Устройство для культивирования организмов и способ культивирования организмов
Изобретение относится к биотехнологии. Устройство содержит сосуд для культуральной среды и расположенный в нем контактирующий с ней микропористый носитель, служащий для размещения на нем выращиваемой культуры и подвода к ней через поры культуральной среды. Микропористый носитель изготовлен формованием обожженного неметаллического неорганического твердого материала. Культивируемые организмы представляют собой клетки ткани растений, грибов или бактерий. Согласно способу, осуществляемому в предложенном устройстве. клетки или ткани помещают на верхнюю поверхность микропористого носителя. Нижнюю часть носителя погружают в культуральную среду, которая поступает к верхней поверхности микропористого носителя, для обеспечения ее поглощения выращиваемой культурой. Изобретение обеспечивает упрощение обслуживания устройства, уменьшение расхода культуральной среды, расширение области применения устройства. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 30 ил., 6 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается устройства и способа культивирования тканей или клеток организма. В частности, настоящее изобретение касается устройства и способа культивирования тканей или клеток организма без прямого контакта между общим объемом культуральной среды и тканью или клетками организма путем снабжения культуральной средой тканей или клеток организма через микропористый носитель.
Предшествующий уровень техники
Вследствие быстрого прогресса в области биотехнологии в последние годы методы культивирования тканей организма приобрели особое значение как в области фундаментальной науки при исследовании экспрессии конкретных генов и метаболизма конкретных факторов, так и в промышленности при разведении редких растений, распространении генетических мутаций, массовом производстве полезных веществ в целях сокращения времени культивирования, сохранения генетических источников и т.д.
В настоящее время предложены различные способы и устройства для культивирования микроорганизмов, клеток и тканей. Один из ближайших аналогов изобретения описан в патенте US 6200809, где раскрывается способ для культивирования эмбрионов с использованием устройства, состоящего из емкости, содержащей гелеобразную культуральную среду, на поверхность которой помещен тонкий пористый носитель, изготовленный из органического материала. Достоинством раскрытого устройства является отсутствие контакта культивируемых эмбрионов и культуральной среды. Однако описанное в US 6200809 устройство имеет ряд ограничений, наиболее существенным из которых является невозможность работы с микропористыми носителями при высоких температурах и при высоких концентрациях кислот и щелочей. Настоящее изобретение направлено на решение указанных недостатков.
Краткое изложение изобретения
Однако в таких методах культуры тканей при культивировании тканей на твердых средах типа агаризованных сред необходимо пересаживать культивируемую ткань на свежую среду через сравнительно короткий промежуток времени, потому что вода и питательные вещества в культуральной среде быстро расходуются культивируемой тканью, а побочные продукты выделяются из культивируемой ткани в культуральную среду. Кроме того, иногда культуральная среда подвергается заражению при пересеве (пересадке). При этом возникает проблема в том, что культивируемую ткань трудно снова выделить из системы тканевой культуры при использовании обычных систем, в которых культивируемая ткань непосредственно контактирует с культуральной средой. Более того, при подсчете числа жизнеспособных клеток бактерий подсчет проводится путем измерения количества колоний на чашках с агаризованной средой. Однако такой подход невозможно осуществить в случае таких бактерий, как молочнокислые бактерии и им подобные, так как они растут в диапазоне чрезвычайно кислых значений рН, при которых агаризованная среда не затвердевает при подготовке чашек (вследствие природы агара).
Кроме того, обнаружены микроорганизмы, которые живут в экстремальных условиях, таких как высокое давление, низкое давление, сильные кислоты, сильные щелочи, высокие температуры, низкие температуры, высокие концентрации солей, анаэробные или аэробные условия, радиация, органические растворители и т.д. (барофильные, ацидофильные, алкалифильные, термофильные, психрофильные, сильно галофильные, устойчивые к органическим растворителям, устойчивые к радиации бактерии и др.), причем оказалось, что они вырабатывают полезные вещества, например ферменты и др., которые эффективно работают даже в таких экстремальных условиях обитания. Таким образом, ожидается, что такие полезные вещества можно выделить при культивировании этих микроорганизмов для всевозможного промышленного применения, и существует потребность в таком устройстве и способе культивирования, которые можно было бы использовать для культивирования таких микроорганизмов.
Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования указанных выше проблем и обнаружили, что эти проблемы решаются путем снабжения культуральной средой культивируемой ткани через микропористый носитель, что привело к созданию настоящего изобретения.
Так, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (1) устройство для культивирования организмов, которое включает культуральную среду, микропористый носитель, обладающий способностью к поглощению воды, часть которого погружена в культуральную среду, и сосуд, содержащий, по меньшей мере, часть культуральной среды и микропористый носитель, причем культуральная среда поступает наверх через сообщающиеся поры внутри микропористого носителя за счет капиллярных сил, снабжая культуральной средой ткань или клетки организма, помещенные на поверхность микропористого носителя, при этом происходит культивирование ткани или клеток организма.
Кроме того, во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает (2) устройство для культивирования организмов, в котором микропористый носитель имеет цилиндрическую или стержневидную форму.
Кроме того, в третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает (3) устройство для культивирования организмов, в котором микропористый носитель состоит из вертикальной цилиндрической или стержневидной части и чашеобразной части, отходящей от цилиндрической или стержневидной части и имеющей больший наружный диаметр, чем у цилиндрической или стержневидной части, при этом в центре чашеобразной части имеется углубление, причем часть (бортик) чашеобразной части выступает в поперечном направлении и имеет больший наружный диаметр, чем у отверстия сосуда, а микропористый носитель опирается на сосуд путем контакта между дном бортика и периметром отверстия сосуда.
Кроме того, в четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (4) устройство для культивирования организмов, в котором микропористый носитель представляет собой обожженное изделие из неметаллического неорганического твердого материала.
Кроме того, в пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (5) устройство для культивирования организмов, в котором микропористый носитель представляет собой пенопласт с открытыми порами.
Кроме того, в шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (6) устройство для культивирования организмов, которое включает культуральную среду, микропористый носитель, обладающий способностью к поглощению воды, промежуточный носитель, соединенный с микропористым носителем, который может снабжать культуральной средой микропористый носитель при контакте между частью промежуточного носителя и культуральной средой, и сосуд, содержащий, по меньшей мере, часть культуральной среды и микропористый носитель, причем культуральная среда, поступающая через промежуточный носитель, переносится наверх через сообщающиеся поры внутри микропористого носителя за счет капиллярных сил, снабжая культуральной средой ткань или клетки организма, помещенные на поверхность микропористого носителя, при этом происходит культивирование ткани или клеток организма.
Кроме того, в седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (7) устройство для культивирования организмов, в котором ткань или клетки организма представляют собой ткань или клетки растений, грибов или бактерий.
Кроме того, в восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (8) способ культивирования организмов, который включает перенос культуральной среды наверх через сообщающиеся поры внутри микропористого носителя, обладающего способностью к поглощению воды, часть которого погружена в культуральную среду, снабжая культуральной средой ткань или клетки организма, помещенные на поверхность микропористого носителя, при этом происходит культивирование ткани или клеток организма.
Кроме того, в девятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает (9) способ культивирования организмов, в котором ткань или клетки организма представляют собой ткань или клетки растений, грибов или бактерий.
Если не указано иначе, в настоящем изобретении сами организмы и ткани организмов, таких как животные, растения, грибы, бактерии и им подобные, в совокупности называются тканями организма. Кроме того, индивидуальные клетки, полученные при обработке ткани ферментом, называются клетками организма. Кроме того, среда, содержащая различные ингредиенты, такие как питательные вещества, буферные растворы, модификаторы вязкости, антибиотики, осморегуляторы, ферменты, природные материалы (типа дрожжевого экстракта), регуляторы (типа гормонов растений), аминокислоты, витамины и т.д., называется культуральной средой.
В соответствии с аспектами (1)-(9) настоящего изобретения расходование культуральной среды можно уменьшить, поскольку лишь необходимое количество культуральной среды подводится к ткани организма под действием капиллярных сил микропористого носителя по сравнению с обычной системой культивирования, в которой культивирование ткани организма происходит при непосредственном контакте с культуральной средой.
