Добавка в состав для детского питания
Изобретение относится к добавке в состав для питания младенцев или к детскому питанию. Добавка для детского питания представляет собой молочный остеопонтин, который вводится в количестве, по меньшей мере, 1% от общего содержания белка в составе для детского питания. Изобретение позволяет получить состав для питания младенцев, в наибольшей степени соответствующий составу материнского молока и обладающий иммуностимулирующим действием. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 табл., 2 ил.
Область техники
Изобретение относится к составам для питания младенцев или к детскому питанию, содержащим остеопонтин, и к применению остеопонтина в составах для младенцев или в детском питании.
Предшествующий уровень техники
Хорошо известно, что составы для питания младенцев не обладают таким же иммунным эффектом, как материнское молоко. Питание младенцев грудным молоком вызывает меньше инфекций и меньше аллергических реакций и дерматитов по сравнению с питанием детей из бутылочек. Поэтому следует предпринимать попытки получения таких составов для младенцев, которые бы как можно больше соответствовали материнскому молоку. Это означает «гуманизацию» составов для младенцев.
Остеопонтин (ОПН) представляет собой белок, который входит в состав молока млекопитающих, например человеческого и коровьего молока.
Считали, что человеческое и коровье молоко содержат ОПН примерно в одинаковых концентрациях. Поэтому не было предложено добавлять дополнительный ОПН в составы для младенцев для получения гуманизированного питания.
Считали, что содержание ОПН в человеческом молоке составляет примерно 3-10 мг/л. Неожиданно было обнаружено, что человеческое молоко в среднем содержит около 25-300 мг/мл ОПН, т.е. примерно в 5-10 раз больше, чем коровье молоко. Могут иметь место индивидуальные различия.
Также было показано, что ОПН играет ключевую роль в приобретении Th-1-ответа. Младенцы от рождения обладают главным образом Th-2-ответом, поскольку они получают антитела с молоком матери, созревание иммунного ответа у младенцев опосредуется индукцией/приобретением Th-1-ответа. Следовательно, ОПН является существенным компонентом человеческого молока для питания младенцев.
ОПН является многофункциональным белком, включенным как в физиологические, так и патологические процессы во множестве органов и тканей, включая биоминерализацию, воспаление, восстановление лейкоцитов и выживание клеток (см. Mazzali M, Kipari Т, Ophascharoensuk V, Wesson JA, Johnson R, Hughes J. 2002. Osteopontin - a molecule for all reasons. Q. J.95: 3-13; Denhart DT, Giachelli CM, Rittling SR. 2001. Role of osteopontin in cellular signaling and toxicant injury. 41: 4723-49). ОПН экспрессируется несколькими типами клеток и эпителиальными клетками. Соответственно ОПН присутствует в большинстве тканей и органов, которые были проанализированы на его присутствие. ОПН присутствует в относительно высоких концентрациях во многих физиологических жидкостях, таких как кровь, плазма, желчь, моча и молоко. ОПН существует в изоформах, специфичных для определенных тканей, т.е. в протеолитически процессированных формах, фосфорилированных и гликозидированных формах и т.п., которые могут соответствовать конкретным клеточным функциям.
ОПН коровьего молока, который является наиболее полно охарактеризованной формой этого белка, содержит 27 фосфосеринов, один фосфотреонин и три О-гликозилированных треонина (Sorensen ES, Hojrup P, Petersen T. 1995. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: Identification of twenty-eight phosphorylation and three О-glycosylations sites. Protein Sci. 4: 2040-2049). Все сайты фосфорилирования расположены в кислых последовательностях узнавания казеин-киназы и казеин-киназы 2 (Sorensen ES, Petersen ТЕ. 1994. Identification of two phosphorylation motifs in bovine osteopontin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 198: 200-205).
Бычий и человеческий ОПН весьма гомологичны по всем функциональным элементам, которые сохраняются в этих видах. Последовательности этих двух белков показаны на фиг.1. Последовательность Arg-Gly-Asp для связывания интегринов отвечает за связывание с клеточными рецепторами, обогащенный остатками аспаргиновой кислоты участок вовлечен в процесс связывания с гидроксиапатитом, солями и ионами кальция, а почти все остатки серина, локализованные в последовательности узнавания казеин-киназы молочной железы, которые, как показано, фосфорилированы в бычьем ОПН, также присутствуют в человеческой последовательности. Аналогично остатки треонина, которые, как показано, гликозилированы в бычьем ОПН, также присутствуют в человеческой последовательности. Это сохранение сайтов и мотивов посттрансляционной модификации указывает на то, что биоактивные пептиды, которые могут быть получены путем расщепления человеческого ОПН, также могут быть получены путем расщепления бычьего ОПН. Таким образом, бычий белок можно считать весьма подходящим для повышения пищевой ценности составов для младенцев и детского питания.
