Способ получения биологически активной добавки

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве биологически активных добавок. Способ предусматривает следующее. Готовят водную суспензию клеток дрожжей. Инактивируют эндогенные ферменты клеток дрожжей путем термической обработки клеток дрожжей при температуре 85-95°С и выдерживанием в течение 15-20 минут. После чего полученную суспензию охлаждают до температуры 54-56°С. Затем осуществляют двухстадийную обработку полученной суспензии экзогенными ферментами. На первой стадии обработку водной суспензии клеток дрожжей осуществляют путем добавления к водной суспензии клеток дрожжей ферментных препаратов Целловиридина и Протосубтилина в течение 1 ч 45 мин - 2 ч 15 мин при температуре 54-56°С, естественном рН и постоянном перемешивании. Полученную на первой стадии суспензию охлаждают до температуры 44-46°С. После чего охлажденную суспензию подвергают обработке культуральной жидкостью штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F - 931, либо концентрированным ферментным препаратом, полученным из культуральной жидкости вышеупомянутого микромицета. С добавлением ферментного препарата Целловиридина, при температуре 44-46°С, естественном рН и постоянном перемешивании в течение 3 ч 45 мин - 4 ч 15 мин. После чего инактивируют экзогенные ферменты нагреванием смеси до температуры 85-95°С и выдерживанием в течение 15-20 минут. Изобретение позволяет повысить качество биологически активной добавки. 1 табл.

 

Изобретение относится к пищевой промышленности, к биотехнологии и может быть использовано при производстве биологически активных добавок.

Известен способ получения белоксодержащей биологически активной добавки, предусматривающий обработку биомассы клеток дрожжей экзогенными гидролитическими ферментами (Патент РФ №2230466, кл. A23L 1/30, опубл. 2004 г.) /1/.

Однако в данном известном способе не описаны условия обработки клеток дрожжей гидролитическими ферментами, не раскрыт состав используемого ферментного препарата, что не позволяет воспроизвести этот известный способ в части осуществления процесса ферментолиза.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является известный способ получения продукта обработки клеток дрожжей композицией гидролитических ферментов (Патент РФ №2104300, кл. C12N 1/06, A23L 1/28, опубл. 1998 г.) /2/.

Однако качество целевого продукта, получаемого этим известным способом, недостаточно высокое.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является повышение выхода целевого продукта, улучшение его качества, а также возможность получения широкого спектра биологически активных добавок пищевого и функционального назначения за счет регулирования глубины гидролиза полимеров клеток дрожжей с образованием биологически активных легко усваиваемых продуктов ферментолиза.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения биологически активной добавки заключается в осуществлении двухстадийной обработки клеток дрожжей экзогенными ферментами, катализирующими гидролиз клеточных полимеров, при этом на первой стадии используют ферменты, катализирующие гидролиз полимеров клеточной стенки, с получением продуктов их гидролиза в смеси с освободившейся из клеток цитоплазмой, а на второй стадии используют ферменты, катализирующие гидролиз полимеров этой смеси, с получением целевого продукта в виде смеси биологически активных легкоусваиваемых продуктов их гидролиза. При этом на второй стадии гидролиза возможно регулирование глубины гидролиза полимеров клеток дрожжей варьированием условий обработки, за счет чего расширяется спектр применения получаемых биологически активных добавок.

Способ согласно изобретению предусматривает приготовление водной суспензии клеток дрожжей, инактивирование эндогенных ферментов клеток дрожжей путем термической обработки при температуре 85-95 град. С в течение 15-20 минут. Полученная смесь имеет естественный рН 5,8-6,0. Далее ее охлаждают до температуры 54-56 град. С и осуществляют двухстадийный ферментативный гидролиз всех полимеров клеток дрожжей экзогенными ферментами с получением смеси биологически активных легкоусваиваемых продуктов гидролиза.

На первой стадии ферментативного гидролиза целесообразно использовать ферменты эндо-бета-глюканазу и экзо-бета-глюканазу, источником которых является ферментный препарат Целловиридин, катализирующие гидролиз основного полимера клеточной стенки дрожжей бета-глюкана с получением продуктов его ферментативного гидролиза, а также ферменты протеиназы и пептидазы, источником которых является ферментный препарат Протосубтилин, катализирующие гидролиз по пептидным связям белково-бета-глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров. Это позволяет получить биологически активные продукты ферментативного гидролиза бета-глюкана, расщепить упомянутые белковые комплексы на белок и соответственно бета-глюкан, маннан и хитин, а также высвободить цитоплазму клеток дрожжей - как результат разрушения полимеров их стенок. Процесс гидролиза на первой стадии осуществляется при естественном рН в течение 1 ч 45 мин - 2 ч 15 мин при температуре 54-56 град. С и постоянном перемешивании. После завершения первой стадии гидролиза полученная смесь содержит продукты гидролиза бета-глюкана, высвободившиеся белки цитоплазмы клеток дрожжей, белки, образующиеся в результате ферментативного гидролиза по пептидным связям белково-бета-глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров, а также освободившиеся из белковых комплексов бета-глюкан, маннан и хитин.

