Штамм базидиомицета fomitopsis tyv-2006, используемый для получения противоопухолевых препаратов
Владельцы патента RU 2360960:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский федеральный университет" (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis Tyv-2006 ВКПМ F-961 обладает высокой цитопатической активностью в отношении опухолевых клеток и может быть использован для получения противоопухолевых препаратов. Изобретение позволяет расширить ассортимент веществ, обладающих противоопухолевой активностью. 2 табл., 5 ил.
Изобретение относится к области микробиологии, касается нового штамма Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Sing и может быть использовано для получения противоопухолевых препаратов.
В практике создания антибактериальных, иммуномодулирующих и противоопухолевых препаратов используются плодовые тела базидиомицетовых грибов, в частности Fomitopsis officinalis [Ооржак У.С. Научно-практические аспекты рационального использования плодовых тел Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Sing. / Автореф. Дисс. канд. биол. наук. Красноярск, 2006. - 18 с.]
Исследованиями последних лет показано, что водные и углекислотные экстракты, полученные из плодовых тел трутовика лекарственного, обладают противомикробной активностью в отношении условно-патогенных бактерий Fcinetobacter bauvfnii, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis [Шариков A.M. Бактерицидная активность метаболитов гриба Fomitopsis officinalis в отношении условно-патогенных бактерий /A.M.Шариков, У.С.Ооржак, О.В.Перьянова, В.М.Ушанова и Д.А.Нешумаев // Грибы в природных и антропогенных экосистемах: тр. Межд. Конф. - Спб., 2005. - с.305-307], а также патогенной бактерии Mycobacterium tuberculosis [Sharicov, A.M. Metabolites of the fungus Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Sing: the bactericidal activity regarding the conditionally-pathogenic bacteria // A.M.Sharicov, U.S.Oorzhac, T.I.Gromovykh, O.V.Peryanova, D.A.Neshumaev // Program & abstracts: XII Symposium of Russia-Japan medical exchange. - Krasnoyarsk, 2005. - P.659-661].
В настоящее время широко известны иммуномодулирующие препараты на основе водорастворимых компонентов, экстрагируемых из плодового тела Fomitopsis officinalis [Богдаев А.Г. Изучение индукции иммуномодулирующих эффектов масляными экстрактами плодовых тел базидиомицетов у мышей с привитой опухолью карциномы / А.Г.Богдаев, А.В.Лавлинский, М.А.Наквасина // Успехи медицинской микологии. Т.9, 2007. - С.148-150]. Установлен биохимический состав плодовых тел в зависимости от мест произрастания [Ооржак У.С. Белковые вещества и витамины гриба Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Sing/ У.С.Ооржак, В.М.Ушанова // Хранение и переработка сельхозсырья. 2004. - №11. - С.52-53]. Предложены способы переработки плодовых тел Fomitopsis officinalis для получения биологически активных соединений [Пат. RU 2257222, МПК 7 А61К 35/84, заявл. 02.07.04, опубл. 27.07.05, бюл. №21. - 5 с.].
Анализ литературы показывает, что нет близких аналогов для заявляемого штамма Fomitopsis officinalis, что объясняется тем, что данный вид гриба является редким, исчезающим видом и встречается лишь в труднодоступных природных местах. В связи с чем исследований экстрактов из мицелия гриба Fomitopsis officinalis не проводилось, что связано со сложностью выделения чистой культуры мицелия и подбора питательных субстратов для культивирования в лабораторных условиях.
В настоящее время микробиологической промышленностью не освоено производство противоопухолевых биологических препаратов на основе активных штаммов базидиомицетов. Отсутствие работ по созданию биотехнологии на основе мицелия базидиомицета Fomitopsis officinalis сдерживает возможности получения на его основе противоопухолевых препаратов.
Техническим результатом изобретения является штамм Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961, обладающий противоопухолевой активностью.
Технический результат достигается использованием штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 для подавления опухолевых клеток карциномы Эрлиха. Особенностью штамма является уникальный биохимический состав. Для рекомендуемого штамма характерно накопление биомассы на элективных средах, содержащих растительные остатки, и способность образовывать бластоконидии.
Предлагается применение этого штамма в качестве продуцента для создания на его основе противоопухолевых препаратов. Мицелий штамма в больших количествах содержит пролин, гистидин, лизин (таблица 1).
Штамм выделен из плодового тела, найденного в естественных условиях республики Тыва в 2006 г (фиг.1).
Штамм характеризуется следующими признаками.
Макроморфологические признаки
На стандартной питательной среде сусло-агара штамм образует плотный серо-белый мицелий. В центре колонии мицелий более плотный. Край колонии изрезанный, неровный (фиг.2).
Гриб медленно растущий. На 40-е сутки инкубирования размер колонии на сусло-агаре достигает 80 мм (фиг.3). Воздушный мицелий на среде сусло-агара обильный белого цвета, субстратный мицелий на среде сусло-агара серо-белого цвета, с обратной стороны колонии серого цвета. Штамм пигмента не образует. По мере старения колонии штамма приобретают серо-палевый цвет.
На сусло-агаре с добавлением опилок (5%) на 40-е сутки инкубирования размер колонии штамма достигает 88 мм, на среде Сабуро - 50 мм, на грибном агаре - 75 мм, на картофельно-декстрозном - 50 мм (фиг.3).
Микроморфология
Мицелий септированный, размер гиф от 3,5-5,8 мкм. В мицелии образуются клетки-пряжки. Гриб образует бластоконидии обильно на 10-15 сутки (фиг.4). Хламидоспоры и склероции не образует.
