Способ определения токсичности почв
Владельцы патента RU 2375714:
Ботанический сад Уральского отделения Российской академии наук (статус государственного учреждения) (RU)
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Уральский государственный лесотехнический университет" (RU)
Изобретение относится к области сельского хозяйства и почвоведения. В способе облучают возбуждающим светом клеток водоросли хлореллы в присутствии анализируемых токсических веществ и измеряют интенсивность замедленной флуоресценции. Облучение и измерение замедленной флуоресценции проводят в водной почвенной суспензии, после биотестирования и экспозиции в темноте в течение 30 минут. При этом определяют коэффициент токсичности исследуемой почвы, сравнивают его с коэффициентом токсичности условно-чистой почвы. По величине коэффициента относительной токсичности, характеризующего уровень воздействия почвы на хлореллу, определяют фитотоксичность почвы. Способ позволяет повысить чувствительность метода, достоверность оценки и сравнения фитотоксичности почв. 2 ил., 4 табл.
Изобретение относится к охране окружающей среды, в частности к методам исследования и определения фитотоксичности почв, и может быть использовано в природоохранной деятельности, сельском хозяйстве и.т.д.
Известна методика определения острой токсичности водных вытяжек из почвы, включающая регистрацию снижения уровня флуоресценции хлорофилла зеленых протококковых водорослей Scenedesmus quadricauda (Тигр.) Breb под воздействием токсических веществ, присутствующих в водной вытяжке из почвы по сравнению с контрольной культурой в пробах, не содержащих токсических веществ. Критерием острой токсичности является подавление уровня флуоресценции хлорофилла водорослей на 50% и более по сравнению с контролем в течение 96-часовой экспозиции (Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей. ФР. 1.39.2001.00284).
Недостатком данной методики является большая трудоемкость и длительность ее проведения.
Известен способ определения содержания фитотоксических веществ в водных и иных растворах, включающий облучение возбуждающим светом клеток водоросли хлореллы в присутствии анализируемого токсичного вещества, и измерение интенсивности фотоиндуцированной замедленной флуоресценции водоросли в миллисекундном интервале затухания под действием токсичного вещества. При этом интенсивность замедленной флуоресценции измеряют в индукционных максимумах после включения возбуждающего света сначала высокой (50-100 Вт/м2), а затем низкой (5-10 Вт/м2) интенсивности. В качестве показателя фитотоксичности используют отношение регистрируемых величин замедленной флуоресценции в указанных условиях, пронормированных к контрольной пробе водоросли, не содержащей токсиканта (патент RU 2069851 С1, опубл. 27.11.1996) - прототип.
Недостатком данного способа является малая чувствительность и низкий уровень адекватности результатов реальным условиям, поскольку полученная информация характеризует токсичность водной вытяжки, которая может существенно отличаться от токсичности почвы, обусловленной действием всего комплекса присутствующих в ней загрязняющих веществ, а не только водорастворимых соединений.
Технической задачей заявленного изобретения является повышение чувствительности метода и достоверности оценки и сравнения фитотоксичности почв.
Техническая задача достигается тем, что в способе определения фитотоксичности почв облучают возбуждающим светом клетки водоросли хлореллы в присутствии анализируемых токсических веществ и измеряют интенсивность замедленной флуоресценции. Облучение и измерение замедленной флуоресценции проводят в водной почвенной суспензии после биотестирования и экспозиции в темноте в течение 30 минут, при этом определяют коэффициент токсичности исследуемой почвы, сравнивают его с коэффициентом токсичности условно-чистой почвы и по величине коэффициента относительной токсичности, характеризующего уровень воздействия почвы на хлореллу, определяют фитотоксичность почвы.