Полученную после первой стадии гидролиза смесь полимеров охлаждают до температуры 44-46 град. С и осуществляют вторую стадию ферментативного гидролиза. На второй стадии используют набор ферментов, катализирующих гидролиз белков цитоплазмы и белков клеточной оболочки, освободившихся из белковых комплексов полимеров бета-глюкана, маннана и хитина, с получением смеси растворимых белков, низкомолекулярных пептидов, аминокислот и продуктов ферментативного гидролиза бета-глюкана, маннана и хитина. В качестве источника комплекса вышеуказанных ферментов используют культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931, содержащую высокоактивный комплекс протеиназ и пептидаз, экзо-бета-глюканазу, эндо-бета-глюканазу, а также маннаназу и хитиназу, либо концентрированный ферментный препарат, полученный из культуральной жидкости. Для осуществления более глубокого гидролиза содержание экзо-бета-глюканаз и эндо-бета-глюканаз увеличивают добавлением ферментного препарата Целловиридина. Ферментолиз осуществляют при естественном рН при температуре 44-46 град. С в течение 3 ч 45 мин - 4 ч 15 мин при постоянном перемешивании.

Условия проведения второй стадии ферментативного гидролиза можно варьировать с целью регулирования глубины гидролиза белков и получения при менее продолжительном процессе гидролиза биологически активной добавки, содержащей растворимые белки, низкомолекулярные пептиды, аминокислоты и редуцирующие вещества (углеводы), продукты глубокого гидролиза бета-глюкана, маннана и хитина, а при более продолжительном процессе гидролиза - в течение 5-6 ч, но при более низкой температуре 35-37 град. С, осуществлять более глубокий гидролиз белков до свободных аминокислот, увеличивая их содержание в конечном продукте. Это дает возможность применения биологически активной добавки как лечебно-профилактической.

По окончании гидролиза гидролизат нагревают до температуры 85-95 град. С и выдерживают при этой температуре в течение 15-20 мин для инактивации экзогенных ферментов, а затем высушивают на распылительной сушилке.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Готовят водную суспензию из 100 г сухих пекарных дрожжей и 250 мл воды. Смесь тщательно перемешивают. Для инактивации эндогенных ферментов клеток дрожжей приготовленную суспензию нагревают до температуры 95 град. С и выдерживают при этой температуры в течение 15 мин, после чего смесь охлаждают до температуры 54 град. С. Смесь имеет естественный рН - 5,8. В нее задают ферментный препарат Целловиридин в количестве 10,0 ед. бета-ГкС на 1 г сухих дрожжей как источник смеси экзо-бета-глюканаз и эндо-бета-глюканаз, катализирующих ферментативный гидролиз бета-глюкана, и ферментный препарат Протосубтилин из расчета 5,0 ед. ПС на 1 г сухих дрожжей как источник протеиназ и пептидаз, катализирующих гидролиз по пептидным связям белково-бета-глюканового, белково-маннанового и белково-хитинового полимеров. Активность в препарате Целловиридина 1000 ед. бета-ГкС на 1 г препарата, активность в препарате Протосубтилина 269 ед. ПС на 1 г препарата. Ферментативный гидролиз полимеров на первой стадии проводят при естественном рН в течение 2 ч 15 мин при температуре 54 град. С при постоянном перемешивании.

После завершения первой стадии ферментативного гидролиза суспензию, обработанную ферментами на первой стадии, охлаждают до температуры 44 град. С и осуществляют вторую стадию ферментативного гидролиза, используя культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931, полученную при его культивировании на питательной среде, содержащей, %: ячменную муку - 4,0; пшеничные отруби - 2,0; КН₂РO₄ - 1,0; воду водопроводную - остальное. Штамм культивирован в аэробных условиях при температуре 32 град. С в течение 42 ч. Культуральная жидкость содержит высокоактивный комплекс протеиназ и пептидаз с активностью 30 ед. ПС на 1 мл культуральной жидкости, смесь экзо-бета-глюканазы и эндо-бета-глюканазы с активностью 4,5 ед. бета-ГкС на 1 мл, а также маннаназу и хитиназу. Культуральную жидкость штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-931 дозируют из расчета 20 ед. ПС на 1 г сухих дрожжей (67 мл культуральной жидкости), доводят активность бета-глюканаз до 100 ед. бета-ГкС на 1 г сухих дрожжей добавлением ферментного препарата Целловиридина и проводят ферментолиз дрожжевой суспензии при естественном рН в течение 4 ч при температуре 44 град. С и постоянном перемешивании.

Об окончании процесса ферментолиза судят по нарастанию концентраций аминного азота и растворимых сухих веществ в супернатанте обрабатываемой суспензии клеток дрожжей. Полученный гидролизат пастеризуют - нагревают до температуры 85 град. С и выдерживают при этой температуре в течение 20 мин для инактивации экзогенных ферментов, затем его высушивают на распылительной сушилке. В полученном гидролизате концентрация аминного азота составляет 4,1%, концентрация редуцирующих веществ (углеводов) - 22,9%, выход гидролизата составляет 92%. Высушенный препарат, выделенный из полученного ферментолизата, содержит растворимые белки, низкомолекулярные пептиды, аминокислоты и биологически активные продукты гидролиза полимеров клеточных стенок. Полученная биологически активная добавка может быть использована в качестве белково-аминокислотного обогатителя пищи.