В WO 02/28413 описаны способ выделения фракции кислых белков из молочного белка путем анионного обмена и применение этой фракции в композициях для лечения костей. Описанная фракция содержит ряд слабокислых белков сыворотки. В число этих белков входят протеозо-пептонный компонент 3, протеозо-пептонный компонент 5 (РР5), также известный как бета-казеин-5Р (fl-105) или бета-казеин-5Р (fl-107), протеозо-пептонный компонент 8-slow (PP8-slow), также известный как бета-казеин-1Р (f29-105) или бета-казеин-1Р (f29-107), сиалированные и фосфорилированные белки, фосфопептиды альфа-s1-казеина и остеопонтин, а также смесь пептидов, полученных из этих белков, а также небольшие количества бета-лактоглобулина, бычьего сывороточного альбумина и иммуноглобулинов. Описанная белковая фракция может быть использована для функционального питания для лечения и/или предотвращения дефектов костей. В описании указанной патентной заявки не упоминается, что остеопонтин является активным компонентом белковой фракции, и что его или эту белковую фракцию можно применять для целей иммуностимуляции или для получения гуманизированных составов для младенцев.
В работе Senger DR, Perruzzi CA, Papadopoulos A, Tenen DG. 1989. Biochem. Biophys. Acta. 996: 43-48. Purification of a human milk protein closely similar to tumor secreted phosphoproteins and osteopontin, описано, что остеопонтин присутствует в грудном человеческом молоке, и описан способ его выделения. Авторы этой работы оценивают содержание остеопонтина в человеческом молоке как 3-10 мг/л. Эти оценки отличаются более чем в 10 раз от значения, которое было определено авторами настоящего изобретения.
В работе Dhanireddy R, Senger R, Mukherjee BB, Mukherjee AB. 1993. Acta Paediatr. 82: 821-2. Osteopontin in human milk from mothers of premature infants описано, что остеопонтин присутствует в молоке матерей недоношенных младенцев. Пробы молока были проанализированы Вестерн-блоттингом. Концентрации остеопонтина в пробах определены не были. Присутствие ОПН в молоке обсуждалось только с точки зрения транспорта кальция.
В работе Sorensen S, Justesen SJ, Johnsen, АН. 2003. Protein Expression and Purification 30: 238-245. Purification and characterization of osteopontin from human milk описан новый протокол выделения остеопонтина из человеческого молока. В работе описано выделение нескольких фрагментов и пептидов, производных остеопонтина, а также интактного остеопонтина полной длины. Оценка концентрации остеопонтина в человеческом молоке была основана на количестве, выделенном посредством описанного способа и в основном соответствует количеству, определенному в работе Senger и др. 1989. Оно было примерно в 10 раз меньше, чем количество, определенное авторами данного изобретения методом сэндвич-ELISA. В работе также описано получение поликлональных антител против остеопонтина, но не было определено действительное содержание остеопонтина в молоке. В работе описан только способ получения остеопонтина и его вариантов для целей процедуры стандартизации, получения антител и функциональных исследований. В этой статье не обсуждается и не упоминается функция или возможное применение остеопонтина в отношении молока, составов для младенцев или других продуктов питания.
Анализы по определению концентрации ОПН в молоке в предшествующем уровне техники оценивают ее как 3-10 мг/л. Однако эти анализы по определению концентрации ОПН трудно осуществить, например, из-за влияния образующихся агрегатов белков. Поэтому содержание ОПН не было точно определено. По этой причине ОПН не добавляли в составы для младенцев для получения продуктов, сходных с материнским молоком, имеющих полезные защитные свойства против развития аллергии. Таким образом, до сих пор не было составов для питания младенцев с факторами, стимулирующими иммунную систему, которые могли бы повысить приобретение Th1-ответа.
Сущность изобретения
Изобретение основано на неожиданном открытии, что ОПН содержится в грудном человеческом молоке в значительно больших количествах, чем в коровьем молоке. Известные данные по оценке содержания ОПН были основаны на анализах Вестерн-блоттинга и методах выделения белка, т.е. 3-10 мг/л. Развитие количественных методов ELISA для анализа молока привело к новому пониманию в отношении содержания ОПН в молоке.
Соответственно изобретение представляет составы для младенцев с остеопонтином из молока человека и других млекопитающих. ОПН можно добавлять в любые известные составы для младенцев в качестве добавки или ОПН можно давать младенцам отдельно от питания, что способствует приобретению Th1-ответа и таким образом уменьшает сниженную иммунную функцию у младенцев.
