Биопрепарат в виде водной суспензии для повышения почвенного плодородия

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и, в частности, к производству бактериальных препаратов на основе азотфиксирующих бактерий, используемых в агротехнике для повышения плодородия почвы и урожайности. Биопрепарат содержит штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1×10⁹ кл/мл в культуральной жидкости, поваренную соль, микроэлементы: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор и воду, при следующем соотношении компонентов, мас.%: штамм бактерий в культуральной жидкости - 50-60, микроэлементы - 0,2-0,3, поваренная соль - 1,0-1,5, вода - до 100%. Изобретение позволяет повысить плодородие почвы, урожайность культурных растений, увеличить срок хранения препарата. 4 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии и, в частности, к производству бактериальных препаратов на основе азотфиксирующих бактерий, используемых в агротехнике для повышения плодородия почвы и урожайности.

Известно использование в сельском хозяйстве различных, в первую очередь минеральных, удобрений, которые вводят в почву в виде растворов, порошка или гранул. Недостатком известных удобрений следует признать их медленно оказываемое действие на растения, поскольку процесс освобождения питательных веществ из удобрений длителен и происходит в основном за счет сообщества микроорганизмов, присущего почве, в которую внесли указанное удобрение. Поэтому вносят вместе с удобрениями различные биодобавки, ускоряющие процесс высвобождения питательных веществ из различных удобрений, а также процесс усвоения высвобожденных веществ растениями. Кроме того, указанные биодобавки способствуют дополнительному накоплению питательных веществ в почве в легкоусвояемой растениями форме.

Известно, что основным источником азота для почвы является молекулярный азот атмосферы. Процесс его усвоения, перевод в доступную для растений форму осуществляется с помощью микроорганизмов азотфиксаторов. Почвенные микроорганизмы-азотфиксаторы при успешном развитии способны накапливать в почве значительные количества до 100 кг/га минерального азота, усвояемого растениями. При внесении в почву азотфиксирующих микроорганизмов значительно сокращается применение минеральных азотных удобрений. Микроорганизмы-азотфиксаторы, переводя молекулярный азот атмосферы в доступную для растений форму, улучшают азотное питание сельскохозяйственных растений.

В настоящее время применение бактериальных препаратов для повышения плодородия почвы является перспективным приемом агротехнологии, альтернативой возрастающему использованию минеральных удобрений. Это особенно актуально в условиях необходимости экологической безопасности.

Известно применение бактериальных удобрений на основе различных штаммов микроорганизмов или их метаболитов (авт. св. СССР №1473345, пат. РФ. №1806123, пат. РФ №2041867).

Для повышения эффективности удобрения в них дополнительно вводят водные суспензии бактериальных культур (авт. свид. СССР №589238), суспензии дрожжей и одноклеточных водорослей (авт. свид. СССР №935501), предварительно ферментированный птичий помет и торф, консорциум бактерий Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Dactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus acidophilus (RU, патент 2055823, С05F 11/08, 1996).

Известно использование различных микроорганизмов: азотфиксирующие (Azotobacter chroococcum), фосфаторастворяющие (Bacillus mucilaginosus), молочнокислые в виде консорциума, содержащего Streptococcus thermophilus. Streptococcus bovis, Lactobacillus salivaries var salicinicus, Lactobacillus salivaries var salivarus, Lactobacillus acidophilus. Дополнительно могут быть внесены Trichoderma viride, Beauveria bassiana (патент РФ №2081866).

Общими недостатками использования микроорганизмов являются сложность производства, а также наличие проблем при хранении и транспортировании и связанная с этим низкая стабильность препарата.

Известно большое количество микроорганизмов-азотфиксаторов, используемых для получения на их основе бактериальных препаратов: симбиотические и ассоциативные азотфиксаторы, свободноживущие азотфиксаторы. Давно известны и применяются препараты на основе свободноживущих азотфиксирующих бактерий рода Azotobacter: препарат «Азотобактерин» (сб. «Бактериальные удобрения», ред. Березовая Е.Ф., Доросинский Л.М., 1961 г., Ленинград). В основном для данных препаратов использовали бактерии Azotobacter chrorococum. Известны штаммы Azotobacter chrorococum для бактериального препарата (авт.св. СССР №1316189). Данный штамм является несимбиотическим азотфиксатором для ячменя. Препарат на основе этого штамма имеет незначительный срок годности и слабую эффективность в полевых условиях, длительное время культивирования - около 130 часов. Также следует признать низкую продуктивность культуры при выращивании в предлагаемых условиях, использование дорогостоящего и дефицитного стимулятора роста - арахидоновой кислоты, а также низкую жизнеспособность культуры на кислых почвах (рН меньше 5,0) и в условиях низкой влажности (меньше 20%).

Использование Azotobacter позволяет повысить урожай в основном лишь овощных культур и кормовых трав (Мишустин Е.Н. и др. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., 1973. Barber J.E. et al. Plant fnd Sil. 1979. 52. №1).

Штамм Azotobacter mysorens-7 №164 применяется для изготовления бактериального удобрения, повышающего урожайность злаковых кормовых трав (авт. свид. СССР №1083531).

