Антибактериальное вещество dm0507 и его применение
Изобретение относится к биотехнологии. Антибактериальное вещество DM0507 получают путем культивирования штамма бактерий Bacillus subtilis DB9011 (FERM BP-3418), сбора супернатанта полученной культуры, сбора осадка, образованного путем регулирования рН до 3 и ниже, с последующей экстракцией осадка этанолом. Антибактериальное вещество DM0507 характеризуется ИК-спектром и спектром ЯМР, указанных на фиг.1 и фиг.2 соответственно. Антибактериальное вещество DM0507 обладает противомикробной активностью против широкого спектра микроорганизмов. Посредством использования указанного вещества получают противомикробный агент, пищевой продукт или напиток. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.
2420-146040RU/011
Область техники изобретения
Настоящее изобретение касается нового противомикробного активного вещества и более подробно оно касается противомикробного активного вещества DM0507, обладающего противомикробной активностью против широкого спектра штаммов, и его применения.
Уровень техники изобретения
Известно, что микроорганизмы продуцируют противомикробное активное вещество, обладающее такой активностью, как противомикробная, противогрибковая или противовирусная, и в качестве противомикробных активных веществ широко применяются пенициллин, продуцируемый штаммами рода Penicillium, цефалоспорин, продуцируемый родом Cephalosporium, стрептомицин, тетрациклин, эритромицин, продуцируемые родом Streptomyces, и тому подобные.
Также известно, что многолетнее применение этих противомикробных активных веществ приводит к появлению бактерий, обладающих резистентностью к этим противомикробным активным веществам (резистентные бактерии), поэтому существует необходимость в более эффективном новом противомикробном активном веществе.
Раскрытие изобретения
Задачи, которые должно решить изобретение
Соответственно задача настоящего изобретения состоит в обеспечении более эффективного нового противомикробного активного вещества, полученного из вещества природного происхождения и обладающего широким спектром противомикробной активности.
Средства для решения задач
Для достижения вышеупомянутой задачи авторы настоящего изобретения провели обширные исследования, и, таким образом, в результате осуществления настоящего изобретения выявили, что вещество, обладающее противомикробной активностью против широкого спектра штаммов, можно получать из культуральной среды специального штамма Bacillus subtilis. Кроме того, выполняя настоящее изобретение, таким образом, они выявили, что вышеупомянутое вещество, обладающее противомикробной активностью, может проявлять противомикробную активность даже в случае его добавления к ряду существующих продуктов.
Таким образом, настоящее изобретение направлено на противомикробное активное вещество DM0507, отличающееся тем, что его получают способом продуцирования, содержащим следующие этапы от (a) до (d):
(a) культивирование Bacillus subtilis;
(b) сбор супернатанта от полученной культуры;
(c) сбор осадка, образованного путем регулирования уровня pH супернатанта до 3 или ниже; и
(d) осуществление экстракции осадка этанолом.
Дополнительно, настоящее изобретение направлено на противомикробный агент, содержащий вышеупомянутое противомикробное активное вещество DM0507 в качестве активного компонента.
Дополнительно, настоящее изобретение направлено на пищевой продукт или напиток, содержащий вышеупомянутое противомикробное активное вещество DM0507.
Дополнительно, настоящее изобретение направлено на способ продуцирования противомикробного активного вещества DM0507, отличающийся содержанием следующих этапов от (a) до (d):
(a) культивирование Bacillus subtilis;
(b) сбор супернатанта от полученной культуры;
(c) сбор осадка, образованного путем регулирования уровня pH супернатанта до 3 или ниже; и
(d) осуществление экстракции осадка этанолом.
Преимущество изобретения
Противомикробное активное вещество DM0507 настоящего изобретения обладает противомикробной активностью против широкого спектра штаммов.
Соответственно можно получать множество противомикробных агентов, пищевых продуктов, напитков и т.д., имеющих превосходную противомикробную активность, посредством использования противомикробного активного вещества DM0507 настоящего изобретения.
Наилучший вариант осуществления изобретения
Противомикробное активное вещество DM0507 настоящего изобретения (далее в настоящем изобретении называемое просто “DM0507”) можно получать способом продуцирования, содержащим нижеописанные этапы:
(а) культивирование Bacillus subtilis;
(b) центрифугирование полученной культуры и сбор супернатанта;
(c) сбор осадка, образованного путем регулирования уровня pH супернатанта до 3 или ниже; и
(d) осуществление экстракции осадка этанолом.
Для культурального использования в этапе (a) вышеупомянутого способа продуцирования Bacillus subtilis конкретно не ограничена, если она продуцирует DM0507, вместе с тем предпочтительные примеры включают в себя штамм DB9011 Bacillus subtilis (FERM BP-3418) и штамм MBI 600 Bacillus subtilis ((торговая марка) Becker Underwood, Inc: SUBTILEX), и особенно предпочтительные примеры включают в себя штамм DB9011 Bacillus subtilis. Этот штамм DB9011 Bacillus subtilis коммерчески доступен от AHC Co., Ltd. (343-1, Koaigi-machi, Maebashi-shi, Gunma-ken, Япония).
