Терапевтические полипептиды, их гомологи, их фрагменты и их применение для модуляции агрегации, опосредованной тромбоцитами

Настоящее изобретение относится к биотехнологии. Описаны полипептиды, включающие в себя, по меньшей мере, одно однодоменное антитело, направленное против vWF, А1 домена vWF, А1 домена активированного vWF, A3 домена vWF, gplb и/или коллагена. Представлены способы получения названных полипептидов, способы покрытия используемых в медицинской практике устройств (например, для РСТА, эндопротезирования) названными полипептидами. Изобретение позволяет получать полипептиды, предназначенные для лечения состояний, требующих модуляции опосредованной тромбоцитами агрегации. 18 н. и 22 з.п. ф-лы, 30 ил., 32 табл.

 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

1. Полипептид или полипептидная конструкция для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и/или опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, включающая, по меньшей мере, одно однодоменное антитело, направленное против фактора фон Вилебранда (vWF).

2. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, включающая два или более однодоменных антител, направленных против vWF.

3. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело против vWF направлено против А1 домена vWF, А1 домена активированного vWF или A3 домена vWF.

4. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, включающая два или более однодоменных антител, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело против vWF направлено против А1 домена vWF, А1 домена активированного vWF или A3 домена vWF.

5. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, или:
a) последовательности, гомологичной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65 с идентичностью последовательности больше чем 70% с родительской последовательностью; или
b) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая сохраняет взаимодействие с мишенью со сродством 1·10^-6 М или выше; или
c) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая включает частичную делецию полной аминокислотной последовательности и все еще сохраняет связывающий участок(ки) и домен(ы) белка, необходимые для связывания и взаимодействия с мишенью.

6. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, или
d) последовательности, гомологичной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65 с идентичностью последовательности больше чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях; или
e) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая сохраняет взаимодействие с мишенью со сродством 1·10^-6 М или выше; или
f) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая включает частичную делецию полной аминокислотной последовательности и все еще сохраняет связывающий участок(ки) и домен(ы) белка, необходимые для связывания и взаимодействия с мишенью.

7. Полипептид или полипептидная конструкция по п.1, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, или
g) последовательности, гомологичной любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность а) способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях и в) не способна ингибировать 50% агрегации тромбоцитов в условиях низкого срезывающего напряжения (300 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях; или
h) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая сохраняет взаимодействие с мишенью со сродством 1·10^-6 М или выше; или
i) функциональной части любой из SEQ ID NO: с 1 по 7, с 23 по 31 и с 62 по 65, которая включает частичную делецию полной аминокислотной последовательности и все еще сохраняет связывающий участок(ки) и домен(ы) белка, необходимые для связывания и взаимодействия с мишенью.

8. Полипептид или полипептидная конструкция для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и/или опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, включающая, по меньшей мере, одно однодоменное антитело, направленное против фактора фон Вилебранда, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной SEQ ID NO: 3, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 3 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях.

9. Полипептид или полипептидная конструкция для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и/или опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, включающая, по меньшей мере, одно однодоменное антитело, направленное против фактора фон Вилебранда, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 5 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях.

10. Полипептид или полипептидная конструкция для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и/или опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, включающая, по меньшей мере, одно однодоменное антитело, направленное против фактора фон Вилебранда, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело соответствует последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 7 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях.

11. Полипептид или полипептидная конструкция для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и/или опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, включающая два или более однодоменных антител против фактора фон Вилебранда, и
i) в которой два или более однодоменных антител соответствуют последовательности, представленной SEQ ID NO: 3, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 3 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях; или
ii) в которой два или более однодоменных антител соответствуют последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 5 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях; или
iii) в которой два или более однодоменных антител соответствуют последовательности, представленной SEQ ID NO: 7, или последовательности, гомологичной SEQ ID NO: 7 с идентичностью последовательности больше, чем 70% с родительской последовательностью, и где указанная гомологичная последовательность способна ингибировать, по меньшей мере, 50% агрегации тромбоцитов в условиях высокого срезывающего напряжения (1600 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях.

12. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело представляет собой VHH домен.

13. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело представляет собой VHH домен, включающий аминокислоту в положении 45 в соответствии с нумерацией Kabat, выбранную из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, серина, треонина, аспарагина и глутамина.

14. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело представляет собой VHH домен, включающий аминокислоту в положении 103 в соответствии с нумерацией Kabat, выбранную из группы, состоящей из аргинина, серина или незаряженного остатка, необязательно глицина.

15. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело представляет собой VHH домен, полученный путем иммунизации верблюда и получения из него гибридомы, или путем клонирования библиотеки однодоменных антител и последующей селекции VHH с использованием фагового дисплея.

16. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело является гуманизированным.

17. Полипептид или полипептидная конструкция по любому из пп.1, 8-10 или 11, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело представляет собой гуманизированный VHH домен.

18. Полипептид или полипептидная конструкция по п.17, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело является гуманизированным путем замены одной или более аминокислот Camelidae, на соответствующий человеческий аналог, найденный в консенсусной последовательности человека.

19. Полипептид или полипептидная конструкция по п.17, в которой, по меньшей мере, одно однодоменное антитело является гуманизированным путем замены любого из следующих остатков или по одному, или в комбинации: положения в FR1 1, 5, 28 и 30, маркерные аминокислоты в FR2 в положениях 37, 44, 45 и 47, положения в FR3 74, 75, 76, 83, 84, 93 и 94, и положения в FR4 103, 104, 108 и 111, причем нумерация положений приведена согласно нумерации Kabat.