Количество ОПН, которое следует давать младенцу, либо с составом для питания младенцев, либо отдельно, должно быть сравнимо с количеством, которое присутствует в грудном человеческом молоке. Остеопонтин можно вводить во все составы для питания младенцев, такие как составы, основанные на коровьем молоке или соевом молоке, а также в детское питание, такое как NAN® от Nestle.
Все составы для питания младенцев, изготовленные как начальное питание, продолжающее питание и питание для детей с низкой массой при рождении, могут содержать молочный ОПН.
Составы для питания младенцев предпочтительно должны содержать молочный ОПН в количестве по меньшей мере 1% от общего содержания белков, которое соответствует количеству молочного ОПН в грудном человеческом молоке.
Краткое описание графических материалов
На фиг.1 представлены последовательности остеопонтина из коровьего и человеческого молока. Фосфорилированные остатки из бычьего ОПН показаны жирным шрифтом.
На фиг.2 представлена экспрессия ИЛ-12 в человеческой Т-клетке после стимуляции бычьим ОПН.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
У большого количества младенцев, которых кормят не материнским молоком, а составами для младенцев, может быть замедлено приобретение Th1 иммунного ответа, в результате чего может наблюдаться усиление аллергических реакций. Если таким младенцам давать составы для питания младенцев, в которые добавлен молочный ОПН в количествах, сравнимых с его количествами в человеческом молоке, скорее всего будет наблюдаться индукция Th1 иммунного ответа.
Таким образом, изобретение предлагает состав для питания младенцев или детское питание, содержащие остеопонтин.
Состав для питания младенцев предпочтительно содержит остеопонтин, полученный из человеческого или коровьего молока. Однако составы для питания младенцев могут также содержать остеопонтин, полученный из молока других животных, таких как коза, овца, верблюд, дромадер и лама.
Предпочтительно составы для питания младенцев содержат остеопонтин в количестве, соответствующем по меньшей мере 1% от общего содержания белков. Можно использовать 3%, предпочтительно более 1,5%, 2% или 2,5%. Это количество в составе для питания соответствует содержанию остеопонтина по меньшей мере 25-300 мг в литре молока. Предпочтительными количествами являются 50-250 мг/л, особенно - 100-200 мг/л. Наиболее предпочтительным количеством является 130-150 мг/л. Во многих случаях считают, что количество 130 мг/л дает наилучшие составы для питания младенцев.
Другим аспектом изобретения является применение молочного остеопонтина в качестве добавки для составов для младенцев или детского питания.
Также считают, что составы с добавкой молочного остеопонтина полезны для лечения некоторых иммунодефицитных состояний.
Как указано выше, остеопонтин можно получить из молока всех млекопитающих, таких как верблюд, овца, коза, лама и дромадер. Предпочтительно остеопонтин получают из человеческого и коровьего молока.
Остеопонтин можно добавлять в любые составы для младенцев, например составы для начального питания, продолжающего питания и питания для детей с низкой массой при рождении и недоношенных младенцев.
Концентрация молочного остеопонтина может зависеть от географического положения, этнической группы, стиля жизни, еды и т.п.
Молочный остеопонтин можно также добавлять в составы для детенышей других млекопитающих, таких как домашние животные, домашний скот (свиньи, коровы, лошади и т.д.), домашние питомцы и животные в зоопарке.
Молоко, взятое в различные дни послеродового периода, можно использовать для измерения концентрации остеопонтина в человеческом грудном молоке в различное время послеродового периода. Эти измерения можно использовать для получения различных уровней ОПН, например, в составах для начального питания, для продолжающего питания и питания для детей с низкой массой при рождении.
Также можно измерять содержание ОПН в материнском молоке и добавлять в него дополнительное количество молочного ОПН, если необходимо, и давать его ребенку той же или другой матери.
Измерять содержание ОПН в человеческом молоке можно методом ELISA или другими иммунологическими методами, такими как Вестен-блоттинг.
Метод ELISA имеет несколько вариантов, многие из которых применимы в настоящем изобретении. В одном варианте ELISA, который особенно применим в настоящем изобретении, используют антитела, специфичные для нативного молочного ОПН.
Составы для младенцев согласно настоящему изобретению содержат молочный ОПН, выделенный из молока, однако следует понимать, что молочный ОПН может быть получен рекомбинантными методами в подходящих клетках, которые экспессируют такой же паттерн фосфорилирования, какой обнаружен в молочном ОПН. Предпочтительными клетками для экспрессии являются клетки молочной железы, поскольку можно ожидать, что такие клетки будут экспессировать идентичный или, по существу, идентичный паттерн фосфорилирования.