Поскольку культивирование вышеупомянутой Bacillus subtilis можно осуществлять стандартным способом, условия культивирования конкретно не ограничены, вместе с тем, например, можно упомянуть условия, при которых культивирование на качалке осуществляют при температуре от 30°C до 40°C, предпочтительно при 35°C, в течение от 24 до 48 часов, предпочтительно в течение 36 часов, с бульоном Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton) (производимым DIFCO).
Затем из культуры, полученной в вышеупомянутом этапе (a), собирают супернатант (этап (b)). В этом этапе (b) сбор супернатанта можно осуществлять центрифугированием. Конкретные условия центрифугирования не имеют определенных ограничений, вместе с тем, например, центрифугирование можно проводить при скорости от 10000 об/мин до 40000 об/мин, предпочтительно при 20000 об/мин в течение от 20 минут до 1 часа, предпочтительно в течение 1 часа.
Уровень pH супернатанта, собранного в вышеупомянутом этапе (b), регулируют до 3 или ниже, предпочтительно до 3,0 и собирают образовавшийся осадок (этап (c)). В этом этапе (c) можно регулировать уровень pH кислотой, такой как серная кислота или соляная кислота. Дополнительно, после регулирования уровня pH, супернатант предпочтительно оставляют отстаиваться в течение от 8 до 24 часов, предпочтительно в течение от 12 до 18 часов при температуре от 4 до 10°C, предпочтительно от 4 до 5°C. Дополнительно, в отношении сбора осадка, образованного путем регулирования уровня pH, можно собирать осадок центрифугированием, ультрафильтрацией, лиофилизацией, диализом или подобными способами, предпочтительно можно осуществлять центрифугирование. Конкретные условия центрифугирования не имеют определенных ограничений, вместе с тем, например, центрифугирование можно проводить при скорости от 10000 об/мин до 40000 об/мин, предпочтительно при 20000 об/мин в течение от 20 минут до 1 часа, предпочтительно в течение 1 часа.
Наконец, собранный в вышеупомянутом этапе (с) осадок подвергают экстракции этанолом (этап (d). Можно получать DM0507 настоящего изобретения посредством этого этапа (d). В качестве способа экстракции DM0507 из осадка можно упомянуть способ, в котором к осадку добавляют этанол, смесь в состоянии, когда осадок в ней флотирует, оставляют отстаиваться в течение примерно от 15 минут до 1 часа, и DM0507 экстрагируют в этаноле и другие способы.
Получаемый таким образом DM0507 настоящего изобретения имеет широкий спектр противомикробной активности против следующих групп микроорганизма от (A) до (D):
Группа (A) (аэробные / факультативные анаэробные микроорганизмы)
Streptococcus suis,
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes,
Bacillus subtilis ATCC 6633,
Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778,
Arcanobacterium pyogenes,
Aeromonas salmonicida,
Aeromonas hydrophila,
Actinobacillus actinomycetemcomitans JCM 2434,
Actinobacillus pleuropneumoniae тип 2,
Haemophilus parasuis,
Pasteurella multocida тип D,
Pasteurella haemolytica,
Salmonella typhimurium,
Salmonella choleraesuis,
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031,
Acinetobacter junii,
Acinetobacter sp.,
Stenotrophomonas maltophilia,
Legionella pneumophila серотип 1,
Mycoplasma gallisepticum, и
Mycoplasma synoviae;
Группа (B) (микроаэрофильные микроорганизмы)
Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli и
Helicobacter pylori ATCC 43526;
Группа (C) (облигатные анаэробные микроорганизмы),
Clostridium perfringens,
Clostridium difficile,
Propionibacterium acnes JCM 6425,
Bacteroides fragilis,
Porphyromonas gingivalis JCM 8525,
Tannerella forsythensis JCM 10827,
Lactobacillus acidophilus JCM 1132,
Bifidobacterium bifidum JCM 1255,
Anaerococcus prevotii JCM 6508 и
Fusobacterium nucleatum; и
Группа (D) (грибы)
Fusarium oxysporum.
Среди этих микроорганизмов DM0507 настоящего изобретения проявляет высокую противомикробную активность, в особенности против Legionella pneumophila серотипа 1, Porphyromonas gingivalis и Propionibacterium acnes. Близкая к ним высокая противомикробная активность проявляется против Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli и Stenotrophomonas maltophilia, и затем, против Aeromonas salmonicida, Mycoplasma gallisepticum и Mycoplasma synoviae.
Поскольку, как описано выше, DM0507 настоящего изобретения обладает противомикробной активностью против широкого спектра микроорганизмов, его можно применять для противомикробного агента, содержащего в качестве действующего компонента указанное вещество, для противомикробного продукта, пищевого продукта или напитка и т.д., содержащих указанное вещество.