Кроме того, в устройстве и способе по настоящему изобретению уменьшается необходимость в таких операциях, как перемешивание и встряхивание, поскольку культивирование ткани организма происходит вне общего объема культуральной среды на микропористом носителе таким образом, что необходимый для культивирования ткани газ, например кислород, поступает в достаточной мере.
Кроме того, в устройстве и способе по настоящему изобретению уменьшается количество необходимых пересевов (пересадок), поскольку побочные продукты, выделяющиеся из ткани организма и накапливающиеся поблизости, также диффундируют в культуральную среду через микропористый носитель и там разбавляются. Следовательно, в устройстве и способе настоящего изобретения наряду с вышеупомянутыми эффектами можно предотвратить заражение, которое может произойти при пересеве, и становится возможным культивирование в одной культуральной среде в течение длительного времени без пересева.
Кроме того, даже если и произойдет заражение культуральной среды микроорганизмами и проч., ткань организма не подвергается заражению или, по крайней мере, промежуток времени до заражения ткани организма удлиняется, поскольку культуральная среда поступает к ткани организма через сообщающиеся поры, поэтому ткань организма может быть перенесена в свежую среду до того, как она подвергнется заражению, что предотвращает заражение самой ткани организма.
Кроме того, становится возможным культивирование по типу «чашки с агаром», на которое не будут влиять рН, температура, высокое давление, низкое давление, ингредиенты культуральной среды, ультрафиолет, радиация и проч., и оно может проводиться просто путем помещения микропористого носителя, предварительно простерилизованного, в сосуд для культивирования, а затем заливания в него культуральной среды без проведения операций расплавления или затвердевания агара. В качестве альтернативы культивирование ткани организма может с легкостью проводиться путем асептического переноса микропористого носителя, пропитанного культуральной средой, в ламинарный бокс вскрытия упакованного носителя в ламинарном боксе и помещения в сосуд для культивирования.
В частности, в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения стоимость изготовления устройства для культивирования организмов может быть снижена при использовании микропористого носителя цилиндрической или стержневидной формы, который легко формируется.
Кроме того, в соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения становится возможным культивирование в течение длительного времени или культивирование большего количества ткани организма при использовании микропористого носителя чашеобразной формы, имеющей больший диаметр, чем у микропористого носителя цилиндрической или стержневидной формы.
Кроме того, в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения можно получить устройство для культивирования организмов, обладающее отличной способностью к формованию, износостойкостью и легким весом при использовании в качестве микропористого носителя обожженного продукта из неметаллического неорганического твердого материала.
Кроме того, в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения устройство для культивирования организмов по настоящему изобретению можно применять для разнообразных назначений, используя в качестве микропористого носителя пенопласт с открытыми порами, поскольку он хорошо поддается формовке, ему можно придавать разнообразные формы и из него можно получить легкий микропористый носитель.
Кроме того, устройство для культивирования организмов по настоящему изобретению может быть изготовлено тонкостенным или маленького размера, что удобно для культивирования, например, в таких условиях, как космическая станция, где нужно ограничивать площадь культивирования и вес устройства, поскольку обожженный продукт из неметаллического неорганического твердого материала или пенопласт с открытыми порами, описанные выше, можно формовать или прессовать в меньших размерах.
Кроме того, в соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения культуральная среда может непрерывно поступать к микропористому носителю и ткани организма даже тогда, когда она расходуется и ее уровень понижается, но при этом возможно культивирование в течение длительного времени, поскольку культуральная среда поступает к микропористому носителю и ткани организма через промежуточный носитель даже тогда, когда микропористый носитель не соприкасается непосредственно с культуральной средой. Кроме того, с точки зрения конструкции устройства для культивирования повышается степень свободы при конструировании сосуда, поскольку возрастает гибкость расположения микропористого носителя относительно сосуда.
Кроме того, в частности, скорость метаболизма и скорость роста тканей или клеток растений, грибов и бактерий меньше, чем у тканей или клеток животных. По этой причине было невозможно культивирование тканей или клеток растений, грибов и бактерий в одной и той же среде в течение длительного времени, поскольку долговечность обычных сред типа агара меньше продолжительности жизни культивируемой ткани или клеток вследствие высыхания среды. Кроме того, даже если культивирование может продолжаться длительное время в жидкой среде, вдобавок к необходимости встряхивания имеется риск того, что оно может вызывать напряжение из-за резкой смены условий вблизи от культивируемой ткани или клеток и может произойти заражение при замене культуральной среды. В соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения ткань или клетки организма можно культивировать в течение очень длительного времени без пересева или пересадки, поскольку культуральная среда постоянно поступает на микропористый носитель устройства для культивирования. Таким образом, можно создать такое устройство для культивирования, с помощью которого можно получать большее количество полезного вещества более удобным способом за одну операцию культивирования, после экстракции полезного вещества из ткани или клеток растений, грибов и бактерий, при этом создание соответствующих условий может осуществляться простой заменой культуральной среды после повторной дифференцировки, особенно в случае культивирования растений.
Кроме того, в соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ культивирования организмов, обладающий вышеуказанными преимуществами.
Далее, в частности, скорость метаболизма и скорость роста тканей или клеток растений, грибов и бактерий меньше, чем у тканей или клеток животных. По этой причине было невозможно культивирование тканей или клеток растений, грибов и бактерий в одной и той же среде в течение длительного времени, поскольку долговечность обычных сред типа агара меньше продолжительности жизни культивируемой ткани или клеток вследствие высыхания среды. Кроме того, даже если культивирование может продолжаться длительное время в жидкой среде, вдобавок к необходимости встряхивания имеется риск того, что оно может вызывать напряжение из-за резкой смены условий вблизи от культивируемой ткани или клеток и может произойти заражение при замене культуральной среды. В соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения ткань или клетки организма можно культивировать в течение очень длительного времени без пересева или пересадки, поскольку культуральная среда постоянно подается на микропористый носитель устройства для культивирования. Таким образом, можно создать такой способ культивирования, при помощи которого можно получать большее количество полезного вещества более удобным способом за одну операцию культивирования, после экстракции полезного вещества из ткани или клеток растений, грибов и бактерий, при этом создание соответствующих условий может осуществляться простой заменой культуральной среды после повторной дифференцировки, особенно в случае культивирования растений.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.2. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.3. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.4. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.5. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.6. Вариант устройства для культивирования по настоящему изобретению.
Фиг.7. Фотография, на которой показано семечко табака (Nicotiana tabacum), пророщенное с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.8. Фотография, на которой показан каллюс табака (Nicotiana tabacum) через 10 дней после посадки, выращенный с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.9. Фотография, на которой показан каллюс табака через 26 дней после посадки, выращенный с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.10. Фотография, на которой показан каллюс табака через 28 дней после посадки, выращенный с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.11. Фотография, на которой показан каллюс табака через 32 дня после посадки, выращенный с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.12. Фотография, на которой показано семечко табака, пророщенное с помощью устройства для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащего культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.13. Фотография, на которой показан листик и верхушка ростка табака сразу после помещения в устройство для культивирования № 2 по настоящему изобретению, содержащее культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.14. Фотография, на которой показан каллюс табака через 10 дней после помещения в устройство для культивирования № 2 по настоящему изобретению, содержащее культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.15. Фотография, на которой показан каллюс табака через 33 дня после помещения в устройство для культивирования № 2 по настоящему изобретению, содержащее культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.16. Фотография, на которой показан каллюс табака через 56 дней после помещения в устройство для культивирования № 2 по настоящему изобретению, содержащее культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.17. Фотография, на которой показан пыльник земляники (Fragaria chiloensis) через 35 дней после помещения в устройство для культивирования № 1 по настоящему изобретению, содержащее культуральную среду с растительным гормоном.