Хорошо известно, что традиционные составы для младенцев не обладают таким же иммуностимулирующим эффектом, как материнское молоко, а дети, вскормленные грудным молоком, имеют меньше инфекций, аллергических реакций и дерматитов, по сравнению с детьми, которых кормят детским питанием из бутылочек. Одной из причин этого является то, что грудное молоко содержит высокие количества ОПН.
Определения
Термин «остеопонтин» или «ОПН», используемый в данном описании, означает остеопонтин из молока, включая природные фрагменты и пептиды, полученные из ОПН путем протеолитического расщепления в молоке, или сплайсированные, фосфорилированные или гликолизированные варианты ОПН, полученные методом, описанным в WO 01/49741.
Молочный ОПН - это ОПН, выделенный из молока млекопитающих.
Молоко млекопитающих - это человеческое молоко или молоко животных, таких как корова, верблюд, коза, овца, дромадер и лама.
Грудное молоко - это молоко, собранное от (здоровых) женщин.
Составы для младенцев - это составы, которые обеспечивают потребность в питании младенцев.
Составы для начального питания - это составы, которые обеспечивают потребность в питании младенцев первые 4-6 месяцев.
Составы для продолжающего питания - это составы, которые обеспечивают потребность в питании младенцев после первых 4-х месяцев.
Составы для питания для детей с низкой массой при рождении - это составы, которые обеспечивают потребность в питании младенцев, родившихся с низкой массой.
Составы для недоношенных младенцев - это составы, которые обеспечивают потребность в питании недоношенных младенцев.
Далее изобретение раскрыто посредством примеров не ограничительного характера.
Описание примеров осуществления изобретения
Примеры
Сбор и обработка образцов молока
Образцы грудного человеческого молока собирали от 10 здоровых женщин в период от 10 до 58 дней после родов. Молоко собирали с помощью грудного насоса, отбирали 2 мл от каждой дойки и объединяли образцы для получения дневной пробы молока. Из цельного молока экстрагировали жир путем высокоскоростного центрифугирования и отделяли снятое молоко. Брали аликвоты по 0,2 мл снятого молока и немедленно их анализировали или хранили в замороженном состоянии при -20°С до тех пор, пока они не потребуются.
Свежее объединенное коровье молоко получали на местной молочной ферме. Молоко отбирали 4 раза в течение 4 месяцев и обрабатывали отдельно. Жир отделяли путем центрифугирования, образцы молока хранили в замороженном состоянии при -20°С до тех пор, пока они не потребуются.
Измерение общей концентрации белка в молоке
Концентрацию белка во всех пробах молока определяли путем анализа Брадфорда с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Анализы проводили согласно описанию производителя.
Метод ELISA для определения ОПН в молоке
Измеряли концентрацию ОПН в индивидуальных пробах молока и имеющихся в продаже составах для младенцев методом сэндвич-ELISA. Для этого анализа у кроликов индуцировали антисыворотку против бычьего и человеческого ОПН против нативного ОПН, выделенного из коровьего и человеческого молока соответственно (Dako, Glostrup, Дания). Бычий ОПН был выделен, как описано в работе Sorensen ES, Petersen ТЕ, 1993, Purification and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk, J. Dairy Res. 60: 189-197. Человеческий ОПН был выделен, как описано в работе Senger DR, Perruzzi CA, Papadopoulos A, Tenen DG, 1989, Purification of a milk protein closely similar to tumor-secreted phosphoproteins and osteopontin. Biochem, Biophys. Acta 996: 43-48. Для получения высокой степени чистоты оба белка подвергали обращенно-фазной хроматографии до иммунизации кроликов. lgG-фракцию антисыворотки очищали аффинной хроматографией с конкавалином А и прямо использовали для анализа ELISA, либо очищали на аффинной колонке с ОПН для получения специфичных антител. Специфичность антител проверяли Вестерн-блоттингом проб молока и очищенного ОПН. Анализ ELISA был весьма чувствительным с пределом детектирования <5 нг/мл молока и линейным в диапазоне 10-300 нг/мл, пробы молока разбавляли в 2000-23000 раз перед анализом. Все образцы анализировали в трех пробах с 6-12 разведениями на одно измерение. Надежность анализов ELISA проверяли с использованием образцов молока с известным содержанием ОПН, и было показано, что анализы являются количественными и хорошо воспроизводимыми в диапазоне содержания ОПН, которое использовали для этих измерений. Также выделение ОПН из проб человеческого молока показало выход, сравнимый с концентрациями, измеренными методом ELISA.