Для получения противомикробного агента, содержащего в качестве действующего компонента DM0507 настоящего изобретения, можно объединять DM0507 и подходящий известный фармацевтически приемлемый лекарственный носитель и посредством стандартного способа создавать рецептуру. Содержание DM0507 в этом противомикробном агенте конкретно не ограничено, если представляет собой количество, способное проявлять противомикробную активность. Вместе с тем измеряют МИК (минимальную ингибирующую концентрацию) DM0507, например против Acinetobacter junii, и продукт может содержать DM0507 в концентрации, равной МИК или в более высоких концентрациях, предпочтительно от 2 до 10-кратных значений МИК. Здесь и далее в настоящем документе показан способ измерения МИК против Acinetobacter junii способом микроразведения в бульоне.
Способ измерения МИК против Acinetobacter junii путем способа микроразведения в бульоне
Измерение проводили в двух сериях для каждого образца и путем последовательных 10-кратных разведений в 2 раза устанавливали уровни концентрации DM0507 до 10240-кратных разведений. Вначале 100 мкл катион-регулируемого бульона Мюллера-Хинтона (в дальнейшем называемого CAMHB) распределяли в каждую лунку 96-луночного плоскодонного микропланшета. В первую лунку, в которую добавляли DM0507, вводили 180 мкл CAMHB. Затем для проведения 10-кратного разведения в первую лунку добавляли 20 мкл DM0507, которые последовательно разводили в 2 раза 100 мкл его аликвотного количества до 10240-кратного разведения. Днем ранее проводили изолированное культивирование Acinetobacter junii, и заранее проводили культивирование с MHA в течение от 18 до 24 часов. Свежие культивированные клетки на агаровой среде регулировали физиологическим раствором до 0,5 стандарта МакФарланда (McFarland) и дополнительно разводили в 10 раз, и регулировали плотность клеток до 107 колониеобразующих единиц КОЕ/мл. Пять микролитров отрегулированной бактериальной суспензии инокулируют в каждую лунку для получения конечной плотности инокулята 5·105 КОЕ/мл (5·104 КОЕ/100 мкл). В качестве контроля приготовляли лунки, содержащие только CAMHB и бактериальную суспензию и лунки, содержащие только CAMHB. Микропланшет инкубировали при 35°C в течение 18 часов и определяли МИК, как самое низкое разведение, в котором при визуальном наблюдении полностью ингибировался рост.
Дополнительно, путем введения или импрегнации DM0507 настоящего изобретения непосредственно или в качестве противомикробного агента, получаемого, как описано выше, в нижеуказанные существующие продукты можно получать противомикробные продукты, как показано ниже.
Парафармацевтические средства, реактивы, полоскания и т.д.
Лекарственные средства для наружного применения, средства для чистки зубов (зубные пасты, зубные порошки и жидкие зубные пасты), щетки для межзубной чистки, полоскания, дезинфицирующие средства, такие как против воспаления ротовой полости, продукты для зубных протезов (для мытья, прикрепления, стерилизации, дезинфекции и дезодорации), средства для ванны, лечебные мыла, средства для защиты губ, средства для защиты ногтей, дезинфицирующие средства для внешних участков кожи, средства против ороговения или костных мозолей, дезинфицирующие средства для ран, средства для защиты от воспаления или потницы, средства против обветривания кожи, средства против сухости или шелушения кожи, средства для кожи головы, средства против перхоти или зуда и подмышечные дезодоранты.
Предметы потребления, туалетные принадлежности, текстильные или кожаные товары и т.д.
Подгузники, кухонные принадлежности, туалетные принадлежности, продукты, полученные импрегнацией в мыло, углеродное волокно, ткань, кожа или подобные продукты.
Моющие средства и т.д.
Гигиенические хлопковые продукты (включающие в себя бумажные продукты), шампуни, ополаскиватели, санитарно-гигиенические товары и моющие средства для контактных линз.
Косметические продукты и т.д.
Косметические лосьоны, эмульсии, очищающие средства, средства декоративной косметики, маски для лица, кремы, кремы для рук, косметические масла, средства для бритья и солнцезащитные кремы.
Дезинфицирующие средства, бактерицидные средства и т.д.
Бактерицидные средства для общественных бань циркуляционного типа или горячих источников, бактерицидные средства для плавательных бассейнов, средства для холодильников (водоохладителей) и средства для фильтров, например, в кондиционерах воздуха.
Строительные материалы, материалы для покрытий и т.д.
Материалы из дерева, бумаги, масляные краски, водорастворимые краски, ткани, клеящие средства, циновки и защитные средства для материалов покрытий.
Пищевые добавки и т.д.
Консерванты (включающие в себя напитки)
Среди этих противомикробных продуктов особенно предпочтительными являются косметические лосьоны и средства для чистки зубов. Получение этих противомикробных продуктов может повторять способ получения общепринятого продукта за исключением добавления эффективного количества DM0507 настоящего изобретения к сырьевым материалам продуктов.
