Фармацевтические композиции для терапевтического применения

Изобретние относится к области медицины и касается терапевтических и профилактических вакцин против гепатита В и HIV. Сущность изобретения заключается в том, что предложенная композиция включает в качестве главного компонента поверхностный антиген гепатита В (HBSAg), полученный как рекомбинантный продукт Pichia pastoris и вакцинный антиген, представляющий собой полиэпиптоидный полипептид CR3, содержащий эпитопные детерминанты вируса иммунодефицита человека. Предложенную композицию можно применять при лечении HIV и в то же время в качестве профилактической вакцины вируса гепатита В. 2 з.п. ф-лы, 10 ил.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, относящейся к терапевтическим вакцинам к патогенам, вызывающим хронические заболевания. Конкретно настоящее изобретение относится к применению поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), продуцируемого рекомбинантными способами в Pichia pastoris в качестве основного соединения фармацевтических композиций для терапевтического применения.

Предшествующий уровень техники

Вирусом гепатита B (HBV) хронически инфицировано приблизительно 350 миллионов человек. Основным риском для хронически инфицированных HBV пациентов является развитие цирроза, приводящее к увеличенной смертности, связанной с гепатоцеллюлярной карциномой и некарциноматозными осложнениями цирроза (портальная гипертензия и печеночная недостаточность).

Контроль репликации вируса значительно уменьшает эти риски, так как патология инфекции HBV главным образом является иммуноопосредованной.

В настоящее время широко признаны только два способа лечения вызванного HBV хронического гепатита, показавшие клинические эффекты: лечение интерфероном-α и лечение аналогом нуклеозидов/нуклеотидов, подобным ламивудину. Оба вида лечения обладают важными ограничениями. Лечение интерфероном-α сочетает антивирусные и иммуностимулирующие свойства γIFN, приводя к продолжительной супрессии репликации вируса только у трети пациентов.

Лечение ламивудином способствует быстрому и почти полному прекращению репликации HBV, но лечение в течение коротких периодов времени связано с частыми рецидивами. Лечение в течение более длительных периодов увеличивает рецидивирование с частотой возникновения от 15 до 20% в год. Ограничения обоих видов антивирусного лечения HBV указывают на необходимость поиска новых терапевтических альтернатив, включающих в себя новые аналоги нуклеотидов и новые специфические и неспецифические способы иммунотерапии, предназначенные для усиления слабого ответа T-клеток у хронически инфицированных пациентов.

Современные иммунотерапевтические стратегии представляют собой пассивный перенос специфического иммунитета, иммуномодулирующие лекарственные средства (цитокины, производные тимуса и факторы роста) и лечение вакцинами (современные рекомбинантные вакцины, новые подходы, подобные вакцинам, основанным на ДНК, и T-клеточные пептиды).

HBV не является цитопатическим вирусом, а повреждение печени во время инфекции главным образом опосредуется иммунным ответом на инфицированные клетки и вследствие продукции воспалительных цитокинов. В периферической крови пациентов с острой и самоограничивающейся инфекцией гепатита B легко и быстро можно обнаружить cильный, поликлональный и полиспецифичный клеточный ответ на HBV в субпопуляциях цитотоксических и хелперных клеток, а также сильный ответ на него цитокинами. В свою очередь, у пациентов с хронической инфекцией тот же ответ является слабым, антигенно-ограниченным или невыявляемым. Показано, что за элиминацию HBV отвечает T-клеточный ответ. Во время острого гепатита B с элиминацией вируса связаны Th1-цитокины (интерферон γ, TNF-α) и IL-2.

