Способ получения панкреатической рибонуклеазы

Авторы патента:

Владельцы патента RU 2388821:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева" (РХТУ им. Д.И. Менделеева) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химической и микробиологической промышленности. Способ предусматривает измельчение поджелудочной железы. Измельченную поджелудочную железу обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5-6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5-2,0) при температуре 25-35°С в течение 2,5-3,5 ч. Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием и обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15-24 ч в объемном соотношении 1:(0,85-1,3) при температуре 15-25°С. Отделяют клетки поджелудочной железы центрифугированием с последующей обработкой этих клеток водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0-3,0, в течение 2,5-4,5 ч при температуре 25-35°С в объемном соотношении 1:(0,8:1,2). Полученные клетки поджелудочной железы отделяют центрифугированием с получением супернатанта. Из полученного супернатанта экстрагируют рибонуклеазу растворами серной кислоты с концентрацией 0,15-0,35 н. в течение 3-4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4-6°С. Отделяют взвешенные частицы центрифугированием с получением экстракта, содержащего рибонуклеазу. Полученный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией. Полученный концентрат охлаждают до 4-6°С и осаждают рибонуклеазу при pH 8,0-9,0. Полученный осадок промывают этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушат. Изобретение позволяет повысить выход фермента. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству ферментов, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Известен способ получения рибонуклеазы (РНК-азы) [Kunitz M., J. Gen. Physiol, 24, 15 (1940); McDonald M.R., Methods in enzymology, Vol.2, p.427 (S.P.Colowick and N.O.Kaplan, Eds.), New York. Academic Press (1955)] путем экстрагирования из свежей бычьей поджелудочной железы 0,25 н. раствором серной кислоты в объемном отношении 1:2 в течение 24 ч с последующим осаждением из экстракта трипсиногена, химотрипсиногена и дезоксирибонуклеазы сернокислым аммонием при 0,6 насыщении, затем при 0,8÷0,85 насыщения фракционируют РНК-азу. Выделенный таким способом фермент обычно загрязнен следовыми количествами протеолитических ферментов. Очистку [Тугунов С.С., Константинов В.Л. и др. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратов ферментов трипсина, химотрипсина и рибонуклеазы из панкреатической железы / Труды Ленинградского химико-фармацевтического института, 1967, вып.20, с.9-18] производственного высола РНК-азы осуществляют повторным переосаждением сульфатом аммония. Обезвоживание осадка РНК-азы проводят этанолом. Сушку кристаллов РНК-азы проводят под вакуумом при температуре 50°С. Выход препарата, по предлагаемой технологии, составляет 0,1% от массы сухой поджелудочной железы. Недостатками данного способа выделения панкреатической РНК-азы являются низкий выход продукта из-за многостадийности процесса, длительность проведения, низкая степень осаждения РНК-азы вследствие ее малой концентрации в растворе.

Известен способ получения панкреатической РНК-азы из поджелудочной железы крупного рогатого скота [Пат. RU 2180918 C1, МПК⁷ C12N 9/22. Способ получения панкреатической рибонуклеазы. Дата публикации: 27.03.2002. Изобретатель: Красноштанова А.А., Баурина М.М., Кашкина Е.А., Крылов И.А. Патентообладатель: Российский химико-технологический университет им. Д.И.Менделеева]. Для увеличения выхода препарата была предложена следующая схема выделения. Фермент выделяется путем экстракции 0,25 н. раствором серной кислотой в отношении 1:2 в течение 24 ч. После отделения взвешенных частиц центрифугированием супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 450 с диаметром пор 450 Å при давлении 0,2 МПа. Пермеат, полученный на данной стадии, используется при повторной экстракции. Осаждение проводят при pH среды 7,8÷8,0. Осадок технической РНК-азы растворяют в дистиллированной воде и раствор нагревают до температуры 85÷90°С с последующим выдерживанием 10 мин. После этого повторно осаждают РНК-азу при pH среды 7,8÷8,0. Выпавшие кристаллы очищенной РНК-азы промывают этанолом и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Получают таким способом 1,2 г РНК-азы с 1 кг ПЖ с активностью 12000-14000 ед./мл. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Указанный способ обладает рядом недостатков, главным из которых является длительность процесса очистки - нагрев, выдержка и охлаждение занимает 30 мин, данная стадия заметно ухудшает качество препарата - в очищенном препарате содержится около 30% примесных инактивируемых белков, при этом выход препарата не превышает 0,6% от массы сухой поджелудочной железы.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода панкреатической РНК-азы в условиях комплексной переработки поджелудочной железы, с предварительным извлечением ферментов пищеварительной группы, таких как амилаза, липаза и комплекс протеаз.

