Композиция для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта
Владельцы патента RU 2361606:
ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов ФМБА (RU)
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "ЦИТОКИН" (RU)
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Изобретение представляет собой композицию на основе интерлейкина-1 и поливинилпирролидона в водосодержащем растворе, которая дополнительно содержит бикарбонат натрия, а компоненты композиции находятся в определенном массовом соотношении. Изобретение обеспечивает выраженное ранозаживляющее действие, стимулирует местный иммунитет слизистой и не имеет системного действия, а также является безвредным. 3 з.п. ф-лы, 6 табл.
Изобретение относится к области медицины, а именно к созданию композиции для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а именно композиции, содержащей препараты интерлейкина-1 (ИЛ-1) для лечения повреждений слизистой оболочки (СО) ЖКТ.
Лечение поражений слизистой оболочки (СО) пищеварительного тракта, как правило, осуществляют путем комплексного воздействия, включающего в себя препараты и приемы, направленные на устранение повреждающего влияния кислотно-пептического фактора, нормализацию моторно-эвакуаторной функций желудка и двенадцатиперстной кишки, стимуляцию регенерации эпителиальных клеток слизистой оболочки и образование слизи, улучшение кровоснабжения слизистой оболочки и другое. Для стимуляции процессов регенерации СО в комплекс лечебных мероприятий включают солкосерил, метилурацил, алоэ, витамины, аутогемотерапию и гипербарическую оксигенацию (Краткая медицинская энциклопедия, под ред. акад. Б.В.Петровского - М., Советская энциклопедия, 1990, стр.437-439).
Известно профилактическое применение интерлейкинов при интерперитонеальном или внутривенном введении при воспалительных процессах ЖКТ в эксперименте (Wallace J.L. et al., Gastroenterology, 1992, V.102, р.1176; Wallace J.L., Eur. J. Pharmacol, 1990, V.186, p.279).
Недостатком указанных методов является относительно невысокая эффективность, наличие значительного числа противопоказаний и осложнений.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является разработанный авторами препарат ИЛ-1β «Беталейкин» (RU 2128706; Р №000222/01-2001, 25.01.2001), содержащий в своем составе ИЛ-1β, человеческий альбумин и поливинилпирролидон. Курс лечения с помощью «Беталейкина» состоит из 3-х ежедневных внутривенных капельных инфузий в дозе 5 нг/кг массы тела (Долгушина А.И., Автореферат канд. дисс., Челябинск, 2003). После применения ИЛ-1 было показано ускорение заживления язвенных дефектов слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки. Однако данная композиция ИЛ-1 имеет ряд недостатков, в частности недостаточная эффективность и появление нежелательных побочные эффектов, таких как лихорадочная реакция после инфузий и реакция со стороны системного иммунитета.
Технической задачей, стоявшей перед авторами, являлось разработка более эффективной и безопасной лечебной композиции для лечения повреждений СО ЖКТ на основе «Беталейкина».
Технический результат достигался созданием композиции в виде водного раствора, содержащего 5×10-7-5×10-5 мас.% ИЛ-1, 1-10 мас.% бикарбоната натрия (БКН) и 1×10-4-1×10-2 мас.% поливинилпирролидона (ПВП).
Препарат вводят ежедневно в дозе 25-2500 нг на 1 кг массы. Курс лечения в зависимости от особенностей заболевания составляет от 1 до 10 дней.
Основой использования заявляемого способа являлось предположение, что заряженные молекулы поливинилпирролидона и бикарбоната натрия способны с одной стороны защитить наиболее уязвимые фрагменты молекулы ИЛ-1 от ферментативной и кислотной биодеградации, увеличивая эффективность действия препарата, а с другой стороны способны ослабить взаимодействие ИЛ-1 с иммуноглобулинами и устранить негативную иммунную реакцию на введение чужеродного белка.
Как показали исследования, использование данной композиции ИЛ-1 как значительно усиливает заживление язвенных поражений слизистой оболочки желудка (СОЖ) в различных моделях, так и минимизирует негативное воздействие введения ИЛ-1 на иммунную систему, что ранее в литературе не отмечалось.
Использование ИЛ-1 в дозе менее 5×10-7 малоэффективно, применение его в дозе более 5×10-5 мас.% возможно при использовании в отдельных осложненных патологиях, но, как правило, экономически нецелесообразно. Использование раствора с концентрацией бикарбоната натрия менее 1% и поливинилпирролидона в дозе менее 1×10-4 не обеспечивает надежную защиту белка от деградации при попадании в желудок, либо не устраняет негативные побочные эффекты. Использование растворов, содержащих большие количества защитных добавок, не повышает эффективности метода.
