Питательная среда для выращивания биолюминесцентных бактерий
Владельцы патента RU 2368658:
Федеральное Государственное унитарное предприятие Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (RU)
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выделения биолюминесцентных бактерий, из морской воды. Питательная среда содержит морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, и сухой питательный агар. рН среды 7,2-7,4. Изобретение позволяет повысить выход биолюминесцентных бактерий. 1 табл.
Предлагаемое изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды.
Известны питательные среды для выращивания штамма люминесцентных бактерий Photobacterium leiognathi (1). Люминесцентные бактерии Photobacterium leiognathi выращивали:
в среде Егоровой: NaCl 30,0 г; КН2РО4 1,0 г; MgSO4 0,5 г; пептон 10,0 г; рыбная вытяжка 0,5 л; агар-агар 18,0 г; водопроводная вода 0,5 л; рН 7,4 (устанавливают 40%-ным NaOH);
в полусинтетической среде (г на 1 л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2РО4 1,0; Na2HPO4·12H2O 10,0; MgSO4·7H2O 0,2; (NH4)2HPO4 0,5; пептон Chemapol 5,0 (пептон Difco 10,0); глицерин 3 мл; агар-агар 20,0; РН 7,0;
в минимальной среде (г на л дистиллированной воды): NaCl 30,0; КН2РО4 1,0; Na2HPO4·12H2O 10,0; MgSO4·7H2O 0,2; (NH4)2HPO4 0,5; глицерин 3 мл или глюкоза 4 г; рН 7,0.
Недостатком известных питательных сред является сложность их состава и относительно высокая стоимость.
Известна питательная среда для культивирования светящихся бактерий (2), включающая NaCl 30,0 г; пептон 20,0 г; глицерин 2,0 г; агар 20,0 г; водопроводную воду до 1 л; рН 7,2-7,4.
Недостатком известной питательной среды является относительная дороговизна составляющих компонентов (пептон, глицерин). При этом производительность выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды с использованием данной среды невысока.
Наиболее близкой к предложенной среде является, выбранная в качестве прототипа, питательная среда для культивирования биолюминесцентных бактерий (3), содержащая следующие компоненты: пептон - 5 г, агар-агар - 15 г, вода морская - до 1 л, рН среды 7,2.
Эту питательную среду готовят в основном из искусственной морской воды, и выход выращенных на ней биолюминесцентных бактерий невысок. При этом один из компонентов этой среды пептон относительно дорогой.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение выхода биолюминесцентных бактерий.
Указанная задача достигается тем, что в питательной среде для выращивания биолюминесцентных бактерий, содержащей морскую воду, питательную основу, согласно изобретению используют морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, а в качестве питательной основы выбирают сухой питательный агар, при следующих соотношениях компонентов в г/л:
| сухой питательный агар - | 34,0-36,0 |
| морская вода | до 1 л |
| рН | 7,2-7,4 |
В предложенной питательной среде, благодаря использованию морской воды, отобранной в районе предполагаемого выделения биолюминесцентных бактерий, и, соответственно, имеющей компоненты, оптимальные для роста этих бактерий, достигается выделение их максимального количества. При этом предлагаемая среда недорогая и очень простая по приготовлению и составу.
В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, а определение прототипа из выявленных аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".
При дополнительном поиске других решений, относящихся к питательным средам, указанных отличительных признаков не обнаружено, таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "изобретательский уровень".
Пример 1. Готовили контрольную питательную среду следующего состава (в г):
пептон - 5,0
агар-агар - 15,0
вода морская - до 1 л.
Для изготовления использовалась искусственная морская вода.
Питательную среду стерилизовали при 111°С в течение 20 мин; рН среды после стерилизации 7,2.
Проводили концентрирование бактерий из воды Черного и Азовского морей методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.
Пример 2. Готовили питательную среду на основе воды, отобранной в районе Черного моря, где предполагалось проводить выделение бактерий. Для питательной основы использовали сухой питательный агар (4) (ФС 42 - 188 ВС-88) производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ.