Поставленная задача решается тем, что предлагается способ извлечения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа:раствор соли 1:(1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95% этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1:(0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием; обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0, в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1:(0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 часов при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1:5 и сушку. В отличие от прототипа, в данном способе выделения сокращается время экстракции РНК-азы из клеток ПЖ, а также не нужно проводить инактивацию белков, обладающих протеазной и ДНК-азной активностью, так как получаемый экстракт не содержит данных ферментов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 1000 г (250 г по абсолютно сухому веществу) измельченной поджелудочной железы обрабатывают раствором хлорида натрия 4,5 мас.% (объемное соотношение поджелудочная железа:раствор соли 1:1,5), в течение 2,5 ч при температуре 25°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий амилазу 29,6 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 770 г, 167 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают 95% этиловым спиртом в течение 15 ч в объемном соотношении 1:0,85 при температуре 15°С, клетки ПЖ отделяют центрифугированием. Получают супернатант, содержащий липазу 8,77 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 400 г, 87 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0, в течение 2,5 часов, объемном соотношении 1:0,8 при температуре 25°С. Получают супернатант, содержащий комплекс протеаз 1252 ед./мл, и отработанные клетки ПЖ (масса 350 г, 72 г по абсолютно сухому веществу), которые обрабатывают раствором серной кислоты с концентрацией 0,15 н. в течение 3 ч при температуре 4°С (объемное соотношение 1:0,8). Взвешенные частицы отделяют центрифугированием, в результате получают супернатант с активностью РНК-азы 100 ед./мл. Супернатант подвергают ультраконцентрированию через ацетилцеллюлозную мембрану УПМ 10 с отсечкой 10 кДа при давлении 0,2÷0,4 МПа. Получаемый на данном этапе пермеат используют повторно на стадии экстракции, ультраконцентрат с активностью РНК-азы 2100 ед./мл подвергают дополнительной очистке с использованием диафильтрации. После этого концентрат охлаждают до температуры 4÷6°С и доводят значение pH среды до 8,0÷9,0. Осадок РНК-азы перекристаллизовывают этиловым спиртом в отношении 1:5. Полученные очищенные кристаллы РНК-азы высушивают в вакуум-сушильном шкафу. В результате получают 0,75 г рибонуклеазы с активностью 12000-14000 ед./мг. Выход препарата по предлагаемой технологии составляет 0,3% от массы сухих веществ исходной поджелудочной железы и 1,04% от массы сухих веществ на стадии.

Условия проведения предварительной обработки ПЖ и экстракции РНК-азы сведены в таблицу.

При осуществлении данного способа выделения РНК-азы из ПЖ происходит увеличение выхода ферментного препарата на стадии выделения РНК-азы в 1,3÷1,7 раза по сравнению с аналогом, при этом активность ферментного препарата РНК-азы не понижается. Также упрощается технологическая схема за счет исключения из технологического процесса стадий очистки ферментного препарата от примесных гидролаз и сокращения времени экстракции.

Проведенный расчет технико-экономических показателей получения РНК-азы по прототипу (в индивидуальном производстве) и в комплексном производстве показал, что в первом случае себестоимость 1 г фермента составляет 110 руб., а при комплексной переработке - 13 руб. Таким образом, при организации комплексного производства себестоимость препарата снижается в 8,5 раз, а срок окупаемости дополнительных капитальных вложений не превышает 1,5 года.