Фиг.18. Фотография, на которой показана флора нитчатого гриба Oospora roseoflava через 26 часов после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.19. Фотография, на которой показана флора нитчатого гриба Oospora roseoflava через 49 часов после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.20. Фотография, на которой показана флора нитчатого гриба Oospora roseoflava через 73 часа после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.21. Фотография, на которой показана флора нитчатого гриба Oospora roseoflava через 91 час после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.22. Фотография, на которой показана флора гриба эноки (Flammulina velutipes) через 10 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.23. Фотография, на которой показана флора гриба эноки через 11 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.24. Фотография, на которой показана флора гриба эноки через 13 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.25. Фотография, на которой показана флора гриба эноки через 14 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.26. Фотография, на которой показана флора гриба эноки через 16 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.27. Фотография, на которой показана бактериальная флора Bacillus subtilis через 66 часов после инокуляции в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.28. Фотография, на которой показана бактериальная флора Bacillus subtilis через 109 часов после инокуляции в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.29. Фотография, на которой показана флора гриба Gonytrichum macrocladum через 55 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Фиг.30. Фотография, на которой показана флора гриба Gonytrichum macrocladum через 55 дней после посева в устройстве для культивирования № 2 по настоящему изобретению.
Подробное изложение изобретения
В дальнейшем описание воплощений устройства для культивирования организмов по настоящему изобретению дано с привлечением фиг.1-6.
Итак, первое воплощение устройства для культивирования организмов по настоящему изобретению (Фиг.1) представляет собой устройство, включающее культуральную среду 3 и микропористый носитель 2 цилиндрической или стержневидной формы, стоящий вертикально на дне устройства для культивирования организмов 1, которое обеспечивает возможность проводить размножение, дифференцировку, дедифференцировку, регенерацию, хранение, селекцию, выделение или скрещивание тканей или клеток организма 4 при помещении их на поверхность микропористого носителя без контакта с культуральной средой.
Культуральная среда 3, используемая в устройстве для культивирования организмов, ничем особенно не ограничена: можно использовать любую культуральную среду, если только она позволяет проводить размножение, дифференцировку, дедифференцировку, регенерацию, хранение, селекцию, разделение и скрещивание тканей или клеток организма. Такие включают, к примеру, культуральные среды для растительных тканей, такие как среда MS (Murashige-Skoog), среда В5, среда W, среда NT, среда Као8Р, среда LS, среда Н, среда КС, среда НВ, среда WPM, среда Kassanis, среда Neelsen, среда Galzy, среда Nitsh and Nitsh, среда Noushi и др., в которые можно добавлять различные гормоны растений, аминокислоты, витамины, антибиотики, осморегуляторы, буферные вещества, природные материалы (типа дрожжевого экстракта) или ферменты в зависимости от назначения; культуральные среды для животных тканей, такие как среда 199, минимальная среда Игла (MEM), модифицированная Дюльбекко минимальная среда Игла (DMEM), среда RPMI1640, среда Ham's F12, среда MCDB 104, среда MCDB 153, среда ES, среда МЕМ1, среда DEMEM1, среда DEMEM2 и др., в которые можно добавлять различные аминокислотные ингредиенты, витамины, ферменты (типа трипсина), антибиотики, осморегуляторы, буферные вещества, природные материалы (типа дрожжевого экстракта и сыворотки) в зависимости от назначения; культуральные среды для грибов, такие как модифицированная среда Ohta, декстрозная среда EBIOS Hamada, среда М, среда MYP, среда PDA, среда Ohta, среда Mozel b, минимальная среда Wessels and Niderpruem для спаривания, среда Kerruish and Da Costa, среда Goodey and Lucetohole, среда Czapek, среда с дрожжевым экстрактом, синтетическая среда Wickerham, среда MY, овсяная среда, модифицированная среда Gorodkowa, среда Christensen с мочевиной, среда Henneberg, среда Czapek-Dox, среда Uschinsky, среда с тиогликолатом для анаэробных грибов, натрий-ацетатная среда Kleyn, полная синтетическая среда для дрожжей (Wickerham), нитратная среда с сукцинатом, среда Gorodkowa, кукурузная среда, ацетатная среда, среда Fowells с нитратом натрия, среда Lindegren и др., в которые можно добавлять различные аминокислоты, витамины, ферменты, антибиотики, осморегуляторы, буферные вещества, природные материалы (типа дрожжевого экстракта) в зависимости от назначения; культуральные среды для бактерий, такие как картофельная среда с сахарозой, среда BL, среда CW, модифицированная среда CCFA, среда B-CYEα, среда WYOα; среда с ДНКазой, среда PS с латексом, среда TCBS, среда BGLB, среда ЕС, среда CVT с агаром, среда ЕМВ, среда ВСМ O157, среда NAC с агаром, основная среда OF, пептонная среда с глюкозой и фосфором, среда Russell, среда Kligler, среда TSI, среда SIM, среда Simmons с цитратом натрия, среда с малонатом, среда с мочевиной, среда Christensen с мочевиной, среда LIM, среда OIML, среда VPOF, среда SS, среда SS-SB, среда MacConkey, среда DHL, среда с бриллиантовым зеленым, среда XLD, бульон Rappaport, основной бульон Hajna с тетратионатом, основной бульон с селенитом, основной серный бульон SBG, бульон ЕЕМ, среда с сердечным экстрактом, среда с мозгосердечным экстрактом, среда SCD, среда SCDLP, лактозная среда ВТВ, среда Drigalski, бульон SCDLP, лактозная среда JP, "лепешка" для метаногенных бактерий, среда MS-1 (1,5% казаминовых кислот, 0,01% цистеина, 0,01% триптофана, 0,05% цитрата натрия, 0,2% сукцината натрия, 0,05% K2HPO4, 0,05% KH2РО4 30,01% KNО3, 2,0% MgSO4·7H2O, 0,005% FeSO4·7H2O, 22-26% NaCl), среда MS-2 (0,5% казаминовых кислот, 1,0% дрожжевого экстракта, 0,5% пептона, 0,3% цитрата натрия, 0,5% КСl, 2,0% MgSO4·7H2O, 0,005% FeSO4·7H2O, 25% NaCl) и среда MS-3 (1,0% дрожжевого экстракта, 0,5% MgCl2·6H2O, 0,5% NH4Cl, 25% NaCl) для сильно галофильных бактерий, среда MSA-4 (1,0% пептона, 0,3% цитрата натрия, 2,0% MgSO4·7H2O, 0,2% КСl, 5,0% NaCO3·10H2O, 25% NaCl) для алкалофильных и сильно галофильных бактерий, среда YSG для термофильных и ацидофильных бактерий, среда МН-1 (1,0 г дрожжевого экстракта, 1,0 г триптона, 30 г NaCl, 3,5 г MgSO4·7H2O, 2,8 г MgCl2·6H2O, 0,2 г FeSO4·7H2O, 0,33 г КСl, 0,2 г NH4Cl, 50 мг NaBr, 20 мг Н3ВО3, 0,5 г KH2PO4 7,5 мг SrCl2·6H2O, 10 мг (NH4)2SO4, 0,1 мг Na2WO4·2H2O, 50 мг KI, 0,75 г CaCl2·H2O, 2 мг NiCl2·6H2O, 1 мг резазурина, 10 мл раствора микроэлементов (1,5 г нитрилотриацетата, 3 г MgSO4·7H2O, 0,5 г MnSO4·7H2O, 1 г NaCl, 0,18 г ZnSO4·7H2O, 10 мг CuSO4·5H2O, 20 мг KAl(SO4)2·7H2O, 10 мг Н3ВО3, 10 мг Na2MoO2·2H2O, 25 мг NiCl2·6H2O, 0,3 мг Na2SeO3·5H2O на 1 л дистиллированной воды), 25 г серы, 25 г Na2S·9H2O на 1 л дистиллированной воды), среда МН-2 (0,01% дрожжевого экстракта, 0,01% казаминовых кислот, 0,1% источника углерода, 0,02% NaCl, 0,03% КН2РO4, 0,13% (NH4)2SO4, 0,025% MgSO4·7H2O, 0,005% CaCl2·2H2O, глюкоза) и среда МН-3 (5 г пептона Bacto, 1 г дрожжевого экстракта Bacto, 0,1 г FeC5H5O7, 19,45 г NaCl, 5,9 г MgCl2, 3,24 г Na2SO4, 1,8 г СаСl2 0,55 г КСl, 0,16 г NaHCO3, 0,08 г KBr, 0,034 г SrCl2, 0,022 г Н3ВО3, 0,004 г силиката натрия, 0,0024 г NaF, 0,0016 г NH4NO3, 0,008 г Na2HPO4, 10 г казеина или крахмала на 1 л дистиллированной воды) для термофильных архебактерий.