Дополнительно, DM0507 настоящего изобретения можно включать в состав пищевых продуктов и напитков, таких как сладости, включающие в себя жевательные резинки, леденцы, печенья, конфеты типа таблеток и тому подобное, в добавки и освежающие напитки. Среди этих пищевых продуктов и напитков особенно предпочтительными являются жевательные резинки и леденцы. Ежедневный прием DM0507 настоящего изобретения путем включения DM0507 в состав обычного пищевого продукта или напитка может представлять собой здоровую пищу, которая уничтожает бактерии, приводящие к заболеваниям периодонта, к заболеваниям, вызываемым Helicobacter pylori или им подобным, или ингибирует колонизацию таких бактерий. Способ получения этих пищевых продуктов и напитков может повторять способ получения обычного пищевого продукта или напитка за исключением добавления эффективного количества DM0507 настоящего изобретения к сырьевому материалу пищевых продуктов и напитков.
ПРИМЕРЫ
Далее описание настоящего изобретения будет приведено посредством примеров, вместе с тем, настоящее изобретение не ограничено этими примерами.
Ссылочный пример 1
Скрининг бактерий, продуцирующих противомикробное активное вещество:
Измеряли противомикробную активность культуральных супернатантов следующих штаммов Bacillus subtilis при использовании в качестве индикатора ингибирующую рост активность против Porphyromonas gingivalis JCM 8525.
Тестируемые штаммы
Штамм DB9011 (депонированный 21 мая 1991 года как FERM BP-3418 в Международном патентном депозитарии организмов (International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Япония))
Штамм ATCC 6633
Штамм BN1001 (производимый Meiji Seika Co.: (торговая марка Bn-Clean)
Штамм Kubota (производимый Asahi Biotech KK: штамм BSK)
Штамм OUV23481 (производимый Mizkan Group Co.: (торговая марка Kinnotsubu Honegenki)
Штамм MBI 600 (производимый Becker Underwood, Inc: (торговая марка SUBTILEX)
Вначале каждый штамм Bacillus subtilis пересевали тремя пассажами на агаровой среде Мюллера-Хинтона (производимой Eiken Chemical Co., Ltd). Затем одну платиновую петлю каждого штамма инокулировали в 10 мл стерильного бульона Мюллера-Хинтона (производства DIFCO) и осуществляли культивирование на качалке при 35°C в течение 24 часов.
Каждую культуральную среду после культивирования на качалке соответственно вводили в микропробирку объемом 1,5 мл и проводили центрифугирование при 15000 об/мин в течение 10 минут. Затем собирали отцентрифугированный супернатант и фильтровали через 0,45 мкм фильтр. Затем эту отфильтрованную супернатантную культуру импрегнировали в бумажный диск диаметром 6,5 мм (производства DIFCO). С другой стороны, Porphyromonas gingivalis заранее культивировали в анаэробных условиях в жидком бульоне GAM (производимом Nissui Pharmaceutical Co., Ltd) для использования в качестве индикатора противомикробной активности. Затем автоклавировали агаровую среду GAM (производства Nissui Pharmaceutical Co., Ltd) и инкубировали при 50°C. После этого с ней смешивали заранее культивированную в анаэробных условиях культуральную среду Porphyromonas gingivalis, при этом погружали в чашку и оставляли для отверждения. Бумажный диск, импрегнированный каждой из отфильтрованных культуральных сред штаммов Bacillus subtilis, помещали в центр чашки, и проводили анаэробное культивирование при 35°C в течение 48 часов. Диаметр зоны ингибирования для Porphyromonas gingivalis каждым штаммом Bacillus subtilis измеряли через 48 часов после начала культивирования. Результаты показаны в Таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||
| Тестируемый штамм | Штамм DB9011 | Штамм 6633 | Штамм BN1001 | Штамм Kubota | Штамм OUV23481 | Штамм MBI 600 |
| Диаметр зоны ингибирования (мм) | 22 | 10 | 9 | 9 | 9 | 22 |
Из Таблицы 1 выявили, что культуральные супернатанты штамма DB9011 и штамма MBI 600 проявляют высокую противомикробную активность против Porphyromonas gingivalis.
Пример 1
Продуцирование противомикробного активного вещества DM0507:
(1) Культура штамма DB9011
Штамм DB9011, выращенный на скошенном агаре и хранившийся в холодильнике, пересевали на агаровую среду Мюллера-Хинтона (производимую Eiken Chemical Co., Ltd) и культивировали при 35°С в течение 24 часов для образования колонии. Затем одну вышеупомянутую колонию инокулировали в 10 мл бульона Мюллера-Хинтона (производства DIFCO) и осуществляли культивирование на качалке при 35°С в течение 24 часов. Наконец, 1 мл вышеупомянутой культуральной среды инокулировали в заранее автоклавированный бульон Мюллера-Хинтона в объеме 3 л и осуществляли культивирование на качалке при 35°C в течение 30 часов при 200 об/мин, и таким образом получали культуральную среду.