Концентрация ОПН в коровьем молоке
Уровень ОПН в объединенных пробах коровьего молока определяли 4 раза в течение 4 месяцев (таблица 1). Было обнаружено, что средняя концентрация составляет 18,28 мг/л. Содержание общего белка было установлено 35000 мг/л согласно литературе. Содержание ОПН в коровьем молоке от общего белка составило 0,05% по массе.
| Таблица 1 Концентрация ОПН в коровьем молоке |
|||
| Коровье молоко Образец № | ОПН (мг/л) | Общий белок (мг/л) | ОПН/белок (%) |
| 301002 | 17,84 | ||
| 061102 | 19,37 | ||
| 141101 | 17,91 | ||
| 120203 | 18,01 | ||
| Среднее | 18,28 | ~35000 | 0,052 |
Концентрация ОПН в человеческом молоке
Образцы молока собирали от 10 женщин в возрасте 25-35 лет (средний возраст 29 лет) в период от 10 до 58 дней после родов (в среднем на 21,6 день после родов) и анализировали на ОПН и общий белок. Данные просуммированы в таблице 2. Содержание ОПН в грудном молоке составило от 22,44 до 257,25 мг/л со средним значением 138,5 мг/л. Общая концентрация белка составила от 8327 до 13268 мг/л со средним значением 10821 мг/л. В среднем содержание ОПН составляет 1,3 мас.% от общего белка в человеческом молоке, а у одной матери было более 3% ОПН от общего молочного белка.
| Таблица 2 Концентрация ОПН в человеческом молоке |
|||||
| Возраст матери | Дни после родов | Концентрация ОПН (мг/л) | Концентрация общего белка (мг/л) | ОПН/белок (%) | |
| 28 | 59 | 65,97 | 8550 | 0,77 | |
| 35 | 13 | 257,35 | 8327 | 3,09 | |
| 28 | 12 | 200,52 | 13268 | 1,50 | |
| 30 | 10 | 238,69 | 12628 | 1,89 | |
| 25 | 12 | 22,44 | 11442 | 0,20 | |
| 30 | 33 | 101,54 | 10000 | 1,02 | |
| 31 | 39 | 113,96 | 10157 | 1,12 | |
| 30 | 17 | 67,04 | 10328 | 0,65 | |
| 23 | 12 | 212,00 | 10936 | 1,94 | |
| 30 | 10 | 105,00 | 12576 | 0,83 | |
| среднее | 29 | 21,6 | 138,4 | 10821 | 1,3 |
Отмечены большие различия в концентрации ОПН по отношению к общему белку у различных матерей. У всех матерей отношение ОПН/общий белок было значительно выше, чем у коровьего молока. Эти измерения показали, что концентрация ОПН по отношению к общему белку в человеческом молоке (1,3%) по сравнению с коровьим молоком (0,05%) примерно в 26 раз выше. Это среднее значение включает отдельные значения в диапазоне от 4 до 62 раз выше по сравнению с коровьим молоком.
Концентрация ОПН в имеющихся в продаже составах для младенцев
Данные рассчитывали как мг ОПН/литр готового к употреблению состава, имеющего концентрацию 125 г/л.
| Таблица 3 | ||
| Название производителя | Состав для младенцев | Содержание ОПН, мг/л |
| Nam Yang | Science 1 | 11,5 |
| Science 2 | 9,4 | |
| Agisarang 3 | 12,3 | |
| Agisarang 4 | 17,4 | |
| ХО1 | 7,9 | |
| ХО2 | 6,2 | |
| ХО3 | 8,4 | |
| ХО4 | 6,7 | |
| Agisarang soo | 5,5 | |
| Imperial Dream | 6,0 | |
| Science | 17,8 | |
| Premium XO | 13,0 | |
| Nestle | Nan 1 | 10,3 |
| Nidina 1 | 5,3 | |
| Beauvais | Allomin 2 | 6,4 |
Бычий остеопонтин индуцирует экспрессию ИЛ-12 в человеческих кишечных клетках
Получали человеческие кишечные клетки и выращивали культуру в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-4, как описано у Agnholt J, Kaltoft К, 2001. Infliximab downregulates interferon production in activated gut T-lymfocytes from patients with Crohn's disease. Cytokine. 15: 212-222. Культивация в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-4 усилила рост Т-клеток с сохраненными клеточными функциями, такими как экспрессия рецепторов, TCRαβ+, CD4+CD45RO+.
Лунки с культурой клеток покрывали 1 мл (1 мг/мл) раствора остеопонтина в фосфатном буфере и фосфатным буфером соответственно и выдерживали в течение ночи при 4°С. Лунки опустошали и выращивали Т-клетки в лунках (10-6 клеток/мл) 24 часа и затем отбирали аликвоты клеточных супернатантов для анализа.