Далее, микропористый носитель 2, обладающий способностью к поглощению воды, используемый в устройстве для культивирования организмов по настоящему изобретению, ничем особенно не ограничен: можно использовать любой микропористый носитель, если только его водопоглощающая способность составляет (вес./вес.) 0,005-500, предпочтительно 0,01-100, более предпочтительно 0,025-50, наиболее предпочтительно 0,05-5 весовых частей воды при 20°С, а его сообщающиеся поры имеют диаметр 0,02-900, предпочтительно 0,05-80, более предпочтительно 0,1-9, наиболее предпочтительно 0,2-3 мкм при пористости, равной (об./об.) 0,05-1, предпочтительно 0,2-0,4 от объема микропористого носителя. Так, путем подбора диаметра пор и пористости микропористого носителя, даже если культуральная среда заражена вирусами, бактериями, нитчатыми грибами, водорослями или простейшими, эти организмы не смогут достичь культивируемой ткани организма или же им потребуется более длительное время, чтобы попасть туда, вследствие фильтрующего действия микропористого носителя, и при переносе ткани организма в другое устройство для культивирования за это время данная ткань организма будет защищена от заражения.
Кроме того, предпочтительно микропористый носитель обладает не только вышеуказанными характеристиками, но и устойчивостью к высоким температурам и высокому давлению при стерилизации, к примеру, в автоклаве, и к сильным щелочам, сильным кислотам, высоким температурам, низким температурам, высокой концентрации соли, высокому давлению, низкому давлению, органическим растворителям, радиации или изменениям гравитации и т.д. Примеры микропористых носителей включают пористые носители, полученные путем замешивания, формования и обжига неметаллических неорганических твердых исходных материалов, таких как глина №10, каолин №2 (Shiroyama Cerapot) и глина Мураками (производимая в префектуре Ниигата в Японии), в соответствии со стандартным методом, а также материалы типа пенопласта с открытыми порами, такие как пеноматериалы из поливинилового спирта, полиуретана, полистирена, поливинилхлорида, полиэтилена, полипропилена, полифениленоксида и полимочевины. В частности, при изготовлении из неметаллических неорганических твердых исходных материалов пористых носителей, легко поглощающих и отдающих воду, предпочтительно подвергать обжигу такие материалы, которые содержат, к примеру, петалит и глинозем в количестве 50-60% по весу. Как правило, петалит предпочтительно содержит (по весу) 76,81% SiO2, 16,96% Аl2О3, 4,03% LiO2, 0,26% K2O и 1,94% сопутствующих примесей. Помимо этого, неметаллические неорганические исходные материалы могут содержать порошковый неорганический пеноматериал. Кроме того, используемый в устройстве для культивирования организмов по настоящему изобретению микропористый носитель состоит из неметаллического неорганического материала, прочность которого практически не уменьшается или форма которого не изменяется даже после поглощения воды.
Что касается метода формования неметаллических неорганических твердых исходных материалов, то в этой области известны такие методы, как шаблонное литье, экструдирование, прессование и формование на гончарном круге. В частности, с точки зрения широкомасштабной продукции и уменьшения затрат предпочтительно экструдирование. Кроме того, высушивание после формовки может осуществляться обычными методами при обычных условиях, известных в данной области. Последующий обжиг формованного изделия ничем особенно не ограничен, если только обжиг осуществляется при стандартных условиях и стандартными методами. Например, можно выбрать окислительный обжиг, при котором легко получается требуемый размер пор. Температура обжига составляет от 1000°С до 2000°С, предпочтительно от 1100°С до 1500°С, более предпочтительно от 1150°С до 1250°С, наиболее предпочтительно 1200°С. Если температура обжига неметаллического неорганического твердого исходного материала меньше 1000°С, то обычно остается серный компонент, с другой стороны, если температура выше 2000°С, то невозможно получить требуемую водопоглощающую способность.
С другой стороны, что касается метода формовки микропористого носителя, состоящего из пенопласта с открытыми порами, то существуют методы формовки, например, из вспененного расплава, формовки из вспененной твердой массы и формовки из вспененной отливки.
Основные операции при формовке из вспененного расплава состоят из плавления и замешивания, формования невспененного листа, теплового или экструзионного вспенивания, охлаждения, разрезания и окончательной обработки. При формовке из вспененной твердой массы полимер подвергается вспениванию в твердой фазе или в состоянии вблизи твердой фазы. Кроме того, при формовке из вспененной отливки жидкий исходный материал (мономер или олигомер) подвергается отливке и вспениванию при прохождении реакции на воздухе. Для получения пенопласта с открытыми порами обычно применяются вспенивающие добавки.
Кроме того, микропористый носитель 2 имеет форму, которая состоит из цилиндрической или стержневидной части и чашеобразной части, отходящей вверх от цилиндрической или стержневидной части и имеющей больший наружный диаметр, чем у цилиндрической или стержневидной части, причем в центре чашеобразной части имеется углубление или структура, в которой имеется стерическая проекция или вогнутость на дне углубления чашеобразной части для того, чтобы повысить удельную площадь поверхности в зависимости от цели культивирования.
Культуральная среда 3 приходит в контакт с частью микропористого носителя 2, поступает наверх через сообщающиеся поры внутри микропористого носителя вследствие капиллярного действия, удерживается внутри него и подводится к ткани или клеткам организма 4, находящегося на поверхности вне культуральной среды, и тем самым способствует размножению, дифференцировке, дедифференцировке, регенерации, сохранению, селекции, выделению или скрещиванию тканей организма. Кроме того, в соответствии с этим воплощением настоящего изобретения ткань или клетки организма, посеянные в начале культивирования на микропористый носитель без контакта с культуральной средой, иногда вырастают настолько сильно, что приходят в контакт с общим объемом культуральной среды в процессе культивирования. Этот случай также входит в рамки настоящего изобретения.
Сосуд 5, содержащий, по меньшей мере, часть вышеуказанной культуральной среды 3 и микропористый носитель 2, подходит в том случае, если микропористый носитель 2, культуральную среду 3 и ткань или клетки организма 4 можно изолировать от внешней среды при закрытии отверстия каким-либо покрытием 6, например алюминиевой фольгой. Предпочтительно сосуд устойчив к высокой температуре и высокому давлению при стерилизации, к примеру, в автоклаве, и к различным условиям культивирования и культуральной среды, таким как сильные щелочи, сильные кислоты, высокие температуры, низкие температуры, высокие концентрации солей, высокое давление, низкое давление, органические растворители, радиация или изменения гравитации и т.д.; его материал и форма позволяют наблюдать за состоянием культуры извне; он изготовлен из материалов, которые обычно используются при культивировании тканей, таких как стекло, пластмасса и винильный полимер и тому подобные, он имеет цилиндрическую форму, плоскодонной колбы, чаши, корзинки или тарелки. Кроме того, при культивировании ткани или клеток организма с заменой атмосферы в сосуде определенным газом и при культивировании ткани или клеток организма при повышенном или пониженном давлении на крышку 6 и сосуд 7 наносится резьба 8, при завинчивании которой обеспечивается герметизация сосуда даже в условиях повышенного или пониженного давления, а также имеется подающая трубка 9, как показано на фиг.2 (при замене атмосферы в сосуде определенным газом имеются две или несколько подающих трубок). Кроме того, при культивировании ткани или клеток организма с применением гравитации или при сборе выделяемых культивируемой тканью или клетками ингредиентов из микропористого носителя можно использовать центрифужную пробирку в качестве сосуда с крышкой, как показано на фиг.3.
При культивировании ткани организма с применением устройства для культивирования организмов по настоящему изобретению обычно выполняются следующие операции.
Во-первых, в сосуд 5 помещают культуральную среду 3 и микропористый носитель 2 через отверстие 7, причем отверстие 7 сосуда закрывается пробкой 6, к примеру алюминиевой фольгой, марлевой, силиконовой, резиновой или пробковой пробкой, и проверяют, чтобы культуральная среда 3 впиталась через микропористый носитель 2, после чего устройство для культивирования организмов подвергают стерилизации при высокой температуре и высоком давлении, к примеру, в автоклаве. В качестве альтернативы такое устройство для культивирования организмов подвергают стерилизации без тепловой обработки, например, ультрафиолетом.
