Способ получения антигенсодержащих липосом

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа получения антигенсодержащих липосом. Сущность изобретения включает приготовление раствора фракций Н и D антигенов возбудителя мелиоидоза, растворение нейтрально заряженных липидов в хлороформе, смешивание раствора антигена со смесью липидов, получение липосом выпариванием с обращением фаз, удаление невключившихся внутрь везикул материала диализом с применением 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2. Полученные липосомы содержат 89-93% Н и D фракций антигенов возбудителя мелиоидоза и имеют размер 600-800 нм. Преимущество изобретения заключается в получении липосом с высокой нагрузкой мелиоидозного антигена. 2 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к проблеме создания носителя, содержащего антигенный материал.

Проблема специфической профилактики мелиоидоза с помощью химических вакцин, создающих напряженный иммунитет и лишенных побочных эффектов, еще далека от успешного решения. В работах последних лет показано, что отдельные фракции поверхностных мелиоидозных антигенов обладают протективной способностью при небольших заражающих дозах возбудителя мелиоидоза (Пивень Н.Н. Антигенный состав возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Дисс… докт. мед. наук. - Волгоград, 1997. - 296 с.); Викторов Д.В. Белковый и антигенный состав штаммов В. pseudomallei различной вирулентности: Дисс… канд. биол. наук. - Волгоград, 1997. - 110 с). Ряд авторов показали возможность повышения протективности антигенов различных возбудителей иммобилизованных в липосомы (синегнойной инфекции, чумы, бруцеллеза) (Минухин Б.В., Бородина Н.С., Цыганенко А.Я. с соавт. Иммуногенные свойства липосомальной формы анатоксина синегнойной палочки // Вестн. АМН СССР. - 1990. - №8. - С.44-47; Бямбаа А., Ефременко В.И., Таран Т.В., Таран В.И., Оверченко В.В. Изучение протективных свойств антигенсодержащих липосом при чуме // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Материалы Юбил. Научн. - практ. конференции, посвященной 70-летию НИИ Микробиологии МО РФ, 30 ноября - 1 декабря 1998. - Киров, 1998. - С.62-63; Куликов В.Н., Кашкин К.П., Драновская Е.А. Включение протективного антигена В. abortus в липосомы и иммуногенные свойства антигенсодержащих липосом // ЖМЭИ. - 1985. - №12 - С.69-72).

Перспективность липосом основывается на двух их основных свойствах: сходстве с природными мембранами и универсальности. Универсальность состоит в том, что благодаря полусинтетической природе липосом можно широко изменять их по размерам, поверхностным характеристикам, составу. Липосомы не токсичны и легко биодеградируемы. Возможность использования в меньших дозах, снижение частоты аллергических и иммунологических реакций, внутриклеточная направленность везикул и увеличение времени элиминации - вот основные преимущества использования липосом. Вместе с тем проблема экстренной иммунопрофилактики мелиоидоза разработана недостаточно.

Приготовление моноламеллярных липосом, содержащих антигены путем впрыскивания этанольного раствора фосфолипидов в водную фазу:

50 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 1 мл 96° этанола. Этанольный раствор липидов набирают в шприц с иглой и быстро вводят в 15 мл раствора включаемого 100 мкг антигенного материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Образующиеся липосомы включают во внутренний объем в среднем 2,5% материала. Данный метод позволяет включать лабильные биологические макромолекулы без потери специфической активности. Недостатком метода является ограничение в количестве липидов - 3,5 мг, которое можно внести в 1,0 мл водной фазы, что требует в ряде случаев последующего концентрирования препарата липосом (Kremer J.М.Н., Esker М.W.J., Pathmamanoharan С., Wiersema Р.Н. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method. - Biochemistry, 1977, vol.16, p.3933-3935).

Приготовление липосом методом «ручного» встряхивания:

100 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 50 мл хлороформа в 200 мл круглодонной колбе для роторного испарителя и при пониженном давлении проводили выпаривание органического растворителя. Время окончания выпаривания определяли по исчезновению запаха хлороформа в колбе, при этом на ее стенках образовывалась тонкая пленка липидов. Снятую с роторного испарителя колбу продували газообразным азотом для предотвращения окисления липидов и затем вносили 5 мл, содержащих 100 мкг антигенного материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. После 2-часовой инкубации при комнатной температуре смеси для образования гомогенной суспензии липосом в колбу помещали несколько стеклянных бусинок и энергично встряхивали в течение 5 минут. Невключившийся антигенный материал удаляли центрифугированием. Мягкие условия приготовления и большие размеры липосом позволяют использовать этот метод для включения крупных биологических макромолекул, без значительной потери активности. Недостатком метода является низкий процент включения материала (1-3%) (Acuto O., Pugliese O., Muler М., Tosi R. Preparation of liposomes incorporating membrane components from human lymphoid cells // Tissue Antigenes. - 1979. - V.14, №5. - P.385-397).

