Способ фторирования для синтеза 2-[18f]-фтор-2-дезокси-d-глюкозы

Изобретение относится к способу получения защищенного фторированного производного глюкозы, включающему взаимодействие производного тетраацетилманнозы с фторидом, отличающемуся тем, что реакцию проводят в растворителе, содержащем воду в количестве, превышающем 1000 частей на миллион и составляющем менее 50000 частей на миллион. Предпочтительно защищенное фторированное производное глюкозы представляет собой 2-фтор-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкозу (тетраацетилфторглюкозу или pFDG), производное тетраацетилманнозы представляет собой 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-O-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозу (трифлат тетраацетилманнозы), растворитель представляет собой ацетонитрил, фторид представляет собой ионный фторид с калиевым противоионом и к фториду добавлен катализатор фазового переноса, такой как 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло-[8,8,8]-гексакозан. 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

 

Изобретение относится к способу фторирования производных сахаров и, в частности, изобретение относится к получению фторированной глюкозы. Способ особенно пригоден для приготовления производных сахаров, фторированных радиоактивным фтором, используемых в таких способах исследования, как позитрон-эмиссионная томография (ПЭТ).

В способах приготовления изотопных индикаторов, меченных [¹⁸F], которые применяют в ПЭТ, одним из наиболее важных факторов является общий нескорректированный выход синтеза. Он зависит не только от общего химического выхода способа, но и от времени синтеза, которое является чрезвычайно важным фактором из-за относительно короткого периода полураспада [¹⁸F], составляющего 109,7 минут.

[¹⁸F]-фторид ион обычно приготавливают в виде водного раствора, получаемого при циклотронном облучении молекул-мишеней воды, содержащих [¹⁸О]. Для превращения [¹⁸F]-фторида в реакционноспособный нуклеофильный реагент, пригодный для использования в реакциях нуклеофильного введения радиоактивных изотопов, применяли разнообразные операции. Как и в реакциях фторирования нерадиоактивным фтором, эти операции включали элиминирование воды от [¹⁸F]-фторидного иона и создание подходящего противоиона (Handbook of Radiopharmaceuticals 2003 Welch & Redvanly eds. Ch.6 pp.195-227). Затем реакции нуклеофильного радиофторирования проводят в безводных растворителях (Aigbirhio et al., 1995, J. Fluor. Chem. 70 pp.279-87). Отделение воды от фторидного иона называется приготовлением «голого» фторидного иона. Присутствие значительных количеств воды, как полагают, приводит к сольватации фторидных ионов, экранирующей фторидный ион, что предотвращает проведение нуклеофильной атаки по защищенному предшественнику сахара. Таким образом, в данной области техники отделение воды считается операцией, необходимой для повышения реакционной способности фторид-иона и избежания получения побочных гидроксилированных продуктов, образующихся в присутствии воды (Moughamir et al., 1998 Tetr. Letts. 39 pp.7305-6).

В патенте США 6172207, относящемся к способу синтеза соединений, меченных [¹⁸F], таких как [¹⁸F]-фтордезоксиглюкозы ([¹⁸F]-FDG), подчеркнута необходимость получения абсолютно безводного фторирующего агента, который получают добавлением ацетонитрила в водные растворы с последующим азеотропным испарением досуха.

Наиболее широко используемым способом синтеза [¹⁸F]-FDG является способ, предложенный Hamacheret al., J. Nucl. Med. 27:235-238 (1986), который включает проведение реакции 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-O-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозы с [¹⁸F]-фторидом в безводном растворителе.

Способы, используемые в настоящее время для приготовления производных сахаров, меченных [¹⁸F], имеют ряд недостатков; одним из них является то, что полное отделение остаточной воды от фторид-иона и растворителя занимает некоторое время и, следовательно, влияет на общий нескорректированный выход синтеза. Кроме того, необходимость удаления всей остаточной воды приводит к повышению синтетической и механической сложности любого автоматического синтезирующего устройства. Например, для синтеза может потребоваться большее количество циклов осушения, в то время как для выполнения синтеза в синтезирующем устройстве может потребоваться установка более мощного нагревателя.