После этого устройство для культивирования организмов 1 охлаждают до комнатной температуры, вынимают пробку 6 в асептических условиях типа ламинарного бокса, а затем на поверхность микропористого носителя 2 помещают предварительно подвергнутую стерилизации хорошо известным в этой области методом ткань или клетки организма 4 с помощью такого приспособления, как пинцет, пипетка, платиновая петля или платиновая игла. После этого отверстие 7 опять закрывают пробкой и проводят культивирование ткани или клеток организма 4 неподвижно, выдерживая устройство для культивирования 1 в соответствующих условиях. Более того, хотя преимущества устройства для культивирования по настоящему изобретению проявляются уже при неподвижной инкубации устройства, поскольку даже неподвижное культивирование обеспечивает поступление к клеткам или тканям необходимого количества газа, встряхивание, центрифугирование устройства и аналогичные приемы могут также быть использованы в зависимости от целей культивирования.
С другой стороны, микропористый носитель можно пропитать культуральной средой, подвергая микропористый носитель 2, помещенный в сосуд 5, и культуральную среду 3, помещенную в другой сосуд, по отдельности стерилизации сухим жаром при высокой температуре и высоком давлении, а затем наливая культуральную среду 3 в сосуд 5 в асептических условиях. В качестве альтернативы микропористый носитель 2 и культуральную среду 3 в отдельном сосуде можно подвергнуть стерилизации ультрафиолетом или гамма-излучением, а затем микропористый носитель 2 поместить в сосуд, содержащий культуральную среду, в асептических условиях.
В этом воплощении микропористый носитель 2 располагается вертикально на дне сосуда 5. Однако в устройстве для культивирования организмов по настоящему изобретению достаточно и того, чтобы часть микропористого носителя 2 находилась в сосуде 5 в таком положении, что эта часть будет соприкасаться с культуральной средой 3 или будет погружена в культуральную среду 3. Например, микропористый носитель можно подвесить на боковую или верхнюю часть сосуда 5 или пробки 6.
В качестве альтернативы, как показано на фиг.6, к нижней части микропористого носителя 12 присоединен промежуточный носитель 20, состоящий из поливинилового спирта, углеродных волокон, стекловолокон или поглощающих воду акриловых волокон, так что при погружении части промежуточного носителя культуральная среда 3 может поступать в микропористый носитель через промежуточный носитель. Кроме того, предпочтительно такой промежуточный носитель 20 обладает гибкостью. В таком случае при поступлении культуральной среды в микропористый носитель через промежуточный носитель при использовании промежуточного носителя создается возможность придания определенной степени свободы размерам микропористого носителя и сосуда. Кроме того, предотвращается выпадение осадка содержащихся в культуральной среде компонентов в порах микропористого носителя при выпадении их в осадок в промежуточном носителе при использовании промежуточного носителя. Кроме того, предпочтительно микропористый носитель и промежуточный носитель обладают устойчивостью к нагреванию, низким температурам, сильным щелочам, сильным кислотам, органическим растворителям, радиации, ультрафиолету, высокому и низкому давлению, а также обладают такой прочностью, что они не деформируются под действием гравитации.
Устройство для культивирования организмов по настоящему изобретению может применяться для культивирования растительных тканей или клеток, таких как семена, листья, верхушки побегов, стебли, корни, пыльники, волокна, точки роста (верхушечные почки, боковые точки, верхушки побегов, верхушки корней), пазушные почки, чешуйки, завязь, семяпочки, зародыши, пыльца, придаточные почки, придаточные зародыши и придаточные корни полезных деревьев, таких как амми (Ammi majus), лук (Allium sepa), чеснок (Allium sativa), сельдерей (Apium graveolens), спаржа (Asparagus officinalis), сахарная свекла (Beta vulgaris), цветная капуста (Brassica oleracea var. botrytis), капуста брюссельская (Brassica oleracea var. gemmifera), капуста кочанная (Brassica oleracea var. capitata), рапс (Brassica napus), тмин (Carum carvi), хризантема (Chrysanthemum morifolum), болиголов крапчатый (Conium maculatum), коптис (Coptis japonica), цикорий (Cichorum intybus), тыква обыкновенная (Curcurbita реро), дурман (Datura meteloides), морковь (Daucus carota), гвоздика (Dianthus caryophyllus), гречиха (Fagopyrum esculentum), фенхель (Foeniculum vulgare), клубника (Fragaria chiloensis), соя (Glycine max), гиацинт (Hyacinthus orientalis), батат (Ipomoea batatis), салат-латук (Lactuca sativa), клевер-лядвенец (Lotus comiculatus, Lotus japonicus), томат (Licopersicon esculentum), люцерна (Medicago sativa), табак (Nicotiana tabacum), рис (Oryza sativa), петрушка (Petroselinum hortense), горох (Pisum sativum), роза (Rose hybrida), баклажан (Solanum melongena), картофель (Solanum tuberosum), пшеница (Triticum aestivum), кукуруза (Zea mays) и др.; лиственных растений, таких как львиный зев (Antirrhinum majus), арабидопсис (Arabidopsis thaliana), лавр пестролистный (Codiaeum variegatum), цикламен (Cyclamen persicum), молочай (Euphorbia pulcherrima), гербера Джемсона (Gerbera jamesonii), подсолнечник (Helianthus annuus), герань садовая (Pelargonium hortorum), петуния (Petunia hybrida), фиалка африканская (Saintpaulia ionatha), одуванчик (Taraxacum officinale), торения (Torenia foumieri), клевер ползучий (Trifolium repens), цимбидий (Cymbidium) и др.; полезных деревьев, таких как мелия (Azadirachta indica), цитрусы (Citrus), кофейное дерево (Coffea arabica), эвкалипт (Eucaliptus), гевея (Hevea brasiliensis), падуб (Ilex aquifolium), понцирус (Poncims trifoliata), миндаль (Prunus amygdalus), тополь канадский (Populus canadensis), туя восточная (Biota orientalis), криптомерия (Cryptomeria japonica), ель обыкновенная (Picea abies), сосна (Pinus), виноград (Vitis venifera), яблоня (Mains pumila), абрикос (Prunus armenica), хурма японская (Diospyros kaki), инжир (Ficus carica), каштан (Castanea crenata) и др.; животных клеток, таких как легочные фибробласты, ороговевшие эпидермальные клетки, меланоциты, кожные фибробласты, эпителиальные клетки бронхов, гладкомышечные клетки бронхов, эпителиальные клетки проксимальных канальцев, эпителиальные клетки коркового слоя почек, мезангиальные клетки, эпителиальные клетки бронхиолей, астроциты, эндотелиальные клетки кровеносных сосудов пуповины, эндотелиальные клетки коронарных сосудов, гладкомышечные клетки коронарных сосудов, синовиальные клетки, эндотелиальные клетки аорты, гладкомышечные клетки аорты, эндотелиальные клетки легочной артерии, гладкомышечные клетки легочной артерии, эндотелиальные клетки легочных капилляров, эндотелиальные клетки кожных капилляров, эндотелиальные клетки подвздошной кишки, эндотелиальные клетки капилляров новорожденных детей, дермальные клетки сосочков волос человека, хондроциты, эндотелиальные клетки коронарных сосудов быка, гладкомышечные клетки коронарных сосудов быка, гладкомышечные клетки аорты кур, эндотелиальные клетки капилляров головного мозга мышей, макрофаги из печени свиньи, макрофаги из яичек свиньи, гладкомышечные клетки аорты крыс, преадипоциты крыс и т.