Для иммунотерапии оценивали определенные рекомбинантные вакцины против гепатита B. Иммунизация трансгенных мышей, конститутивно экспрессирующих в печени HBsAg, показала возможности такого подхода в отношении преодоления функциональной толерантности к HBsAg, индуцируя специфический иммунный ответ (Mancini M, et al., Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing "nonresponse" to HBsAg. J Med Virol. 1993; 39:67-74). Начальные клинические испытания в лабораторных масштабах подтвердили, что лечение специфическими вакцинами было способно подавить или уменьшить репликацию HBV приблизительно у 50% носителей хронической инфекции (Pol S, et al. Lancet 1994; 342 (Letter), Wen Y-M, et al. Lancet 1995; 345: 1575-1576 (Letter), Pol S, et al. Acta Gastroenterologica Belgica 1998; 61:228-33).

Наконец, многоцентровое и контролируемое исследование показало реальную работоспособность вакцин против гепатита B в лечении хронической инфекции (Pol S, et al. J Hepatol 2001; 34: 917-21). Анализировали коммерческие вакцины, содержащие антиген, включающий в себя области пре-S или только с S-области. После одного года и пяти инъекций не существовало различий в проценте устранения вирусной ДНК по сравнению с необработанной контрольной группой, не было элиминации HBsAg, а также было недостаточным устранение антигена "e", хотя и более благоприятным для вакцинированной группы. Все эти результаты свидетельствуют о необходимости новых иммунотерапевтических стратегий, а также позволяют заключить, что для ранее описанной стратегии необходимо усиление стратегий иммунизации более мощными кандидатами.

Недавно доказано, что антигены с меньшей способностью к связыванию с рецептором CD14 были способны индуцировать большую пролиферативную активность в PBMC индивидуумов, у которых развивается сильный ответ на HBsAg. Данный факт позволяет предположить связь между способностью к связыванию CD14 и механизмом иммуносупрессии (Valandschoot P, et al. J. Med Virol 2003, 70: 513-519).

Новый поверхностный антиген гепатита B в качестве свидетельства его большой иммуногенности в контексте клеточного ответа, показавший увеличенную активность по сравнению с совместно вводимыми гомологичными и гетерологичными антигенами, а также полученный способом, отбирающим вариант со значительным уменьшением его способности связываться с рецептором CD14 как результат определения его физико-химических параметров представляет собой новый антиген, и его можно рассматривать для применения в антивирусной терапии против вируса гепатита B как одного, так и включенным в качестве части композиций из нескольких антигенов для лечения хронических инфекций или совместных инфекций.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описано новое применение поверхностного антигена гепатита B, продуцируемого в Pichia pastoris описанным в данной заявке способом, для получения новых фармацевтических композиций для терапевтического применения. Для достижения этого приняты в рассмотрение новые свойства продуцируемого в условиях авторов изобретения HBsAg по сравнению с другими антигенами гепатита B.

По настоящему изобретению авторы обнаружили, что способ, описанный в патенте EP 0480525 B1 "Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена вируса гепатита B", предусматривает новые свойства у полученного в результате антигена. Из HBsAg, продуцируемого в Pichia pastoris с применением процесса очистки, включающего в себя следующие стадии: клеточный лизиз в лизирующем буфере, содержащем хаотропное средство; осаждение загрязняющих примесей в кислых условиях (низкие значения pH); иммуноаффинная хроматография антигена с применением специфического моноклонального антитела к поверхностному антигену гепатита B; термическая обработка элюированного антигена при температурах в интервале от 30°C до 40°C; в результате получают новый антиген, отличный от других поверхностных антигенов гепатита B, описанных в литературе, поддерживая терапевтическое применение этого антигена.

Отличия среди антигенов HBsAg основываются на более высокой иммуногенности антигена объекта настоящего изобретения по сравнению с антигенами, продуцируемыми у других хозяев и с применением других способов очистки. Другое отличие представляет собой увеличение активности по сравнению с гомологичными и гетерологичными антигенами, также рассматриваемыми как потенциальные антигены для включения в терапевтические вакцины для совместного введения, как результат увеличенной активности HBsAg авторов изобретения. Кроме того, существуют различные аспекты структуры и химического состава HBsAg, полученного в условиях авторов изобретения, заметно влияющих на его поведение в отношении иммунной системы.