Наиболее близким аналогом является метод получения липосом предложенный Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - V.75, N 9. - P.4194-4198. Согласно методу 30 мг липидов (фосфатидилхолин, холестерин, дицетилфосфат в соотношении 7:2:1) растворяют в 3 мл смеси эфира с хлороформом 2:1 и вносят в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3 1 мл раствора включаемого материала в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5, добавляют к раствору липидов в органической фазе и обработкой ультразвуком 20 кГц, мощностью 200 Вт в течение 5 минут достигают образования эмульсии типа «вода в масле». Колбу с эмульсией присоединяют к роторному испарителю и постепенно понижая давление так, чтобы не происходило кипение и полностью удаляют органический растворитель. Об окончании выпаривания судят по образованию геля в колбе и исчезновения запаха органического растворителя. В процессе выпаривания поддерживают температуру смеси выше температуры фазового перехода фосфолипидов (20-25°С). Колбу снимают с испарителя, к образовавшемуся гелю добавляют 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,5 и встряхивают до образования гомогенной суспензии липосом. Липосомы, полученные данным методом, характеризуются высокой эффективностью включения - до 50-60% и большими размерами - до 1,0-1,2 мкм. Невключившийся материал удаляют центрифугированием. Недостатками является малая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле», вследствие чего в каждом конкретном случае требуется подбор состава липидной смеси, техники выпаривания и навыка в работе, использование смеси растворителей с разной температурой кипения, что приводит к неоднородному образованию фосфолипидных везикул (температура кипения эфира + 34,5°С, температура кипения хлороформа + 61,2°С), а также токсическое воздействие ионов титана на антигенный материал и фосфолипиды (Г.Грегориадис., А.Аллисон. Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина. - 1983. - С.28-29).

Целью изобретения является разработка способа получения антигенсодержащих липосом с высоким количеством иммобилизации фракций (Н, D) антигена возбудителя мелиоидоза.

Поставленная цель достигается тем, что вследствие увеличения липидной нагрузки, повышается стабильность мембраны липосом, их количество и возрастает процент инкапсуляции антигенных мелиоидозных фракций (Н, D). Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) на антигенные фракции. Для этого 56, 7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа. Включаемый материал, растворенный в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе, и обработкой на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 1 мин достигали образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Удаление невключившегося антигенного материала осуществляли диализом. В качестве диализующего раствора использовали буфер, взятый для приготовления липосом (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2). Диализ проводили при + 4°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке диализующий раствор в течение 2 ч, после чего производили смену буфера. Для полного удаления невключившегося в липосомы антигенного материала достаточно 4-х смен буфера.

Вследствие увеличения липидной нагрузки достигнута высокая устойчивость эмульсии и геля типа «вода в масле». Универсальность носителя обеспечивается нетральным зарядом мембраны липосом. Используемый метод позволяет применять один органический растворитель с определенной температурой кипения. Получение эмульсии на роторном миксере позволяет исключить токсическое влияние ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Данный способ позволяет инкапсулировать внутрь липосом 89-93% Н и D фракций мелиоидозного антигена.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Иммобилизация внутрь липосом Н-фракции антигена возбудителя мелиоидоза.

Для этого 56, 7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа. 100 мкг фракции Н-антигена возбудителя мелиоидоза, в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляли к раствору липидов в органической фазе и обрабатывали на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 1 мин до образования эмульсии. При пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивали в колбе на роторном испарителе. Удаление невключившегося материала (фракции Н-антигена) осуществляли диализом. В качестве диализующего раствора использовали буфер, взятый для приготовления липосом (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2). Диализ проводили при + 4°С, постоянно перемешивая на магнитной мешалке диализующий раствор в течение 2 ч, после чего производили смену буфера. Для полного удаления невключившегося в липосомы антигенного материала проводили 4 смены буфера. Процент иммобилизации Н-фракции определяли хемилюминесценцией и радиоизотопным методом. Он составлял 89%. При этом сорбции Н-фракции антигена на поверхности мембраны липосом не отмечалось. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-800 нм (фиг.1). Степень окисления лиипдов мембраны липосом составляла 0,8±0,02 (перекисный индекс Клейна) (Klein R.A. The detection of oxidation in liposome preparations // Biochim. Biophys. Acta. - 1970. - N 21. - P.486-489).

Пример 2. Получение инкапсулированной в липосомы D-фракции антигена возбудителя мелиоидоза

При получении липосом с D-фракцией антигена возбудителя мелиоидоза методика приготовления препарата идентична указанной в примере №1. Процент иммобилизации D-фракции составлял 93%. При этом сорбции D-фракции антигена на поверхности мембраны липосом не отмечалось. Размеры липосомального препарата при электронно-микроскопическом исследовании составляли 600-700 нм (фиг.2). Степень окисления липидов мембраны липосом составляла 0,8±0,02.

Таким образом, вследствие увеличения нагрузки липидов в исходных навесках достигнута высокая стабильность и пластичность мембраны липосом и возросло их количество. Получение эмульсии на роторном миксере позволило исключить токсическое влияние на антигенный материал ионов титана (титановый зонд ультразвукового дезинтегратора) и сократить время обработки. Универсальность носителя обеспечивается нейтральным зарядом мембраны липосом. Данный способ позволяет получать стабильные липосомы, содержащие 89-93% Н- и D-фракций антигенов возбудителей мелиоидоза.

