Способ получения препарата на основе хламидоспор микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных. Способ включает глубинное культивирование микроскопического гриба на питательной среде, содержащей источники углерода и органического азота, соли и воду, до максимального накопления вегетативной мицелиальной массы, введение индуктора спорообразования с последующим получением хламидоспор. В качестве микроскопического гриба используют Duddingtonia flagrans F-882, глубинное культивирование осуществляют в газовихревом биореакторе до достижения содержания биомассы по сухому веществу не менее 10,0 г/л. При получении препарата в жидкой форме в качестве индуктора спорообразования вводят воду, разбавляя вегетативную мицелиальную массу в 2-5 раз, и/или добавляют глицерин в конечной концентрации 1-2 мас.% и биомассу дополнительно инкубируют до максимального накопления хламидоспор в культуре. При получении препарата в сухой форме в качестве индуктора спорообразования вводят в вегетативную мицелиальную массу стерильный вспученный вермикулит в соотношении 1,0-4,0 мл мицелиальной массы на 1 г вспученного вермикулита, перемешивают и полученную смесь дополнительно инкубируют до получения хламидоспор. Изобретение позволяет повысить эффективность препарата. 5 з.п. ф-лы, 10 табл.

 

Изобретение относится к способам получения препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба Duddingtonia flagrans в жидкой или сухой форме, который может быть использован в микробиологии и сельском хозяйстве для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных.

Известен способ получения спор грибов в жидкой культуре (патент Японии 2003079362, МПК A01N 63/04, опубл. 18.03.2003), в котором процесс спорообразования в грибной культуре запускается при недостатке питательных веществ в среде, т.е. для поддержания процесса спорообразования достаточно не добавлять компонентов питания после их исчерпания в питательной среде, не допуская размножения вегетативных клеток мицелия.

Однако у грибов Duddingtonia flagrans при исчерпании питательных веществ в среде формируется очень мало хламидоспор (см. таблицу 1), т.е. указанный способ не эффективен для использования в производстве препаратов на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба Duddingtonia flagrans.

Известен способ выращивания мицелиальных форм микроорганизмов на носителе (патент РФ №1169359, СПК С12N 3/00, опубл. 10.07.1999), предполагающий периодическое погружение носителя в питательную среду.

Однако реализация данного способа требует сложного аппаратного обеспечения. Необходимость периодического погружения носителя в питательную среду вызвана недостаточной влагоемкостью использованных носителей. Недостаток воды и питательных веществ, адсорбированных в материале носителя, приводит к снижению урожая спор, что компенсируется периодическими погружениями в питательную среду.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения триходермина путем глубинного культивирования микроскопического гриба Trichoderma lignorum на питательной среде (патент РФ №2035145, МПК А01М 63/04, Опубл. 20.05.1995), содержащей источники углерода, органического азота, фосфаты, сернокислый магний, азотнокислый аммоний и воду, с последующим концентрированием культуральной жидкости. В качестве источника углерода используют глицерин и зеленую патоку, в качестве источника органического азота - гидролизат белково-витаминного концентрата при следующем соотношении компонентов в среде, мас.%:

Глицерин 0,3-2,0

Зеленая патока 0,5-3,0

Гидролизат белково-витаминного концентрата 3,0-10,0

Фосфаты 0,2-0,6

Сернокислый магний 0,3-0,5

Азотнокислый аммоний 0,3-0,6

Вода - Остальное.

В процессе культивирования при естественном снижении рН культуральной жидкости до 3,0-4,5 дополнительно вводят глицерин в количестве 0,3-1,0 мас.%. Культивирование гриба проводят до максимального накопления мицелиальной массы или спорообразования, концентрирование культуральной жидкости осуществляют до содержания сухих веществ 6-10%, в концентрат вводят 4-10 мас.% глицерина и 0,1-1,0 мас.% полиэтиленоксида или 1-3 мас.% поливинилпироллидона. Культивирование гриба проводят до максимального спорообразования, концентрирование культуральной жидкости осуществляют до содержания сухих веществ 20-30 мас.%, в концентрат вводят смесь цеолита типа NaX и монтмориллонита или полыгорскита в соотношении 1:2 в количестве 10-30 мас.% к сухим веществам. Полученную смесь гранулируют и высушивают. Титр хламидоспор в жидком препарате составляет 10⁸ спор в 1 мл, а в сухой форме 10⁹ спор в 1 г.