Кроме того, обычно довольно сложно обеспечить хорошую воспроизводимость реакции радиофторирования. Это объясняется частым присутствием небольших количеств остаточной воды в растворителе (например, в количестве приблизительно 1000 частей на миллион), и общий нескорректированный выход синтеза значительно изменяется в зависимости от количества остаточной воды, присутствующей во время проведения реакции введения радиоактивного индикатора. Было установлено, что можно поддерживать содержание воды, составляющее 1500 частей на миллион +/-200 частей на миллион, т.е. с отклонением 15%. При 750 частях на миллион такое абсолютное отклонение содержания воды приведет к удвоению процентного отклонения.

Авторы неожиданно обнаружили, что фторирование производных сахаров не обязательно проводить в безводных условиях. Действительно, если тщательно регулировать содержание воды в реакционной смеси, то фактически повышается радиохимическая чистота (и, следовательно, общий выход) получения производных. Это особенно неожиданно, учитывая особое внимание, которое на существующем уровне техники уделялось проведению реакции в безводных условиях.

Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к способу получения фторированного производного сахара, включающему взаимодействие нефторированного производного сахара с фторидом, отличающемуся тем, что указанную реакцию проводят в растворителе, содержащем воду в количестве, превышающем 1000 частей на миллион и составляющем менее 50000 частей на миллион.

Способ, предлагаемый согласно настоящему изобретению, имеет значительные преимущества перед способами существующего уровня техники. Во-первых, было обнаружено, что выход реакции не только не уменьшается, но, наоборот, увеличивается в присутствии таких регулируемых количеств воды.

Во-вторых, поскольку содержание воды в реакционной смеси превышает 1000 частей на миллион, то обеспечить присутствие соответствующего количества воды в реакционной смеси становится намного проще (например, намеренно вводя загрязняющие количества воды в растворитель для проведения реакции), что означает большую воспроизводимость условий реакции.

В-третьих, это позволяет исключить несколько стадий сушки, применяемых в существующем уровне техники, что может снизить общую стоимость способа как в отношении стоимости реактивов, так и в отношении себестоимости синтезирующего устройства. Также полагают, что упрощение способа окажет позитивное влияние на общую надежность способа.

В настоящем описании термин «нефторированное производное сахара» относится к сахару типа полисахарида, олигосахарида, дисахарида или моносахарида, в котором одна из групп ОН замещена отщепляющейся группой, которая, возможно, связана с твердой подложкой, например, как описано в WO-A-03/002157. Способ, предлагаемый согласно настоящему изобретению, особенно пригоден для фторирования моносахаридов, таких как глюкоза, фруктоза, рибоза, арабиноза, манноза или галактоза.

В «защищенном нефторированном производном сахара» остальные группы ОН сахара защищены подходящими защитными группами.

Термин «фторированное производное сахара» относится к сахару типа полисахарида, олигосахарида, дисахарида или моносахарида, такому как глюкоза, фруктоза, рибоза, арабиноза, манноза или галактоза, в котором одна из групп ОН замещена на атом фтора.

В «защищенном фторированном производном сахара» остальные группы ОН сахара защищены подходящими защитными группами.

Подходящие защитные группы, применяемые для защиты производных сахаров в соответствии с настоящим изобретением, известны в данной области техники и описаны, например, в публикации "Protecting Groups in Organic Synthesis", Theodora W.Green and Peter G.M.Wuts, опубликованной John Wiley & Sons Inc. Выбор конкретной защитной группы зависит от предполагаемого использования фторированного продукта, но, например, гидроксильная группа может быть защищена превращением ее в алкильную или ароматическую сложноэфирную группу, например, по реакции с алканоилхлоридом, таким как ацетилхлорид. В альтернативном случае гидроксильные группы могут быть превращены в эфирные группы, например в алкильные или бензиловые эфиры.

Предпочтительно, как исходные материалы, так и продукты реакции представляют собой защищенные производные сахаров.

Подходящие отщепляющиеся группы хорошо известны в данной области техники и включают толуолсульфонатную и метансульфонатную группы. Однако особо предпочтительная отщепляющаяся группа представляет собой трифторметансульфонатную (трифлатную) группу.

Реакция фторирования обычно представляет собой реакцию нуклеофильного замещения, а замещение отщепляющейся группы фтором может вызывать инверсию стереохимического строения сахара, протекающую по механизму SN2. Таким образом, исходное нефторированное производное сахара часто бывает производным сахара, который отличается от продукта.

Предпочтительный продукт представляет собой защищенное фторированное производное глюкозы, которое может быть получено из соответствующего производного маннозы, например из производного тетраацетилманнозы.

