Способ получения иммуноглобулинового препарата

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения иммуноглобулинового препарата. Сущность изобретения включает стадию экстракции осадка Б (III фракции по Кону) физиологическим раствором, удаления балластных примесей сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С и выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений. Преимущество изобретения заключается в исключении из технологического цикла токсичного реагента, повышении выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов, выделяемых экстракцией из осадка Б (III фракции по Кону) солями металлов.

Известен способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата для энтерального применения, включающий экстракцию спиртового осадка Б ((III фракции Кона) хлороформом в концентрации 10% в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия с последующим осаждением фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (RU, патент 2084229 C1, А61К 35/14, 20.07.1997).

Основным недостатком этого изобретения является то, что длительная обработка хлороформом приводит к потерям эффекторных функций иммуноглобулинов, их полимеризации и снижению титра антител в продукте.

Наиболее близким по своей сути к заявляемому является способ получения иммуноглобулинового препарата, в соответствии с которым осадок Б экстрагируют в десятикратном объеме 0,9% раствора хлорида натрия при комнатной температуре и постоянном перемешивании 0,1-3,0% хлороформом, удаляют балластные примеси центрифугированием, обрабатывают фракции иммуноглобулинов сульфатом меди с конечной концентрацией 0,1-2,0% при рН раствора 6-8, раствор центрифугируют и обрабатывают раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в концентрации 0,2-1,0%, диализируют и концентрируют методом ультрафильтрации до концентрации белка 6%, стабилизируют, подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и высушивают сублимацией (RU, патент 2189833 С2, А61К 39/395, 35/16, 27.09.2002).

Основным недостатком прототипа является использование хлороформа для связывания липидов, что малоэффективно, и больших концентраций сульфата меди для осаждения липопротеидов, что приводит к снижению выхода выделяемых из осадка Б иммуноглобулинов.

В основу заявляемого изобретения положена задача исключения из технологического цикла токсичного реагента, повышения выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.

Задача решена тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.

В результате проведенных исследований нами впервые показано, что высокой степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей (балластных белков, липопротеидов, липидов) можно добиться, создав такие условия проведения реакции, когда с реагентом будут взаимодействовать только примеси, находящиеся в растворе. Это реализуется при сочетании следующих факторов: реагент - сульфат меди в концентрации 0,003-0,03%, рН проведения реакции 4,9-5,1 и температура смеси 0-5°С. При таком сочетании факторов сульфат меди реагирует только с примесными белками и липопротеидами, а рН и температура раствора способствуют выделению липидов. Кроме того, рН раствора создает условия попадания примесных белков в изоэлектрическую точку, что приводит к их коагуляции, которая усиливается взаимодействием этих белков с ионами меди.

Таким образом, указанное сочетание факторов обеспечивает высокую степень очистки иммуноглобулинового раствора от примесей, что позволило отказаться от использования токсичного реагента - хлороформа.

Применение сульфата меди в концентрации менее 0,003%, так же как изменение рН и температуры реакции, ведет к ухудшению степени очистки растворов иммуноглобулинов от примесей, а превышение концентрации более 0,03% приводит к снижению выхода иммуноглобулинов из осадка Б.

В результате проведенных исследований впервые показана возможность выделения 50-99% иммуноглобулинов из раствора осадка Б посредством осаждения примесных белков и липидов сульфатом меди без использования токсичного реагента - хлороформа.

Согласно изобретению исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей обеспечивается тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.

Заявляемый способ получения иммуноглобулинового препарата является новым и в литературе не описан.

Техническим результатом заявляемого изобретения является исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей.

Преимущества предлагаемого способа получения иммуноглобулинового препарата доказаны результатами экспериментальных исследований. Содержание иммуноглобулинов определяли в реакции преципитации и методом радиальной иммунодиффузии по методическим рекомендациям Чернохвостовой Е.В. с соавт., 1984. Содержание балластных примесей определяли на биохимическом анализаторе Cobas Integra 400+ по методикам разработчика, а содержание общих липидов - с помощью «Bio-la-test» Lachema. Гравитационное осаждение примесей осуществляли в центрифугах MLW T24D. Ультафильтрацию - на установке с полыми волокнами или фильтрационной установке Millipore.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих исключение из технологического цикла токсичного реагента, повышение выхода выделяемых иммуноглобулинов и степени очистки препарата от примесей при использовании заявляемого способа.