Однако при использовании выше описанной технологии для получения препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба Duddingtonia flagrans не обеспечивается высокий титр микроскопического гриба: в жидкой форме не более 10³ спор/мл, а в сухой форме - не более 10⁴ спор/г. Это обусловлено биологическими различиями грибов Trichoderma lignorum и Duddingtonia flagrans. В частности, отличаются условия процесса спорообразования, а размеры спор D. flagrans более чем на порядок превышают размеры спор Т. lignorum. Использование цеолита, монтмориллонита или полыгорскита также нецелесообразно из-за малой сорбционной емкости указанных носителей.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание технологии получения препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба Duddingtonia flagrans в жидкой и сухой форме с более высоким титром путем использования более эффективных добавок (индукторов спорообразования) на стадии образования хламидоспор указанного нематофагового гриба.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения препарата на основе хламидоспор микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных, включающем его глубинное культивирование на питательной среде, содержащей источники углерода и органического азота, соли и воду, до максимального накопления вегетативной мицелиальной массы, введение индукторов спорообразования с последующим получением хламидоспор, согласно изобретению в качестве микроскопического гриба используют штамм Duddingtonia flagrans F-882, глубинное культивирование осуществляют в биореакторе до достижения содержания биомассы по сухому веществу не менее 10 г/л, при получении препарата на основе хламидоспор в жидкой форме в качестве индуктора спорообразования вводят воду, разбавляя вегетативную мицелиальную массу в 2-5 раз, и/или добавляют глицерин до конечной концентрации 1-2 мас.% и биомассу инкубируют до максимального содержания хламидоспор в жидкой форме, а при получении препарата хламидоспор в сухой форме в качестве индуктора спорообразования вводят в вегетативную мицелиальную массу стерильный вспученный вермикулит в соотношении 1,0-4,0 мл мицелиальной массы на 1 г вспученного вермикулита, перемешивают и полученную смесь инкубируют до получения хламидоспор.

Глубинное культивирование указанного штамма Duddingtonia flagrans F-882 в биореакторе осуществляют 40-50 часов при температуре +28±2°С, интенсивном перемешивании и аэрации.

При получении хламидоспор в жидкой форме дополнительное инкубирование осуществляют в биореакторе в течение 4-7 суток при температуре +28°С.

При получении хламидоспор в сухой форме дополнительное инкубирование смеси мицелиальной массы со вспученным вермикулитом осуществляют при температуре +28°С в течение 4-10 суток.

При получении хламидоспор в сухой форме вегетативную мицелиальную массу перед смешиванием со вспученным вермикулитом концентрируют, например, в 5 раз.

При получении хламидоспор в сухой форме в полученную вегетативную мицелиальную массу гриба перед смешиванием со вспученным вермикулитом добавляют глицерин, или мелассу, или крахмал, или муку в количестве от 2,0 до 12,0 мас.%.

Штамм гриба Duddingtonia flagrans T-89 выделен из почвы тепличного комбината «Кировец» г.Новосибирска в 1989 г., депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (р.п.Кольцове, Новосибирская область) под номером F-882 и защищен патентом РФ №2253671, МПК⁸ С12N 1/14, А01N 63/00, опубл. 27.11.2004.

