Способ определения зараженности собак dirofilaria immitis
Владельцы патента RU 2371145:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Астраханский государственный университет" (АГУ) (RU)
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ заключается в получении комплекса антигенов гельминта путем приготовления экстракта из выделенных от погибших собак самцов Dirofilaria immitis и взрослых самок Dirofilaria immitis с микрофилариями. Затем доводят концентрацию белка в экстракте до 15 г/л методом диализа и ставят реакции преципитации в агаровом геле между комплексом антигенов гельминта и исследуемой сывороткой животного. Способ позволяет увеличить точность диагностики дирофиляриоза у собак и сократить время ее проведения. 1 табл.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано, в частности, для диагностики дирофиляриоза у собак.
В практической ветеринарии известно всего несколько лабораторных способов определения наличия филярий в организме животного. В частности, микроскопический метод, основанный на обнаружении микрофилярий в мазке крови, при этом дифференциальная диагностика между D.immitis и D.repens, а также личинок Dipetalonema reconditum, обнаруживаемых под кожей у собак, не представляется возможным. Более точная дифференциация возможна только при исследовании гистохимических мазков на кислотно-фосфатазную активность. (Г.М.Уркхарт, Дж Эрмур, Дж.Дункан и др. Ветеринарная паразитология. / Пер. с англ. Болдырева Е., Минаева С.М.: «АКВАРИУМ ЛТД», 2000, c.113).
Хотя проблема дирофиляриоза актуальна, прежде всего в странах и регионах с теплым и умеренным климатом, где имеет место большое количество комаров, являющихся промежуточными хозяевами, заболевание получило широкое распространение в последние десять лет и в районах с умеренными среднегодовыми температурами в связи с импортом собак (в нашей стране в настоящее время кроме территории юга России, фиксируются случаи заболевания в Москве и Московской области и других регионах). Эта проблема в Северной Америке в настоящее время настолько актуальна, что созданы специальные клиники для лечения сердечных гельминтозов.
Патогенетическое действие оказывают взрослые гельминты. У большинства собак с паразитированием в их организме небольшого количества особей явных признаков заболевания не проявляется (что резко повышает их эпидемическую опасность) и только при значительной инвазии отмечается нарушение функционирования кровеносной системы, в основном это хроническая застойная правосторонняя сердечная недостаточность. Кроме того, возможны эндокардит сердечных клапанов и пролиферативный легочный эндоартериит. К летальному исходу приводят также легочная эмболия, вызываемая мертвыми или погибающими гельминтами, и синдром полой вены, вызываемый теми же причинами.
Одним из факторов распространения данного заболевания следует считать длительный латентный период (до 5 лет), в течение которого в крови присутствуют циркулирующие микрофилярии. Этот процесс сочетается с повсеместным расселением комаров, являющихся промежуточными хозяевами, их способностью к быстрому увеличению популяции и короткий период развития в них микрофилярии до личинок третьей стадии. Контрольные мероприятия при этом заболевании трудноосуществимы, поэтому профилактика основывается преимущественно на лечении.
В тропических странах препараты назначаются в течение всего года, в странах с более умеренным климатом лечение начинается за месяц до сезона развития комаров и прекращается через 2 месяца после его окончания. Все этот требует значительных финансовых вложений, кроме того, не исключен риск неблагоприятной реакции организма собаки на погибающего паразита и применяемые химиотерапевтические средства.
Все вышеперечисленное делает раннюю и видоспецифическую диагностику дирофиляриоза весьма актуальной.
Близким по своим прогностическим параметрам к предлагаемому нами способу является группа иммунодиагностических тестов ELISA для определения антигенов взрослых гельминтов в сердце, которые позволяют идентифицировать большинство зрелых паразитов и обладают высокой специфичностью (Г.М.Уркхарт, Дж. Эрмур, Дж.Дункан и др. Ветеринарная паразитология. / Пер. с англ. Болдырева Е., Минаева С.М.: «АКВАРИУМ ЛТД», 2000, с.113).