(2) Экстракция противомикробного активного вещества DM0507
Три литра культуральной среды, полученной, как указано выше (1), центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 минут, при этом поддерживали температуру 4°С и собирали отцентрифугированный супернатант. Затем уровень pH отцентрифугированного супернатанта регулировали до 3 путем добавления к нему 10н. соляной кислоты и оставляли отстаиваться в течение ночи в холодильнике. После этого супернатант дополнительно центрифугировали при 20000 об/мин в течение 30 минут, при этом поддерживали температуру в 4°С, удаляли супернатант и затем собирали осадок. К осадку добавляли 10 мл этанола (99,5% от массы), чтобы осадок был способен течь, и смесь оставляли отстаиваться в течение около 15 минут для экстракции противомикробного активного вещества DM0507. После чего для получения противомикробного активного вещества DM0507 проводили дополнительное центрифугирование при 20000 об/мин в течение 30 минут, при этом поддерживали температуру в 4°С, уровень pH супернатанта регулировали до 7,0 путем добавления к нему 1н. гидроксида натрия, фильтровали с фильтром 0,45 мкм и фильтрат криоконсервировали при температуре -80°С.
(3) Измерение физиологических свойств противомикробного активного вещества DM0507
Инфракрасное измерение (ИК)
В результате выполнения ИК измерения DM0507 при следующих условиях наблюдались пики при длине 3060,48; 2958,27; 2927,41; 2871,49; 2856,06; 1737,55; 1650,77; 1573,63; 1558,20; 1469,49; 1403,92; 1274,72 и т.д. (все единицы указаны в см-1) (фиг.1).
Условия измерения
Аппарат для измерения: HORIBA FT-710 (производства Horiba Ltd).
Способ измерения: способ KBr
Температура измерения: комнатная температура
Измерение ядерно-магнитного резонанса (ЯМР)
Измерение ЯМР DM0507 проводили при следующих условиях. Эти результаты показаны в фиг.2.
Условия измерения
Аппарат для измерения: Unity INOVA 600 (производства Varian)
Частота измерения: 599,898 МГц
Растворитель измерения: диметилсульфоксид-d6
Температура измерения: 30°С
Пример 2
Измерение противомикробной активности
Измеряли противомикробную активность против следующих тестируемых штаммов с использованием противомикробного активного вещества DM0507, полученного в Примере 1.
Тестируемые штаммы
Staphylococcus aureus MSSA,
Staphylococcus aureus MRSA,
Staphylococcus hyicus,
Micrococcus luteus ATCC 9341,
Streptococcus mutans JCM 5705,
Streptococcus suis,
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes,
Enterococcus gallinarum,
Bacillus subtilis DB9011,
Bacillus subtilis ATCC 6633,
Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778,
Arcanobacterium pyogenes,
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802,
Aeromonas salmonicida,
Aeromonas hydrophila,
Actinobacillus actinomycetemcomitans JCM 2434,
Actinobacillus pleuropneumoniae тип 2,
Haemophilus parasuis,
Pasteurella multocida тип D,
Pasteurella haemolytica,
Pasteurella trehalosi,
Escherichia coli,
Salmonella typhimurium,
Salmonella choleraesuis,
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031,
Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas aeruginosa, штамм с гиперэкспрессией насоса,
Pseudomonas aeruginosa, дефицитный по насосу штамм,
Acinetobacter junii,
Acinetobacter sp.,
Stenotrophomonas maltophilia,
Legionella pneumophila серотип 1,
Mycoplasma gallisepticum,
Mycoplasma synoviae,
Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli,
Helicobacter pylori ATCC 43526,
Clostridium perfringens,
Clostridium difficile,
Propionibacterium acnes JCM 6425,
Bacteroides fragilis,
Porphyromonas gingivalis JCM 8525,
Tannerella forsythensis JCM 10827,
Lactobacillus acidophilus JCM 1132,
Bifidobacterium bifidum JCM 1255,
Anaerococcus prevotii JCM 6508,
Fusobacterium nucleatum,
Candida albicans,
Cryptococcus sp.,
Aspergillus niger и
Fusarium oxysporum
(1) Исследование
Тестируемые штаммы пересевали тремя пассажами с подходящей средой при подходящих условиях культивирования (Таблица 2) соответственно и инокулировали в среду способом наливания (2) или нижеописанным штриховым способом (3). Затем импрегнировали 20 мкл противомикробного активного вещества DM0507, полученного в Примере 1, в соответствующие тонкие бумажные диски диаметром 8 мм (производства Advantech), и выпаривали этанол путем отстаивания чашек в холодильнике в течение 30 минут при условиях, что чашки были слегка приоткрыты. В качестве контроля проводили эту же процедуру с диском, импрегнированным только этанолом. Один диск с DM0507 и контрольный диск помещали в среду, в которую был инокулирован какой-либо из тестируемых штаммов, и осуществляли инкубацию. Затем измеряли зону ингибирования вокруг диска.
(2) Способ наливания
Штамм, пересеваемый тремя пассажами, был откорректирован стерильным физиологическим раствором в объеме 1 мл до 2 стандартов МакФарланда (6,0·108/мл) и дополнительно 10-кратно разведен. Затем эту бактериальную суспензию добавляли и смешивали с заранее автоклавированной агаровой средой и культивировали при 50°С при соотношении масс 0,1%. Дополнительно, 10 мл среды, содержащей бактериальную суспензию, наслаивали на чашку, в которую заранее наливали 10 мл агаровой среды. Число клеток к этому моменту составляло 1,0·104/см2.