20. Полипептид или полипептидная конструкция по п.11, которая включает два или более однодоменных антител, направленных против А1 домена vWF.

21. Полипептид или полипептидная конструкция по п.11, в которой два или более однодоменных антител имеют одинаковую последовательность.

22. Полипептид или полипептидная конструкция по п.11, в которой С-конец первого однодоменного антитела может быть соединен с N-концом следующего однодоменного антитела.

23. Полипептид или полипептидная конструкция по п.11, которая не способна ингибировать 50% или более агрегации тромбоцитов в условиях низкого срезывающего напряжения (300 с^-1) при 1 мкг/мл или при более низких концентрациях.

24. Нуклеиновая кислота, кодирующая однодоменное антитело, соответствующее любой из последовательностей, представленных SEQ ID NO: 1-7, 23-31 и 62-65.

25. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией.

26. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения состояний, требующих модуляции опосредованной тромбоцитами агрегации.

27. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики первых стадий образования тромба.

28. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, где названные нарушения являются любыми из возникающих в результате кратковременного ишемического повреждения головного мозга, нестабильной или стабильной стенокардии, грудной жабы, инсульта головного мозга, инфаркта миокарда, закупорки периферических артерий, рестеноза, шунтирования коронарных сосудов, замены сердечного клапана или оперативных вмешательств на сердце, таких как ангиопластика, эндопротезирование, эндартерэктомия сонной артерии или атерэктомия.

29. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения нарушений, связанных с опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, где названные нарушения являются любыми из образования неокклюзивных тромбов, образования окклюзивных тромбов, образования артериальных тромбов, острой коронарной окклюзии, рестеноза, рестеноза после РСТА или эндопротезирования, образования тромбов в стенозированных артериях, гиперплазии после ангиопластики, атерэктомии или эндопротезирования артерий, окклюзивного синдрома сосудистой системы или потери проницаемости больных артерий.

30. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения тромботической тромбоцитопенической пурпуры (ТТР), кратковременного ишемического повреждения головного мозга, нестабильной или стабильной стенокардии, инсульта головного мозга, инфаркта миокарда, закупорки периферических артерий, рестеноза или нарушений, возникающих при шунтировании коронарных сосудов, замене сердечного клапана и оперативных вмешательствах на сердце, таких как ангиопластика, эндопротезирование или атерэктомия.

31. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения состояний, связанных с опосредованной тромбоцитами агрегацией, включая, но не ограничиваясь, нестабильную стенокардию, стабильную стенокардию, грудную жабу, образование эмбола, тромбоз глубоких вен, гемолитический уремический синдром, гемолитическую анемию, острую почечную недостаточность, тромболитические осложнения, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, диссеминированную внутрисосудистую комгелопатию, тромбоз, коронарное заболевание сердца, тромбоэмболические осложнения, инфаркт миокарда, рестеноз и формирование тромба в предсердии при фибрилляции предсердий, хроническую нестабильную стенокардию, кратковременные ишемические повреждения и инсульты, заболевания периферических сосудов, артериальный тромбоз, пре-экламсию, эмболию, рестеноз и/или тромбоз после ангиопластики, эндартерэктомии сонной артерии, анастомоза васкулярных трансплантатов, хроническое применение сердечно-сосудистых устройств, и состояний, возникающих в результате тромбоэмболии и закупорки сосудов во время и после тромболитической терапии, после ангиопластики, и после шунтирования коронарных артерий.

32. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 или нуклеиновой кислоты по п.24 для получения лекарственного средства для лечения, профилактики и/или облегчения при образовании бляшки или тромба в условиях высокого срезывающего напряжения.

33. Способ получения полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23, включающий:
(а) культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту по п.24, в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида, и,
(б) извлечение полученного полипептида из культуры.

34. Способ по п.33, где указанные клетки-хозяева являются клетками бактерий, клетками дрожжей, клетками млекопитающих или клетками насекомых.

35. Способ по п.33, где указанные клетки-хозяева являются клетками бактерий или клетками дрожжей.

36. Способ по п.33, где указанные клетки-хозяева являются клетками Е. coli, клетками S. cerevisiae или клетками P. pastoris.

37. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 для покрытия инвазивных медицинских устройств для предотвращения опосредованной тромбоцитами агрегации вокруг участка вмешательства.

38. Применение по п.37, где инвазивное медицинское устройство представляет собой любое из эндопротезов, трубок, надувных баллонов, катетеров, трансплантационных материалов, закупоривающих устройств или протезов.

39. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 в способе диагностирования болезни или нарушений, характеризующихся дисфункцией опосредованной тромбоцитами агрегации, включающем следующие стадии:
a) контактирование образца с полипептидом или полипептидной конструкцией по любому из пп.1-23, и
b) детектирование связывания названного полипептида или полипептидной конструкции с названным образцом, и
c) сравнение связывания, зарегистрированного на стадии (b), со стандартом, где различие в связывании по отношению к названному образцу является диагностическим признаком для болезни или нарушения, характеризующегося дисфункцией опосредованной тромбоцитами агрегации.

40. Применение полипептида или полипептидной конструкции по любому из пп.1-23 в наборе для скрининга для диагностики заболевания или нарушения, характеризующегося дисфункцией опосредованной тромбоцитами агрегации.
Приоритеты по пунктам:

10.01.2003 по пп.1-4;

09.01.2004 по пп.5-7, 24-40;

01.12.2003 по пп.8-23.