В качестве препарата ИЛ-1 могут использоваться природный ИЛ-1, а также рекомбинантные ИЛ-1ά или ИЛ-1β. Выбор конкретного интерлейкина-1 и длительность применения определяется, в основном, особенностями заболевания пациента.
Промышленная применимость способа и его эффективность иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. 10 мкл раствора субстанции ИЛ-1, содержавшего 20 мкг ИЛ-1β, разводили в 980 мкл стерильного 4%-ного раствора натрия двууглекислого и получали, таким образом, раствор с концентрацией ИЛ-1 20 мкг/мл. Затем 50 мкл полученного раствора вносили в 9950 мкл стерильного 4%-ного раствора пищевой соды, перемешивали пипетированием и получали раствор с концентрацией ИЛ-1β 100 нг/мл. Поливинилпирролидон (ПБП) добавляли в дозе на 1 мл раствора 0,1 мг ПБП. После этого пробы лиофилизировали.
Для испытания биологической активности композиции при пероральном введении использовали самки крыс Wistar весом около 150 г. За 24 часа до проведения опыт крыс не кормили, оставляя свободный доступ к воде. Повреждения слизистой вызывали внутрижелудочным введением 1 мл 96°-ного этанола (Wallace J.L., Eur. J. Pharmacol., 1990, V.186, p.279). Через 1 час после поражения внутрижелудочно через зонд вводили 1 мл субстанции, содержащей ИЛ-1β в дозах 0,005-0,5 мкг/мл и поливинилпирролидон в 4%-ного раствора пищевой соды или плацебо в том же объеме. На каждую точку были исследованы по пять животных. Животные были забиты через 3 часа, сутки и трое суток после введения ИЛ-1. Желудки были вынуты, зафиксированы 10%-ным формалином, разрезаны по большой кривизне, приколоты к восковой платформе и сфотографированы цифровой камерой, после чего площадь поражений измеряли с использованием программы Scion Image. Проводилось планиметрическое измерение площадей поражений СОЖ и высчитывали их процент по отношению к общей площади секреторной части желудка, что является широко используемым методом. В нашем исследовании мы учитывали наиболее выраженные повреждения СОЖ, имевшие четкие контуры, процент их площади составлял заявленные значения относительно площадей секреторной части желудка. Процент поражения высчитывали как отношение пораженных участков к общей площади слизистой желудка. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Влияние заявляемого препарата и рекомбинантного ИЛ-1 бета и «Бета-лейкин» на площадь поражения СОЖ (% площади поражения от общей площади секреторной части желудка) |
|||||
| Срок исследования | Используемый препарат | Концентрация ИЛ-1 бета | |||
| 5 нг/мл (5×107%) | 50 нг/мл рек ИЛ-1β | 500 нг/мл (5×105%) | Плацебо | ||
| 3 часа | заявляемый | 10,66±2,56 | 14,84±5,0 | 8,98±1,5 | 11,48±1,76 |
| «Беталейкин» | 11,8±2,40 | 14,8±2,5 | 11,0±1,55 | ||
| 24 часа | заявляемый | 4,2±1,62* | 5,62±1,24* | 4,09±1,39* | 15,5±3,83 |
| «Беталейкин» | 6,5±2,55 | 5,8±1,5* | 5,9±3,9 | ||
| 72 часа | заявляемый | 2,74±0,77** | 3,54±1,18 | 2,78±1,28* | 6,98±1,05 |
| «Беталейкин» | 4,9±0,8 | 4,5±1,8 | 3,8±1,8 | ||
| Примечания: *р<0,05, ** р<0,01 различия с плацебо достоверны. Количество наблюдений: n=5 на каждую точку. |
Результаты показали, что применение рек ИЛ-1β в составе композиции в диапазоне доз в два-три раза статистически достоверно снижало площадь поражения в использованных дозах на сроках исследования 24 и 72 часа по сравнению с контрольной группой. Использование препарата «Беталейкин» также приводило к положительным эффектам, так, начиная со срока 24 часа, применение ИЛ-1 в 1,5-3 раза снижало площадь поражения по сравнению с контрольной группой. Однако действие рек ИЛ-1β в составе композиции было более выраженным, что проявлялось в достоверных различиях с плацебо на сроках 24 и 72 часа практически во всем диапазоне доз, а препарат «Беталейкин» достоверно снижал площадь поражений на 24 часа в дозе 50 нг/мл.