HBsAg по настоящему изобретению можно применять в вакцинных препаратах для лечения хронической инфекции гепатита B, а также в случаях хронической совместной инфекции с другими вирусами вследствие способности антигена стимулировать усиление пролиферативного и функционального клеточного ответа на гетерологичные антигены.

Среди антигенов, которые совместно вводили, наряду с HBsAg по настоящему изобретению, присутствуют антигены из других вирусов, способных вызывать хронические инфекции, например антигены гепатита C и HIV. Описанные в примерах настоящего изобретения результаты получены с нуклеокапсидом вируса гепатита C и с химерным белком VIH-1, содержащим эпитопы, связанные у людей с клеточным ответом против указанных патогенов.

Данное свойство, которое согласно свидетельствам авторы получили в своей лаборатории, распространяется на любой гомологичный или гетерологичный белок, который с той же целью можно совместно вводить с HBsAg, полученным данным способом. Гомологичный белок, который можно применять в препарате авторов изобретения, а также важный для конечного эффекта препарата, представляет собой белок нуклеокапсида вируса гепатита B или HBcAg. Данный белок, когда его совместно вводят с HBsAg по настоящему изобретению, способен вызывать иммунологическую стимуляцию при клеточном ответе на него.

В то же время из данного изобретения понятно возможное применение полученных в результате поливалентных препаратов у индивидуумов, страдающих хроническим течением заболевания, за исключением гепатита B, на который можно оказывать благоприятное терапевтическое воздействие в отношении хронического заболевания, и в то же время они индуцируют профилактический иммунный ответ против инфекции посредством заражения HBV.

Также объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, в которой применяют HBsAg, полученный в Pichia pastoris с применением способа, описанного для лечения хронического гепатита B, в растворе, а также легко усиленной в солях алюминия или любом другом адъюванте, выбранном для данной цели. Они могут представлять собой в качестве неограничивающих примеров соли алюминия или любой другой адъювант, пригодный при введении вакцины авторов изобретения для терапевтического применения.

Также объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для терапевтического применения, в которой поверхностный антиген гепатита B, полученный описанным способом в Pichia pastoris, вводят в сочетании с гомологичными и гетерологичными антигенами, которые получают серьезный усиливающий эффект для их терапевтической активности. Гомологичный антиген находится среди антигенов вируса гепатита B, предпочтительно он представляет собой нуклеокапсидный антиген указанного вируса. Другие антигены, которые можно включить в препараты - объекты по настоящему изобретению, представляют собой в качестве неограничивающих примеров антигены, принадлежащие вирусам с хроническим развитием у людей, например вирус гепатита C и HIV-1, с возможностью применять антигены из других вирусов с такими характеристиками.

Важно указать, что фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно применять посредством слизистого способа, парентерального способа или сочетая оба способа с целью усиления качества требуемого терапевтического ответа. Количество антигена в фармацевтических композициях по настоящему изобретению зависит от антигенов, входящих в препараты; в случае HBsAg антиген находится в диапазоне от 5 до 300 микрограмм на дозу. Соотношение для остальных совместно вводимых антигенов варьирует от 5:1 до 1:5, в зависимости от конкретного рассматриваемого лечения.

Описание чертежей

Фигура 1. 1A) Графическое изображение кинетики иммунного ответа IgG против HBsAg в сыворотке мышей, иммунизированных на сутки 0, 15, 30 и 90 различными коммерческими вакцинами. Одна из вакцин представляет собой Heberbiovac-HB, содержащую HBsAg, полученный в Pichia pastoris, а другие вакцины получены в других хозяевах и различными способами. (1B) Лимфопролиферативный ответ, вызываемый различными вакцинами после повторной дозы на сутки 90. 1C) Ответ секретирующих γIFN клеток после стимуляции клетками мышиной мастоцитомы p815 меченных пептидом S28-39.