Наиболее близким техническим решением к предлагаемому относится биопрепарат, который содержит ассоциацию азотфиксирующих бактерий Azotobacter chrorococum и Beijerinckia fluminensis, консервант, а также микро- и макроэлементы, например ионы магния, железа, марганца, цинка, молибдена, бора и кобальта (пат. РФ №2148571).

Общим недостатком известных биопрепаратов является низкая жизнеспособность культуры на кислых почвах, низкая продуктивность культуры.

Техническая задача, решаемая посредством настоящего изобретения, состоит в разработке биопрепарата на основе штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 для повышения почвенного плодородия, способствующего повышению урожайности культурных растений, увеличению срока хранения препарата и более простой и дешевой технологии получения препарата.

Поставленная цель достигается путем использования биопрепарата для повышения почвенного плодородия, содержащего азотфиксирующие бактерии, консервант и микроэлементы медь, цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор, при этом в качестве азотфиксирующих бактерий используется штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1×10⁹ кл/мл в культуральной жидкости, а в качестве консерванта используют поваренную соль, при следующем соотношении компонентов, мас.%

штамм бактерий в культуральной жидкости	50-60
микроэлементы	0,2 - 0,3
поваренная соль	1,0-1,5
вода	остальное до 100

Штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 является продуцентом экзополисахарида (патент РФ 2073712). Препарат получают простой и дешевой технологией получения препарата, а именно используют один штамм, что упрощает технологию и позволяет повысить технологическую стерильность.

Штамм Azotobacter vinelanlii (Lipman) выделен из почвы методом почвенных пластинок из нейтральной пахотной почвы АБС МГУ "Чашково". Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИгенетики", наименование штамма ФЧ-1, присвоенный номер при депонировании ВКПМ В-5933. Штамм растет на многих натуральных и синтетических средах: МПА, агаризованном сусле, средах Эшби, Виноградского, Федорова. Культивирование на указанных средах осуществляется при 28-30°С в течение 2-2,5 суток при рН 6,8-7,2.

Для улучшения роста культуры и синтеза втор-метаболитов в состав сред вносится азот в виде аммонийных солей и органический азот в виде белково-витаминного концентрата (БВК). На вязкость раствора постферментационной жидкости рН в интервале 2-11 не влияет, система биологически стабильна.

Пример 1. Бактерия Azotobacter vinelandii (Lipman) ВКПМ В-5933 при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в условиях аэрации при 20-30°С в течение 48 ч продуцирует экзополисахарид, превращая постферментационную жидкость в гель. Культивирование штамма осуществляли на жидкой минеральной среде, содержащей в 100 г воды К₂НРO₄ - 1,0 г; MgSO₄·7Н₂O - 0,5 г; FeSO₄·7Н₂O - 0,0005 г; Na₂МоO₄ ·2H₂О - 0,005 г.

В качестве источника углеродного питания использовали глюкозу в концентрации 1,5%. При культивировании на жидкой минеральной среде заявляемый штамм требует дополнительный фактор роста - ферментализат БВК в количестве 0,2 г на 100 г воды. Выращивание осуществляли при 28-30°С в условиях аэрации и перемешивании в колбах объемом 750 см³ со 100 мл среды указанного состава в течение 48 ч на качалках (n 220 об/мин). При этом происходит подкисление среды до рН 4,7 за счет выделения органических кислот и СО в культуральную жидкость. Было установлено оптимальное значение рН для роста культуры Azotobacter vinelandii (Lipman) 6,8-7,0 и для синтеза экзополисахаридов 6,8-7,2.

Пример 2. Периодическое культивирование штамма Azotobacter vinelandii (Lipman) осуществляют в аппаратах типа АНКум объемом 10 л, рабочий объем 4 л. Использовали среду из примера 1. В качестве источника углеродного питания применяли этанол в количество 1 об. В качестве инокулята использовали штамм, полученный по примеру 1, в колбе на качалке. Количество инокулята 10-20%. Условия проведения процесса: температура 28-30°С, рН 6,8-7,2, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин, скорость перемешивания 300 об/мин, время культивирования 18-20 ч. Содержание живых бактерий в культуральной жидкости 1,3×10⁹ кл/мл. Процесс идет стабильно, ассоциация устойчиво сохраняет свои свойства в пяти последовательных ферментациях.

Авторами были установлены новые свойства штамма бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Указанная культура обладает рядом ценных характеристик: возможность развития на кислых почвах (рН меньше 5,5), в условиях пониженной влажности (12-14%), на почвах, бедных органикой. Культура накапливает значительные количества витаминов (табл.1). При определенных условиях культура синтезирует значительное количество полисахаридов-альгинатов, которые играют важную роль в выживаемости и адаптационных процессах при внесении препарата в почву. Температурный режим +12+40°С.

При выращивании культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 на плотных средах культура образует так называемую полисахаридную капсулу, что способствует устойчивости биопрепарата при хранении и в почве.