п. из таких животных, как человек (Homo sapiens), японская макака (Масаса fuscata), макака-резус (Масаса mulatta), шимпанзе (Pan troglodytes), орангутанг (Pongo pygmaeus), свинья (Sun scrofa), мышь (Mus musculus), крыса (Rattus norvegicus), курица (Gallus gallus) и др.; мицелия или клеток грибов, таких как гриб эноки (Flammulina velutipes), гриб шиитаке (Lentinula edodes), гриб бунашимедзи (Hypsizygus marmoreus), гриб "жареный цыпленок" (Lyophyllum decastes), гриб намеко (Pholiota nameko), чернильный гриб (Coprinus atramantarius), опенок серножелтый (Naematoloma sublateritium), дождевик (Lycoperdon gemmatum), гриб маннентаке (Ganoderma lucidum), гриб сюехиротаке (Schizophyllum commune), вешенка (Pleurotus ostreatus), гриб маитаке (Grifola frondosa), гриб мацутаке (Tricholoma matsutake), гриб янагимацутаке (Agrocybe cylindracea), гриб "хвост индейки" (Coriolus versicolor), масленок (Suillus luteus, Suillus grevillei), гриб амиханаигучи (Boletinus cavipes), гриб хоншимедзи (Lyophyllum shimeji), Mucor, Rhizopus, Absidia, Phycomyces, Aspergillus -Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus tamarii и др., Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Monilia, а также дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и др.); бактерий, таких как фотосинтезирующие бактерии (Rhodospirillum molischianum, Rhodopseudomonas acidophila, Rhodomicrobium vannielii, Chromatium vinosum, Thiocapsa roseopersicina, Thiopedia rosea, Chlorobium limicola, Chlorobium phaeovibrioides, Pelodictyon clathratiforme, пурпурные фотосинтезирующие бактерии - Ectothiorhodospira halophila), скользящие бактерии (Myxococcus fulvus, Myxococcus coralloides, Myxococcus stipitatus, Myxococcus xanthus), капсульные бактерии (Sphearotilus natans), почкующиеся бактерии - бактерии с отростками (Hyphomonas neptinium, Gallionella ferruginea), спирохеты (Spirochaeta icterohaemorrhagiae, Spirochaeta pallida, Spirochaeta aurantia), извитые бактерии - спириллы, грамнегативные бактерии, аэробные бациллы или кокки (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas gluconicum, Xanthomonas oryzae, Gluconobacter oxydans), азотфиксирующие бактерии (Azotobacter chroococcum, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium trifolii, Rhizobium meliloti, Rhizobium phaseoli, Rhizobium japonicum, Clostridium pasteurianum), семейство Methylomonadaceae (Methylomonas methanica), уксуснокислые бактерии (Acetobacter aceti), факультативные анаэробные бациллы (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, тифозная палочка Salmonella typhi. Salmonella typhimurium. Salmonella enteritidis, дизентерийная палочка Shigella dysenteriae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus), анаэробные бактерии (Bacteroides succinogenes), аэробные кокки или коккобациллы (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactia, Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus avium, Corynebacterium diphtheriae, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis. Bacillus cereus), анаэробные кокки (Neisseria gonorrhoeae), грамотрицательные литотрофные бактерии (Nitrosomonas europaea, Nitrosococcus oceani, Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris, Nitrobacter winogradskyi, Thiobacillus thiooxydans), грамположительные кокки (глутаминовокислая бактерия Micrococcus glutamicus, Staphylococcus aureus, Streptococcus lactis, Streptococcus bovis, Streptococcus mutans, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc lactis, Pediococcus cerevisiae, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rimae, Sporolactobacillus inulinus. Bacillus coagulans. Bacillus subtilis. Bacillus polymyxa, Bacillus maercerans. Bacillus pycnoticus, сибиреязвенная бактерия Bacillus anthrax), маслянокислые бактерии (Clostridium butyrium), ацетонобутиловая бактерия Clostridiwn acetobutylicum, Clostridium sporogenes, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, столбнячная палочка Clostridium tetani, сульфатредуцирующая бактерия Desulfatomaculum rumimis, спорообразующая сарцина (Sporosarcina ureae), бактерии, родственные микобактериям (возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), Corynebacterium fascians, Corynebacterium rathayi, Corynebacterium sepedonicum, Corynebacterium insidiosum, Corynebacterium flaccumfaciens, Actinomyces bovis, Nocardia farcinica, Streptomyces griseus, Streptomyces rameus, Streptomyces venezuelae, Streptomyces omiyaensis, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avellaneus, Streptomyces lutianus), термофильные бактерии (Aeropyrum pemix, Aquifex aeolicus, Archaeoglobus fulgidus, Bacillus thermoleovorans, Methanococcus jannaschii, Methanothermus fervidus, Pyrobaculum aerophilum, Pyrobaculum calidifontis, Pyrobaculum islandicum, Pyrobaculum oguniense, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus kodakaraensis, Pyrococcus shinkaj, Pyrolobus fumarii, Rhodothermus obamensis, Saccharopolyspora rectivirgula, Sulfolobus acidocaldarius, Sulfolobus shibatae, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Thermoactinomyces vulgaris, Thermococcus celer, Thermococcus odakaraensis, Thermococcus litoralis, Thermococcus profundus, Thermococcus strain, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermus thermophilus), метановые бактерии (Methanobacterium formicicum, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanobrevibacter arboriphilus, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanococcus jannaschii, Methanoculleus chikugoensis, Methanopyrus kandleri, Methanosaeta concilii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazeii, Methanosphaera stadmaniae, Methanothermobacter thermoautotrophicus), галофильные бактерии (Haloarcula japonica, Haloarcula marismortui, Halobacterium halobium, Halobacterium salinarium, Haloferax mediterranei, Haloferax volcanii, Halomonas variabilis, Natronobacterium pharaonis, Tetragenococcus halophila. Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus), криофильные бактерии (Colwellia psychrerythraea, Moritella marina, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Shewanella benthica), барофильные бактерии (Moritella japonica, Moritella yayanosii, Photobacterium profundum, Shewanella benthica, Shewanella violaceae, Shewanella oneidensis), ацидофильные бактерии (Aeropyrum pemix, Sulfolobus solfataricus, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum), Alicyclobacillus acidocaldarius, Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus cycloheptanicus, Thiobacillus acidophilus, Acidianus brierleyi, алкалофильные бактерии (Bacillus alcalophilus, Bacillus halodurans, Bacillus pasturii, Exiguobacterium aurantiacum), устойчивые к радиации бактерии (Deinococcus radiodurans, Micrococcus radiodurans. Bacillus cereus), катаболизирующий нефть штамм бактерий HD-1, выделенный из нефтяного месторождения в префектуре Сидзуока (СО2-фиксирующие нефтесинтезирующие или нефтерасщепляющие бактерии), штамм ТК-122, а также устойчивые к органическим растворителям бактерии (Pseudomonas putida, штамм IH-2000) и др. Что касается конкретных методов культивирования, то возможны любые методы, известные в этой области. Когда объектом культивирования являются растения, то примеры методов включают дедифференцировку (каллюсная культура) и редифференцировку растительной ткани, культивирование пыльников, верхушек побегов, протопластов, серийные культуры, культуры клональных клеток, семенные культуры, культуры высокой плотности, совместное культивирование, питающие культуры, метод кондиционирующей культуры, метод конкуренции за изотоп, метод прямого мечения, метод культивирования завязи, семяпочки, зародыша, пыльцы, метод синхронизированной культуры и др. Кроме того, когда объектом культивирования являются грибы, то примеры методов включают культуры, выделенные из таких частей, как ножка, верхняя часть ножки, пластинка и шляпка плодового тела гриба, выделительные культуры спор, выделительные культуры из почвы и воздуха, субкультуры из выделенных штаммов грибов и др. Кроме того, когда объектом культивирования являются животные, то примеры методов включают культуры желудочно-кишечных эпителиальных клеток, культуры гепатоцитов, культуры эпидермальных кератиноцитов человека, культуры эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, культуры почечных клеток, культуры клеток островков Лангерганса, культуры фибробластов, культуры мышечных клеток, культуры миелоцитов, культуры раковых клеток, культуры нервных клеток, культуры эпителиальных клеток бронхов, культуры дифференцирующихся нервных клеток, культуры дифференцирующихся клеток крови, культуры эмбриональных стволовых клеток, культуры клеток гепатокарциномы. Далее, когда объектом культивирования являются бактерии, то примеры методов включают анаэробные культуры в атмосфере азота, двуокиси углерода и т.п., аэробные культуры в атмосфере воздуха, кислорода под давлением и т.п., культивирование в сильно щелочных условиях, в сильно кислотных условиях, культивирование при высоких температурах, при низких температурах, при высоких концентрациях солей, культивирование под давлением, которое осуществляется в атмосфере, превышающей атмосферное давление, культивирование при пониженном давлении, культивирование в органическом растворителе, культивирование при воздействии радиации, культивирование при изменении гравитации путем центрифугирования.