Штамм характеризуется:

- образованием в поверхностной культуре на различных твердых (агаризованных и сыпучих) средах спороношения преимущественно в виде хламидоспор, имеющих толстую оболочку;

- хламидоспоры хранятся в сухом состоянии без потери исходных свойств гриба и жизнеспособности не менее двух лет, легко восстанавливаются даже после 10-летнего хранения при помещении культуры в суспензию нематод, которые стимулируют прорастание хламидоспор;

- обладает высокой эффективностью по отношению к разным нематодам, проявляет длительность действия. Штамм обладает высокой эффективностью в уничтожении галловых нематод растений, возбудителей гельминтозов животных, способностью сохранять жизнеспособность без потери свойств как при прохождении через желудочно-кишечный тракт животных, так и в условиях почвы, а также обладает свойством стимулировать рост и развитие растений.

Вспученный вермикулит представляет собой сыпучий пористый материал в виде чешуйчатых частиц серебристого и золотистого цветов, получаемых ускоренным обжигом (до температуры 600°÷1000°С) до вспучивания вермикулита - гидрослюды, содержащей между элементарными слоями связанную воду. Пар, образующийся из этой воды, действует перпендикулярно плоскостям спайности и раздвигает пластинки слюды, увеличивая первоначальный объем зерен в 18÷25 раз. Плотность вспученного вермикулита составляет 70÷150 г/л. Вспученный вермикулит способен абсорбировать до 400% воды, т.е. на 1 г вермикулита можно наносить до 4 мл культуральной жидкости, и при этом свободная жидкость отсутствует. К достоинствам вспученного вермикулита можно отнести также отсутствие токсичности и практическую стерильность благодаря высокотемпературной обработке природного материала. В частности, его используют для улучшения структуры почвы и в качестве субстрата при гидропонном выращивании растений. Благодаря высокой сорбционной емкости вспученного вермикулита можно варьировать количество наносимого посевного материала и питательных веществ в широком диапазоне.

Описание способа получения препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба в жидкой или сухой форме

Готовят стерильную питательную среду, содержащую источники углерода и органического азота, соли и воду, а также 2-х суточный посевной материал штамма F-882 гриба вида Duddingtonia flagrans. Процесс культивирования проводят в биореакторе при температуре 28°С, в условиях интенсивного перемешивания и аэрации. Культивирование осуществляют до достижения содержания биомассы по сухому веществу не менее 10,0 г/л (40-50 часов).

При получении препарата на основе хламидоспор в жидкой форме в вегетативную мицелиальную массу вводят индуктор спорообразования, в качестве которого используют воду, разбавляя ею вегетативную мицелиальную массу в 2-5 раз, и/или добавляют глицерин до конечной концентрации 1-2 мас.%. Далее биомассу дополнительно инкубируют в биореакторе в течение 4-7 суток при температуре +28°С, интенсивном перемешивании и аэрации до максимального накопления хламидоспор в культуре.

При получении препарата хламидоспор в сухой форме в вегетативную мицелиальную массу вводят индуктор спорообразования, в качестве которого используют стерильный вспученный вермикулит в соотношении 1,0-4,0 мл мицелиальной массы на 1 г вспученного вермикулита, перемешивают и полученную смесь дополнительно инкубируют при температуре +28°С в течение 10 суток до получения хламидоспор. Полученный влажный препарат высушивают. Влажность готового препарата должна быть не более 12%. Количество хламидоспор достигает (2÷4)*10⁶ спор/г сухого препарата.

При получении хламидоспор в сухой форме вегетативную мицелиальную массу перед смешиванием со вспученным вермикулитом концентрируют в 5 раз.

При получении хламидоспор в сухой форме для повышения титра хламидоспор в полученную вегетативную мицелиальную массу гриба перед смешиванием со вспученным вермикулитом добавляют источник углерода глицерин, или мелассу, или крахмал, или муку в количестве от 2,0 до 12,0 мас.%.

Ниже приведены конкретные примеры выполнения способа.

Пример 1. Наработку вегетативного мицелия (первая стадия) штамма D. flagrans F-882 производили в 5 л вихревом биореакторе БИОК - 022 с. Культивирование проводили в питательной среде следующего состава:

KH2PO4 -	5 г,
MgSO4 -	2 г,
NaNO3 -	5 г,
кукурузный экстракт -	7,5 мл,
меласса -	30 мл
вода водопроводная -	до 1 л.