(3) Способ штрихов
Штамм, пересеваемый тремя пассажами, был откорректирован до 0,5 стандартов МакФарланда (1,5·108/мл) стерильным физиологическим раствором в объеме 1 мл, который был импрегнирован в стерильный хлопковый тампон на деревянной палочке (производства Eiken Kizai Co., Ltd), и на каждую среду в трех направлениях наносили штрихи.
| Таблица 2-1 | ||||||
| Название штамма | Диаметр зоны ингибирования (мм) | Способ исследования | Агаровая среда *1 | Способ культивирова- ния |
Температура культивирования (°C) | Время культивиро- вания (часы) |
| S. aureus MSSA | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. aureus MRSA | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. hyicus | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| M. luteusATCC9341 | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. mutans JCM 5705 | ≤8 | Наливание | GAM | CO2 | 35 | 24 |
| S. suis | 17 | Наливание | GAM | CO2 | 35 | 24 |
| S. pneumoniae | 14 | Штриховой | MHA с добавлением овечьей крови | CO2 | 35 | 24 |
| S. pyogenes | 14 | Штриховой | MHA с добавлением овечьей крови | CO2 | 35 | 24 |
| E. gallinarum | <8 | Наливание | GAM | CO2 | 35 | 24 |
| B. subtilis штамм DB9011 | <8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| B. subtiiisATCC6633 | 15 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| B. cereusATCC 11778 | 13 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| A. pyogenes | 20 | Наливание | Sawada | CO2 | 35 | 24 |
| V. parahaemolyticus ATCC 17802 | ≤8 | Наливание | MHA с добавлением 3% NaCl | Аэробный | 35 | 24 |
| A. salmonicida | 22 | Наливание | MHA | Аэробный | 25 | 24 |
| A. hydrophila | 13 | Штриховой | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| A. actinomycetemcomitans JCM 2434 | 10 | Наливание | GAM | CO2 | 35 | 24 |
| A. pleuropneumoniae тип 2 | 14 | Наливание | Sawada | CO2 | 35 | 24 |
| H. parasuis | 15 | Наливание | Sawada | CO2 | 35 | 24 |
| P. multocida тип D | 19 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| P. haemolytica | 21 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| P. trehalosi | <8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| E. coil | <8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. typhimurium | 10 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. choleraesuis | 12 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| K.pneumoniae ATCC 10031 | 10 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| P. aeruginosa | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| P. aeruginosa гиперэкспрес- сирующий насос штамм |
<8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| P. aeruginosa дефицитный по насосу штамм | ≤8 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| A. junii | 18 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| Acinetobacter. sp. | 9 | Штриховой | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| S. maltophilia | 26 | Наливание | MHA | Аэробный | 35 | 24 |
| L. pneumophila серотип 1 | 40 | Штриховой | B-CYE α | Аэробный | 35 | 48 |
| M. gallisepticum | 23 | Штриховой *2 | Fray | CO2 | 35 | 6 дней |
| M. synoviae | 23 | Штриховой *2 | Fray | CO2 | 35 | 6 дней |
| Таблица 2-2 | ||||||
| Название штамма | Диаметр зоны ингибирования (мм) | Способ исследования | Агаровая среда *1 | Способ культивирования | Температура культивирова- ния (°C) |
Время культивиро- вания (часы) |
| C. jejuni | 25 | Штриховой | GAM | Микроаэробный | 35 | 24 |
| C. coli | 26 | Штриховой | GAM | Микроаэробный | 35 | 24 |
| H. pylori ATCC 43526 | 19 | Штриховой | MHA с добавлением овечьей крови | Микроаэробный | 35 | 4 дня |
| C. perfringens | 18 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| C. difficile | 27 | Штриховой | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| P. acnes JCM 6425 | 33 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 48 |
| B. fragilis | 20 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| P. gingivalis JCM 8525 | 33 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 48 |
| T.forsythensis JCM 10827 | 9 | Штриховой *3 | MHA с добавлением овечьей крови | Анаэробный | 35 | 5 дней |
| L acidophilusJCM1132 | 13 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| В. bifidumJCM1255 | 23 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 48 |
| A. prevotii JCM 6508 | 21 | Наливание | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| F. nucleatum | 20 | Штриховой | GAM | Анаэробный | 35 | 24 |
| C. albicans | ≤8 | Штриховой | GAM | Аэробный | 35 | 24 |
| Cryptococcus sp. | ≤8 | Штриховой | GAM | Аэробный | 35 | 48 |
| A. niger | ≤8 | Штриховой *4 | PDA | Аэробный | 25 | 48 |
| F. oxysporum | 19 | Штриховой *4 | PDA | Аэробный | 25 | 48 |
*1: Агаровая среда
MHA: агаровая среда Мюллера-Хинтона (производимая Eiken Chemical Co., Ltd).
GAM: агаровая среда GAM (производимая Nissui Pharmaceutical Co., Ltd).
Sawada: среда Sawada (подготовленная самостоятельно)
B-CYEα: агаровая среда B-CYE((производимая Eiken Chemical Co., Ltd).
Fray: среда Фрея (подготовленная самостоятельно)
PDA: Картофельно-декстрозная агаровая среда (производимая Eiken Chemical Co., Ltd).