Второе воплощение устройства для культивирования организмов по настоящему изобретению представлено устройством для культивирования организмов 11, включающим культуральную среду 13 и микропористый носитель 12, состоящий из цилиндрической части и чашеобразной части, отходящей вверх от цилиндрической части и имеющей больший наружный диаметр, чем у цилиндрической части, причем оно дает возможность проводить размножение, дифференцировку, дедифференцировку, регенерацию, хранение, селекцию, выделение и скрещивание при помещении ткани организма 14 на дно 15 чашеобразной части, в центре которой имеется углубление, как показано на фиг.4 и фиг.5. Микропористый носитель 12, состоящий из цилиндрической части и чашеобразной части, опирается на сосуд 18 и закрывает внутреннюю часть сосуда путем контакта между дном 17 бортика 16, выступающего в поперечном направлении из чашеобразной части, и периметром отверстия сосуда. В качестве альтернативы чашеобразная часть 12 микропористого носителя может закрываться подходящей по размеру крышкой 19 из такого материала и такой формы, которая позволяет наблюдать за состоянием культуры снаружи, к примеру чашкой Петри с внутренним диаметром, соответствующим наружному диаметру чашеобразной части или большим. С другой стороны, чашеобразная часть может просто закрываться алюминиевой фольгой, как изложено в первом воплощении. Кроме того, крышка 19 вместе с бортиком 16 сосуда 18 смыкается с подающей трубкой. Такое устройство может оставаться закрытым даже при повышенном или пониженном давлении. Кроме того, микропористый носитель предпочтительно устойчив к нагреванию, сильным щелочам, сильным кислотам, высокому давлению, низкому давлению, органическим растворителям, радиации, ультрафиолету и т.п.
Поскольку культуральные среды, исходные материалы и материал микропористого носителя, а также ткани или клетки организмов, являющихся объектами культивирования, остаются такими же, как в первом воплощении, то их описание не приводится.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Примеры
Для культивирования клеток организмов с помощью устройства для культивирования организмов по настоящему изобретению использовали следующие устройства и образцы.
Эксперимент по культивированию № 1
1. Устройство для культивирования
Микропористый носитель цилиндрической формы с наружным диаметром 1,4 см, внутренним диаметром 0,9 см и высотой 4,5 см, полученный при отжиге при 1250°С в течение 24 часов, содержащей 50-60% окиси алюминия Аl2О3 глины Мураками (производимой в префектуре Ниигата в Японии), помещали вертикально на дно стеклянной пробирки с плоским дном диаметром 2,3 см и высотой 15 см и заливали в нее 6 мл предназначенной для дедифференцировки жидкой культуральной среды MS, содержащей по 2 ppm нафталинуксусной кислоты (НУК) и бензиладенина (БА). После этого отверстие стеклянной пробирки закрывали сложенной вдвое алюминиевой фольгой. После того как культуральная среда пропитала весь микропористый носитель, устройство подвергали стерилизации в автоклаве при высокой температуре и высоком давлении в течение 10 мин (121°С при избыточном давлении в 1,2 атм) и оставляли охлаждаться, получая устройство для культивирования №1. Микропористый носитель, использовавшийся в эксперименте, был устойчивым к нагреванию.
Отдельно другой микропористый носитель, состоящий из чашеобразной части с наружным диаметром 7,5 см, внутренним диаметром 5,5 см и глубиной 5,0 см и цилиндрической части с наружным диаметром 1,7 см, внутренним диаметром 0,7 см и высотой 4,7 см и имеющий цилиндрическую часть с наружным диаметром 1,5 см и высотой 4,3 см, стоящую на дне углубления в центре чашеобразной части, полученные из тех же исходных материалов и в тех же условиях, что и вышеописанное устройство для культивирования №1, помещали в стеклянный сосуд объемом 570 мл и закрывали отверстие чашеобразной части, накрывая его чашкой Петри. Устройство подвергали стерилизации сухим жаром в течение 2 часов в печке (161°С). С другой стороны, в коническую колбу наливали предназначенную для дедифференцировки жидкую культуральную среду MS, содержащую по 2 ppm нафталинуксусной кислоты (НУК) и бензиладенина (БА), и подвергали стерилизации в автоклаве при высокой температуре и высоком давлении в течение 10 мин (121°С при избыточном давлении в 1,2 атм). Затем в асептических условиях микропористый носитель приподнимали, отделяя от сосуда, и через щель заливали 130 мл подвергнутой стерилизации жидкой культуральной среды MS. После этого устройство оставляли до тех пор, пока микропористый носитель не пропитается культуральной средой, получая устройство для культивирования № 2.
2. Тестируемый материал
В качестве тестируемого материала использовали семена и листья незрелого растения табака SRI (Nicotiana tabacum) через 17 дней после прорастания, а также пыльники из бутона земляники (Fragaria chiloensis) диаметром 3 мм. Эти материалы подвергали стерилизации путем промывки водопроводной водой, погружения в 70%-ный этанол на несколько секунд и погружения в 5%-ный водный раствор гипохлорита натрия на 10 мин перед употреблением. Пыльники из бутона земляники извлекали в асептических условиях из бутона, который был стерилизирован, как описано выше, и использовали в качестве тестируемого материала.
3. Культивирование
В асептических условиях снимали алюминиевую фольгу с устройства для культивирования № 1, тестируемый материал помещали на внутренннюю, поверхность верхушки микропористого носителя и снова закрывали отверстие алюминиевой фольгой. Отдельно из устройства для культивирования № 2 снимали чашку Петри в тех же условиях, помещали тестируемый материал на дно чашеобразной части микропористого носителя и снова закрывали отверстие чаши чашкой Петри. При этом тестируемый материал, помещенный в устройство для культивирования № 1 или № 2, культивировали в неподвижном состоянии при 26°С и естественном освещении (около 10 см через матовое стекло).
4. Результаты
i. Семена табака
Процесс роста семечка табака, помещенного в устройство для культивирования Хо 1, как описано выше, представлен в табл.1, а состояние через 5, 10, 26, 28 и 32 дней после посадки представлено на фиг.7-11 соответственно. Отдельно на фиг 12 представлен рост семечка табака, культивируемого в культуральной среде, не содержащей НУК и БА.
| Таблица 1 | |
| Время после посадки, дней | Процесс роста семечка табака |
| день 0 | Посадка |
| 5 дней | Прорастание без дедифференцировки |
| 7 дней | Образование каллюса |
| 10 дней | Диаметр каллюса 0,8 мм |
| 26 дней | Диаметр каллюса 4,3 мм |
| 28 дней | Диаметр каллюса 5,0 мм |
| 32 дней | Диаметр каллюса 6,6 мм |
ii. Листочки незрелого растения табака
Процесс роста листочка незрелого растения табака, помещенного в устройство для культивирования №2, как описано выше, представлен в табл.2, а состояние сразу после посадки и через 10, 33 и 56 дней после посадки представлено на фиг.13-16. соответственно.
| Таблица 2 | |
| Время после посадки, дней | Изменения диаметра листочка табака и каллюса |
| День 0 | Посадка, 3,1 мм |
| 10 дней | Диаметр каллюса 4,7 мм |
| 33 дней | Диаметр каллюса 4,9 мм |
| 56 дней | Диаметр каллюса 5,1 мм |
iii. Пыльники земляники
Процесс роста пыльника земляники, помещенного в устройство для культивирования №1, как описано выше (n=29), представлен в табл.3. Кроме того, представлена фотография каллюса из пыльника земляники через 35 дней после посадки на фиг.17.
| Таблица 3. Образец № 26 | |
| Время после посадки, дней | Процесс роста пыльника земляники |
| День 0 | Посадка |
| 7 дней | Образование каллюса |
| 10 дней | Диаметр каллюса 0,3 мм |
| 28 дней | Диаметр каллюса 0,8 мм |
| 35 дней | Диаметр каллюса 2,6 мм |
Эти результаты подтверждают, что в устройстве для культивирования по настоящему изобретению можно выращивать растительные ткани так же, как на стандартных агаровых средах, независимо от вида растения и части растения, а также что гормоны растений в культуральной среде влияют на морфогенез и рост растительных тканей через микропористый носитель. Показатель образования каллюса из пыльников земляники составил 55,1%.