Пары антител к цитокинам для определения ИЛ-12 были получены от R&D Systems. Все антитела были биотинилированы. Для определения содержания ИЛ-12 использовали флюорометричекий анализ с высоким временным разрешением с меченным европием (Eu3+) стрептавадином и флюорометр Delphia 1234 (Wallac, Turku, Финляндия). Полученные значения являются средними из трех данных ELISA в трех экспериментах.
| Таблица 4 Экспрессия ИЛ-12 в человеческих кишечных иммунных клетках после стимуляции бычьим остеопонтином |
|
| ИЛ-12 (пг/мл) | |
| Среднее (станд. откл.) | |
| Контрольные клетки | 3,3 (±3,2) |
| + остеопонтин | 16,7 (±2,1) |
Как показано в таблице 4 и на фиг.2, можно наблюдать значительное увеличение экспрессии ИЛ-12 в человеческих иммунных клетках, стимулированных бычьим остеопонтином.
Нами показано, что природный бычий остеопонтин способен индуцировать экспрессию Th-1 цитокина ИЛ-12 в неактивированных человеческих кишечных иммунных клетках, прямо указывая на роль в регуляции кишечной иммунности.
Смеси составов для младенцев, содержащие ОПН
В следующих примерах показано, что содержание ОПН 100-130 мг/л является подходящим количеством для составов для младенцев. Однако рамки изобретения не ограничены этим количеством, поскольку существуют различия в составе человеческого молока из-за различий в питании, стиле жизни, географической территории, этнических групп и т.п.
В примеры настоящего изобретения включены композиции составов для младенцев, которые были получены в соответствии с законодательством Европейского Союза и рекомендациями для детского питания.
В этой связи принимали в расчет только содержание белка, а состав компонентов не меняли. В качестве добавки во все продукты было выбрано 100 мг ОПН на 1000 мл, однако также возможно в рамках изобретения применять ОПН в зависимости от содержания белка в конкретном продукте.
В коровьем молоке содержится 15-20 мг/л ОПН, что по меньшей мере в 5 раз ниже содержания ОПН в человеческом молоке, которое составляет в среднем 138,4 мг/л как измерено в примерах настоящего изобретения. 15-20 мг/л ОПН соответствует 0,05% от общего содержания белка в коровьем молоке. Эта цифра примерно в 26 раз ниже, чем 1,3% (ОПН/общий белок) как измерено в человеческом молоке в примерах настоящего изобретения.
При расчетах исходили из того, что ОПН содержится в сыворотке молока, следовательно, уровень ОПН будет примерно 18 мг/100 г порошкового молока и примерно 360 мг/100 г порошка WPC80 (концентрат сывороточных белков с содержанием белка 80%). Исходя из этих цифр был рассчитан уровень, который можно ожидать от применяемых ингредиентов.
В некоторых из примеров была уменьшена доля сывороточных белков благодаря применению дополнительного количества ОПН, т.к. считают, что гликопротеин остается в сыворотке при осаждении сычужного казеина при примерном значении рН 6,2 и кислого казеина при рН 4,6.
Уровень белков в составах для младенцев можно рассчитать следующим образом.
Составы для начального питания
Составы для начального питания - это составы, которые обеспечивают потребность в питании младенцев первые 4-6 месяцев.
Нормативные требования к содержанию белка согласно законодательству Европейского Союза
Источник: постановление №202 касательно составов для младенцев и добавок для новорожденных младенцев и детей.
Белки:
Содержание белка=содержание азота × 6,38 для белков коровьего молока.
Содержание белка=содержание азота × 6,25 для белков соевого молока и частично гидролизованного белка.
Под химическим индексом понимают наименьшее отношение между количеством незаменимых аминокислот в конкретном белке и количеством незаменимых аминокислот в контрольном белке.
Продукты, основанные на коровьем молоке
| Минимум | Максимум | |
| Составы для начального питания | 0,45 г/100 кДж (1,8 г/100 ккал) | 0,7 г/100 кДж (3 г/100 ккал) |
При одинаковой энергетической ценности продукт должен содержать такое же количество незаменимых аминокислот и частично заменимых аминокислот, как и контрольный белок (материнское молоко как указано в приложении 6); при расчете могут быть добавлены метионин и цистеин.
Продукты, основанные на частично гидролизованном белке
| Минимум | Максимум | |
| Составы для начального питания | 0,56 г/100 кДж (2,25 г/100 ккал) | 0,7 г/100 кДж (3 г/100 ккал) |
При одинаковой энергетической ценности продукт должен содержать такое же количество незаменимых аминокислот и частично заменимых аминокислот, как и контрольный белок (материнское молоко как указано в приложении 6); при расчете могут быть добавлены метионин и цистеин.