Способ получения панкреатической рибонуклеазы из поджелудочной железы, предусматривающий измельчение, обработку измельченной поджелудочной железы раствором хлорида натрия 4,5÷6 мас.% в объемном соотношении поджелудочная железа : раствор соли 1 : (1,5÷2,0) при температуре 25÷35°С в течение 2,5÷3,5 ч, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы 95%-ным этиловым спиртом в течение 15÷24 ч в объемном соотношении 1 : (0,85÷1,3) при температуре 15÷25°С, отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, обработку клеток поджелудочной железы водой, подкисленной соляной кислотой до pH 1,0÷3,0 в течение 2,5÷4,5 ч при температуре 25÷35°С в объемном соотношении 1 : (0,8÷1,2), отделение клеток поджелудочной железы центрифугированием, экстракцию рибонуклеазы растворами серной кислоты с концентрацией 0,15÷0,35 н. в течение 3÷4 ч при объемном соотношении 1:(0,8-1,2) при температуре 4÷6°С, отделение взвешенных частиц центрифугированием, концентрирование экстракта ультрафильтрацией на мембране УПМ 10 с последующей диафильтрацией, охлаждение экстракта до 4÷6°С, осаждение фермента при pH 8,0÷9,0, промывку полученного экстракта этиловым спиртом в объемном соотношении 1 : 5 и сушку.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, устойчивого к стрептомицину продуценту щелочной внеклеточной рибонуклеазы.

Способ получения холестеролэстеразы, трипсина, дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы из поджелудочной железы крупного рогатого скота // 2311455

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в производстве медицинских препаратов - рибонуклеазы панкреатической, дезоксирибонуклеазы панкреатической, трипсина, а также холестеролэстеразы.

Олигонуклеотидпептидный конъюгат, обладающий способностью расщеплять фосфодиэфирные связи рнк в последовательностях 5'gpn3' // 2305108

Изобретение относится к биоорганической химии. .

Способ разделения смеси человеческой днказы (варианты), очищенная дезамидированная человеческая днказа, очищенная недезамидированная человеческая днказа, фармацевтическая композиция для снижения вязкоупругости гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего скоплением гноя (варианты), способ лечения пациента, страдающего муковисцидозом, бронхитом, пневмонией // 2238320

Изобретение относится к биотехнологии, касается идентификации и характеристики двух компонентов рекомбинантного препарата ДНКазы. .

Способ получения инсерционных мутаций // 2237715

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения инсерционных мутаций в случайных или псевдослучайных положениях в хромосомной или внехромосомной нуклеиновой кислоты клетки-мишени.

Молекула каталитической днк, обладающая сайтспецифической эндонуклеазной активностью (варианты), композиция, расщепляющая нуклеиновую кислоту, способ расщепления фосфоэфирной связи в субстрате, способ селекции каталитической днк (варианты), молекула энзиматической днк (варианты) // 2220204

Изобретение относится к ферментативным нуклеиновым (НК) кислотам, которые способны расщеплять последовательности нуклеиновых кислот. .

Модифицированная tn5-транспозаза, набор для транспозиции, способ транспозиции, фрагмент днк и генетическая конструкция мобильной последовательности днк // 2218406

Изобретение относится к генетической инженерии. .

Актин-резистентный вариант днказы i (варианты), выделенная нуклеиновая кислота, способ снижения вязкоупругости или вязкой консистентности мокроты пациента // 2215787

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения варианта ДНКазы I человека, имеющей уменьшенное сродство связывания в отношении актина.

Способ получения панкреатической рибонуклеазы // 2180918

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения панкреатической рибонуклеазы, и может быть использовано в медицинской, химической и микробиологической промышленности.

Способ очистки рибонуклеазы // 2152995

Изобретение относится к технологии производства ферментов. .

Контролируемая деградация структурированных полирибонуклеотидов // 2458986

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в препаративной биохимии РНК

Конструкция на основе белковой пары барназа-барстар и способ ее получения // 2480524

Изобретение относится к области нанотехнологии и биотехнологии

Штамм бактерий aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью // 2520086

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм бактерий Aeromonas bestiarum - продуцент щелочной рибонуклеазы, обладающий противовирусной активностью и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером B-1270. Штамм обладает высокой продукцией щелочной рибонуклеазы - 921,8 Е/мл и активностью против вирусов гриппа птиц A/H5N1 и человека А/Аichi/2/68 (H3N2). 2 ил., 7 табл., 8 пр.

Штамм бактерий serratia species, являющийся продуцентом внеклеточной рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью // 2528064

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species является продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Предложенный штамм депонирован в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1287. При использовании культуральной жидкости или экстракта клеток штамма для производства противовирусных препаратов нейтрализация вирусов гриппа A/chickenKurgan/05/2005 и A/Aichi/2/68 составляет 100%. 1 ил., 2 табл., 6 пр.