Пример 2. Получен гидролизат по методике примера 1. Затем после завершения второй стадии ферментолиза снижают температуру обработанной смеси до 35 град. С и продолжают ферментолиз, выдерживая смесь при этой температуре в течение 6 часов. По окончании инактивируют экзогенные ферменты, нагревая смесь до температуры 85 град. С и выдерживая ее при этой температуре в течение 20 мин. Полученный гидролизат сушат на распылительной сушилке. Концентрация аминного азота в полученном гидролизате составляет 6,3%, концентрация редуцирующих веществ - 30,9%, выход составляет 95%. Белковые вещества в гидролизате представлены в основном в виде аминокислот в свободной форме - 65% от общего количества и низкомолекулярных пептидов с молекулярной массой ниже 1,5 кДа - 20%. Полученный препарат был использован как пищевая добавка, а также как биологически активная лечебно-профилактическая добавка функционального назначения.

Показатели гидролизата	По первому примеру	По второму примеру
Концентрация аминного азота, %	4,1	6,3
Концентрация редуцирующих веществ, %	22,9	30,9
Выход гидролизата	92	95
Содержание аминокислот в свободной форме и низкомолекулярных пептидов, % от общего количества в белке		65 - аминокислоты 20 - пептиды с М.М. 1,5 кДа

Препарат исследован на токсичность и медико-биологическую активность. Исследования показали отсутствие токсичности.

Опытные партии разработанной и полученной по примеру 2 биологически активной добавки функционального назначения прошли клинические испытания, подтвердившие ее высокую биологическую ценность для усиления иммунитета и функциональной выносливости организма человека, для повышения сопротивляемости заболеваниям, полученным вследствие неправильного питания.

Биологически активная добавка, полученная по методике примера 2 на основе регулируемого ферментативного гидролиза полимеров клеток дрожжей, характеризуется высоким содержанием аминокислот в свободной форме, активных низкомолекулярных пептидов и углеводов, а также отсутствием горьких пептидов. Проведенные клинические испытания показали эффективность ее использования в качестве лечебно-профилактической добавки в питании больных, страдающих нарушениями обмена веществ и работы желудочно-кишечного тракта, больных в постоперационный период, а также для больных псориазом и атопическим дерматитом.

Установлено, что ферментолизаты клеток дрожжей с высокой степенью гидролиза полимеров клеток обладают также антиоксидантными свойствами, влияя на степень оксидативного стресса организма в условиях бета-облучения, а также проявляют селективную токсичность по отношению к онкоклеткам, не оказывая при этом токсического воздействия на нормальные фибробластомы человека.

Результаты испытаний у детей с нарушениями противоинфекционной защиты подтвердили высокую биологическую ценность биологически активной добавки для повышения иммунного статуса и функциональной выносливости организма, улучшения обменных процессов.

Биологически активная добавка, полученная способом согласно изобретению, рекомендована детям и взрослым, длительно болеющим, имеющим очаги хронической инфекции, со сниженными показателями сопротивляемости организма, а также вследствие каких-либо причин не получающих необходимого количества полноценного белка, витаминов и микроэлементов с пищей.

Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получать высококачественные биологически активные добавки как пищевого, так и лечебно-профилактического назначения.

1. Способ получения биологически активной добавки, предусматривающий приготовление водной суспензии клеток дрожжей, инактивирование эндогенных ферментов клеток дрожжей путем их термической обработки при температуре 85-95°С и выдерживания при этой температуре в течение 15-20 мин, охлаждение до температуры 54-56°С, двухстадийную обработку суспензии экзогенными ферментами: на первой стадии - ферментными препаратами Целловиридином как источником экзо-бета-глюканаз и эндо-бета-глюканаз и Протосубтилином как источником протеиназ в течение 1 ч 45 мин - 2 ч 15 мин, при этой температуре, естественном рН и постоянном перемешивании, на второй стадии после охлаждения полученной смеси до температуры 44-46°С обработку ее культуральной жидкостью штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F- 931 либо концентрированным ферментным препаратом, полученным из культуральной жидкости, содержащим комплекс протеиназ, пептидаз, экзо-бета-глюканаз, эндо-бета-глюканаз, маннаназу и хитиназу, с добавлением ферментного препарата Целловиридина, при этой температуре, естественном рН и постоянном перемешивании в течение 3 ч 45 мин - 4 ч 15 мин инактивирование экзогенных ферментов нагреванием смеси до температуры 85-95°С и выдерживанием ее при этой температуре в течение 15-20 мин.

2. Способ по п.1 отличающийся тем, что дополнительно по завершении второй стадии ферментативного гидролиза полученную смесь охлаждают до температуры 35-37°С и продолжают гидролиз при этой температуре в течение 5-6 ч.