Фигура 2. Сравнительное исследование антигена, продуцируемого Pichia pastoris, и антигена, продуцируемого в клетках высших организмов (CHO) в отношении их способности усиливать клеточный ответ против других совместно вводимых антигенов. В данном случае в качестве антигенной модели применяли ядерный антиген гепатита B.

Фигура 3. Исследование иммунного ответа, индуцированного комбинированными препаратами для терапевтического применения, содержащими HBsAg, HBcAg и полиэпитопный белок, содержащий последовательности из HIV-1. Протокол назальной иммунизации: 3A) CD8+ лимфоциты к CR3, секретирующие γIFN после стимуляции клеток селезенки трансгенными p815 со вставленной последовательностью CR3. 3B) Секретирующие γIFN лимфоциты после прямой стимуляции клеток селезенки с применением CR3.

Фигура 4. Исследование иммунного ответа, индуцированного комбинированными препаратами HBsAg, HBcAg и белка CR3 из HIV-1. Протокол парентеральной иммунизации. 4A) CD8+ лимфоциты к CR3, секретирующие γIFN после стимуляции клеток селезенки трансгенными p815 со вставленной последовательностью CR3. 4B) Секретирующие γIFN лимфоциты после прямой стимуляции клеток селезенки с применением CR3.

Фигура 5. Титр вируса в яичниках животных из различных групп.

Фигура 6. Способность связывать CD14 группы 1), где HBsAg продуцируется в Saccharomyces и групп 2-9), где HBsAg продуцируется в Pichia в описанных условиях.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Иммуногенность различных вакцин против гепатита B, получаемых из различных хозяев, в отношении их способности индуцировать гуморальный и клеточный виды иммунного ответа.

Для изучения гуморального и клеточного типов иммунного ответа вызываемых различными коммерческими вакцинами против гепатита B у мышей Balb/C выполняли протокол иммунизации. Пять групп по 10 мышей в возрасте от 8 до 12 недель в каждой, на сутки 0, 15, 30 и 90 внутримышечно иммунизировали дозой 2 мкг (микрограмма) HBsAg. Через 10 суток после каждого введения проводили заборы крови для оценки гуморального ответа, а после третьей и пятой дозы мышей в количестве от 3 до 4 на группу забивали для исследования иммунного ответа, в зависимости от типа исследования.

В данном исследовании дозу 2 мкг HBsAg на мышь выбрали, так как она является минимально достаточной, чтобы позволить выявление любого различия между очень сходными продуктами (все оцениваемые вакцины несли сходные количества HBsAg и гидроксида алюминия).

Группы по протоколу иммунизации представляли собой 1) вакцина Heberbiovac HB, содержащая антиген HBsAg, продуцируемый в Pichia pastoris, 2) вакцина Shanvac B, также продуцируемая в Pichia pastoris, но с применением другого способа очистки, 3) Hepavax Gene и 4) вакцина Euvax B, продуцируемая в Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha соответственно. Пятая группа представляла собой контроль плацебо, включающий в себя мышей, получавших только гидроксид алюминия в сходном количестве.

Гуморальный иммунный ответ, а также длительность титров оценивали посредством ELISA, определяя общее количество IgG в образцах сыворотки. Сывороточные титры IgG тестировали через две недели после второй, третьей и четвертой доз, а также перед четвертой дозой. Результаты ответа антителами показаны на фигуре 1A.

В течение анализируемого периода времени значимых различий между группами, иммунизируемыми вакцинами Heberbiovac HB и Shanvac B, не выявлено. Обе вакцины после второй и третьей дозы приводили к образованию сходных титров, больших чем для остальных анализируемых вакцин (Euvax B и Hepavax Gene).

Через десять суток после четвертой дозы 4 мышей из группы умерщвляли для проведения исследований клеточного иммунитета, измеряя лимфопролиферативный ответ отдельной мыши. В экспериментальных условиях низкой дозы антигена авторов изобретения только Heberbiovac HB была способна индуцировать лимфопролиферативный ответ, четко выявляемый после вторичной дозы. Положительного ответа для оставшихся в исследовании вакцин не выявили (фиг. 1B).

