Способ размножения анаэробных клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов и автономный переносной биореактор разового применения

Изобретение относится к биотехнологии. Предложенный способ предусматривает подачу инокулята в анаэробную камеру инокуляции, подачу среды выращивания в анаэробную камеру размножения, отделенную от камеры инокуляции разделительным средством. Инокулят и неинокулированную среду выращивания хранят раздельно. Открывают разделительное средство для введения инокулята в камеру размножения. Выращивают культуры в анаэробных условиях и отбирают выращенную культуру из камеры размножения. Все процессы проводят в герметичных камерах при сохранении условий анаэробиоза в них при сообщении камер, а также в анаэробных и асептических условиях. Камеру размножения и разделительное средство перед размножением культуры стерилизуют. Предложенный биореактор включает, по меньшей мере, одну анаэробную герметичную камеру выращивания, по меньшей мере, одну анаэробную герметичную камеру инокуляции с инокулятом, имеющую горловину, закрытую разделительным средством в виде перегородки. Камеры соединены при помощи трубки с расположенным в ней шипом для прокалывания перегородки и образования прохода для инокулята в камеру выращивания. Горловина камеры инокуляции соединена с концом трубки при помощи резьбового соединения для перемещения ее к шипу и прокалывания перегородки. Камера выращивания снабжена трубкой для отбора выращенной культуры. Изобретение обеспечивает получение размножений культуры с высокой жизнеспособностью, предотвращена возможность нарушения анаэробного режима в процессе инокуляции, обеспечен продолжительный срок хранения инокулята и среды выращивания культуры, а также создано удобство доставки биореактора к месту использования. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к автономному переносному биореактору разового применения и способу размножения и доставки клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов.

Уровень техники

В патенте Южной Африки №99/5408 описывается биореактор, включающий переносной прозрачный растяжимый пакет разового применения с входным отверстием, которое герметично запечатывается. Конструкция биореактора в предпочтительном варианте похожа или аналогична конструкции инфузионного мешка. Это изобретение может работать в экспериментальных условиях, однако оно неэффективно для промышленного размножения микроорганизмов и доставки, особенно при использовании его начинающими конечными пользователями, которые не обладают достаточными знаниями или не имеют доступа к лабораторным приборам и оборудованию, из-за необходимости:

- введения подходящей стерильной среды;

- инокуляции этой среды подходящими микроорганизмами;

- потребности в отдельном устройстве для доставки.

Для начинающего промышленного конечного пользователя чрезвычайно трудно будет вводить стерильную среду и проводить ее инокуляцию без риска заражения биореактора нежелательными микроорганизмами или материалами.

Другим недостатком известного биореактора является то, что он не исключает опасности введения неподходящей среды или микроорганизмов либо риска контаминации, поскольку указанный реактор не является закрытой системой для размножения. Более того, в этом изобретении нет упоминания того, что сам биореактор может использоваться в качестве устройства для доставки. Инокуляция пакета микроорганизмами в строго анаэробных условиях также связана с большими трудностями.

В патенте США №6245555 описывается биореактор для асептического биологического воспроизводства или обработки клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов. Биореактор включает опорный корпус с внутренней камерой, вкладыш разового применения, выстилающий поверхность внутренней камеры, и прикрепленную сверху к вкладышу пластину, образующую вместе с вкладышем герметичную камеру. После использования вкладыш можно удалить, а биореактор использовать повторно с новым вкладышем.

В патенте США №6391638 раскрывается одноразово используемое устройство и способ анаэробного культивирования и сбора выращенных клеток и/или тканевых культур по принципу последовательных циклов. Устройство состоит из стерилизуемого контейнера разового применения, который может частично заполняться соответствующей стерильной биологической культуральной средой для клеток и/или тканей. Контейнер оборудован приспособлением для удаления из него избыточного воздуха и/или отходящих газов и приспособлением для введения инокулята, и/или питательной среды, и/или добавок к ней. Многократно используемое приспособление сбора обеспечивает сбор, когда требуется, по меньшей мере, части питательной среды, содержащей клетки и/или тканевые культуры, что позволяет использовать указанное приспособление непрерывно в течение, по меньшей мере, одного последовательного цикла культивирования/сбора. Часть содержащей клетки и/или тканевую культуру среды, оставшаяся от предыдущего цикла сбора, может служить в качестве инокулята для следующего цикла культивирования и сбора.

Другие типы биореакторов раскрываются в патентах США №5763267; 5994129; 6228635; 4839292; 5416022 и в ЕР 1022329.