Реакция особенно пригодна для приготовления 2-фтор-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкозы (тетраацетилфторглюкозы или pFDG) из 1,3,4,6-тетра-О-ацетил-2-O-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозы (трифлата тетраацетилманнозы).

Подходящие растворители включают апротонные органические растворители, такие как ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, диоксан, 1,2-диметоксиэтан, сульфолан или N-метилпирролидинон либо смесь любых указанных растворителей. Однако было обнаружено, что наиболее предпочтительным растворителем для проведения реакции является ацетонитрил.

Несмотря на то, что повышения выхода реакции достигают за счет включения в растворитель по меньшей мере 1000 частей на миллион, но менее 50000 частей на миллион воды, дальнейшего повышения выхода достигали за счет добавления от 1000 до 15000 частей на миллион воды. Наилучшие результаты получали при использовании растворителя, содержание воды в котором составляло приблизительно от 2000 до 7000 частей на миллион, предпочтительно от 2500 до 5000 частей на миллион. В одном из примеров реализации предпочтительное содержание воды составляет от 3000 до 6000 частей на миллион.

В настоящем описании при обозначении содержания воды в конкретном растворителе термин «части на миллион» означает микрограммы воды/грамм.

Правильной концентрации воды в растворителе можно достигать либо сушкой влажного растворителя до достижения желаемого содержания воды, либо добавлением подходящего количества воды в сухой растворитель. Фторид можно получать в водном растворе и в этом случае раствор фторида с желаемым содержанием воды можно получать многократным добавлением растворителя с последующим испарением смеси растворитель/вода или разбавлением водного раствора фторида желаемым органическим растворителем. Содержание воды в растворителе также можно снизить, применяя поглотительную смолу, такую как функционализированная полистирольная смола, например эпоксидная смола, метилизоцианатная смола или функционализированная смола на основе ангидридов кислот, предназначенная для удаления воды из раствора фторида. Подходящие смолы являются коммерчески доступными продуктами, например, поставляемыми Novabiochem. Технические характеристики поглотительной смолы можно улучшить, используя подходящий катализатор, например, 4-диметиламинопиридин (4-DMAP).

В этом примере реализации стадию сушки можно проводить смешиванием поглотительной смолы с раствором фторида в контейнере и последующим отделением поглотительной смолы при помощи фильтрования. В альтернативном и особенно подходящем случае, если поглотительную смолу применяют в автоматическом синтезирующем устройстве, поглотительная смола может находиться в сосуде, через который пропускают раствор фторида. Раствор фторида можно пропускать через поглотительную смолу непрерывным потоком, например со скоростью от 0,1 до 100 мл/мин, или в периодическом режиме, выдерживая раствор в контакте с поглотительной смолой в течение времени пребывания, достаточного для осушения.

Такое применение поглотительной смолы является новым; таким образом, в соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения предложен способ снижения содержания воды в растворе радиофторида, в частности в растворе [¹⁸F]-фторида, который включает контакт указанного раствора с поглотительной смолой. Удобно получать раствор фторида в апротонных органических растворителях, таких как ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, диоксан, 1,2-диметоксиэтан, сульфолан и N-метилпирролидинон; наиболее подходящим растворителем является ацетонитрил.

Реакцию можно проводить в растворе или, в альтернативном случае, нефторированное производное сахара может быть связано с твердой подложкой с образованием вектора смола-линкер (RVL) формулы (I):

ТВЕРДАЯ ПОДЛОЖКА-ЛИНКЕР-Х-Защищенное нефторированное производное сахара (I)

где твердая подложка представляет собой любую подходящую твердую подложку;

защищенное нефторированное производное сахара определено выше;

Х представляет собой группу, промотирующую нуклеофильное замещение по конкретному центру защищенного нефторированного производного сахара, например -SO₂O-;

линкер представляет собой любую органическую группу, которая служит для достаточного разделения реакционноспособного центра и структуры твердой подложки с целью создания максимальной реакционной способности, например содержащая от нуля до четырех арильных групп (например, фенильных), и/или C₁-С₆-алкильную или галогеналкильную (в особенности, фторалкильную) цепочку, и, возможно, от одной до четырех дополнительных функциональных групп, таких как амидные или сульфонамидные группы.

Системы RVL подробно описаны в WO-A-03/002157, в которой также описаны подходящие линкеры.

RVL формулы (I) вводят в контакт с раствором фторида, что приводит к отщеплению сахара от твердой подложки с образованием защищенного нефторированного производного сахара.