Лимфопролиферативный анализ указывает на способность клеток селезенки пролиферировать без отбора субпопуляции специфических клеток, но известно, что в течение времени анализа T-клетки памяти CD4+ представляют собой главную клеточную популяцию, отвечающую на стимул. Данные T-лимфоциты CD4+, специфически пролиферирующие в ответ на антигенный стимул, могут взаимодействовать с B-клетками и с CD8+ T-клетками, способствуя развитию гуморального и цитотоксического ответа соответственно.

Через десять суток после третьей дозы трех мышей в группе умерщвляли и проводили анализ ELISPOT, результаты которого показаны на фигуре 1C.

Полученные в анализе ELISPOT результаты свидетельствуют, что HBsAg с квасцами способен индуцировать сильный ответ секретирующих γINF лимфоцитов после повторной стимуляции пептидом S28-39, полученным из HBsAg. Прямой анализ ELISPOT выявил более слабый ответ по сравнению с результатами после повторной стимуляции (данные не показаны). Показанные на фигуре 1C результаты свидетельствуют, что Heberbiovac HB способна индуцировать более высокую частоту секретирующих γIFN клеток в селезенке иммунизированных животных по сравнению с оставшимися в исследовании вакцинами. Секреция γIFN указывает на развитие клеток Th1, что очень важно для контроля репликации HBV.

Взятые вместе полученные результаты демонстрируют более высокий клеточный ответ на HBsAg, полученный в Pichia pastoris и очищенный в условиях, указанных в данном изобретении, по отношению к антигенам, полученным в других хозяевах, а также в том же хозяине и других условиях. Этот результат является выдающимся в области терапевтической вакцинации, так как широко распространена корреляция между ответом, оцениваемым в данном эксперименте (лимфопролиферативная активность и секреция γIFN), и контролем инфекции вирусом гепатита B.

Пример 2: Усиливающее действие полученного описанным способом HBsAg на клеточный иммунный ответ.

Для оценки потенциальных возможностей HbsAg, полученного из Pichia pastoris по отношению к антигену HBsAg, полученному в других хозяевах, спланировали эксперимент для оценки иммунного ответа на гомологичный антиген HBcAg (антиген нуклеокапсида гепатита B), индуцируемого совместным введением обоих антигенов.

С данной целью оценивали частоту секретирующих γIFN клеток после стимуляции клеток селезенки антигеном нуклеокапсида посредством анализа ELISPOT.

Определение проводили в группах, иммунизированных посредством HBsAg из Heberbiovac HB, а также посредством HBsAg, продуцированным высшим организмом (CHO) в обоих случаях введенным вместе с антигеном нуклеокапсида. Кроме того, оценивали соответствующий контроль плацебо (данные не показаны), а также контроль, содержащий только антиген нуклеокапсида (группа C, фигура 2).

Результат свидетельствует об увеличении частоты секретирующих γIFN клеток в группе, иммунизированной посредством HBsAg, продуцированного в Pichia pastoris (группа A), по отношению к группе, содержащей HBsAg, продуцированный в клетках CHO (группа B, фигура 2). Затем авторы смогли предложить применение HBsAg, продуцируемого в Pichia, в разработке терапевтических препаратов, содержащих другие антигены: гомологичный, как в данном случае, или гетерологичный, как авторы продемонстрируют в дальнейших экспериментах.

Пример 3: Применение HBsAg в препаратах терапевтических вакцин, сочетающих антигены HBV и полученный из HIV-1 белок CR3 из HIV-1.