Недостатком вышеуказанного типа биореакторов является то, что, хотя они могут работать в экспериментальных условиях и в промышленных лабораториях, они не могут использоваться как жизнеспособные промышленные системы размножения и доставки при использовании начинающими конечными пользователями из-за необходимости:

- введения подходящей стерильной среды;

- инокуляции среды соответствующими микроорганизмами;

- из-за потребности в отдельном аппарате для доставки.

В дополнение к этому эти типы биореакторов:

- являются относительно сложными и трудными в эксплуатации и требуют знаний по микробиологии для управления ими;

- создают опасность заражения нежелательными микроорганизмами или другими материалами;

- создают опасность нарушения анаэробиоза в биореакторах на стадии инокуляции;

- создают опасность инокуляции среды неправильными микроорганизмами вследствие ошибки или недостатка знаний, что может привести к значительному ущербу;

- имеют тот недостаток, что инокулированная культура имеет ограниченный срок хранения и должна быть использована в течение ограниченного промежутка времени;

- не являются переносными и транспортабельными.

Цель изобретения

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение автономного устройства для размножения и доставки клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов и способа размножения и доставки клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов, с помощью которых можно устранить или, по меньшей мере, свести к минимуму вышеуказанные недостатки.

Раскрытие изобретения

Согласно первому аспекту изобретения обеспечивается способ размножения анаэробных клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов, включающий подачу инокулята в анаэробную камеру инокуляции, подачу среды выращивания в анаэробную камеру размножения, отделенную от камеры инокуляции разделительным средством, хранение инокулята и неинокулированной среды выращивания раздельно, открывание разделительного средства для введения инокулята в камеру размножения, выращивание культуры в анаэробных условиях и отбор выращенной культуры из камеры размножения, отличающийся тем, что указанные процессы проводят в герметичных камерах при сохранении условий анаэробиоза в них при открывании разделительного средства и сообщении камер, при этом подачу инокулята и среды выращивания в камеры, их хранение, инокуляцию, открывание указанного средства и размножение осуществляют в анаэробных и асептических условиях.

Способ может включать стадию стерилизации камеры размножения и разделительного средства до размножения культуры.

В соответствии со вторым аспектом изобретения обеспечивается автономный переносной биореактор разового применения, включающий, по меньшей мере, одну анаэробную герметичную камеру выращивания анаэробных клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов, содержащую среду выращивания, по меньшей мере, одну анаэробную герметичную камеру инокуляции с инокулятом, имеющую горловину, закрытую разделительным средством в виде перегородки, соединяющую камеры трубку с расположенным в ней шипом для прокалывания перегородки и образования прохода для инокулята в камеру выращивания, при этом горловина камеры инокуляции соединена с концом трубки при помощи резьбового соединения для перемещения ее к шипу и прокалывания перегородки, причем камера выращивания снабжена трубкой для отбора выращенной культуры.

Камера размножения биореактора может быть выполнена в виде гибкого контейнера типа инфузионного мешка.

В качестве альтернативы камера размножения биореактора может быть выполнена в виде контейнера типа «оплетенной бутыли».

Камера инокуляции биореактора может быть выполнена в виде гибкого флакона с горловиной для его сжатия и выдавливания инокулята в камеру размножения.

Краткое описание чертежей

Ниже изобретение будет раскрываться дополнительно путем неограничивающего примера со ссылкой на чертежи, где:

Фиг.1 представляет вид сбоку автономного переносного биореактора разового применения согласно первому воплощению изобретения;

Фиг.2 представляет вид сбоку автономного переносного биореактора разового применения согласно второму воплощению изобретения;

Фиг.3 представляет вид сбоку автономного переносного биореактора разового применения согласно третьему воплощению изобретения;

Фиг.4 представляет вид сбоку автономного переносного биореактора разового применения согласно четвертому воплощению изобретения;

Описание предпочтительного воплощения изобретения

Со ссылкой на Фиг.1 переносной автономный биореактор разового применения согласно первому воплощению изобретения в общем обозначен ссылочным обозначением 10.

Биореактор 10 включает камеру размножения 12, вмещающую среду для выращивания 14, и камеру инокуляции 16, вмещающую инокулят 18. Камеры размножения и инокуляции 12 и 16 соединяются трубкой 19, образующей проход 20, который закрывается разделительным средством в виде перегородки 22. Камера инокуляции 16 выполнена в виде гибкого флакона с горловиной 16.1, закрываемой перегородкой 22. Открывающее приспособление в форме шипа 24 смонтировано в проходе 20 в направлении перегородки 22. Горловина 16.1 камеры инокуляции 16 соединена с одним концом трубки 19 с помощью средства перемещения в виде резьбового соединения 26.

