Способ получения препарата антитромбина iii из плазмы крови человека

Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способа получения антитромбина III из плазмы крови человека. Способ предусматривает стадию аффинной хроматографии, очистку от вирусов и концентрирование продукта, при этом предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют ПЭГ 4000, инкубируют, центрифугируют, диафильтруют против буферного раствора рН 7,20, содержащего трис HCl и цитрат натрия, пропускают через колонну с ДЕАЕ-сефарозой, к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют гепарин три-н-бутилфосфат и твин-80, смесь инкубируют и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют трис-HCl буфером рН 9,0 с проводимостью 40.0±0.8 мСи, элюат диализуют против трис-HCl буфера, рН 7,40, содержащего хлорид натрия и цитрат натрия, пастеризуют при 60°С в течение 10 часов, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40, содержащего трис-HCl и цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0.03 М хлорид натрия, раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера, стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают. Способ позволяет повысить выход по активности продукта до 60%, а также обеспечивает его высокое качество и чистоту.

 

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и касается способов получения лиофилизированного высокоочищенного препарата антитромбина III (ATIII) из плазмы крови.

Антитромбин III - гликопротеин с молекулярной массой 58 кДа, относится к классу серпинов и, в первую очередь, участвует в инактивации тромбина. Как врожденный, так и приобретенный дефицит ATIII характеризуется тромбофилиями различной степени выраженности, требующими медикаментозной коррекции. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания, протекающий в рамках разнообразных нозологии, рассматривается среди наиболее частых причин тромбофилий, связанных с дефицитом ATIII. Необходимость заместительной терапии AT в суперфизиологических концентрациях обусловлена противовоспалительными свойствами данного гликопротеина, например, при сепсисе.

Существует ряд способов выделения и очистки ATIII. Почти все они основаны на выделении целевого продукта из плазмы крови с применением хроматографии.

Например, известен способ выделения ATIII из нормальной плазмы путем пропускания ее через колонку с сульфированным декстраном, активированным BrCN, и элюции градиентом NaCl в буфере. Способ является достаточно простым, но характеризуется недостаточно высоким выходом и не обеспечивает требуемой чистоты получаемого препарата (SU патент 447876, 1974).

Известен способ выделения антитромбина III из плазмы крови или фракции Кона IV-1, предусматривающий несколько стадий хроматографии: на сильноосновной анионообменной смоле с четвертичными аммониевыми группами, на аффинном сорбенте - гепарин-сефарозе с элюцией раствором NaCl в буфере и на сорбенте Q-сефарозе. Способ обеспечивает получение препарата антитромбина с приемлемой степенью чистоты, но является сложным и трудоемким (JP 10-168100, 1998).

Известен способ, согласно которому ATIII получают из плазмы крови или фракции Кона IV-1, когда на первом этапе освобождаются от балластных белков путем осаждения 20% полиэтиленгликолем (ПЭГ). Далее супернатант пропускают через колонну, заполненную гепарин-сефарозой. Связавшийся с носителем ATIII элюируют, добавляют 0,5 М цитрат натрия в качестве стабилизатора, пастеризуют, удаляют избыток цитрата натрия с помощью гель-фильтрации, стерильно фильтруют, разливают и лиофилизируют. Выход по активности составляет около 32% в случае использования плазмы в качестве сырья. Если сырьем служила фракция Кона IV-1, то выход по активности составлял 16% (Wickerhauser М. et al., Vox Sang, 36, 5, 281-293, 1979).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения и очистки ATIII из плазмы крови, который сводится к следующим основным этапам: 1) получению супернатанта фракции II+III по методу Кона (Cohn E.J. et al, J Am Chem Soc 68, 459-475, 1946), 2) первой аффинной хроматографии на гепарин-агарозном геле, элюции и концентрации ATIII, 3) пастеризации (60°С, 10 часов), 4) второй аффинной хроматографии на таком же геле для удаления денатурированного ATIII, 5) элюции ATIII, его концентрации, замены буферного раствора на формулирующий буфер, содержащий стабилизатор (D-маннитол), стерильной фильтрации, розлива и лиофильной сушки (Biescas Н. et al., Haematologica, 83, 305-311, 1998). Выход процесса около 30%. Чистота препарата составляла более 95%.

Недостатками данного способа являются небольшой выход целевого продукта и однократность процедуры вирусной инактивации, что уменьшает надежность способа по вирусной безопасности получаемого препарата.

Как показали сами авторы, причиной невысокого выхода являются, в первую очередь, большие потери ATIII на этапе извлечения его из супернатанта фракции Кона II+III.

Задачей изобретения является повышение выхода целевого продукта, при этом конечный препарат должен иметь высокий уровень чистоты и активности ATIII, а технология не должна быть чрезмерно трудоемкой.

Чтобы решить поставленную задачу, предлагается не использовать супернатант фракции Кона II+III в качестве материала, который наносится на колонну с гепарин-сефарозой, а использовать для этой цели криосупернатант, полученный из свежезамороженной плазмы, из которого последовательно будут удаляться балластные белки (в том числе и гепарин-связывающие). Для этого криосупернатант предлагается обработать полиэтиленгликолем (ПЭГ), а затем, отбросив осадок, удалить из надосадочной жидкости ряд других белков с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе. К не связавшимся с носителем белкам добавляют гепарин. Это позволяет изменить электростатические характеристики поверхности гепарин-связывающих белков и повысить стабильность, в частности ATIII. Такой методический прием позволил, во-первых, провести сольвент-детергентную обработку концентрата, содержащего ATIII, с меньшими потерями активности целевого белка, а во-вторых, более полно собрать антитромбин, используя колонну с Q-сефарозой. Дальнейшее использование гепарин-сефарозы позволило получить конечный препарат высокой степени очистки и с большим выходом (до 60%) несмотря на использование этапа пастеризации.