Для оценки применения HBsAg в назальных иммунизациях в качестве антигена и в то же время в качестве адъюванта для иммуноусиления специфического клеточного ответа против гетерологичных антигенов в терапевтических вакцинных препаратах шесть групп самок мышей Balb/c в возрасте 6-8 недель инокулировали согласно следующему протоколу: 0, 7, 14, 35 и 63. Мышей в разных группах иммунизировали интраназальным способом, как указано ниже: 1. PBS, 2. HBcAg + HBsAg, 3. CR3, 4. HBcAg + CR3, 5. HBsAg + CR3, 6. HBcAg + HBsAg + CR3. Антиген CR3 соответствовал полиэпитопному полипептиду, полученному посредством рекомбинантных технологий и содержащему некоторые последовательности из HIV-1, специфичные для человеческих T-клеток. Антигены растворяли в PBS и вводили по 50 мкл (25 мкл в ноздрю). Для HBsAg (CIGB, Cuba), HBcAg (CIGB, Cuba) и CR3 (CIGB, Cuba) применяли дозы величиной 5, 5 и 10 мкг на мышь соответственно. Специфический иммунный ответ к CR3 с секрецией γIFN измеряли в анализах ELISPOT для клеток CD8+, а также с использованием тотального количества клеток селезенки через 10 суток после последней инокуляции.

Исследование клеточного ответа проводили измерением частоты секретирующих γIFN клеток селезенки посредством анализа ELISPOT. Эта APC конститутивно продуцирует белок CR3, который процессируется внутри клетки и представляется посредством HLA класса I. Клетки мастоцитомы P815 не экспрессируют на своей поверхности молекул MHC-II, вследствие этого факта P815CR3 будет специфически активировать CD8+ T-клетки. Показано, что только группы, иммунизированные HBsAg + CR3 и HBcAg + HBsAg + CR3, отвечали положительно (фигура 3A), демонстрируя увеличение активности клеточный ответ против CR3, стимулируемое HBsAg на белке CR3. С применением тотального количества клеток селезенки белок CR3 добавляли к культуре, где он эндоцитировался и процессировался для презентации главным образом в контексте MHC класса II профессиональных APC, таких как макрофаги и дендритные клетки.

Результаты авторов изобретения показали, что только те же группы, что демонстрировали положительный ответ CD8+ T-лимфоцитов, также были положительными в отношении описанного выше анализа (с применением тотального количества клеток селезенки), где главными отвечающими элементами были CD4+-клетки: HBsAg + CR3 и HBcAg + HBsAg + CR3 (фигура 3B). В основном возможно заключить, что HBsAg усиливал клеточный ответ против HIV-1 как результат потенцирования ответа против его эпитопов представленных белком CR3. Этот результат обосновывает применение HBsAg в качестве антигена, а также в качестве адъюванта в контексте терапевтической иммунизации против HIV-1 и HBV в одно и то же время.

Пример 4: Применение HBsAg в терапевтических вакцинах совместно с иммуногенами из HIV-1 парентеральным способом.

Для оценки применения HBsAg в качестве антигена, а также адъюванта клеточного ответа при парентеральных иммунизациях в области совместных иммунизаций против HBV-HIV оценивали различные препараты. Группы от 8 до 10 самок мышей Balb/c (CENPALAB, Cuba) в возрасте 6-8 недель иммунизировали на сутки 0, 14, 35. Мышей иммунизировали подкожно в разных группах, как указано ниже: 1) HBsAg, 2) CR3, 3) HBsAg + CR3, 4) HBsAg + HBcAg + CR3. Все иммуногены добавляли с адъювантом в виде 1 мг/мл фосфата алюминия. Применяли следующие дозы HBsAg и HBcAg: 2, 4 и 10 мкг в 100 мкл на мышь. Оба антигена продуцировали в CIGB, Cuba. Специфический клеточный иммунный ответ против CR3 секретирующих γIFN клеток измеряли посредством ELISPOT с применением экспрессирующих CR3 P815, как описано в примере 3 (фиг. 4A). Положительные ответы выявили только в случае групп, иммунизированных: HBsAg + CR3 и HBcAg + HBsAg + CR3 в фосфате алюминия (фигура 4A), что свидетельствует об эффекте HBsAg на иммуногенность совместно вводимого антигена.