Камера размножения 12 выполнена или задается в виде гибкого пакета типа инфузионного мешка; и биореактор 10 дополнительно снабжен второй трубкой 28 с отверстием 30, служащим для подсоединения к дозирующему устройству (не показано) для применения размноженной культуры на месте ее использования. Конструкция устройства такова, что давление, которое создается в камере размножения 12 в процессе культивирования микроорганизмов, выталкивает размноженную культуру через указанное отверстие 30, благодаря чему отпадает необходимость применения внешних источников давления воздуха для отбора культуры и тем самым снижается опасность заражения.

Среда для выращивания 14 является микроорганизм-специфичной, а инокулят 18 присутствует в стабильной форме, например в виде лиофилизированной культуры, что делает его стабильным и жизнеспособным в течение периода, превышающего обычный срок жизни традиционной культуры в закрытом контейнере.

Понятно, что камера размножения 12, среда для выращивания 14, проход 22 и шип 24 являются стерильными перед инокуляцей.

Со ссылкой на Фиг.2, 3 и 4 переносной автономный биореактор разового применения согласно второму, третьему и четвертому воплощению изобретения в общем обозначен ссылочными обозначениями 10А, 10В и 10С соответственно.

Биореакторы 10А, 10В и 10С все сходны с биореактором 10, показанным на Фиг.1. Однако биореактор 10А включает две камеры размножения 12 и 12А, каждая из которых предназначена для того, чтобы вмещать среду выращивания 14 и 14А; и две камеры инокуляции 16 и 16А, каждая из которых предназначена для того, чтобы вмещать инокулят 18 и 18А. Биореактор 10В включает две камеры размножения 12 и 12А, каждая из которых предназначена для того, чтобы вмещать среду выращивания 14 и 14А; и одну камеру инокуляции 16, предназначенную для того, чтобы вмещать инокулят 18. Биореактор 10С включает одну камеру размножения 12, предназначенную для того, чтобы вмещать среду выращивания 14; и две камеры инокуляции 16 и 16А, каждая из которых предназначена для того, чтобы вмещать инокулят 18 и 18А.

Со ссылкой на Фиг.2 камеры размножения 12 и 12А соединены друг с другом посредством перемычки, выполненной с возможностью открывания. При использовании обе камеры инокуляции 16 и 16А соединяются с внутренностью камер 12 и 12А соответственно. Среда выращивания 14, таким образом, инокулируется инокулятом 18, а среда выращивания 14А инокулируется инокулятом 18А. Среды выращивания 14 и 14А могут представлять собой среды выращивания различных типов, а инокуляты 18 и 18А также могут быть инокулятами различных типов. После того как процесс размножения прошел в обеих камерах размножения 12 и 12А, камеры 12 и 12А соединяют друг с другом путем открывания перемычки 13, так что смесь отбирается из биореактора 10А через отверстие 30.

Со ссылкой на Фиг.3 камеры размножения 12 и 12А соединены друг с другом посредством перемычки, выполненной с возможностью открывания. При использовании камера инокуляции 16 соединяется с внутренностью камеры 12 для инокуляции среды выращивания 14 инокулятом 18. Среда выращивания 14А в камере 12А может представлять собой среду выращивания отличного типа и может соединяться с камерой 12А во время процесса размножения или после того, как процесс размножения прошел. После этого смесь отбирают из биореактора 10В через отверстие 30.

Со ссылкой на Фиг.4 обе камеры инокуляции 16 и 16А соединяются с камерой размножения 12. При использовании обе камеры инокуляции 16 и 16А соединяются с внутренностью камеры 12. Среда выращивания 14, таким образом, инокулируется инокулятами 18 и 18А. Инокуляты 18 и 18А могут представялть собой инокуляты различных типов, которые хранят, транспортируют и соединяют с камерой размножения 12 отдельно. Инокуляты 18 и 18А могут вводиться в среду размножения 14 одновременно или один после другого. После того как процесс размножения прошел в камере размножения 12, смесь отбирают из биореактора 10С через отверстие 30.