Доводили рН до 6,8.

В биореактор загружали 4 л питательной среды и 400 мл инокулята - 2-х суточной культуры F-882. Культивирование продолжалось в течение 48 часов, при условиях, указанных ниже:

- аэрация - 6 л/мин,

- скорость вращения активатора - 2000 об./мин,

- температура - +28°С.

В конце культивирования получили культуральную жидкость, содержащую 12 г/л вегетативного мицелия, по сухому весу.

Пример 2. Исследовали зависимость урожая хламидоспор от степени разбавления культуральной жидкости (КЖ). Вегетативный мицелий был получен, как описано в примере 1. КЖ разводили стерильной водопроводной водой и разливали по 100 мл в колбы объемом 0,5 л. Образцы инкубировали на качалке (при 180 об./мин, +28°С) в течение 4 суток. Отбирали пробы, гомогенизировали и подсчитывали концентрацию хламидоспор. Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Данные по содержанию хламидоспор в зависимости от разбавления водой
Описание образцов	количество хламидоспор *104 в 1 мл жидкости	количество хламидоспор *104 на 1 мл исходной (не разбавленной) КЖ
не разбавленная КЖ	0,4	0,4
КЖ, разбавленная в 2 раза	4,6	9,2
КЖ, разбавленная в 3 раза	5,8	17,4
КЖ, разбавленная в 4 раза	6,2	24,8
КЖ, разбавленная в 5 раз	5,4	27,0

В таблице 1 приведены значения, усредненные по трем повторностям, отклонения от среднего в пределах 10%.

Хламидоспоры образуются также в неразбавленной культуральной жидкости (КЖ), но их очень мало. Разбавление культуральной жидкости водой стимулирует процесс спорообразования так, что выход хламидоспор с 1 мл КЖ увеличивается в 23-68 раз по сравнению с неразбавленной КЖ. Чем больше степень разбавления КЖ, тем выше урожай хламидоспор, образующихся из вегетативного мицелия. Вероятно роль пускового фактора для процесса спорообразования играет резкое уменьшение концентрации питательных веществ в среде. Чем выше степень разбавления, тем сильнее ощущается недостаток питательных веществ клетками мицелия, и тем больше клеток мицелия трансформируется в хламидоспоры.

Пример 3. Исследовали зависимость урожая хламидоспор от добавок глицерина в жидкой культуре штамма F-882. Условия эксперимента аналогичны описанным в примере 2. Отличие лишь в том, что в часть образцов, наряду с разбавлением водой, добавляли глицерин. Через 4, 7 и 14 суток отбирали пробы, гомогенизировали и подсчитывали концентрацию хламидоспор. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Данные по содержанию хламидоспор в зависимости от концентрации в КЖ глицерина
№	Описание образцов	Время инкубирования образцов / количество хламидоспор *104 в 1 мл КЖ
4 суток	7 суток	14 суток
1	Не разбавленная КЖ	0,3	0,3	0.3
2	Как №1 + глицерин до 2%	0,1	2,2	33,0
3	КЖ, разбавленная в 2 раза	4,5	4,5	4,5
4	Как №3 + глицерин до 2%	4,6	13,7	14.0
5	КЖ, разбавленная в 3 раза	5,5	5,5	5,5
6	Как №5 + глицерин до 2%	7,4	11,8	12,0

В таблице приведены значения (концентрация хламидоспор в 1 мл жидкости *10⁴), усредненные по трем повторностям, отклонения от среднего в пределах 10%.

Исследования показали, что добавка глицерина до концентрации 1-2% существенно увеличивает выход хламидоспор (см. табл.2). В неразбавленной КЖ добавка глицерина увеличивает урожай хламидоспор на 2 порядка. К сожалению при этом длительность процесса формирования хламидоспор увеличивается до 2 недель. В разбавленной в 2-3 раза культуральной жидкости процесс спорообразования заканчивается за 7 суток, тогда как без глицерина формирование хламидоспор занимает 4 суток. Однако добавка глицерина (+разбавление водой) приводит к увеличению выхода хламидоспор в 2-3 раза, по сравнению с образцами без глицерина.