Подходящие твердые подложки также описаны в WO-A-03/002157 и включают полимеры, такие как полистирол (который может быть блокпривитым, например, полиэтиленгликолем), полиакриламид или полипропилен, или стекло, или кремний с нанесенным на него покрытием из указанного полимера. В альтернативном случае, например, может быть использована смола, подобная описанной в WO-A-03/002157. Твердая подложка может находиться в виде мелких разрозненных частиц, например шариков или палочек, или в виде покрытия на внутренней поверхности картриджа или микрососуда. Проведение способа, предлагаемого согласно настоящему изобретению, на твердой подложке позволяет получать продукт в чистом виде, без проведения дополнительной стадии разделения. Это особенно выгодно, если фторирование представляет собой радиофторирование, поскольку любое сэкономленное время при изготовлении продукта приводит к повышению нескорректированного радиохимического выхода.

Реакцию обычно проводят при температуре от 5 до 180°С, но, в частности, от 75 до 125°С.

Способ, предлагаемый согласно настоящему изобретению, можно осуществлять как часть автоматизированного синтеза. Это осуществимо, если реакция протекает в растворе, или если нефторированный сахар связан с твердой фазой.

Фторид, который приводят во взаимодействие с нефторированным производным сахара, может представлять собой ионное соединение и может находиться в паре с любым подходящим противоионом. Однако, важно отметить, что противоион должен иметь достаточную растворимость в реакционном растворителе, чтобы поддерживать растворимость фторида. Таким образом, подходящие противоионы включают большие, но мягкие ионы металлов, таких как рубидий или цезий, или, в альтернативном случае, ионы неметаллов, такие как ионы тетраалкиламмония и тетраалкилфосфония. Ионы калия также можно использовать в качестве противоионов, но в этом случае для повышения реакционной способности фторида добавляют катализатор фазового переноса, такой как 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло-[8,8,8]-гексакозан (продаваемый под торговой маркой Kryptofix™ 2.2.2), чтобы повысить растворимость соли калия в органических растворителях.

Способ, предлагаемый согласно настоящему изобретению, хорошо подходит для получения радиофторированных производных, в частности производных, меченных [¹⁸F], и, следовательно, фторид может включать [¹⁸F]-фторидный ион.

Как было кратко отмечено выше, [¹⁸F]-фторидный ион можно получать облучением молекул-мишеней воды, содержащих [¹⁸О], и эта операция может представлять собой начальную стадию способа, предлагаемого согласно настоящему изобретению.

Способ по настоящему изобретению особенно пригоден для получения радиофторированных производных сахаров, например [¹⁸F]-pFDG, с которых затем может быть снята защита с образованием таких соединений, как [¹⁸F]-FDG, хорошо известного изотопного индикатора для ПЭТ. Снятие защиты может представлять собой дополнительную стадию способа. Если защитная группа в получаемом фторированном сахаре представляет собой сложный эфир, например производное ацетила, то снятие защиты можно проводить кислотным или щелочным гидролизом.

Другие дополнительные стадии включают удаление избытка [¹⁸F]-фторида из раствора и удаление органического растворителя. Избыток [¹⁸F]-фторида можно удалять любым стандартным способом, например ионообменной хроматографией или твердофазными поглотителями. Подходящие ионообменные смолы включают BIO-RAD AG 1-X8™ и Waters QMA™, а подходящие твердофазные поглотители включают оксид алюминия.

Органический растворитель можно удалять испарением при повышенной температуре в вакууме или пропусканием потока инертного газа, такого как азот или аргон, через раствор.

Конечный продукт этих стадий, т.е. изотопный индикатор, меченный [¹⁸F], можно изготовить в виде композиции для введения пациенту, например в виде водного раствора, который можно приготовить растворением меченного [¹⁸F] изотопного индикатора в стерильном изотоническом солевом растворе, который также может содержать до 10% подходящего органического растворителя, например этанола, или, в альтернативном случае, в подходящем буферном растворе, таком как фосфатный буфер. В композицию можно вводить и другие добавки, например аскорбиновую кислоту, которая снижает радиолиз.