Предлагается способ, согласно которому предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют 20,0±0,4% ПЭГ 4000, инкубируют 2 часа, центрифугируют, диафильтруют против уравновешивающего буфера рН 7,20±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис HCl и 50±1 мМ цитрат натрия, пропускают через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой (к этой стадии остается около 78-80% активности ATIII), к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют 1×107 ME гепарина и после 20-минутной инкубации в раствор вносят три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%), смесь инкубируют 16 часов (на этой процедуре теряется не более 5% активности) и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют 100±2 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0±0,1 с проводимостью 40,0±0,8 мСи (после этой стадии остается 68-70% активности ATIII), элюат диализуют против 10,0±2 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40±0,14, содержащего 0,150±0,03 М хлорид натрия, 1,00±0,02М цитрат натрия, и пастеризуют при 60°С в течение 10 часов, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис-HCl и 10,0±0,2 мМ цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,150±0,003М хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0,03М хлорид натрия (к этому моменту остается около 60-63% активности ATIII), раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера. Затем его стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают. Выход процесса по активности ATIII составлял 59±2%. Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия давал только одну полосу.

Продукт может представлять собой раствор или лиофилизированный порошок (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом). В случае необходимости он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам. Наполнителями являются, например, сахара (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза или их смеси), восстановительные сахара (эритрол, маннитол и др.) в физиологически приемлемых концентрациях, в случае необходимости - антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. Дополнительно продукт может содержать неорганические и/или органические соли и их сочетания для поддержания приемлемых значений рН.

Растворителями для лиофилизированного продукта могут служить дистиллированная апирогенная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор.

Также можно лиофилизировать готовый продукт, содержащий антитромбин III и любой из перечисленных вспомогательных веществ или их сочетание.

Осуществление способа поясняется следующим примером.

Пример.

100 л плазмы размораживали и подвергали центрифугированию. После отделения осадка к супернатанту добавляли 20% ПЭГ 4000, инкубировали 2 часа, центрифугировали, диафильтровали против уравновешивающего буфера (10 мМ трис HCl буфером, рН 7,2, содержащим 50 мМ цитрат натрия) и пропускали через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой. К не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляли 1×107 ME гепарина и после 20-минутной инкубации в раствор вносили три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%). Смесь инкубировали при перемешивании 16 часов и наносили на колонну с Q-сефарозой. Белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюировали 100 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0 с проводимостью 40 мСи, доводимой хлоридом натрия. Элюат диализовали против 100 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40, содержащего 0,15 М хлорид натрия, 1 М цитрат натрия, и пастеризовали при 60°С в течение 10 часов. После этого обогащенную ATIII смесь белков диализовали против уравновешивающего буфера (10 мМ трис-HCl буфер, рН 7,4, содержащий 10 мМ цитрат натрия) и наносили на колонну с гепарин-сефарозой. Затем промывали колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,15М хлорид натрия. Целевой продукт элюировали тем же буфером, но содержащим 1,5 М хлорид натрия. Раствор ATIII диафильтровали против формулирующего буфера, стерильно фильтровали, разливали и лиофильно высушивали. Выход ATIII по активности составлял 57. Чистота конечного препарата более 95%.

Преимущества данного способа по сравнению со способом-прототипом заключаются в получении препарата с повышенным выходом по активности (около 60% против 30%), что было достигнуто за счет более селективного удаления других белков и за счет введения гепарина, что позволило изменить электростатические характеристики гепарин-связывающих белков, а также в возможности повысить вирусную безопасность препарата и гарантировать его качество.

Способ получения антитромбина III из плазмы крови человека, предусматривающий стадии аффинной хроматографии, очистки от вирусов, концентрирования продукта, отличающийся тем, что предварительно плазму центрифугируют, после отделения осадка к супернатанту добавляют 20,0±0,4% ПЭГ 4000, инкубируют 2 ч, центрифугируют, диафильтруют против уравновешивающего буфера рН 7,20±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис HCl и 50±1 мМ цитрат натрия, пропускают через колонну, заполненную ДЕАЕ-сефарозой, к не связавшейся с носителем смеси белков плазмы добавляют 1×10 ME гепарина и после 20 минутной инкубации в раствор вносят три-н-бутилфосфат (0,3%) и твин-80 (1%), смесь инкубируют 16 ч и наносят на колонну с Q-сефарозой, белковую фракцию, содержащую целевой белок, элюируют 100±2 мМ трис-HCl буфером, рН 9,0±0,1 с проводимостью 40,0±0,8 мСм, элюат диализуют против 100±2 мМ трис-HCl буфера, рН 7,40±0,14, содержащего 0,150±0,003 М хлорид натрия, 1,00±0,02 М цитрат натрия и пастеризуют при 60°С в течение 10 ч, обогащенную ATIII смесь белков диализуют против буфера с рН 7,40±0,14, содержащего 10,0±0,2 мМ трис-HCl и 10,0±0,2 мМ цитрат натрия, наносят на колонну с гепарин-сефарозой, промывают колонну тем же буфером, но содержащим дополнительно 0,150±0,003 М хлорид натрия, целевой продукт элюируют тем же буфером, содержащим 1,50±0,03 М хлорид натрия, раствор ATIII диафильтруют против формулирующего буфера, стерильно фильтруют, разливают и лиофильно высушивают.