В питательный агар добавляли морскую воду до 1 л, отобранную в районе Черного моря, где предполагалось проводить выделение бактерий. Затем кипятили 1-2 мин до полного расплавления агара. Профильтровали через ватно-марлевый фильтр, разлили в стерильные емкости. Приготовленную питательную среду стерилизовали при температуре 121°С в течение 15 мин; рН среды после стерилизации 7,3. В чашки Петри среду разлили слоем 3-0,1575 дюйма. Готовая среда в чашках Петри прозрачная, желтого цвета. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.
Пример 3. Проводили концентрирование бактерий из воды Азовского моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на питательной среде, приготовленной в примере 2, при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.
Пример 4. Готовили питательную среду из сухого питательного агара (4) (ФС 42-188 ВС-88) производства ФГУП «НПО «МИКРОГЕН» МЗ РФ. В нее добавляли морскую воду до 1 л. Приготовление проводили, как в примере 2, но на основе воды, отобранной в районе Азовского моря, где предполагалось проводить выделение бактерий.
Проводили концентрирование бактерий из этого района Азовского моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на приготовленной питательной среде при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет.
Полученные данные приведены в таблице 1.
Пример 5. Проводили концентрирование бактерий из воды Черного моря методом мембранных фильтров и выращивали их в чашках Петри на питательной среде, приготовленной в примере 4, при комнатной температуре в течение 24 часов. Присутствие колоний биолюминесцентных бактерий определяли, визуально анализируя наличие биолюминесценции, и производили их подсчет. Полученные данные приведены в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Пример | Питательная среда | Выход колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из морской среды | |
| Черного моря | Азовского моря | ||
| 1 | Контрольная | 4-5 | 2-3 |
| 2 | На основе воды Черного моря | 9-12 | |
| 3 | -′′- | 2-3 | |
| 4 | На основе воды Азовского моря | 7-10 | |
| 5 | -′′- | 2-3 |
В таблице 1 показано, что на контрольной среде количество колоний биолюминесцентных бактерий, выросших после фильтрации воды из Черного и Азовского морей, составило 4-5 и 2-3 соответственно. На среде (пример 2), приготовленной на основе воды из Черного моря, выросло 9-12 колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Черного моря, и 2-3 колонии, выделенные из Азовского моря (пример 3). На среде, приготовленной на основе воды, отобранной в Азовском море, выросло 7-10 колоний биолюминесцентных бактерий, выделенных из Азовского моря (пример 4), и 2-3 колонии, выделенные из Черного моря (пример 5).
Таким образом, количество биолюминесцентных бактерий, выросших на средах, приготовленных на основе морской воды, отобранной в местах, где проводилось их выделение, в 2,7-3,5 раза превышает их количество, выросшее в известной питательной среде. Особенно это важно для морей, например Азовского моря, для солености которых характерна существенная временная и пространственная изменчивость.
Исследования показали, что приготовление питательной среды на морской воде, отобранной в районе выделения биолюминесцентных бактерий, способствует созданию оптимальных условий для развития аборигенных биолюминесцентных бактерий, повышению их выживаемости и соответственно увеличению количества выделенных колоний бактерий.
Источники информации
1. Авт. свид. № 1484829, МКИ С12N 1/20.
2. Кн. «Методы водной микробиологии». Изд-во «Наука», Ленинград, 1965, стр.297-298.
3. Морской экологичный журнал, Т.3, № 3, 2004, с.49-53, Иваницына В.А, Бухтияров А.Е. «Таксономический состав гетеротрофных бактерий Одесского побережья, устойчивых к тяжелым металлам», прототип.
4. Справочник по микробиологическим питательным средам. Под редакцией Меджидова М.М. Дагестанское книжное издательство, Махачкала, 1989, с.15.
Питательная среда для выращивания биолюминесцентных бактерий, включающая морскую воду, питательную основу, отличающаяся тем, что используют морскую воду, отобранную в районе выделения биолюминесцентных бактерий, а в качестве питательной основы выбирают сухой питательный агар при следующих соотношениях компонентов, г/л:
| сухой питательный агар | 34,0-36,0 |
| морская вода | до 1 л |
| рН | 7,2-7,4 |