Как уже было отмечено, особенно предпочтительно соединение, которое можно получить способом по настоящему изобретению, - это [¹⁸F]-pFDG, и, следовательно, второй аспект настоящего изобретения относится к способу приготовления [¹⁸F]-pFDG, причем указанный способ включает реакцию трифлата тетраацетилманнозы с [¹⁸F]-фторидом и отличается тем, что указанный фторид растворяют в растворителе, содержащем воду в количестве, превышающем 1000 частей на миллион и составляющем менее 50000 частей на миллион. В одном из примеров реализации этого аспекта настоящего изобретения трифлат тетраацетилманнозы (1 эквивалент) взаимодействует с [¹⁸F]-фторидом в присутствии Kryptofix™ 2.2.2 (от 0,9 до 1,1 молярных эквивалентов; предпочтительно, от 0,98 до 0,99 молярных эквивалентов) и карбоната калия (от 0,4 до 0,6 молярных эквивалентов; предпочтительно от 0,50 до 0,60 молярных эквивалентов) в ацетонитриле, содержащем воду в количестве, превышающем 1000 частей на миллион и составляющем менее 50000 частей на миллион.

Предпочтительные особенности настоящего изобретения подробно рассмотрены выше для первого аспекта изобретения. В частности, способ может включать начальную стадию получения [¹⁸F]-фторида облучением молекул-мишеней воды, содержащих [¹⁸О], и последующую стадию превращения [¹⁸F]-pFDG в [¹⁸F]-FDG кислотным или щелочным гидролизом.

Далее изобретение будет более подробно описано со ссылками на примеры и чертежи где:

На Фиг.1 изображен график зависимости радиохимической чистоты получаемой [¹⁸F]-pFDG от содержания воды в растворителе.

На Фиг.2 - график зависимости образования [¹⁸F]-pFDG и защищенной глюкозы в процессе введения изотопного индикатора при помощи вектора смола-линкер.

На Фиг.3 - график зависимости радиохимической чистоты получаемой [¹⁸F]-pFDG от содержания воды в растворителе при автоматизированном синтезе.

Пример 1. Влияние изменения содержания воды на введение изотопного индикатора [¹⁸F] в молекулы сахаров

В этом примере применяли три разных способа введения изотопного индикатора ¹⁸F^- и исследовали влияние изменения содержания воды в реакционной смеси.

а) Введение изотопного индикатора при помощи вектора смола-линкер (RVL)

Ион ¹⁸F^- вводили в Tracerlab MX™, и систему сушили с применением стандартного способа сушки, используемого в получении 2-[¹⁸F]-фтор-2-дезоксиглюкозы. Для повышения растворимости фторида в ацетонитриле применяли Kryptofix™ 2.2.2/карбонат калия. После завершения сушки и последующего растворения фторида в ацетонитриле отбирали образец раствора осушенного ¹⁸F^- в ацетонитриле для проведения анализа содержания воды, который проводили при помощи титрометра Карла Фишера. При необходимости для достижения содержания воды, превышающего концентрацию, получаемую при сушке, добавляли дополнительное количество воды.

В картридж Hi Trap® емкостью 1 мл упаковали приблизительно 370 мг предшественника защищенной маннозы, связанного с твердофазной подложкой, при замещении 0,003 ммол/г. Один конец картриджа соединяли посредством петли с поршнем шприца. Другой конец картриджа соединяли с флаконом, наполненным N₂ и снабженным выпускным отверстием, закрытым молекулярным ситом. Для нагрева картриджа использовали пистолет-распылитель горячего воздуха; внешняя температура картриджа составляла 80°С.

Затем через систему пропускали 6×0,5 мл сухого ацетонитрила для удаления каких-либо примесей и воды (естественно присутствующих в смоле, например, из-за неполной сушки) и затем ацетонитрил отбрасывали. Флакон для автоотбора проб, содержащий высушенный раствор ¹⁸F^- (450 мкл), вставляли в аппарат на отведенное ему место. Затем поршень шприца передвигал высушенный раствор фторида возвратно-поступательным способом при скорости потока 180 мкл/мин в течение 5 циклов. Высушенный фторид взаимодействовал с твердофазным предшественником маннозы с высвобождением защищенного производного [¹⁸F]-2-дезоксиглюкозы (которое после снятия защиты образует 2-[¹⁸F]-2-дезоксиглюкозу).

