat.

5. Конструирование штаммов, имеющих инактивированными все гены ацетолактатсинтазы (Комбинация делеций ΔilvBN, ΔilvIH и ΔilvGM).

Делецию генов ilvIH (ΔilvIH::cat) вводили в дикий штамм E.coli K12 (VKPM В-7) с помощью Р1 трансдукции (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Штамм E.coli MG1655 ΔilvIH::cat, описанный в Разделе 3, использовали в качестве донорского штамма, отбирали трансдуктанты CmR. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH::cat. Для удаления маркера устойчивости к хлорамфиниколу из штамма В-7 ΔilvIH::cat, клетки трансформироали плазмидой pMW18-int-xis (Ap^R) заявка РСТ WO 2005/010175). Клоны Ap^R выращивали на чашках с LB-агаром, содержащим ампициллин в концентрации 150 мг/мл при темепратуре 30°С. Несколько тенов с клонами Ар^R пикетировали и проверяли на чувствительность к хлорамфиниколу. Плазмиду pMW118-int-xis удаляли из клеток Cm^S путем выращивания на чашках с LB-агаром при температуре 42°С. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH.

Делецию генов ilvBN (ΔilvBN::cat) вводили в штамм E.coli B-7 ΔilvIH с помощью Р1 трансдукции. Штамм E.coli MG1655 ΔilvBN::cat описан в Разделе 1 и использовался в качестве донорского штамма; отбирали трансдуктанты CmR. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH ΔilvBN::cat. Маркер устойчивости к хлорамфиниколу удаляли из штамма В-7 ΔilvIH ΔilvBN::cat, как было описано выше. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH ΔilvBN.

Делецию генов ilvGM (ΔilvGM::cat) ввели в штаммы E.coli B-7 ΔilvIH с помощью Р1 трансдукции. Штамм E.coli MG1655 ΔilvGM::cat, описанный в Разделе 4, использовали в качестве донорского штамма; отбирали трансдуктанты CmR. В результате получили штамм B-7 ΔilvIH ΔilvGM::cat. Маркер устойчивости к хлорамфиниколу удаляли из штамма В-7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM::cat, как было описано выше. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH ΔilvGM. Штамм В-7 ΔilvIH ΔilvGM был прототрофным, поэтому делеция генов ilvGM не предотвращала экспрессию дистальных генов изолейцин-валинового оперона.

Делецию генов ilvGM (ΔilvGM::cat) вводили в штаммы Е.coli B-7 ΔilvIH ΔilvBN с помощью Р1 трансдукции. Штамм E.coli MG1655 ΔilvGM::cat, описанный в Разделе 4, использовали в качестве донорского штамма; отбирали трансдуктанты CmR. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM::cat. Маркер устойчивости к хлорамфиниколу удаляли из штамма В-7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM::cat, как было описано выше. В результате получили штамм В-7 ΔilvIH ΔilvBN ΔilvGM.

Таблица 1
Штамм	AHAS активность, нмоль/мин мг	Остаточная активность AHAS в присутствии 10 mM L-Val, %
B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-PivbL-ilvBN B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH/pMIV-PivbL-ilvBNValR33 B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33	0 8.1 1.3 1.7 21.5	0 11 92 82 91
Таблица 2
Штамм	L-valine, г/л
В7 B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::PivbL-ilvBNValR33 B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33	0 0 2.0 3.0

Таблица 3
Штамм	Специфическая активность AHAS, нмоль/мин мг	Остаточная активность (%) в присутствии 10 мМ
L-валина	L-изолейцина
В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR1 B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR4 В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR5 B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR6 В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR18 В7 ΔilvIH ΔilvGM cat-PL-ilvBN (wt) B7ΔilvBNΔilvGMΔilvIH mini-Mu::cat-PL-ilvBNValR33	40 88 72 39 57 49 9	86 74 86 54 97 15 86	91 87 98 90 94 22 100
Таблица 4
Штамм	L-валин, г/л
B7ΔilvIHΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR1 B7ΔilvIHΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR4 B7ΔilvIHΔilvGM cat-PL-ilvBN ValR5 B7ΔilvIHΔilvGM cat-PL-ilvBN wt	2.3 7.6 3.3 0
Таблица 5
Штамм	L-лейцин, г/л
57	1.6
57 cat-PL-ilvBN ValR4	1.9

1. Малая мутантная субъединица ацетолактатсинтазы (AHAS I) из бактерий, отличающаяся тем, что L-аминокислота в позиции 17, 30 и/или 33 в малой субъединице природной ацетолактатсинтазы из Escherichia coli заменена на другую L-аминокислоту или несколько L-аминокислот встроены в указанную позицию или позиции, и ингибирование валином по типу обратной связи в указанной субъединице ослаблено.

2. Малая мутантная субъединица ацетолактатсинтазы по п.1, отличающаяся тем, что аспарагин в позиции 17 природной ацетолактатсинтазы заменен на лизин.

3. Малая мутантная субъединица ацетолактатсинтазы по п.1, отличающаяся тем, что аланин в позиции 30 природной ацетолактатсинтазы заменен на пролин.

4. Малая мутантная субъединица ацетолактатсинтазы по п.1, отличающаяся тем, что аланин в позиции 33 природной ацетолактатсинтазы заменен на последовательность из 12-ти аминокислот, имеющую в своем составе сайт терминации трансляции.

5. Мутантная ацетолактатсинтаза, содержащая малую субъединицу по любому из пп.1-4.

6. Мутантная ацетолактатсинтаза по п.5, отличающаяся тем, что указанная природная ацетолактатсинтаза получена из Escherichia coli.

7. Мутантная ацетолактатсинтаза по п.5, которая содержит делецию, замену, вставку или добавление одной или нескольких аминокислот в одной или в нескольких позициях, кроме позиции 17, 30 и/или 33, отличающаяся тем, что в таком ферменте ингибирование валином по типу обратной связи ослаблено.

8. Фрагмент ДНК, кодирующий мутантную ацетолактатсинтазу по любому из пп.1-7.

9. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, которая содержит фрагмент ДНК по п.8 и обладает способностью к продукции разветвленных L-аминокислот.

10. Бактерия по п.9, отличающаяся тем, что указанные разветвленные L-аминокислоты выбраны из группы, состоящей из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.

11. Бактерия по п.10, отличающаяся тем, что активность мутантной ацетолактатсинтазы в этой бактерии увеличена.

12. Бактерия по п.11, отличающаяся тем, что активность мутантной ацетолактатсинтазы увеличена путем усиления экспрессии гена, кодирующего мутантную ацетолактатсинтазу.

13. Бактерия по п.12, отличающаяся тем, что активность мутантной ацетолактатсинтазы увеличена способом, выбранным из группы, включающей:
а) увеличение количества копий гена мутантной ацетолактатсинтазы, и
б) модифицирование последовательности, контролирующей экспрессию гена мутантной ацетолактатсинтазы таким образом, что экспрессия этого гена усиливается.

14. Бактерия по п.13, отличающаяся тем, что количество копий гена увеличено путем встраивания нескольких копий гена мутантной ацетолактатсинтазы в хромосому бактерии.

15. Способ получения разветвленной L-аминокислоты, включающий выращивание бактерии по любому из пп.11-14 в питательной среде, и выделение разветвленной L-аминокислоты из культуральной жидкости.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что бактерия обладает усиленной экспрессией генов, вовлеченных в биосинтез разветвленной L-аминокислоты.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанная разветвленная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-лейцина, L-изолейцина и L-валина.