Таким образом, глицерин может использоваться либо в качестве самостоятельного индуктора спорообразования, либо параллельно с разбавлением культуральной жидкости.

Пример 4. Выращивали вегетативный мицелий штамма D. flagrans F-882, как описано в примере 1. Параллельно готовили вермикулит - в 0,5 л колбы насыпали по 10 г вермикулита, стерилизовали 4 часа при 180°С. Культуральную жидкость, выращенную в биореакторе, наносили на вермикулит и тщательно смешивали.

Закрытые фольгой колбы помещали в термостат при +28°С на время процесса спорообразования (4 суток). В таблице 3 приведены усредненные результаты тестирования по 4 вариантам, отличающимся по количеству КЖ, наносимой на 1 г вермикулита. Каждый вариант ставили в 4-х повторностях.

Таблица 3 Данные по содержанию хламидоспор в зависимости от соотношения КЖ и вермикулита
Описание варианта	хламидоспор/г вермикулита* 105	хламидоспор/мл исходной КЖ* 105
1 мл КЖ на 1 г вермикулита	1,7	1,7
2 мл КЖ на 1 г вермикулита	3,2	1,6
3 мл КЖ на 1 г вермикулита	4,9	1,6
4 мл КЖ на 1 г вермикулита	6,2	1.5

Отклонения от указанных средних значений составляют ±10%.

Урожай хламидоспор практически линейно зависит от количества биомассы вегетативного мицелия, нанесенного на вермикулит. Однако дальнейшее увеличение урожая хламидоспор за счет увеличения количества КЖ, наносимой на вермикулит, невозможно, так как влагоемкость вермикулита ограничена 400% от массы самого вермикулита. Количество биомассы в 1 мл глубинной культуры также ограничено.

Пример 5. Выращивали вегетативный мицелий и готовили вермикулит, как описано в примерах 1 и 4. Биомассу концентрировали в 5 раз посредством фильтрования. Концентрат культуральной жидкости наносили на вермикулит, по 3 мл концентрата на 1 г вермикулита, и тщательно смешивали. Закрытые фольгой колбы помещали в термостат при +28°С на время процесса спорообразования (10 суток). В таблице 4 приведены усредненные (по 4 повторностям) результаты тестирования.

Таблица 4 Данные по содержанию хламидоспор на вермикулите при концентрировании КЖ
Варианты	хламидоспор/г вермикулита *105	хламидоспор/мл исходной КЖ *105
Контроль - 3 мл КЖ на 1 г вермикулита	4,5	1.5
3 мл концентрата КЖ на 1 г вермикулита	42,0	2.8
* Отклонения от указанных средних значений составляют ±10%.

Использование концентрата биомассы позволило увеличить выход хламидоспор в 9 раз, тогда как культуральная жидкость была сконцентрирована только в 5 раз. Дополнительный выигрыш в урожае обусловлен тем, что в концентрированной биомассе хламидоспоры формировались более интенсивно. В расчете на 1 мл исходной КЖ в концентрате получилось почти в 2 раза больше хламидоспор. Полученные результаты говорят о том, что повышенная плотность мицелия на поверхности вермикулита является дополнительным фактором, стимулирующим спорообразование.

Пример 6. Выращивали вегетативный мицелий и готовили вермикулит, как описано в примерах 1 и 4. В полученную в биореакторе культуральную жидкость добавляли один из следующих источников углерода: мелассу, глицерин, крахмал или муку, в различных концентрациях. Обогащенную питательными веществами культуральную жидкость (КЖ) вносили в емкости со стерильным вермикулитом, из расчета 2 мл КЖ на 1 г вспученного вермикулита, и тщательно перемешивали.