Затем из флакона для автоотбора проб брали образец объемом 5 мкл, который исследовали при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ); образец помещали на пластинку силикагеля 60 F254 и проявляли смесью ацетонитрила с водой, взятых в отношении 90/10. Радиохимическую чистоту устанавливали при помощи устройства мгновенного формирования изображения Perkin Elmer.

b) Введение изотопного индикатора в трифлат тетраацетилманнозы

Готовили раствор 32 мг K₂CO₃ в 600 мкл H₂O хроматографической чистоты с добавлением 150 мг Kryptofix™ 2.2.2, растворенного в 2,5 мл ацетонитрила. В реактор, изготовленный из стеклоуглерода, помещали 0,6 мл этого раствора и приблизительно 40 МБк (мегабеккерель) ¹⁸F^- в воде, обогащенной ¹⁸О. Автоматический регулятор нагревателя устанавливали на отметке 95°С и реакционный сосуд нагревали в течение 35 минут для осушения фторида. Воду и ацетонитрил выпаривали в токе азота.

Для ускорения азеотропного удаления воды из фторида в него вводили, разделив на три порции, 1 мл ацетонитрила через 2-х минутные интервалы; первое добавление производили спустя 20 минут после начала операции сушки. Спустя 35 минут нагреватель отключали и реакционный сосуд охлаждали потоком сжатого воздуха снаружи реакционного сосуда приблизительно до температуры 45°С.

Затем к высушенному фториду добавляли 25 мг трифлата маннозы в 2,0 мл CH₃CN и перемешивали. Автоматический регулятор нагревателя устанавливали на отметке 85°С. Спустя 2 минуты после достижения заданной температуры отбирали образец для ТСХ. Нагреватель отключали, и реакционный сосуд охлаждали потоком сжатого воздуха приблизительно до температуры 45°С.

Образец для ТСХ помещали на полоску с силикагелем и проявляли смесью ацетонитрила с водой, взятых в отношении 95:5. Радиохимическую чистоту устанавливали при помощи устройства мгновенного формирования изображения Perkin Elmer. Затем снимали крышку реакционного сосуда и отбирали образец объемом 50 мкл для анализа содержания воды, который выполняли на титрометре Карла Фишера.

с) Автоматизированное введение изотопного индикатора

Введение изотопного индикатора проводили с помощью опытного образца платформы для автоматизированного синтеза, включающего 25 трехходовых клапанов, встроенный нагреваемый реакционный сосуд и одноразовую полипропиленовую кассету. Проточный канал кассеты также позволял производить очистку промежуточных продуктов или конечного продукта с помощью твердофазной экстракции.

Первоначально фторид был зафиксирован на картридже квадурпольного масс-анализатора (QMA), и его элюировали раствором, содержащим 20 мг Kryptofix™ 2.2.2, 4,1 мг K₂CO₃, 320 мкл CH₃CN, 80 мкл H₂O. Затем смесь сушили при 105°С/120°С в течение приблизительно 6 минут в токе азота и вновь растворяли в 1,5 мл раствора трифлата тетраацетилманнозы в ацетонитриле концентрацией приблизительно 20 мг/мл.

Реакцию введения изотопного индикатора проводили при температуре реакции, равной либо 105°С, либо 120°С, в течение либо 90, либо 270 секунд. После введения изотопного индикатора 2-[¹⁸F]-2-дезоксиглюкозу анализировали способом ТСХ. Пластинка для ТСХ представляла собой пластинку силикагеля 60 F254; хроматограмму проявляли смесью 95% ацетонитрила и 5% воды. Радиохимическую чистоту устанавливали при помощи устройства мгновенного формирования изображения Perkin Elmer.

Результаты трех экспериментов Примера 1 показаны на Фиг.1, из которого ясно, что радиохимическая чистота продукта относительно низка, если содержание воды в растворителе меньше 1000 частей на миллион, но она сильно улучшается, если содержание воды в растворителе составляет от 1000 до 5000 частей на миллион. Из графика видно, что оптимальные концентрации воды в растворителе находятся в диапазоне от 2000 до 7000 частей на миллион.

Пример 2. Корреляция между образованием [¹⁸F]-pFDG и защищенной глюкозы в процессе введения изотопного индикатора

Введение [¹⁸F] в RVL проводили в ацетонитриле в присутствии Kryptofix™ 2.2.2, карбоната калия и различных количеств воды. После введения индикатора полученную смесь подвергали жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) с обращенной фазой, с градиентом проявителя: от смеси 90% растворитель А:10% растворитель В (растворитель А=0,1% раствор трифторуксусной кислоты в воде; растворитель В=0,1% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) до 5% А, 95% В, в течение 10 минут при скорости 1 мл/мин, с использованием колонки Phenomenex Luna 5 мкм C₁₈ (4,6 мм × 150 мм). Были определены и скоррелированы интегральные пики, соответствующие защищенной глюкозе при времени задержки, равном 3 минуты, и защищенной FDG при времени задержки, равном 6,6 минут (в основном, благодаря присутствию [¹⁹F]-FDG, концентрация которой пропорциональна концентрации [¹⁸F]-FDG).