Для определения фитотоксичности используют водную почвенную суспензию с размером почвенных частиц >0,315 мм и выдержанную в течение 2-х часов при температуре 90°С. После внесения клеток водоросли в почвенную суспензию проводится биотестирование продолжительностью 2 часа при температуре 28-30°С и освещенности 75-80 Вт/м2 с последующей экспозицией 20-30 минут. Уровень воздействия почвы на хлореллу количественно выражается величиной коэффициента относительной токсичности (Кот). Для этого полученные значения коэффициентов токсичности Кт исследуемой почвы нормируются по отношению к условно-чистой почве. (см. табл.1 и 2)
Таблица 1
| Влияние освещенности и времени биотестирования на Кт (температура 28-30°С) | |||
| Освещенность, Вт/м2 | Время биотестирования | ||
| 1 час | 2 часа | 3 часа | |
| 65 | -0,097 | -0,137 | -0,331 |
| 80 | -0,231 | -0,525 | -0,768 |
Таблица 2
| Влияние температуры биотестирования на Кт (освещенность 80 Вт/м2) | |||
| образец | Температура, °С | ||
| 26 | 29 | 36 | |
| Почва 1 | -0,470 | -0,469 | -0,213 |
| Почва 2 | -0,541 | -0,616 | -0,306 |
| Почва 3 | -0,653 | -0,734 | -0,401 |
Водные экстракты почв не оказывают заметного влияния на параметры ЗФ хлореллы, регистрируемые коэффициенты токсичности колеблются в пределах 0-0,05. Токсический эффект начинает проявляться при работе с водной почвенной суспензией. При непосредственном контакте хлореллы с частицами почвы проявляется действие нерастворимых форм загрязняющих веществ, в частности тяжелых металлов, большая часть которых связана с почвенными компонентами.
Температурная обработка почвенных суспензий перед добавлением тест-объекта усиливает эффект воздействия. Это связано как с увеличением степени извлечения токсичных элементов в водную фазу, так и с разрушением структуры почвенных частиц, что увеличивает поверхность соприкосновения с хлореллой. Повышению чувствительности хлореллы на действие токсиканта способствует уменьшение размера почвенных частиц, поскольку этот фактор, как и температурная обработка, увеличивает площадь контакта водоросли с почвой, а также полноту и скорость экстракции. Были исследованы почвенные фракции с размером частиц меньше 1 мм; 0.385-0.315 мм и меньше 0.315 мм. Установлено, что наибольшее влияние на параметры ЗФ хлореллы оказывают водные суспензии фракции меньше 0.315 мм. Величины коэффициента токсичности водных суспензий фракции 0.385-0.315 мм и меньше 0.315 мм составили соответственно -0.520 и -0.917.
Таблица 3
| Влияние температурной обработки почвенной суспензии на величину Кт | ||
| Образец | Условия экстракции | |
| 3 часа при 80° С | 2 часа при 90°С | |
| Почва 1 | -0,246 | -0,222 |
| Почва 2 | -0,314 | -0,302 |
| Почва 3 | -0,394 | -0,427 |
Для получения максимально объективного сравнения фитотоксичности почв необходимо, чтобы все пробы тест-культуры были взяты из одной суспензии, что при анализе большого количества образцов невыполнимо. Введение почвы в контрольную пробу, относительно которой производится расчет коэффициентов токсичности, не дало удовлетворительных результатов, поскольку при этом снижался уровень и уменьшался интервал варьирования получаемых коэффициентов токсичности почв с разной степенью загрязненности. Поэтому в качестве "внутреннего стандарта" вводится условно-чистая почва, относительно которой рассчитывается уровень воздействия той или иной почвы на хлореллу и производится их сравнение, что количественно выражается величиной коэффициента относительной токсичности.
Заявляемая совокупность признаков не была выявлена в результате проведения патентно-информационных исследований, поэтому заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Сравнение заявляемого решения с прототипом показывает, что оно также соответствует критерию «новизна».
Заявляемый способ реализован авторами изобретения и может быть использован в различных сферах, связанных с исследованиями почв, поэтому он соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ осуществляется следующим образом
Навеску почвы фракции <0,315 мм помещают в стеклянные флаконы объемом 10 мл, добавляют 2 мл дистиллированной воды, тщательно размешивают с помощью стеклянной лопаточки, закрывают пробками и выдерживают 2 часа в сушильном шкафу при температуре 90°С, несколько раз перемешивая содержимое флаконов встряхиванием. Объем почвенной суспензии, а следовательно, и величины навески исследуемой почвы и объем водной фазы определяются размером кювет регистрирующего прибора. В результате проведенных исследований показано, что количество почвы в 50-100 мг и 2 мл воды обеспечивает оптимальное соотношение твердой и жидкой фаз при экстракции и позволяет выявить различие почв по их воздействию на флуоресцентные характеристики хлореллы.