Отношение эффективности белка (ОЭБ) и нетто утилизация белка (НУБ) должны соответствовать по меньшей мере казеину. Содержание таурина должно быть по меньшей мере 10 мкмоль/100 кДж (42 мкмоль/100 ккал), а содержание L-карнитина должно быть по меньшей мере 1,8 мкмоль/100 кДж (7,5 мкмоль/100 ккал).
Продукты, основанные только на выделенных соевых белках или композиции вместе с белками коровьего молока
| Минимум | Максимум | |
| Составы для начального питания | 0,56 г/100 кДж (2,25 г/100 ккал) | 0,7 г/100 кДж (3 г/100 ккал) |
Для таких составов для начального питания можно использовать только выделенные соевые белки. Химический индекс белков должен быть по меньшей мере 80% от контрольного белка (материнское молоко как указано в приложении 7 постановления).
При одинаковой энергетической ценности продукт должен содержать такое же количество метионина, как и контрольный белок (материнское молоко). Содержание L-карнитина должно быть по меньшей мере 1,8 мкмоль/100 кДж (7,5 мкмоль/100 ккал).
В продукт можно добавлять аминокислоты для повышения питательной ценности и только в соотношениях, необходимых для достижения этой цели.
Примеры: смеси для составов для начального питания
Энергетическая ценность: 2200 кДж/100 г (525 ккал/100 г)
Разбавление: 125 г/л
| Традиционный состав для начального питания | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 12 | 15 | 2,29 | 0,550 |
| Казеин | 4,8 | 6,1 | 0,91 | 0,220 |
| Сывороточный белок | 7,2 | 9,1 | 1,38 | 0,330 |
| * от этого ОПН | 0,030 | 0,038 | 0,006 | 0,001 |
| Отношение казеин/сывороточный белок | 40/60 |
| Состав для начального питания, содержащий ОПН | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 12 | 15 | 2,29 | 0,550 |
| Казеин | 4,8 | 6,1 | 0,91 | 0,220 |
| * от этого ОПН | 0,030 | 0,038 | 0,006 | 0,001 |
| Сывороточный белок | 7,12 | 9,0 | 1,36 | 0,326 |
| Добавленный ОПН | 0,074 | 0,092 | 0,014 | 0,003 |
| Отношение казеин/сывороточный белок | 40/60 |
Составы для продолжающего питания
Нормативные требования к содержанию белка согласно законодательству Европейского Союза
Источник: Постановление №202 касательно составов для младенцев и добавок для новорожденных младенцев и детей.
Белки:
Содержание белка = содержание азота × 6,38 для белков коровьего молока.
Содержание белка = содержание азота × 6,25 для белков соевого молока.
Под химическим индексом понимают наименьшее отношение между количеством незаменимых аминокислот в конкретном белке и количеством незаменимых аминокислот в контрольном белке.
Продукты, основанные на коровьем молоке
| Минимум | Максимум | |
| Составы для продолжающего питания | 0,50 г/100 кДж (2,25 г/100 ккал) | 1 г/100 кДж (4,5 г/100 ккал) |
Химический индекс белков должен быть по меньшей мере 80% от контрольного белка (материнское молоко как указано в приложении 7 постановления). Для таких составов можно использовать только выделенные соевые белки. В продукт можно добавлять аминокислоты для повышения питательной ценности и только в соотношениях, необходимых для достижения этой цели.
При одинаковой энергетической ценности продукт должен содержать такое же количество незаменимых аминокислот и частично заменимых аминокислот, как и контрольный белок (материнское молоко как указано в приложении 6); при расчете могут быть добавлены метионин и цистеин.
Примеры
Энергетическая ценность: 2170 кДж/100 г (520 ккал/100 г)
Разбавление: 150 г/л
| Традиционный состав для продолжающего питания | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 15 | 22,5 | 2,89 | 0,690 |
| Казеин | 12 | 18 | 2,31 | 0,554 |
| Сывороточный белок | 3 | 4,5 | 0,58 | 0,138 |
| * от этого ОПН | 0,007 | 0,011 | 0,001 | 0,000 |
| Отношение казеин/сывороточный белок | 80/20 |
| Состав для продолжающего питания, содержащий ОПН | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 15 | 22,5 | 2,89 | 0,690 |
| Казеин | 12 | 18 | 2,31 | 0,554 |
| Сывороточный белок | 2,92 | 4,4 | 0,56 | 0,134 |
| * от этого ОПН | 0,007 | 0,011 | 0,001 | 0,000 |
| ОПН | 0,078 | 0,117 | 0,015 | 0,004 |
| Отношение казеин/сывороточный белок | 80/20 |
Составы для детей с низкой массой при рождении
В настоящее время отсутствуют нормативные требования в данной области, однако они в процессе разработки. Производители составов для детей с низкой массой при рождении постоянно получают рекомендации от педиатров и от «Ассоциации Пищевой Промышленности по Применению Питательных Продуктов Европейского Союза» касательно продажи составов для детей с низкой массой при рождении. Эти рекомендации являются основанием для будущего законодательства в этой области в Европейском Союзе.