В общем, полагают, что присутствие больших количеств воды в реакционной смеси приводит к образованию больших количеств защищенной глюкозы (а не [¹⁸F]-pFDG), происходящему в результате нуклеофильного замещения трифлатной группы. Таким образом, полагают, что график зависимости концентрации [¹⁸F]-pFDG от концентрации производного защищенной глюкозы в смеси продуктов реакции должен иметь отрицательный наклон, причем большие концентрации воды должны приводить к образованию больших концентраций защищенной глюкозы и меньших концентраций [¹⁸F]-pFDG.

Однако исследования введения изотопного индикатора в трифлат тетраацетилманнозы, связанный со смолой, показали, что имеется сильная положительная корреляция (см. Фиг.2) между двумя пиками на хроматограмме ЖХВД. Это указывает на то, что присутствие высоких концентраций воды замедляет образование обоих продуктов.

Пример 3. Автоматизированный синтез 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-фтор-β-D-маннопиранозы

Отбор пробы из радиоактивной реакционной смеси в начале введения радиоизотопного индикатора оказался проблематичным. Таким образом, содержание воды, а также радиохимическую чистоту измеряли при помощи мгновенной тонкослойной хроматографии (МТСХ) по окончании реакции введения радиоизотопного индикатора. Затем содержание воды в начале реакции введения радиоизотопного индикатора вычисляли, определяя коэффициент связывания воды, как описано ниже.

Эксперимент по введению радиоизотопного индикатора

Синтез 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-фтор-β-D-маннопиранозы проводили при помощи автоматического синтезирующего устройства, в которое может быть вставлена одноразовая кассета. Эта кассета включает 25-клапанную одноразовую кассету, включающую различные флаконы, содержащие реактивы, а также шприцы и пространство для установки картриджей твердофазной экстракции.

Затем выполняли последовательность синтезов, включающую фиксацию приблизительно 50 МБк [¹⁸F]-фторида в 2 мл воды в картридже Waters Access PlusQMA (в виде карбонатной формы) и последующее элюирование картриджа раствором Kryptofix и карбоната в ацетонитриле/воде (Kryptofix 2.2.2 - 20,3 мг, карбонат калия - 4,3 мг, ацетонитрил - 320 мкл, вода - 80 мкл) в нагреваемый реактор. Полученную смесь сушили в токе сухого азота, затем в реактор добавляли раствор трифлата маннозы в ацетонитриле, содержащий определенные количества воды.

Далее реактор выдерживали еще в течение 80 секунд при внешней температуре нагревателя, равной 125°С, затем отбирали 0,6 мл раствора, которые отбрасывали (для удаления каких-либо следов остаточной воды из трубок), и остаток переносили во флакон с продуктом. Содержание воды во флаконе с продуктом определяли титрованием Карла Фишера, используя 50 мкл раствора, а радиохимическую чистоту определяли при помощи мгновенной тонкослойной хроматографии (МТСХ). Тонкослойную хроматографию производили на пластинках силикагеля, предназначенных для проведения для ТСХ, проявляя смесью 95% ацетонитрила и 5% воды, а затем измеряли относительное содержание [¹⁸F]-фторида и 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-фтор-β-D-маннопиранозы (во всех случаях они были единственными компонентами) при помощи МТСХ.

Измерение коэффициента связывания воды

Для определения снижения количества воды во время реакции с трифлатом маннозы проводили два холодных (нерадиоактивных) опыта, в которых из реактора отбирали определенный объем жидкости до и после введения индикатора. Это позволяло определить коэффициент связывания воды в измеряемых количествах воды.

Затем выполняли последовательность синтезов, аналогичную последовательности эксперимента введения радиоизотопного индикатора; при этом 2 мл воды пропускали через картридж Waters Access PlusQMA (в карбонатной форме), после чего картридж элюировали раствором Kryptofix и карбоната в ацетонитриле/воде (Kryptofix 2.2.2 - 20,3 мг, карбонат калия - 4,3 мг, ацетонитрил - 320 мкл, вода - 80 мкл) в нагреваемый реактор. Полученную смесь сушили в токе сухого азота, затем в реактор добавляли раствор трифлата маннозы в ацетонитриле, содержащий определенные количества воды.