Пример 2. В условиях примера 1 было проведено исследование по действию заявленной композиции, включавшей природный ИЛ-1 бета, или препарата «Беталейкин» на заживление кислотных язв желудка.
| Таблица 2 Влияние природного ИЛ-1 бета или препарата «Беталейкин» на площадь язв СОЖ |
|
| Группы животных | Площадь язвы, мм2 |
| ИЛ-1 бета 100 нг/мл - 1×10-8% - заявляемый препарат (n=10) | 5,65±0,65** |
| «Беталейкин» (n=6) | 11,10±2,13 |
| Плацебо (n=8) | 16,56±4,47 |
| **р<0,01 различия с контрольной группой достоверны. |
Как следует из представленных данных, при применении заявленной композиции, включавшей природный ИЛ-1 бета, наблюдалось значительное снижение площадей язв в опытной группе по сравнению с контролем (более чем в 3 раза), которое было статистически достоверным. Использование препарата «Беталейкин» также снижало площадь язв в среднем на треть, но не наблюдали достоверных отличий от плацебо.
Пример 3. Получение природного препарата ИЛ-1 проводили путем стимуляции клеток человека. Выделение клеток проводили следующим образом (Boyum А., Scand. 1. Clin. Invest., 1968, V.21, S.97, p.77-89). К 10 мл свежей венозной крови, взятой на гепарине (20 МЕ/мл) в стерильную пробирку, добавляли 1 мл 10%-ного раствора желатины, перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем проводили центрифугирование в градиенте плотности Histopaque ("Sigma"). Для этого 6 мл полученной лейковзвеси наслаивали на 3 мл градиента плотности и центрифугировали в течение 40 минут при 450 g и +40 С°. Образовавшееся в интерфазе "кольцо" мононуклеаров снимали пипеткой, полученную клеточную взвесь трижды отмывали 0,9%-ным раствором NaCl. Жизнеспособность клеток, которую определяли по методу окрашивания трипановым синим, составляла не менее 95%. Клетки ресуспендировали в концентрации 5×106 клеток /мл в среде RPMI 1640 с добавлением 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл гентамицина. Для приготовления рабочего раствора продигиозана смешивали 2,4 мл среды RPMI 1640 и 800 мкл 0,005%-ного раствора продигиозана, при этом в 100 мкл полученного раствора содержалось 1,0 мкг продигиозана. В 96-луночный планшет для культивирования клеток ("COSTAR") вносили индуктор по 100 мкл на лунку, затем во все лунки добавляли по 100 мкл разведенных клеток. Культивирование проводили при 37°С в 5% СО2 в течение 24 часов, после чего осторожно отбирали супернатанты и доводили содержание ИЛ-1 до нужной концентрации.
В экспериментах использовали самки крыс Wistar массой 150-200 гр. У крыс индуцировали язву желудка путем введения в полость желудка уксусной кислоты (Tsuki-mi У., et al., Gastroenterology Hepatology, 1994, V.9, p.60). На 3 день после операции происходило формирование язвенного дефекта, что было подтверждено гистологическим исследованием. На каждую точку были исследованы по четыре-пять животных, при этом у каждого животного образовывалось по две язвы. На 4 и 5 дни после операции у опытных групп вводили через зонд в желудок 1 мл 6%-ного раствора бикарбоната, содержащего ИЛ-1 в дозе 100 нг/мл, ПВП в дозе 0,1 мг/мл. Животные контрольной группы на те же сроки получали плацебо. На 8 день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и измеряли площадь поверхности язв. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева, а формулу крови просчитывали на мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимза. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты измерения площадей язв представлены в таблице 3.
| Таблица 3 Влияние концентрации ИЛ-1 на площадь язв |
||
| Концентрация ИЛ-1 | Площадь язвы, мм2 | % снижения |
| Заявляемый - 1×10-7% (n=10) | 5,56±0,65** | 66,4 |
| Плацебо (контроль) (n=8) | 16,56±4,47 | 0 |
| **р<0,01 различия с контрольной группой достоверны. |
Как следует из представленных данных, наблюдалось значительное снижение площадей язв в опытной группе по сравнению с контролем (более чем в 3 р~а), которое было статистически достоверным.
| Таблица 4 Количество лейкоцитов и формула крови у крыс, получавших ИЛ-1 |
|||||
| Показатели крови | ИЛ-1 10 нг/мл | ИЛ-1 100 нг/мл | Беталейкин | Плацебо | |
| Количество лейкоцитов, тыс./мм3 | 12,0±1,2 | 11,5±3,3 | 11,5±3,3 | 11,5±3,3 | |
| Формула крови, % | Нейтрофилы | 29,6±5,8 | 20,2±5,9 | 24,2±5,5 | 29,1±8,1 |
| Лимфоциты | 66,3±5,4 | 72,4±5,3 | 64,2±6,1 | 66,3±7,2 | |
| Моноциты | 2,6±0,7 | 4,4±1,4 | 3,1±1,6 | 3,2±1,1 | |
| Эозинофилы | 1,8±0,6 | 1,8±0,4 | 1,8±0,4 | 2,0±0,9 |
Результаты подсчетов абсолютного и относительного количества лейкоцитов показали отсутствие достоверных различий между контрольной и опытной группами (таблица 4). Это позволяет судить об отсутствии значительного системного воздействия ИЛ-1 при его введении в желудок, что подтверждает повысившуюся безопасность новой композиции.