Анализ специфического клеточного иммунного ответа против CR3 секретирующих γIFN клеток также проводили, когда белок CR3 непосредственно добавляли в культуру без каких-либо APC подобных P815. Этот эксперимент привел к положительному ответу в ELISPOT только для тех же групп, которые были положительными в случае ответа CD8+. Они представляют собой: HBsAg + CR3 и HBcAg + HBsAg + CR3 в фосфате алюминия (фиг. 4B), эти группы снова свидетельствуют об увеличении клеточной активности HBsAg на CR3.

Пример 5: Исследование сочетания HBsAg и антигенов HCV.

С целью оценки влияния сочетания укороченного белка из капсида HCV (Co. 120), (Lorenzo LJ, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001; 281(4):962-965) и HBsAg на иммунный ответ, развивающийся на антигены структурной области HCV, выполняли протокол внутримышечного введения на мышах BALB/c. Применяли группы из 10 самок мышей в возрасте 8 недель. Протокол включал в себя четыре инокуляции на неделях 0, 3, 6 и 9. Заборы крови проводили через 11 недель после первой иммунизации. Все иммуногены были усилены гидроксидом алюминия. Группу 1 использовали в качестве отрицательного контроля и вводили только гидроксид алюминия. Группе 2 инокулировали 5 мкг белка Co.120. Группе 3 инокулировали смесь из 5 мкг каждого белка, а группу 4 иммунизировали 5 мкг HBsAg. Животных стимулировали через две недели перитонеальным способом, вводя 106 бляшкообразующих единиц рекомбинантного вируса коровьей оспы с капсидным антигеном HCV, вставленным посредством рекомбинантных технологий.

Животных умерщвляли через 5 суток после стимуляции и выделяли и обрабатывали яичники. После серийных разведений в течение 2 суток для определения вирусного титра с применением окрашивания кристаллическим фиолетовым заражали клетки BSC-40.

На фигуре 5 показан вирусный титр в яичниках из различных групп. Для статистического анализа применяли T-критерий Стьюдента, сравнивая результаты между каждой группой и контрольной группой, считая p<0,05 в качестве значимого различия. На фигуре 5 показано, что иммунизированное смесью белка Co.120 и HBsAg животное обладало значимо меньшим вирусным титром по сравнению с оставшимися группами (p<0,05), свидетельствуя об индукции сильного и эффективного клеточного ответа in vivo против капсида вирус гепатита C. Данная группа была единственной группой, способной значительно уменьшить вирусный титр по сравнению с группой отрицательного контроля (мыши, иммунизированные гидроксидом алюминия). Таким образом, в данной системе прямого анализа функциональной противовирусной способности была показана увеличенная активность HBsAg в отношении уменьшения вирусного титра.

Пример 6: Исследование усиливающего действия HBsAg, описанного в данной заявке на различные антигены, ассоциированные с несколькими патологиями.

С целью оценки применения HBsAg при парентеральных иммунизациях в качестве антигена и в то же время в качестве иммуноусилителя специфического клеточного иммунного ответа в области вирусов, связанных с хроническими заболеваниями, проводили различные эксперименты с применением препаратов, содержащих HBsAg и различные совместно вводимые антигены в одном и том же препарате. Совместно вводимые антигены включали в себя антигены патологий человека, такие как: HIV (аттенуированные вирусы, содержащие антигены из вируса HIV-1, пептиды и полиэпитопные пептиды); HPV (авторы работали с вирусоподобными частицами из 16, 18 и 33); HCV (антигены, содержащие последовательности из нуклеокапсида, пептидов и белков их поверхностных антигенов, а также сегментов из неструктурных последовательностей); подобным образом, антигены других патологий, приводящих к хроническим заболеваниям, подобным злокачественной опухоли (ассоциированные с опухолью и опухолеспецифичные антигены из легкого, печени, молочной железы и простаты). Во всех случаях оценивали увеличение активности секреции γIFN в отношении введения только одних антигенов, демонстрируя потенциальные возможности HBsAg для введения в терапевтических препаратах, описанные в заявке авторов изобретения.