При использовании камера инокуляции 16 навинчивается в направлении шипа 24 до тех пор, пока шип 24 не проколет перегородку 22 для соединения внутренних полостей камер 12 и 16 через проход 20. После этого камера инокуляции 16 сжимается вручную для инокуляции среды для выращивания 14 инокулятом 18 и начинается процесс размножения микроорганизмов. Само собой понятно, что шип 24 может быть выполнен в виде полой иглы для обеспечения внутреннего прохода, вдоль которого может происходить инокуляция.

В случае анаэробных микроорганизмов, в особенности строго анаэробных микроорганизмов, биореактор 10 представляет собой полностью замкнутую и герметичную конструкцию. Кроме того, конструкция такова, что прокалывание перегородки 22, инокуляция среды для выращивания 14 и размножение микроорганизмов осуществляются в анаэробных условиях.

Далее в ходе использования инокулят 18 и неинокулированная среда для выращивания 14 хранятся и транспортируются отделенными друг от друга в биореакторе 10 до того времени, пока не потребуется размноженная культура, для получения которой среда для выращивания 14 инокулируется, как описано выше, и происходит размножение, после которого размноженная культура отбирается из биореактора 10 через отверстие 30.

Авторами заявки установлено, что биореактор 10 обладает рядом преимуществ перед традиционными биореакторами. Например, автономная и несложная конструкция аппарата облегчает его использование и снижает риск заражения нежелательными микроорганизмами или другими материалами. Она устраняет также опасность нарушения анаэробного режима камер 12 и 16 в процессе инокуляции. Она обеспечивает также правильность инокуляции среды для выращивания требуемыми микроорганизмами на требуемом уровне. В дополнение к этому она предусматривает продолжительный срок хранения, т.е. инокулят и среда для выращивания стабильны до момента прокалывания перегородки.

В частности, обеспечивается получение размноженной культуры с высокой жизнеспособностью благодаря раздельному хранению и транспортированию инокулята и среды для выращивания и проведению инокуляции незадолго до доставки к месту использования. Вследствие того что микроорганизмы находятся в размноженной культуре в лог-фазе роста, когда его ферментные системы находятся в оптимальном состоянии, эффект от них в месте доставки намного лучше по сравнению с системами предшествующего уровня техники.

Понятно, что возможны различные модификации автономного биореактора для размножения клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов и доставки их к месту использования, равно как и способа размножения и доставки клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов согласно изобретению, без отступления от объема приложенной формулы изобретения. Например, перегородка может открываться любым другим способом - растворением ее химическим путем, разрыванием или разломом, а разделительное средство может быть выполнено, например, в виде клапана.

1. Способ размножения анаэробных клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов, предусматривающий подачу инокулята в анаэробную камеру инокуляции, подачу среды выращивания в анаэробную камеру размножения, отделенную от камеры инокуляции разделительным средством, хранение инокулята и неинокулированной среды выращивания раздельно, открывание разделительного средства для введения инокулята в камеру размножения, выращивание культуры в анаэробных условиях и отбор выращенной культуры из камеры размножения, отличающийся тем, что указанные процессы проводят в герметичных камерах при сохранении условий анаэробиоза в них при открывании разделительного средства и сообщении камер, при этом подачу инокулята и среды выращивания в камеры, их хранение, инокуляцию, открывание указанного средства и размножений осуществляют в анаэробных и асептических условиях.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что камеру размножения и разделительное средство перед размножением культуры стерилизуют.

3. Автономный переносной биореактор разового применения, включающий по меньшей мере одну анаэробную герметичную камеру выращивания анаэробных клеток, тканевых культур и/или микроорганизмов, содержащую среду выращивания, по меньшей мере одну анаэробную герметичную камеру инокуляции с инокулятом, имеющую горловину, закрытую разделительным средством в виде перегородки, соединяющую камеры трубку с расположенным в ней шипом для прокалывания перегородки и образования прохода для инокулята в камеру выращивания, при этом горловина камеры инокуляции соединена с концом трубки при помощи резьбового соединения для перемещения ее к шипу и прокалываания перегородки, причем камера выращивания снабжена трубкой для отбора выращенной культуры.

4. Биореактор по п.3, отличающийся тем, что камера размножения выполнена в виде гибкого контейнера типа инфузионного мешка.

5. Биореактор по п.3, отличающийся тем, что камера размножения выполнена в виде контейнера типа «оплетенной бутылки».

6. Биореактор по п.3, отличающийся тем, что камера инокуляции представляет собой контейнер в виде гибкого флакона с горловиной для его сжатия и выдавливания инокулята в камеру размножения.