Данный способ имеет следующие недостатки:
Способ не эффективен на ранних стадиях заболевания, когда паразитируют микрофилярии, а не взрослые особи. В то же время очевидно, что именно диагностика на ранних стадиях инвазии приводит в дальнейшем к наибольшему клиническому эффекту и профилактике эпидемической ситуации.
Способ достаточно дорогой (стоимость тест-систем), требует наличия соответствующего оборудования, которое в большинстве ветеринарных клиник отсутствует.
Целью представленного изобретения является увеличение чувствительности, точности, сокращение времени, необходимого для постановки диагноза дирофиляриоза собак при одновременной простоте и доступности предлагаемого способа для широкого применения.
Поставленная цель в изобретении достигается постановкой реакции преципитации в агаровом геле с использованием комплекса антигенов гельминтов.
Предложенный способ успешно апробирован на 100 образцах в практической работе кафедры молекулярной биологии, генетики и биохимии Астраханского государственного университета в течение 2006-2007 гг.
Ниже приводятся результаты апробации.
Пример 1
Приготовление комплекса антигенов гельминтов и проверка его специфичности включало несколько этапов. На первом этапе готовили экстракт из D.immitis (самцы, взрослые самки с микрофиляриями), выделенные от 50 погибших собак. Концентрацию белка в экстракте доводили до 15 г/л методом диализа. На втором этапе для проверки антигенной специфичности иммунизировали 5 кроликов полученным экстрактом по стандартной схеме для получения антисыворотки. Через 10 дней после окончания иммунизации из краевой вены уха проводили забор крови и отделяли сыворотку (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перер. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С.163-168). На следующем этапе методом двойной диффузии по Ухтерлони показано наличие четких преципитатов в агаре между сывороткой кролика и комплексом антигенов гельминтов, а также доказана специфичность данной реакции, так как отсутствуют перекрестные иммунологические реакции полученной нами сыворотки с экстрактами тканей внутренних органов и сывороткой крови собак (Ройт А. Основы иммунологии. Пер. с англ. - М.: Мир, 1991. - С.85-87).
Определяли инфицированность собаки D.immitis с помощью комплекса антигенов гельминтов.
Для этого осуществляли постановку реакции преципитации в агаровом геле комплекса антигенов гельминтов с сывороткой крови, взятой на вскрытии у восточноевропейской овчарки, из правых отделов сердца которой были выделены филярии. В этом примере нами установлено наличие преципитатов между реагентами, что говорит об инфицированности животного D.immitis (см. таблицу).
Пример 2
Проводили профилактическое обследование восточноевропейской овчарки из питомника способом, описанным в примере 1. Отсутствие преципитатов в агаре свидетельствует об отсутствии инфекции (см. таблицу).
Пример 3
Проводили профилактическое обследование сывороткой крови, взятой у кавказской овчарки из питомника. Наличие преципитатов между реагентами говорит об инфицированности животного D.Immitis (см. таблицу).
| Воспроизводимость результатов определения зараженности собак D.immitis предлагаемым способом | ||
| Пример | Наличие положительной реакции при постановке реакции преципитации в агаровом геле | Интерпретация результатов |
| 1 | имеется | собака инфицирована D.immitis |
| 2 | отсутствует | собака не инфицирована |
| 3 | имеется | собака инфицирована D.immitis |
Предлагаемым способом достигается положительный эффект:
увеличение чувствительности, точности сокращение времени, необходимого для постановки диагноза дирофиляриоза собак при одновременной простоте и доступности предлагаемого способа для широкого применения за счет использования комплекса антигенов гельминтов. Проведение этого исследования расширит возможности установления этиологии инфекционного процесса различной локализации.
Предлагаемый способ может быть использован в фундаментальной и практической ветеринарии для определения инфицированности животных D.immitis.
Способ определения зараженности собак Dirofilaria immitis, заключающийся в получении комплекса антигенов гельминта путем приготовления экстракта из выделенных от погибших собак самцов Dirofilaria immitis и взрослых самок Dirofilaria immitis с микрофилариями, доведения концентрации белка в экстракте до 15 г/л методом диализа и постановке реакции преципитации в агаровом геле между комплексом антигенов гельминта и исследуемой сывороткой животного.