Емкости помещали в термальную комнату при +28°С и инкубировали в течение 13 суток. В таблице 5 приведены усредненные (по 4 повторностям) результаты тестирования.

Добавка источников углерода позволяет повысить урожай хламидоспор в 2-11 раз, при том что количество посевного материала, наносимого на вермикулит, не увеличивается. Наибольший эффект дают добавки 12% мелассы, 10% картофельного крахмала и особенно 10% пшеничной муки.

Таблица 5 Данные по содержанию хламидоспор на вермикулите при добавлении в КЖ источника углерода
Описание варианта	хламидоспор/г вермикулита * 106	Выход хламидоспор относительно контроля (принятого за 1)
Контроль - ЮК без добавок	0,5	1
КЖ с 2% глицерина	0,9	1,8
КЖ с 3% мелассы	1,0	2,0
КЖ с 6% мелассы	1,9	3,8
КЖ с 12% мелассы	3,7	7,4
КЖ с 10% крахмала	3,8	7,6
КЖ с 10% муки	5,4	10,8
*Отклонения от указанных средних значений составляют ±10%.

Добавки таких компонентов, как меласса и глицерин, в основном расходуются на процесс формирования хламидоспор, тогда как добавки крахмала и муки, наряду с формированием хламидоспор, стимулируют и процесс роста вегетативного мицелия. Использование добавок позволяет, во-первых, в несколько раз сократить производственные затраты на выращивание посевного материала в биореакторе, и, во-вторых, исключает операцию концентрирования биомассы перед нанесением на вермикулит.

Пример 7. Исследовали динамику процесса формирования хламидоспор на вермикулите в образцах с различными добавками. Эксперимент проводился по схеме, описанной в примере 6. Но отбор проб делали после 4, 7, 10 и 13 суток инкубирования образцов. В таблице 6 приведены результаты - динамика прироста хламидоспор на вермикулите.

Таблица 6 Данные по содержанию хламидоспор на вермикулите при добавлении в КЖ источника углерода
Описание образцов	Продолжительность инкубации / количество хламидоспор *106 в 1 г сухого препарата
4 сут	7 сут	10 сут	13 сут
Контроль - КЖ без добавок	0,5	0.5	0,5	0,5
КЖ с 2% глицерина	0,8	0,9	0,9	0,9
КЖ с 12% мелассы	3,5	3,7	3,7	3,7
КЖ с 10% крахмала	0,5	2,2	3,1	3,8
КЖ с 10% муки	0,6	2,7	4,4	5,4

В таблице указано содержание хламидоспор в расчете на 1 г сухого препарата 10⁶. В контроле, где на вермикулит наносится КЖ без добавок, процесс формирования хламидоспор завершается в течение 4 суток. Практически также быстро завершается спорообразование в образцах с добавками глицерина и мелассы. В образцах с добавками крахмала и муки процесс растягивается на 13 суток. Причина в том, что крахмал и мука прежде всего стимулируют рост вегетативного мицелия, в результате чего формирование хламидоспор начинается значительно позже, чем в контроле. С другой стороны, добавка муки обеспечивает наиболее высокое содержание хламидоспор в препарате. Наиболее оптимальным представляется вариант с добавкой 12% мелассы, где высокое содержание хламидоспор достигается за минимальное время - 4 суток.

Полученный влажный препарат высушивают. Влажность готового препарата должна быть не более 12%. Количество хламидоспор достигает (2-4)*10⁶ спор/г сухого препарата.

Таким образом, примеры 1-7 подтверждают, что технический результат предлагаемого изобретения обеспечивает получение препарата на основе хламидоспор микроскопического нематофагового гриба Duddingtonia flagrans в жидкой и сухой форме с более высоким титром (до 4*10⁶ спор/г сухого препарата) путем использования более эффективных добавок (индукторов спорообразования) на стадии образования хламидоспор.