После добавления в реактор раствора трифлата маннозы отбирали 0,6 мл раствора, которые помещали во флакон с продуктом. Далее реакцию введения радиоизотопного индикатора проводили еще в течение 80 секунд при внешней температуре нагревателя, равной 125°С, затем отбирали остаток раствора, который помещали в отдельный флакон с продуктом. Содержание воды в каждом флаконе определяли титрованием Карла Фишера, используя 50 мкл раствора.

Результаты определения опытов по связыванию воды показаны в Таблице 1, в которой приведены концентрации воды, присутствующие в ацетонитрильном растворителе.

Таблица 1
Перед началом реакции (части на миллион)	После проведения реакции (части на миллион)
786	802
2603	2527
8433	7860

При низких и средних концентрациях воды значительного связывания воды в результате реакции с трифлатом маннозы не наблюдали. Однако при повышенных концентрациях воды наблюдали снижение содержания воды приблизительно на 7%.

Результаты введения радиоизотопного индикатора

Для получения содержания воды перед началом проведения реакции введения радиоизотопного индикатора измеряли содержание воды в каждой реакции введения радиоизотопного индикатора, которое затем уточняли, вводя коэффициент связывания воды трифлатом маннозы. Степени радиохимической чистоты, полученные для каждой концентрации воды, приведены в Таблице 2 и показаны на Фиг.3.

Таблица 2
Части на миллион воды до начала реакции (вычислено)	Радиохимическая чистота, %
506	94,6
707	91,4
2803	97,6
3855	95,9
4114	96,7
5779	98,4
5943	94,1
7980	85,6
9206	73,6
15382	85,0
43375	85,5

Эти результаты подтверждают, что предпочтительное содержание воды составляет от 3000 до 6000 частей на миллион. Если исключить случайный результат при 73,6% радиохимической чистоты, то результаты реакции группируются около радиохимической чистоты, равной 85%, даже при большом содержании влаги.

1. Способ получения защищенного фторированного производного глюкозы, включающий взаимодействие производного тетраацетилманнозы с фторидом, отличающийся тем, что реакцию проводят в растворителе, содержащем воду в количестве, превышающем 1000 частей на миллион и составляющем менее 50000 частей на миллион.

2. Способ по п.1, в котором защищенное фторированное производное глюкозы представляет собой 2-фтор-1,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-глюкозу (тетраацетилфторглюкозу или pFDG), а указанное производное тетраацетилманнозы представляет собой 1,3,4,6-тетра-O-ацетил-2-O-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозу (трифлат тетраацетилманнозы).

3. Способ по любому из п.1 или 2, в котором растворитель выбирают из группы, содержащей ацетонитрил, диметилформамид, диметилсульфоксид, тетрагидрофуран, диоксан, 1,2-диметоксиэтан, сульфолан и N-метилпирролидинон.

4. Способ по п.3, в котором растворитель представляет собой ацетонитрил.

5. Способ по п.1, в котором содержание воды в растворителе составляет приблизительно от 1000 до 15000 частей на миллион.

6. Способ по п.5, в котором содержание воды в растворителе составляет приблизительно от 2000 до 7000 частей на миллион.

7. Способ по п.1, в котором содержание воды в растворителе составляет приблизительно от 3000 до 6000 частей на миллион.

8. Способ по п.7, который проводят в растворе.

9. Способ по п.1, который автоматизирован.

10. Способ по п.1, в котором фторид представляет собой ионный фторид с калиевым противоионом, и к фториду добавлен катализатор фазового переноса, такой как 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло-[8,8,8]-гексакозан.

11. Способ по п.1 для приготовления радиофторированного производного сахара.

12. Способ по п.11, в котором радиофторированное производное сахара представляет собой производное сахара, меченное [¹⁸F].

13. Способ п.12, в котором указанное производное сахара, меченное [¹⁸F], представляет собой [¹⁸F]-pFDG.

14. Способ п.1, также включающий одну или несколько дополнительных стадий, проводимых в любом порядке:
1) удаление избытка фторида из раствора;
2) снятие защиты с защищенного фторированного производного сахара с получением незащищенного фторированного производного сахара;
3) удаление органического растворителя; и
4) введение незащищенного фторированного производного сахара в водный раствор.