Культуральные признаки
Изучение продуктивности штамма при поверхностном жидкофазном культивировании на пивном сусле показало, что прирост биомассы мицелия составляет на 10-е сутки - 1.56 г/л, на 30-е - 4.14 г/л. Штамм сохраняет жизнеспособность на скошенном сусло-агаре с добавлением лиственничных опилок в течение 6 месяцев. Для размножения штамма оптимальной средой является сусло-агар с добавлением лиственничных опилок (5%), рН 4,7-5,0, время инкубации 15 суток, в освещении для роста штамм не нуждается.
Другие среды, используемые для культивирования: грибной агар, картофельно-декстрозный агар, агар Сабуро. Для ферментации оптимальной является среда сусло (4° Б) с добавлением лиственничных опилок, рН 4,8-5,0.
По заключению специалистов Красноярской краевой ветеринарной лаборатории данный штамм авирулентен, нетоксичен, нетоксигенен в отношении теплокровных организмов и не вызывает инфекционных заболеваний.
На фиг.1-5 представлены следующие иллюстрации.
Фиг.1. Морфология плодового тела, из которого выделен штамм Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961.
Фиг.2. Морфология колоний штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 на различных питательных средах:
1 - сусло-агар;
2 - сусло-агар с добавлением опилок;
3 - грибной агар;
4 - картофельно-декстрозный агар;
5 - среда Сабуро.
Фиг.3. Динамика роста штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 на плотных стандартных питательных средах.
Фиг 4. Морфология мицелия штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961: А - мицелий, формирующий пряжки; Б - образование бластоконидий.
Фиг 5. Цитотоксическое действие экстрактов на клетки карциномы Эрлиха: А - действие экстрактов на клетки асцитной карциномы Эрлиха (агглютинация); Б - контроль.
Пример 1. Технология глубинного периодического культивирования включает несколько этапов:
Посев производят культурой штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 из расчета 1,5-2×106 бластоконидий на 1 мл питательной среды. В качестве посевного материала используют культуру штамма, выращенную на скошенном сусло-агаре с опилками (5%). Из пробирок делают смыв в колбы со стерильной водой, затем определяют титр пропагул в полученной суспензии микроскопическим способом в камере Горяева и методом пересчета на весь объем питательной среды используют необходимое количество суспензии для засева. Засев производят в колбы Эрленмейера объемом на 250 мл на 100 мл питательной среды. Выращивание штамма производят в течение 25 суток на жидком сусле с добавлением опилок (5%).
После окончания культивирования биомассу отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе; при такой форме препарата отсутствует питательная среда, на которой выращивали штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961.
Полученный биопрепарат представляет собой сухой порошок светло-желтого цвета.
| Таблица 1 | |||
| Аминокислотный состав мицелия штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 | |||
| Незаменимые аминокислоты | Содержание в мицелии, % на сухой вес | Заменимые аминокислоты | Содержание в мицелии, % на сухой вес |
| Аргинин | 3.9 | Аланин | 3.3 |
| Валин | 1.5 | Аспарагин | 2.0 |
| Гистидин | 18.6 | Глицин | 3.9 |
| Изолейцин | 3.2 | Пролин | 37.4 |
| Лейцин | 4.1 | Серин | 1.7 |
| Лизин | 16.9 | Тирозин | 2.0 |
| Метионин | 0.6 | Треонин | 0.9 |
Пример 2. Мицелий культуры штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 выращивают в течение 25 суток на сусло-агаре с опилками (5%). После окончания культивирования биомассу отделяют от питательной среды, высушивают до постоянного веса и измельчают на гомогенизаторе; при такой форме препарата отсутствует питательная среда, на которой выращивали штамм.
Противоопухолевое действие водного экстракта из мицелия оценивают в отношении опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro. К водному экстракту из мицелия прибавляют взвесь (в питательной среде 199) опухолевых клеток с титром 4.02×106 (разведения 1:10, 1:50, 1:100, 1:200). Культивирование проводят на водяной бане при температуре 37°С в течение всего времени исследования. Противоопухолевое действие оценивают по физиологическому состоянию клеток карциномы Эрлиха с окрашиванием 1% раствором метиленового синего: живые клетки, клетки с признаками блеббинга (частичное разрушение клеточной стенки и выход содержимого цитоплазмы наружу) и мертвые клетки (фиг.5). Подсчет клеток проводят с помощью камеры Горяева при увеличении на 640 (8×40×2 призма) на микроскопе SK 14 26183, Польша.
| Таблица 2 | |||||
| Действие водного экстракта мицелия штамма Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 на клетки асцитной карциномы Эрлиха in vitro, % | |||||
| Разведение экстракта | Через 5 мин после внесения | 1 ч | 2 ч | 3 ч | |
| 1:10 | живые | 90,9 | 97,69 | 83,85 | 100% мертвые агглютинация |
| мертвые | 2,18 | 1,8 | 9,56 | ||
| блеббинг | 9,31 | 0,51 | 6,59 | ||
| 1:50 | живые | 93,59 | 73,9 | 65,2 | 100% мертвые агглютинация |
| мертвые | 4,23 | 8,58 | 9,36 | ||
| блеббинг | 2,18 | 17,52 | 25,44 | ||
| 1:100 | живые | 91,97 | 76,76 | 84,35 | 100% блеббинг |
| мертвые | 7,73 | 5,89 | 2,16 | ||
| блеббинг | 0,29 | 17,35 | 13,49 | ||
| 1:200 | живые | 97,32 | 90,89 | 3,2 | 44,29 |
| мертвые | 2,68 | 2,67 | 75,3 | 16,35 | |
| блеббинг | 0 | 6,44 | 21,5 | 39,36 |
Таким образом, штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961, может быть использован для получения на его основе противоопухолевых препаратов.
Штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis ВКПМ F-961 (Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов), используемый для получения противоопухолевых препаратов.