При разработке состава препарата с использованием культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 было проверено влияние микроэлементов: кобальта, молибдена, бора, магния, марганца, цинка. Результаты испытаний отражены в табл.3. При использовании заявленного препарата с микроэлементами установлено экспериментально положительное влияние микроэлементов на азотфиксацию и выживаемость штамма Azotobacter vinelandii при хранении и внесении в почву.

Биопрепарат эффективен по азотфиксации, обладает способностью к синтезу биологически активных веществ в защищенном и открытом грунте в широком диапазоне рН и влажности, удобен в применении, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов.

Пример 3.

Биопрепарат готовили в аппарате с мешалкой. Для приготовления препарата использовали культуру Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, выращенную в условиях примера 2.

Взяли 50 г культуральной жидкости, содержащей Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933. Дополнительно внесли в культуральную жидкость смесь микроэлементов: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор в равных долях из расчета 0,22 г смеси микроэлементов, в качестве консерванта внесли соль поваренную (ГОСТ Р 51574 - 2000) 1 г. Добавили воду до 100 г, перемешали. Товарная форма препарата - водная суспензии.

Таким образом, предлагаемый препарат имеет следующий состав, из расчета на 100 г препарата:

культуральная жидкость Azotobacter vinelandii
ВКПМ В-5933	50 г
микроэлементы	0,22 г
поваренная соль	1 г
вода	48,78

Срок хранения препарата 12 месяцев.

Используемые составы биопрепарата в последующих опытах приведены в табл.1.

Экспериментально была установлена способность культуры Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 синтезировать и выделять витамины, играющие важную роль в нормальном обмене веществ и жизнедеятельности растений (табл.2).

Полученный препарат использовали для обработки овощей защищенного грунта (помидоры, огурцы) и открытого грунта (картофель). Результаты применения приведены в табл.3.

Было определено влияние биопрепарата на урожайность ячменя и пшеницы при применении в фазе кущения. Опытно-производственные обработки полей ячменя и пшеницы проведены с помощью аэрозольного генератора регулируемой дисперсности. Результаты приведены в табл.4.

В условиях 2006 года на яровой пшенице биопрепарат проявил высокую эффективность, увеличивал урожайность культуры в пределах 13-18% и проявлял свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям. Показатели фитосанитарного состояния посевов были более благополучными на вариантах с используемым препаратом. Снижалось развитие корневых гнилей на 15-20% и бурая ржавчина развивалась менее интенсивно на 5-10% по сравнению с контролем.

Предложенный препарат, кроме накопления фиксированного азота, проявляет свойства, усиливающие сопротивляемость пшеницы к различным заболеваниям, улучшает показатели фитосанитарного состояния посевов, снижает интенсивность развития корневых гнилей и бурой ржавчины, что позволяет сохранить урожай при существенном сокращении использования для данных целей различных ядохимикатов.

Таким образом, применение предложенного препарата позволяет сократить внесение азотных минеральных удобрений, повысить урожайность и получить более качественную, содержащую большое количество белка, углеводов, витаминов продукцию при существенном сокращении содержания в продукции нитратов, нитритов, вредных ядохимикатов.

Таблица 1
Культуральная жидкость Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933, мас.%	Микроэлементы, мас.%	Консервант, мас.%	Срокхранения, месяц	Прибавка урожая огурцов, кг/м2
50	0,2	1,0	12	4,4
60	0,3	1,5	12	4,7
55	0,25	1,2		4,5
Штамм по прототипу (пат.2148571) 50%	0,22	1	4,5	3,8

Таблица 2
Наименование витаминов	Содержание витаминов в мкг на 1 г сухого вещества в клетках Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933
Тиамин	90
Рибофлавин	356
Никотиновая кислота	395
Биотин	5,1

Таблица 3
Культура	Урожайность различных культур, кг/м2
Контроль (без добавления препарата)	С добавлением биопрепарата	С добавлением биодобавки по прототипу
Томаты	17,2	23,1	21,7
Огурцы	13,5	17,8	16,5
Картофель	11,4	17,3	17,3

Таблица 4
Культура	Площадь, га	Урожай, ц/га	Прибавка
опыт	контроль	опыт	контроль	ц/га	%
Ячмень «Ача»	120	34	28,8	22,6	6,2	27
Пшеница
Новосибирская 20	4,9	56,1	31,6	27,4	4.4	15
Пшеница Новосибирская 15	34,5	7,5	24,4	19,9	4,5	18

Биопрепарат для повышения почвенного плодородия, содержащий азотфиксирующие бактерии Azotobacter, консервант микроэлементы: цинк, магний, марганец, кобальт, молибден, бор и воду, отличающийся тем, что в качестве азотфиксирующих бактерий используется штамм бактерий Azotobacter vinelandii ВКПМ В-5933 с содержанием живых бактерий не менее 1·10⁹ кл/мл в культуральной жидкости, а в качестве консерванта использована поваренная соль при следующем соотношении компонентов, мас.%:

штамм бактерий в культуральной жидкости	50-60
микроэлементы	0,2-0,3
поваренная соль	1,0-1,5
вода	остальное до 100%