Пример 4. Язва желудка индуцировалась, как описано в примере 3. На 4, 5 и 6-й дни после операции животным опытных групп вводили через зонд в желудок различные композиции, содержавшие препарат рекомбинантного ИЛ-1а в дозе 100 нг/мл. Животные контрольной группы на те же сроки получали 1 мл плацебо. На каждую точку были исследованы по пять животных, при этом у каждого животного образовывалось по две язвы. На 8-й день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и измеряли площадь поверхности язв. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты измерения площадей язв представлены в таблице 5.
| Таблица 5 Влияние состава композиции на площадь язв СОЖ |
||||
| Состав композиции, мас.% | Площадь язвы, мм | % снижения от контроля | ||
| ИЛ-1а | ПВП | БКН | ||
| 1×10-7 | 0 | 0 | 21,5±2,0* | 21,5 |
| 1×10-7 | 0 | 4 | 19,2±2,6* | 29,9 |
| 1×10-7 | 1×10-3 | 0 | 20,2±2,8* | 26,3 |
| 1×10-7 | 1×10-3 | 4 | 14,8±2,4** | 46,0 |
| 1×10-7 | 1×10-4 | 1 | 18,6±2,4** | 32,1 |
| 1×10-7 | 1×10-2 | 10 | 14,2±2,6** | 48,2 |
| плацебо | 27,4±2,8 |
Лучшие результаты достигались при содержании ПВП - 1×10-2-1×10-3 %, бикарбоната натрия - 4-10 мас.%.
Пример 5. Язва желудка индуцировалась так же, как описано в примере 2. На 4, 5 и 6-й дни после операции животным опытных групп вводили через зонд в желудок композицию, содержавшую препарат рекомбинантного ИЛ-1а в дозе 100 нг/мл, ПВП - 10-3 мас.%, бикарбоната натрия - 2 мас.%. Животные контрольной группы на те же сроки получали 1 мл плацебо. На каждую точку были исследованы по пять-восемь животных, при этом у каждого животного образовывалось по две язвы. На 8-й день эксперимента проводился забор крови из хвостовой вены, после чего животных забивали, вскрывали желудок и измеряли площадь поверхности язв. Подсчет абсолютного количества лейкоцитов проводили в камере Горяева. Статистическую обработку проводили по критерию Стьюдента. Результаты измерения площадей язв представлены в таблице 5.
| Таблица 6 Влияние ИЛ-1а на площадь язв СОЖ |
|
| Группы животных | Площадь язвы, мм |
| ИЛ-1a - 1×10-7 % (n=16) | 18,2±1,02** |
| Плацебо (n=10) | 25,2±2,63 |
| **р<0,01 различия с контрольной группой достоверны. |
Как следует из представленных данных, трехкратное курсовое введение в желудок препарата ИЛ-1а приводило к значительному, статистически достоверному снижению площадей язв по сравнению с контролем.
| Таблица 5 Количество лейкоцитов у крыс на фоне терапии ИЛ-1а |
||
| Группа животных | ИЛ-1а - 1×10-7 % | Плацебо |
| Количество лейкоцитов, тыс./мм3 | 10,10±1,71 | 9,25±1,05 |
Результаты подсчетов абсолютного количества лейкоцитов показали отсутствие различий между контрольной и опытной группами (таблица 6). Это также позволяет сказать об отсутствии значительного системного воздействия ИЛ-1а при местном использовании.
Таким образом, в ходе проведенных экспериментов было показано, что пероральное применение композиции, содержащей ИЛ-1, оказывает выраженное ранозаживляющее действие, стимулирует местный иммунитет слизистой и не имеет системного действия.
Композиция показала эффективность, безвредность и свою перспективность для лечения воспалительных, инфекционных и стрессорных поражений, механических повреждений и ран слизистой оболочки ЖКТ.
1. Композиция для лечения повреждений слизистой оболочки желудочно кишечного тракта на основе интерлейкина-1 и поливинилпирролидона в водосодержащем растворе, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит бикарбонат натрия при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
| интерлейкин-1 | 5·10-7-5·10-5 |
| бикарбонат натрия | 1-10 |
| поливинилпирролидон | 1·10-4-1·10-2 |
| вода | остальное |
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве интерлейкина-1 она содержит рекомбинантный интерлейкин-1 бета.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве интерлейкина-1 она содержит природный интерлейкин-1.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве интерлейкина-1 она содержит рекомбинантный интерлейкин-1 альфа.