Способ получения антигенсодержащих липосом, включающий растворение навесок липидов в хлороформе, приготовление раствора фракций антигена, создание эмульсии из хлороформенного раствора липидов и антигенного материала, получение липосом выпариванием с обращением фаз, удаление невключившегося внутрь везикул антигенного материала диализом, перевод в раствор для применения и хранения, отличающийся тем, что для получения липосом с высоким содержаним нативных Н и D антигенов возбудителя мелиоидоза 56, 7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяют в 3,8 мл хлороформа, затем 100 мкг фракции антигена, растворенного в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2, в объеме 1,5 мл добавляют к раствору липидов в органической фазе и обрабатывают на роторном миксере мощностью 500 Вт при 15000 об/мин в течение 1 мин до достижения образования эмульсии, после чего понижают давление в роторном испарителе и полностью удаляют органический растворитель, к образовавшемуся гелю добавляют до 5 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,2 и тщательно перемешивают в колбе на роторном испарителе, удаление невключившегося материала осуществляют диализом, в качестве диализующего раствора используют буфер, взятый для приготовления липосом (0,01 М фосфатный буфер рН 7,2), диализ проводят при температуре +4°С при постоянном перемешивании магнитной мешалкой диализующего раствора в течение 2 ч, после чего производят 4 смены буфера, полученные липосомы при хемилюминесцентном и радиоизотопном исследовании содержали 89-93% Н- и D-фракций мелиоидозного антигена, а при электронномикроскопическом исследовании размеры антигенсодержащих липосом составляли 600-800 нм.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и касается средства для лечения бактериального вагиноза, которое содержит кумыс 2-3-дневной выдержки с активностью протеиназы 475,5 ед, полученный при использовании микроорганизмов Lactobacterium bulgaricum и дрожжей рода Torula, и включает молочную кислоту, аскорбиновую кислоту, пантотеновую кислоту, рибофлавин, тиамин, витамин В12.
Изобретение относится к области ветеринарии. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к дезинфицирующим средствам. .
Изобретение относится к области ветеринарии. .

Изобретение относится к способу получения 3-фторсодержащих хинолинов общей формулы (I): где R1, R2, R3 и R4, идентичные или различные, представляют собой: - водород; - атом фтора; - группу OR6, в которой R6 представляет собой атом водорода, или линейный, или разветвленный алкильный радикал, отличающемуся тем, что соединение общей формулы (IV): где R1, R2, R3 и R4 имеют значения, указанные выше, подвергают расщеплению по Хофману, которое осуществляют гидроксидом натрия и бромом, а также пиридином в воде при температуре около 60°С, для получения соединения общей формулы (III): где R1, R2, R3 и R4 имеют значения, указанные выше, которое подвергают обработке солью щелочного металла или сложным алкильным эфиром азотистой кислоты и фторборной кислоты или комплексом трифторида бора и этилового эфира, в среде подходящего растворителя при температуре в интервале от 15°С до 20°С, приводящей к получению соли диазония общей формулы (II): где R1, R2, R3 и R4 имеют значения, указанные выше, которую нагревают в среде инертного органического растворителя при температуре от 35°С до 120°С, с получением соединений формулы (I).

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к липосомальной препаративной форме для фотодинамической терапии. .

Изобретение относится к медицине, в частности, к лекарственному препарату для внутрисуставного введения при лечении ревматических заболеваний. .

Изобретение относится к медицине, к созданию и применению аэрозольных распыляемых композиций для лечения заболеваний или расстройств, лечение которых требует снижения клеточной пролиферации и/или индукции клеточного апоптоза у пациента, таких как неопластические, аутоиммунные, вирусные заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к лекарственным препаратам и композициям, применяемым для профилактики и лечения костной резорбции, а именно остеопороза, болезни Педжета, патологических переломов у онкологических больных, а также для профилактики остеопороза в климактерическом периоде.

Изобретение относится к области фармакологии, а именно к способам получения системы доставки (лекарственным формам доставки) биологически активных веществ в виде наноразмерных макромолекулярных носителей на основе амфифильных полимеров, в которых инкапсулированы различные количества биологически активных веществ, в том числе гидрофобные, плохо- или нерастворимые в воде лекарственные вещества, а также к самим лекарственным формам доставки водонерастворимых и плохорастворимых лекарственных средств.

Изобретение относится к области биотехнологии и описывает способ получения липосом путем гидратирования липидов, сухих или в виде растворов, причем гидратирование проводят водным раствором, содержащим мочевину в концентрации от 0.1 до 5%.
Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для эффективной доставки широкого спектра лекарственных препаратов и биологически-активных веществ.

Изобретение относится к медицине, лечению патологических состояний, опосредованных активированными макрофагами. .
Изобретение относится к области медицины, в частности, к микробиологии и иммунологии и касается разработки способа отбора протективных антигенов, перспективных в отношении конструирования химической вакцины для специфической профилактики мелиоидозной инфекции.

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается способа получения антигенсодержащих липосом

Наверх