Все это свидетельствует о том, что растительные ткани можно культивировать в данном устройстве для культивирования, используя микропористый носитель в качестве среды, причем его преимущества проявляются в достаточной степени без недостатков предшествующих сред.
Эксперимент по культивированию № 2
1. Устройство для культивирования
Эксперимент проводился тем же способом, что в вышеописанном эксперименте по культивированию № 1, за исключением того, что в устройство для культивирования вносили 130 мл модифицированной среды Ohta (полученной растворением 10 г глюкозы, 1 г лимонной кислоты, 1 г тартрата аммония, 1 г фосфата калия, 1 г сульфата магния, 50 мг хлорида кальция и 7 г HEPES в 1 л воды) в качестве культуральной среды.
2. Тестируемый материал
В качестве тестируемого материала использовали нитчатые грибы Oospora roseoflavia и Flammulina velutipes.
3. Культивирование
В асептических условиях из устройства для культивирования №2 снимали чашку Петри, засевали нитчатые грибы в центре дна чашеобразной части микропористого носителя с помощью платиновой иглы и снова закрывали чашеобразную часть чашкой Петри. Нитчатые грибы, посеянные в устройстве для культивирования №2, таким образом, культивировали в неподвижном состоянии при 26°С и естественном освещении (около 10 см через матовое стекло).
4. Результаты
i. Oospora roseoflavia
Процесс роста Oospora roseoflavia, посеянного в устройстве для культивирования № 2, как описано выше, представлен в табл.4 и на фиг.18-21.
| Таблица 4 | |
| Время после посева, час | Процесс роста нитчатого гриба |
| Час 0 | Посев |
| 26 часов | Диаметр культуры 5,2 мм |
| 49 часов | Диаметр культуры 29,6 мм |
| 73 часа | Диаметр культуры 56,8 мм |
| 91 час | Диаметр культуры 56,8 мм |
| (Дно 22,9 мм, внутренняя сторона 5,1 мм) |
ii. Flammulina vehitipes
Процесс роста Flammulina velutipes, посеянного в устройстве для культивирования № 2, как описано выше, представлен в табл.5 и на фиг.22-26.
| Таблица 5 | |
| Время после посева | Процесс роста нитчатого гриба |
| Час 0 | Посев |
| 10 дней | Диаметр культуры 19,6 мм |
| 11 дней | Диаметр культуры 34,6 мм |
| 12 дней | Диаметр культуры 42,0 мм |
| 13 дней | Диаметр культуры 44,8 мм |
| 14 дней | Диаметр культуры 54,0 мм |
| 15 дней | Диаметр культуры 56,0 мм |
Эти результаты подтверждают, что в данном устройстве для культивирования можно выращивать грибы независимо от их вида.
Эксперимент по культивированию № 3
1. Устройство для культивирования
Эксперимент проводился тем же способом, что в вышеописанном эксперименте по культивированию № 1, за исключением того, что в устройство для культивирования № 2 вносили 130 мл картофельной среды с сахарозой (полученной внесением 200 г картофеля, практически очищенного от кожуры, в соответствующее количество воды, кипячением в течение 30 минут, фильтрованием, добавлением 10 г сахарозы и доведением объема водой до 1 л) в качестве культуральной среды.
2. Тестируемый материал
В качестве тестируемого материала использовали бактерии Bacillus subtilis.
3. Культивирование
В асептических условиях из устройства для культивирования № 2 снимали чашку Петри, наносили суспензию Bacillus subtilis на дно чашеобразной части микропористого носителя и снова закрывали чашеобразную часть чашкой Петри. Бактерии, посеянные в устройстве для культивирования № 2, таким образом, культивировали в неподвижном состоянии при 26°С и естественном освещении (около 10 см через матовое стекло).
4. Результаты
Внешний вид Bacillus subtilis, посеянных в устройстве для культивирования № 2, как описано выше, представлен на фиг.27 и 28, а процесс роста одной культуры представлен в табл.6.
| Таблица 6 | |
| Время после посева | Процесс роста бактерий |
| Час 0 | Посев |
| 66 часов | Диаметр культуры 2,00 мм |
| 92 часа | Диаметр культуры 5,29 мм |
| 109 часов | Диаметр культуры 5,94 мм |
| 118 часов | Диаметр культуры 7,12 мм |
| 132 часа | Диаметр культуры 7,74 мм |
Эти результаты подтверждают, что в данном устройстве для культивирования также можно выращивать бактерии.
Эксперимент по предотвращению заражения
В культуральную среду устройства для культивирования №2, использовавшегося в вышеописанном эксперименте по культивированию пыльников земляники, засевали нитчатый гриб Gonytrichum macrocladum и культивировали в неподвижном состоянии при 26°С и естественном освещении (около 10 см через матовое стекло). Результаты представлены на фиг.29 и 30.
Как видно из фиг.29 и 30, рост и удлинение нитчатого гриба, засеянного в культуральную среду, подавляется в нижней части цилиндрической части микропористого носителя даже через 55 дней после посева, и гриб не достигает чашеобразной части, в которой происходит культивирование тканей организмов. Этот результат подтверждает, что в устройстве для культивирования по настоящему изобретению, даже если общий объем культуральной среды заражен нитчатым грибом, проникновение нитчатого гриба ингибируется или подавляется вследствие фильтрующего действия микропористого носителя, находящегося между культуральной средой и образцом организма, поэтому образцы организмов можно переносить в другое устройство для культивирования еще до того, как произойдет заражение, и продолжить их культивирование опять.
Промышленная применимость
В соответствии с настоящим изобретением представлено устройство для культивирования, в котором расходуется лишь небольшое количество культуральной среды, уменьшается необходимость в таких операциях, как перемешивание и встряхивание, уменьшается число необходимых пересевов (пересадок) и тем самым становится возможным культивирование тканей или клеток организма в течение более длительного времени без пересева, так что можно сделать такое устройство для культивирования, с помощью которого можно получить большее количество нужного вещества за одну операцию культивирования после экстракции этого вещества из ткани или клеток. Также предотвращается заражение при пересеве и другие неблагоприятные воздействия (физическое воздействие при пересеве). Кроме того, становится возможным такое культивирование, на которое не влияет значение рН культуральной среды, температура культивирования и т.п. Кроме того, устройство можно сделать более тонким, меньшим по размеру и более высоким.
1. Устройство для культивирования тканей и клеток организма, характеризующееся тем, что содержит сосуд для культуральной среды и расположенный в нем контактирующий с ней микропористый носитель, служащий для размещения на нем выращиваемой культуры и подвода к ней через поры культуральной среды, при этом микропористый носитель изготовлен формованием обожженного неметаллического неорганического твердого материала.
2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что микропористый носитель имеет цилиндрическую форму.
3. Устройство по п.1, отличающееся тем, что микропористый носитель состоит из цилиндрической части и расположенной над ней чашеобразной части большего диаметра, снабженной бортиком, опирающимся на торец сосуда для культуральной среды при размещении в нем микропористого носителя, при этом дно чашеобразной части носителя имеет углубление.
4. Устройство по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанные клетки и ткани организма представляют собой клетки или ткани растений, грибов или бактерий.
5. Устройство по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что оно снабжено дополнительно промежуточным носителем, соединенным с микропористым носителем, обеспечивающим снабжение культуральной средой микропористого носителя.
6. Способ культивирования клеток и тканей организма, включающий стадии:
помещение клеток или тканей организма в устройство по любому из пп.1-5 на верхнюю поверхность расположенного в указанном устройстве микропористого носителя, обладающего способностью к поглощению воды;
погружение нижней части микропористого носителя в культуральную среду без погружения в нее клеток и тканей организма; и
предоставление возможности клеткам и тканям поглощать культуральную среду с верхней поверхности микропористого носителя,
при этом культуральная среда, поглощаемая нижней частью микропористого носителя, переносится вверх через сообщающиеся поры микропористого носителя.
7. Способ культивирования по п.6, в котором указанные клетки или ткани организма представляют собой клетки или ткани растений, грибов или бактерий.