*2: Штриховой способ для M. gallisepticum и M. synoviae
Тремя пассажами пересевали M. gallisepticum или M. synoviae при 35°C с использованием бульона Фрея (подготовленного самостоятельно), при этом их рост был подтвержден изменением цвета на желтый. Стерильный хлопковый тампон на деревянной палочке импрегнировали бульоном третьего пассажа, цвет которого изменялся на желтый, и в трех направлениях на агаровой среде Фрея наносили штрихи.
*3: Штриховой способ для T. forsythensis JCM 10827
Для роста T. forsythensis необходима N-ацетилмурамовая кислота, поэтому его культивировали путем помещения в центр среды диска, содержащего 1,5% N-ацетилмурамовой кислоты. Пятнадцать миллиграммов N-ацетилмурамовой кислоты растворяли в 1 мл очищенной воды и фильтром 0,45 мкм фильтровали раствор. Затем 20 мкл раствора импрегнировали в соответствующие бумажные диски диаметром 8 мм и при комнатной температуре высушивали диски, которые использовали как диски, содержащие 1,5% N- ацетилмурамовой кислоты.
*4: Штриховой способ для A. niger и F. oxysporum
A. niger и F. oxysporum культивировали при 25°C в течение 7 дней с использованием среды PDA на скошенном агаре. К среде на скошенном агаре, на которой выращивали грибы, добавляли 2 мл физиологического раствора с добавлением 0,1% Твин 80 и аккуратно смешивали, и таким образом приготовляли раствор спор. Раствор спор помещали в гемоцитометр и определяли количество спор. Затем физиологическим раствором с добавлением 0,1% Твин 80 регулировали количество спор до 1 · 106/мл. Стерильный хлопковый тампон на деревянной палочке импрегнировали раствором спор и на чашке PDA в трех направлениях наносили штрихи.
Вышеуказанные результаты показали, что DM0507 настоящего изобретения имеет чрезвычайно широкий спектор противомикробной активности и потенциал противомикробной активности варьирует в зависимости от штаммов.
Пример 3
Получение лосьона, стягивающего поры
На основе стандартного способа изготовляли стягивающий поры лосьон со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Глицерин | 3,0 |
| Сорбитол | 2,0 |
| Гидрофильный сурфактант | 1,0 |
| Этанол | 14,0 |
| Цитратно-фосфатный буфер | 0,1 |
| Парафенолсульфонат цинка | 0,2 |
| DM0507* | 1,0 |
| Ароматизатор | q.s. |
| Консервант | q.s. |
| Очищенная вода | 78,7 |
| *полученное в Примере 1 |
Пример 4
Получение эмульсии
На основе стандартного способа изготовляли эмульсию со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Пчелиный воск | 0,5 |
| Вазелин | 2,0 |
| Сквалан | 5,0 |
| Липофильное эмульгирующее вещество | 0,8 |
| Гидрофильное эмульгирующее вещество | 1,2 |
| Ароматизатор | 0,5 |
| Консервант | q.s. |
| Антиоксидант | q.s. |
| Пропиленгликоль | 5,0 |
| Этанол | 4,0 |
| Водный раствор загустителя (1%) | 20,0 |
| Гидроксид калия | 0,1 |
| DM0507* | 1,0 |
| Очищенная вода | 59,9 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 5
Получение лечебного средства для чистки зубов
На основе стандартного способа изготовляли лечебное средство для чистки зубов со следующей рецептурой, смешивая соответствующие компоненты.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Хлорид цетилпиридиния | 0,01 |
| Хлорид натрия | 10,0 |
| Гидрофосфат кальция | 20,0 |
| Трагакант | 2,0 |
| Цитрат натрия | q.s. |
| Лимонная кислота | q.s. |
| Сложный эфир p-гидроксибензоата | 0,5 |
| Очищенная вода | равновесное количество |
| Ароматизатор | очень незначительное количество |
| Разрешенный краситель | очень незначительное количество |
| DM0507* | 1,0 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 6
Получение лечебного мыла
На основе стандартного способа изготовляли лечебное мыло со следующей рецептурой, смешивая соответствующие компоненты.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Триклозан | 0,3 |
| Полиоксиэтилен | q.s. |
| Лаурил эфир фосфат | 2,0 |
| Смешанный растительный экстракт | 2,0 |
| Основа для мыла | 35,0 |
| Лимонная кислота | q.s. |
| Сложный эфир p-гидроксибензоата | 0,5 |
| Очищенная вода | равновесное количество |
| Ароматизатор | очень незначительное количество |
| Разрешенный краситель | очень незначительное количество |
| DM0507* | 1,0 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 7
Получение эссенции для декоративной косметики
На основе стандартного способа изготовляли эссенцию для декоративной косметики со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Глицерин | 5,0 |
| BG | 10,0 |
| Гиалуроновая кислота | 0,01 |
| Коллаген | 0,8 |
| Аминокислота | 0,5 |
| Растительный экстракт | 0,5 |
| Карбомер | 0,2 |
| Парабен | 0,2 |
| Очищенная вода | равновесное количество |
| DM0507* | 1,0 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 8
Получение крема
Изготовляли крем со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов на основе стандартного способа.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Глицерин | 6,0 |
| BG | 7,0 |
| Гиалуроновая кислота | 0,01 |
| Растительный экстракт | 0,5 |
| Сквалан | 10,0 |
| Стеариновая кислота | 2,0 |
| Бехениловый спирт | 5,0 |
| Парабен | 0,2 |
| Очищенная вода | равновесное количество |
| DM0507* | 1,0 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 9
Получение очищающего средства
На основе стандартного способа изготавливали очищающее средство со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Глицерин | 3,0 |
| BG | 3,0 |
| Стеариновая кислота | 5,2 |
| Минеральное масло | 15,0 |
| Диалкилкарбонат | 10,0 |
| Кокоилметилтаурат | 0,5 |
| Цетеариловый спирт | 1,5 |
| Парабен | 0,2 |
| Очищенная вода | равновесное количество |
| DM0507* | 1,0 |
| * полученное в Примере 1 |
Пример 10
Получение средства для ванны
На основе стандартного способа изготовляли средство для ванны со следующей рецептурой путем смешивания соответствующих компонентов.