Белки:
Содержание белка = содержание азота × 6,38 для белков коровьего молока и гидролизованных белков коровьего молока.
Продукты, основанные на коровьем молоке и гидролизованных белках коровьего молока
| Минимум | Максимум | |
| Составы для детей с низкой массой | 0,6 г/100 кДж (2,4 г/100 ккал) | 0,8 г/100 кДж (3,3 г/100 ккал) |
Составы должны содержать такое же количество незаменимых аминокислот и частично заменимых аминокислот, как и контрольный белок (грудное молоко). В отличие от стандартных составов для младенцев, нельзя добавлять метионин и цистеин для целей расчетов.
Содержание таурина должно быть по меньшей мере 1,3 мг/100 кДж (5,3 мг/100 ккал).
Примеры
Энергетическая ценность: 315 кДж/100 мл (75 ккал/100 мл)
Разбавление: 150 г/л
| Традиционный состав для детей с низкой массой | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 15 | 22,5 | 3 | 0,718 |
| Гидролизованный сывороточный белок | 14,96 | 22,44 | 2,992 | 0,716 |
| * от этого ОПН | 0,067 | 0,101 | 0,012 | 0,002 |
| Таурин | 0,04 | 0,06 | 0,008 | 0,002 |
| Состав для детей с низкой массой, содержащий ОПН | ||||
| Порошок, г/100 г | Разбавление, г/л | Грамм на 100 ккал | Грамм на 100 кДж | |
| Общий белок* | 15 | 22,5 | 3,000 | 0,718 |
| Гидролизованный сывороточный белок | 14,89 | 22,34 | 2,972 | 0,712 |
| * от этого ОПН | 0,067 | 0,101 | 0,012 | 0,002 |
| Таурин | 0,04 | 0,06 | 0,008 | 0,002 |
| ОПН | 0,023 | 0,034 | 0,005 | 0,002 |
Чертежи
На фиг.1 представлены последовательности остеопонтина из коровьего и человеческого молока. Идентичность показана двумя точками, а гомологичные аминокислоты показаны одной точкой. Фосфорилированные остатки из бычьего ОПН показаны жирным шрифтом. Интегрин-связывающий триплет RGD (Arg-Gly-Asp) и участок, содержащий гликозилированные остатки в последовательности бычьего ОПН, подчеркнуты.
На фиг.2 представлена экспрессия ИЛ-12 в Т-клетках, стимулированных бычьим ОПН.
1. Добавка в состав для детского питания, представляющая собой молочный остеопонтин, вводимый в количестве по меньшей мере 1% от общего содержания белка в составе для детского питания.
2. Добавка по п.1, отличающаяся тем, что молочный остеопонтин получен из человеческого или коровьего молока.
3. Добавка по п.1, отличающаяся тем, что молочный остеопонтин вводится в количестве, которое дает по меньшей мере 25-300 мг/л остеопонтина в готовом для употребления продукте питания.
4. Добавка по п.1, отличающаяся тем, что молочный остеопонтин вводится в количестве, которое дает по меньшей мере 50-250 мг/л остеопонтина в готовом для употребления продукте питания.
5. Добавка по п.1, отличающаяся тем, что состав для детского питания представляет собой состав для начального питания.
6. Добавка по п.1, отличающаяся тем, что состав для детского питания представляет собой состав для продолжающего питания.
7. Применение молочного остеопонтина в качестве добавки в составе для детского питания.
8. Применение по п.7, отличающееся тем, что молочный остеопонтин получен из человеческого или коровьего молока.
9. Применение по п.8, отличающееся тем, что количество молочного остеопонтина составляет по меньшей мере 1% от общего содержания белка.
10. Применение по п.7, отличающееся тем, что молочный остеопонтин содержится в количестве, которое дает по меньшей мере 25-300 мг/л остеопонтина в готовом для употребления продукте питания.
11. Применение по п.7, отличающееся тем, что состав для детского питания представляет собой состав для начального питания.
12. Применение по п.7, отличающееся тем, что состав для детского питания представляет собой состав для продолжающего питания.