Пример 1

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,03 мг/мл (0,003%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,1. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Пример 2

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,3 мг/мл (0,03%). При этом рН суспензии снижался до 4,8-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Пример 3

Осадок Б, содержащий иммуноглобулины в количестве 11,9 мг/мл и примесные белки - 11,7 мг/мл, гомогенизировали в 0,85% растворе натрия хлорида с рН 7,0 в соотношении 1:10. Нерастворимые примеси удаляли методом гравитационного осаждения на центрифугах. Из белкового раствора при рН 5,2-5,3 иммуноглобулиновую фракцию выделяли введением приготовленного ранее раствора сульфата меди при постоянном перемешивании до конечной концентрации 0,115 мг/мл (0,0115%). При этом рН суспензии снижался до 4,9-5,0. Суспензию перемешивали в течение 15 мин и удаляли образующийся нерастворимый осадок примесей гравитационным осаждением. В полученный супернатант, представляющий собой иммуноглобулиновую фракцию, при перемешивании вводили 0,1 М ЭДТА с рН 6,2 в количестве 10% по объему. Перемешивание осуществляли до прекращения изменения цвета раствора (1-5 мин), что характеризовало полное связывание ЭДТА не прореагировавших с примесями ионов меди. Раствор концентрировали ультрафильтрацией до содержания белка 6% и анализировали. При необходимости подвергали осветляющей и стерилизующей фильтрации и обезвоживанию. Результаты представлены в таблице.

Таблица
Характеристики Значения характеристик для
прототипа заявляемого способа при концентрации сульфата меди, %
осадок Б препарат осадок Б 0,003 0,0115 0,03
Общий белок, мг/мл 35,4 56,0 23,6 60,0 67,0 56,0
Общие Ig, мг/мл 16,9 54,9 11,9 58,5 65,0 54,0
Содержание IgG, IgA, IgM, % 39;35;26 60;23;17 59,28,13 59,25,16 64;24;12 62;24;14
Примесные белки, мг/мл 18,5 1,1 11,7 1,5 2,0 1,0
Доля примесей, % 52,0 1,8 49,6 1,9 1,7 3,0
Альбумин, мг/мл 17,5 1,0 10,8 1,4 1,8 1,0
Трансферрин, мг/мл 0,1 0,1 0,13 0,1 0,1 0,1
Церулоплазмин, мг/м 0,2 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1
Холестерол, мг/мл 1,68 0,7 1,5 0,5 0,5 0,2
Триглицериды, мг/мл 1,3 0,3 1,6 0,3 0,3 0,1
Общие липиды, мг/мл 2,07 1,04 2,90 1,04 0,90 0,5
Выход иммуноглобулинов, % - 15 - 97 64 54

Предлагаемый способ позволяет исключить из технологического цикла токсичный реагент, повысить выход выделяемых иммуноглобулинов и степень очистки препарата от примесей при одинаковой производительности с прототипом.

Способ получения иммуноглобулинового препарата, включающий стадии экстракции осадка Б (III фракции по Кону), удаления балластных примесей, выделения целевого продукта методом ультрафильтрации в присутствии комплексообразующих соединений, отличающийся тем, что удаление балластных примесей осуществляют сульфатом меди в концентрации 0,003-0,03% при величине рН 4,9-5,1 и температуре 0-5°С.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к новой твердой фармацевтической композиции телитромицина. .
Изобретение относится к области гигиены, а именно к моющим средствам для ухода за кожей. .

Изобретение относится к области генетической инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для блокирования хронических интеграционных инфекций, вызываемых вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом лейкоза крупного рогатого скота (BLV), вирусом иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), вирусом лейкоза мышей (MuLV), вирусом инфекционной анемии лошадей (EIA) и вирусом гепатита В.
Изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственной композиции в форме геля для наружного применения, обладающего противовоспалительным и противоаллергическим действием.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолей, экспрессирующих антиген G250. .
Изобретение относится к медицине, а более конкретно - к офтальмологии, и предназначено для хирургического лечения неоваскуляризации роговицы. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и представляет собой фармацевтическую композицию для лечения ревматоидного артрита, включающую антитело к рецептору интерлейкина-6 и метотрексат.
Изобретение относится к офтальмологии и может быть использовано для хирургического лечения субретинальных кровоизлияний на фоне возрастной макулодистрофии с субретинальной неоваскулярной мембраной.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается полипептидов антител, которые моновалентно связывают CD40L. .

Изобретение относится к области ветеринарии. .
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается способа получения иммуноглобулиновых препаратов
Наверх