Затем к охлажденным до комнатной температуры почвенным суспензиям добавляют 3 мл водной суспензии хлореллы с оптической плотностью 0,54-0,56. После выдерживания смеси в фитотестере в течение 2 часов при освещенности 80 Вт/м2 и температуре 29°С содержимое флаконов тщательно перемешивают встряхиванием и переносят в кюветы фитотоксиметра. Возможен вариант осторожной декантации. Затем дают 30-минутную выдержку в темноте. Облучение клеток водоросли с анализируемой почвенной суспензией и измерение интенсивности фотоиндуцированной замедленной флуоресценции водоросли в миллисекундном интервале затухания под действием токсических веществ почвенной суспензии проводится в фитотоксиметре Фотон7-1 (разработчик и изготовитель КрасГУ).
Серия опыта состояла из 11 определений, два из которых - контрольные (суспензия хлореллы и вода, прошедшая ту же термообработку, что и почвенная суспензия), три -хлорелла в суспензии 100 мг "внутреннего стандарта", шесть - хлорелла в суспензии, содержащей две разные навески исследуемой почвы (по три повторности каждой). Количество определений в серии определялось особенностями конструкции фитотоксиметра. По каждой из трех повторностей рассчитывалось среднее значение коэффициента токсичности относительно хлореллы. Для определения относительной токсичности исследуемой почвы строится график зависимости Кт от логарифма массы почвы (прямая линия 1, рис.1).
Значение Кт "внутреннего стандарта" выражается прямой, параллельной оси абсцисс (прямая линия 2). По абсциссе точки пересечения прямых линий находят массу исследуемой почвы, оказывающую такой же эффект, как масса "внутреннего стандарта" (так называемую приведенную массу). Отношение массы "внутреннего стандарта" к приведенной массе будет выражать коэффициент относительной токсичности почвы - Кот. Чем больше эта величина, тем более значительное влияние на хлореллу оказывает опытная почва по сравнению с условно-чистой почвой.
, где m - масса "внутреннего стандарта", мг;
mx - приведенная масса, мг.
Корректность такого подхода к определению коэффициента относительной токсичности основывается на линейном характере зависимости величины Кт от логарифма массы почвы (Рис.2).
Методика была апробирована на почвах с известным содержанием приоритетных техногенных элементов: меди, кадмия, цинка и свинца. В качестве «внутреннего стандарта» используют фоновую почву. Анализ результатов определения коэффициентов относительной токсичности почв, представленных в таблице 4, показывает, что сильнозагрязненные почвы обладают более высокой фитотоксичностью.
Таблица 4
| Содержание металлов и коэффициенты относительной токсичности почв | ||||||
| Почва | Cu (мг/кг) | Cd (мг/кг) | Zn (мг/кг) | Pb (мг/кг) | Кот (m±Δm) | Коэф. вариации, % |
| Фоновая почва | 25,19 | 0,65 | 32,91 | 32,46 | - | - |
| Образец 1 | 714,57 | 10,30 | 564,29 | 173,91 | 2,13±0,07 | 5,7 |
| Образец 2 | 89,62 | 1,31 | 71,45 | 36,66 | 1,33±0,03 | 4,9 |
| ПДК в почве | 66,0 | 1,0 | 110,0 | 65 | - | - |
Таким образом, заявляемое изобретение за счет использования водной почвенной суспензии, совокупности условий ее подготовки (размер почвенных частиц, температура, время), условий биотестирования клеток хлореллы (время, температура, освещенность, контакт с почвенными частицами) увеличивает чувствительность известного способа, позволяет определять фитотоксичность почв разной степени загрязнения и получать результаты, адекватные реальным условиям. Введение в качестве "внутреннего стандарта" условно-чистой почвы, относительно которой рассчитывается уровень воздействия той или иной почвы на хлореллу, что количественно выражается величиной коэффициента относительной токсичности, дает возможность максимально объективного сравнения фитотоксичности почв при анализе большого количества образцов.
Способ определения фитотоксичности почв, включающий облучение возбуждающим светом клеток водоросли хлореллы в присутствии анализируемых токсических веществ и измерение интенсивности замедленной флуоресценции, отличающийся тем, что облучение и измерение замедленной флуоресценции проводят в водной почвенной суспензии после биотестирования и экспозиции в темноте в течение 30 мин, при этом определяют коэффициент токсичности исследуемой почвы, сравнивают его с коэффициентом токсичности условно-чистой почвы и по величине коэффициента относительной токсичности, характеризующего уровень воздействия почвы на хлореллу, определяют фитотоксичность почвы.