Пример 8. В зараженную галловыми нематодами (Meloidogyne incognita) почву теплицы Новосибирского метрополитена вносили сухую и жидкую формы препарата на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882, одновременно с высадкой рассады огурца сорта Королек. По окончании вегетации растений учитывали балл поражения корневой системы и средний урожай на одно растение. В каждом варианте проводили учет по 100 растениям. В табл.7 представлены результаты по урожайности и пораженности корневой системы в опытных и контрольных вариантах.

Таблица 7 Средний урожай на одно растение и пораженность корней огурца мелойдогинозом, обработанных препаративными формами на основе Duddingtonia flagrans F-882
Вариант	Средний урожай огурца на одно растение, кг	Балл поражения корней огурца мелойдогинозом
Сухая форма (на вспученном вермикулите) - 30 г/растение	1,92±0,08	2
Жидкая форма - 30 мл/растение	1,78±0,07	3
Контроль (без обработки)	1,08±0,09	5

Как видно из полученных результатов, наибольший эффект проявила сухая форма препарата, что обусловлено большим содержанием грибных пропагул во внесенной дозе по сравнению с жидкой формой.

Пример 9. Для отработки доз применения сухой формы препарата (на вспученном вермикулите) на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882 против галловых нематод растений был заложен вегетационный опыт. Почва для эксперимента была взята из очага сильного поражения корневой системы огурца мелойдогинозом (5 баллов), тщательно перемешана и набита в сосуды, вмещающие 400 г почвы. Доза внесенного препарата составляла 1%, 2% и 3% к массе почвы в сосуде. Контролем служили сосуды с необработанной почвой. Каждый вариант был представлен 20 сосудами. Использовали проросшие семена огурца сорта Королек. Через 1 месяц опыт был прерван и проведены замеры высоты растений, площади листовых пластин, длины корней, балла поражения корневой системы мелойдогинозом (табл.8).

Таблица 8 Результаты вегетационного опыта по оценке оптимальной дозы сухой формы препарата на основе Duddingtonia flagrans F-882 против галловых нематод
Вариант	Высота растений, см	Площадь листовой пластины, см2	Длина корня, см	Балл поражения корня мелойдогинозом
1% препарата	14,0±0,3	64,0±1,2	15,0±0,3	1
2% препарата	13,4±0,2	62,6±1,0	12,7±0,3	1
3% препарата	12,9±0,2	51,6±2,2	12,1±0,3	1
контроль	12,5±0,2	44,0±2,5	10,5±0,5	5

Как видно из табл.8, корневая система у всех опытных растений была в основном очищена от нематод, однако результаты по росту и развитию растений были лучшими в варианте с 1%-м препаратом, что, возможно, связано с незначительным токсическим эффектом биопрепарата в повышенных дозах на начальных стадиях развития растений огурца.

Пример 10. На участке с высоким уровнем зараженности почвы картофельной нематодой Globodera rostochiensis (10-12 тысяч личинок на 100 г почвы) препарат на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882 в сухой и жидкой форме вносили под сорта картофеля «Свитанок Киевский» и «Любава» (восприимчивые к нематоде), «Никита» (устойчивый сорт). Доза внесения биопрепарата составляла 150 г/м² (сухая и жидкая формы). Препарат вносили в лунку при посадке картофеля в мае месяце.

По всем сортам на стадии всходов отмечалось стимулирующее влияние препарата, особенно в жидкой форме. Данные по влиянию препарата на зараженность картофеля нематодой представлены в табл.9.

Как видно из табл.9, снижение зараженности картофельной нематодой у восприимчивых сортов было выше в вариантах с препаратом на вспученном вермикулите по сравнению с жидкой формой (68-70% против 52-60%).

Пример 11. Эффективность жидкой формы препарата на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882 оценивали на личинках возбудителя элафостронгилеза (Elaphostrongylus panticola) маралов.