Пример 7. Исследование способности HBsAg связываться с рецептором CD14 с применением различных партий HBsAg, полученных из Pichia pastoris, с применением описанного способа получения в сравнении с антигеном, полученным в других хозяевах.

Анализ HBsAg, полученного в виде рекомбинантного белка с применением способа очистки, описанного в настоящем изобретении, свидетельствует, что существуют различия, влияющие на высокую иммуногенность в отношении клеточной части, как в случае способности HBsAg связывать рецептор CD14, найденный на макрофагах, и в связи с развитием процессов иммунологической толерантности.

После иммуноцитометрического анализа показали, что существует заметное уменьшение способности связывания рецептора CD14 антигеном, продуцируемым в дрожжах Pichia pastoris в условиях, описанных в данной заявке по сравнению с антигеном, продуцируемым в Saccharomyces cerevisiae (фигура 6). Данный факт поддерживает открытие авторов изобретения различного поведения антигенов, анализируемых в настоящем изобретении.

1. Фармацевтическая композиция для лечения совместной инфекции вируса гепатита В и инфекции вируса HIV, содержащая поверхностный антиген гепатита В, получаемый из дрожжей посредством способа очистки, включающего в себя следующие стадии: лизис клеток в лизирующем буфере, содержащем хаотропное средство; осаждение загрязняющих примесей в условиях кислого рН; иммуноаффинную хроматографию антигена с применением специфического моноклонального антитела к поверхностному антигену гепатита В; термическую обработку элюированного антигена при температурах в интервале от 30 до 40°С; и вакцинный антиген, представляющий собой полиэпитопный полипептид CR3, содержащий эпитопные детерминанты вируса иммунодефицита человека.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся применением в качестве бивалентной вакцины, применяемой при лечении HIV, и в то же время в качестве профилактической вакцины вируса гепатита В.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, где поверхностный антиген В вводят в сочетании с HBCAg.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины и касается применения вируса миксомы для терапевтического лечения рака. .
Изобретение относится к созданию комплексных гомеопатических средств для профилактики и лечения респираторных воспалительных заболеваний. .

Изобретение относится к новым замещенным дигидрохиназолинам формулы (I) и его фармацевтически приемлемым солям, обладающим противовирусным действием. .

Изобретение относится к применению мелоксикама или его фармацевтически приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для лечения или профилактики респираторных заболеваний у свиней.

Изобретение относится к области фармацевтической химии, в особенности к соединениям, композициям и способам лечения вирусных инфекций у млекопитающих, опосредованных, по меньшей мере частично, вирусом из вирусов семейства Flaviviridae.
Изобретение относится к области сельского хозяйства, преимущественно к ветеринарии, и может быть использовано при возникновении и угрозе распространения гриппа животных и птиц.

Изобретение относится к имидазохинолинам, имеющим формулу (I) и (II), а также тетрагидроимидазохинолинам, имеющим формулу (III), в которых радикалы и символы имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Изобретение относится к биотехнологии. .
Изобретение относится к области медицины и касается терапевтического средства для лечения заболеваний, родственных детским хроническим артритным заболеваниям, например, собственно детских хронических артритных заболеваний, болезни Стилла и им подобных, включающее в качестве активного ингредиента антагонист рецептора интерлейкина-6 IL-6, гуманимзированное антитело РМ-1.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунотерапии и иммунопрофилактики бактериальных и вирусных заболеваний.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к применению ингибитора р21-активируемой киназы (PAK1) для лечения заболевания суставов, такого как остеоартрит или ревматоидный артрит, или для лечения боли в суставах, и к применению PAK1 в качестве белка-мишени для поиска ингибитора PAK1 как лекарственного средства для лечения заболевания суставов.

Изобретение относится к медицине и касается лечения патологического воспаления, вызванного рассеянным склерозом или болезнью Крона. .
Изобретение относится к области медицины и касается композиции иммуноглобулина и способа их получения. .
Наверх