Применение фермента рибонуклеазы bacillus pumilus в качестве ингибитора фитопатогенных вирусов // 2542480

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве. Предложено применение фермента РНКазы Bp в качестве ингибитора развития РНК-геномных фитовирусов. Изобретение обладает высокой эффективностью в отношении ингибирования РНК-геномных фитовирусов. При обработке растений табака раствором фермента РНКазы Bp концентрацией 100 мкг/мл дистиллированной воды 94% растений являются невосприимчивыми к вирусу-Х табака. 10 з.п. ф-лы, 8 табл., 6 пр.

Ингаляционная лекарственная форма полисиалированной дезоксирибонуклеазы i человека и способ ее получения // 2559522

Изобретение относится к биотехнологии. Описана лиофилизированная лекарственная форма гликопротеина дезоксирибонуклеазы I человека для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты, отличающаяся тем, что указанный гликопротеин представляет собой рекомбинантную дезоксирибонуклеазу I человека с аминокислотной последовательностью, представленной в описании, получаемую в микроорганизме Е. coli и ковалентно связанную своим N-концом с полисахаридом, содержащим от 65 до 80 звеньев альфа-2,8 сиаловой кислоты в полисахаридной цепи. Гликопротеин используется в качестве активного вещества в количестве 45,0±5,0 мас.%. В качестве вспомогательных веществ используются магния хлорид 3,5±0,5 мас.%, кальция хлорид 4,0±0,5 мас.% и лактоза 45,0±5,0 мас.%. Предложен способ получения указанной лекарственной формы, отличающийся тем, что к водному раствору синтетического гликопротеина формулы I добавляют водный раствор, содержащий магния хлорид, кальция хлорид, лактозу при следующем соотношении компонентов, мас.%: гликопротеин формулы I (45,0±5,0), магния хлорид (3,5±0,5), кальция хлорид (4,0±0,5), лактоза (45,0±5,0); перемешивают, затем стерильно разливают во флаконы боросиликатного стекла, лиофилизируют, заполняют флаконы стерильным азотом, стерильно укупоривают флаконы пробками и обжимают колпачками. Изобретение позволяет получить препарат полисиалированной рекомбинантной ДНКазы I человека, пригодный для приготовления ингаляционного раствора для снижения вязкости мокроты. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

Средство для селективной апоптотической элиминации опухолевых клеток // 2567670

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в биотехнологии, генетической инженерии, медицине и ветеринарии. Предложено применение РНКаза Bacillus sp. ВКПМ В-9862 в качестве средства для селективной апоптотической элиминации опухолевых клеток. Предложенное средство обладает выраженным апоптозиндуцирующим действием в отношении малигнизированных клеток, при этом не оказывает токсического эффекта на нормальные клетки крови, печени, нервной ткани и фибробласты. 4 ил., 5 пр.

Мутантные полимеразы вируса гепатита в // 2625021

Настоящее изобретение относится к биохимии, в частности к мутантному полипептиду полимеразы ВГВ, содержащему мутантный домен полимеразы ВГВ с внутренней делецией, которая подавляет функциональную активность полимеразы, и мутантный домен РНКазы Н с внутренней делецией и мутациями, которые подавляют функциональную активность РНКазы Н. Настоящее изобретение также относится к гибридному белку, содержащему указанный мутантный полипептид полимеразы ВГВ и коровый полипептид ВГВ или иммуногенные домены HBsAg envl и env2. Указанный мутантный полипептид и гибридные белки используют для индукции или стимуляции иммунного ответа против ВГВ. Настоящее изобретение также раскрывает молекулу нуклеиновой кислоты и экспрессирующий вектор, а также композицию и набор для лечения или предотвращения инфекции, вызванной ВГВ, или ассоциированных с ВГВ заболеваний и патологических состояний. Настоящее изобретение также раскрывает клетку-хозяина и способ для получения указанных гибридных белков и способ получения вирусных частиц, использующий указанный вектор экспрессии. Настоящее изобретение позволяет улучшить иммуногенность мутантных полипептидов ВГВ с сохранением при этом безопасности при их использовании. 11 н. и 35 з.п. ф-лы, 11 ил., 2 пр.