Таблица 9 Влияние препарата на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882 на зараженность растений картофельной нематодой Globodera rostochiensis (среднее по повторностям)
Вариант	Учет в фазу бутонизации (13 июля)	Учет при уборке клубней (8 сентября)
Сорт картофеля	Форма препарата	Кол-во самок на одно растение, экз.	% от контроля	Кол-во самок на одно растение, экз.	% от контроля
Свитанок Киевский	Жидкая	16,3±2,8	- 28,2*	12,0±1,8	-52,0
	Сухая	5,0±0,8	-77,9	8,0±1,2	-68,0
Контроль	22,7±3,2	-	25,0±4,1	-
Любава	Жидкая	5,0±0,8	-79,2	8,0±1,1	-60,0
	Сухая	3,0±0,5	-87,5	6,0±0,9	-70,0
Контроль	24,0±3,9	-	20,0±3,2	-
Никита	Жидкая	0	0	0	0
	Сухая	0	0	0	0
Контроль	0	0	0	0
*(-) - снижение зараженности относительно контроля

Для этого использовали фекалии маралов, содержащие в среднем 18,5 личинок в 1 г. В опытные варианты, помещенные в чашки Петри, вносили по 30 мл препарата, в контрольные чашки вносили такое же количество дистиллированной воды. Пробы помещали в термостат при температуре +26,4°С. На 3, 6 и 10 сутки исследовали по три пробы от каждой группы, подсчитывая количество личинок Е. panticola в 1 г фекалий по методу Бермана-Орлова (табл.10).

Таблица 10 Влияние жидкой формы препарата на основе штамма Duddingtonia flagrans F-882 на численность личинок элафостронгилеза маралов
Вариант	Число личинок на 1 г фекалий, шт. (по суткам отбора проб)
0	3	6	10
Жидкий препарат	18,5	0,2	0.1	0,07
Контроль	18,5	10,7	23,6	11,7

Как видно из табл.10, зарегистрировано значительное снижение количества личинок под влиянием жидкой формы препарата уже через 3 суток. По сравнению с контролем на 3-и, 6-е и 10-е сутки количество личинок уменьшилось в 53, 236 и 167 раз, соответственно.

1. Способ получения препарата на основе хламидоспор микроскопического гриба для борьбы с паразитическими нематодами растений и животных, включающий его глубинное культивирование на питательной среде, содержащей источники углерода и органического азота, соли и воду, до максимального накопления вегетативной мицелиальной массы, введение индукторов спорообразования с последующим получением хламидоспор, отличающийся тем, что в качестве микроскопического гриба используют штамм Duddingtonia flagrans F-882, глубинное культивирование осуществляют в биореакторе до достижения содержания биомассы по сухому веществу не менее 10 г/л, при получении препарата на основе хламидоспор в жидкой форме в качестве индуктора спорообразования вводят воду, разбавляя вегетативную мицелиальную массу в 2-5 раз, и/или добавляют глицерин в конечной концентрации 1-2 мас.% и биомассу инкубируют до максимального содержания хламидоспор в жидкой форме, а при получении препарата хламидоспор в сухой форме в качестве индуктора спорообразования вводят в вегетативную мицелиальную массу стерильный вспученный вермикулит в соотношении 1,0-4,0 мл мицелиальной массы на 1 г вспученного вермикулита, перемешивают и полученную смесь дополнительно инкубируют до получения хламидоспор.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что глубинное культивирование указанного штамма Duddingtonia flagrans F-882 в биореакторе осуществляют 40-50 ч при температуре 28°С, интенсивном перемешивании и аэрации.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения максимального содержания хламидоспор в жидкой форме осуществляют инкубирование в биореакторе в течение 4-7 сут при температуре 28°С.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для получения хламидоспор в сухой форме инкубирование смеси мицелиальной массы со вспученным вермикулитом осуществляют при температуре 28°С в течение 4-10 сут.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении хламидоспор в сухой форме вегетативную мицелиальную массу перед смешиванием со вспученным вермикулитом концентрируют в 5 раз.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении хламидоспор в сухой форме в полученную вегетативную мицелиальную массу гриба перед смешиванием со вспученным вермикулитом добавляют глицерин или мелассу, или крахмал, или муку в количестве от 2,0 до 12,0 мас.%.