| (Рецептура) | (Количество в составе: % от массы) |
| Гидрокарбонат натрия | 50,0 |
| Сухой сульфид натрия | 30,0 |
| Хлорид титана | 1,2 |
| Разрешенный краситель | очень незначительное количество |
| Ароматизатор | очень незначительное количество |
| Полиэтиленгликоль | равновесное количество |
| DM0507* | 0,001 |
| * полученное в Примере 1 и затем измельченное в порошок |
Промышленная применимость
Поскольку DM0507 настоящего изобретения обладает противомикробной активностью против широкого спектра штаммов, его можно применять для противомикробного агента, противомикробного продукта, пищевого продукта или напитка, и т.д., имеющих превосходную противомикробную активность.
Краткое описание фигур
[Фиг.1] Диаграмма, показывающая ИК спектр DM0507.
[Фиг.2] Диаграмма, показывающая ЯМР спектр DM0507.
1. Противомикробное активное вещество DM0507, отличающееся тем, что оно имеет ИК-спектр, представленный на Фиг.1, и спектр ЯМР, представленный на Фиг.2 и тем, что его получают способом продуцирования, содержащим следующие этапы от (а) до (d):
(a) культивирование Bacillus subtilis DB9011 (FERM BP-3418);
(b) сбор супернатанта от полученной культуры;
(c) сбор осадка, образованного путем регулирования уровня рН супернатанта до 3 или ниже; и
(d) осуществление экстракции осадка этанолом.
2. Противомикробное активное вещество DM0507 по п.1, обладающее противомикробной активностью против следующих групп микроорганизмов от (А) до (D):
Группа (А) (аэробные/факультативные анаэробные микроорганизмы)
Streptococcus suis,
Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes,
Bacillus subtilis ATCC 6633,
Bacillus cereus var. mycoides ATCC 11778,
Arcanobacterium pyogenes,
Aeromonas salmonicida,
Aeromonas hydrophila,
Actinobacillus actinomycetemcomitans JCM 2434,
Actinobacillus pleuropneumoniae тип 2,
Haemophilus parasuis,
Pasteurella multocida тип D,
Pasteurella haemolytica,
Salmonella typhimurium,
Salmonella choleraesuis,
Klebsiella pneumoniae ATCC 10031,
Acinetobacter junii,
Acinetobacter sp.,
Stenotrophomonas maltophilia,
Legionella pneumophila серотип 1,
Mycoplasma gallisepticum и
Mycoplasma synoviae;
Группа (В) (микроаэрофильные микроорганизмы)
Campylobacter jejuni,
Campylobacter coli и
Helicobacter pylori ATCC 43526;
Группа (С) (облигатные анаэробные микроорганизмы),
Clostridium perfringens,
Clostridium difficile,
Propionibacterium acnes JCM 6425,
Bacteroides fragilis,
Porphyromonas gingivalis JCM 8525,
Tannerella forsythensis JCM 10827,
Lactobacillus acidophilus JCM 1132,
Bifidobacterium bifidum JCM 1255,
Anaerococcus prevotii JCM 6508 и
Fusobacterium nucleatum; и
Группа (D) (грибы)
Fusarium oxysporum.
3. Противомикробный агент, содержащий противомикробное активное вещество DM0507 по любому из пп.1 и 2 в качестве активного компонента и подходящий фармацевтически приемлемый носитель.
4. Пищевой продукт или напиток, содержащий противомикробное активное вещество DM0507 по любому из пп.1 и 2.
5. Способ получения противомикробного активного вещества DM0507 по п.1, отличающийся содержанием следующих этапов от (а) до (d):
(a) культивирование Bacillus subtilis DB9011 (FERM BP-3418);
(b) сбор супернатанта от полученной культуры;
(c) сбор осадка, образованного путем регулирования уровня рН супернатанта до 3 или ниже; и
(d) осуществление экстракции осадка этанолом.
