Применение местной композиции, содержащей эпидермальный фактор роста (еgf), для профилактики ампутации по поводу диабетической стопы

Изобретение относится к применению композиций для местного применения, которые содержат эпидермальный фактор роста. Изобретение направлено на применение эффективного количества эпидермального фактора роста, инкапсулированного или связанного с деформируемыми или обычными липосомами, для производства фармацевтической композиции для местного применения для лечения диабетических язв стопы IV и V степени тяжести у пациентов с диабетом. Изобретение обеспечивает высокую биодоступность EGF в ткани глубоко ниже очагов поражения и позволяет предотвратить ампутацию по поводу диабетической стопы. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 табл., 1 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям для местного применения, которые содержат эпидермальный фактор роста (EGF), инкапсулированный или связанный со способными деформироваться или обычными липосомами, которые предназначены для нанесения на поверхность хронических ишемических поражений кожи и вокруг них, для профилактики ампутации по поводу диабетической стопы.

Уровень техники изобретения

Сахарный диабет и его осложнения являются главной нетравматической причиной ампутаций нижней конечности. Это является медицинской проблемой с повышающейся важностью, так как заболеваемость и распространенность диабета должны увеличиваться в результате старения популяции и сидячего образа жизни. По крайней мере, у 15% пациентов, страдающих диабетом, развиваются хронические язвы на ногах на протяжении всей жизни, установлено, что 20% этих пациентов требуется ампутация нижней конечности (Reiber G.E., Boyko E.J., Smith D.G. (1995) Lower extremity foot ulcers and amputations in diabetes. In: Harris M.I., Cowie C.C., Reiber G., Boyko E., Stern M., Bennett P., editors. Diabetis in America, Washington, DC: US Government Printing Office, 409-28; Moss S.E., Klein R, Klein B.E. (1992) The prevalence and incidence of lower extremity amputation in a diabetic population. Arch Int Med. 152:610-6).

Для лечения пациентов с диабетической стопой применяли несколько способов, включая строгий метаболический контроль, профилактику модифицируемых факторов риска, хирургическое удаление омертвевших тканей, применение перевязочных средств, лечение инфекций с помощью противомикробных средств, устранение любого давления, оказываемого на область поражения, применение кожных имплантатов, факторов роста и способов реваскуляризации в случае, если они показаны.

При строгом метаболическом контроле, наиболее важным шагом лечения диабетических язв является хирургическое удаление омертвевших тканей, и это необходимо осуществлять перед любым другим методом местного лечения. Этот способ включает удаление погибшей или инфицированной ткани (включая кости), которая может находиться в пределах области поражения и окружающей мозолистой ткани. Широко известно применение при диабетических язвах стопы перевязочных средств, и, несмотря на то, что было изучено несколько видов перевязочных средств, преимущества каждого вида перевязочного средства среди других неизвестны. Кроме того, так как проведено небольшое число исследований перевязочных средств, и они были направлены главным образом на язвы с небольшим поражением, для демонстрации их эффективности необходимо больше доказательств, полученных при клинических испытаниях. К новым видам перевязочных средств, которые были изучены в клинических испытаниях, относятся средства, основанные на полупроницаемой полимерной мембране, промогран (коллагеновая матрица), альгинате, карбоксиметилцеллюлозе, гиалуронане, и средства, в которых применяется давление ниже атмосферного (Eldor R., et al. (2004) New and experimental approaches to treatment of diabetic foot ulcers: a comprehensive review of emerging treatment strategies. Diabet Med.21(11):1161-73).

Применяли также вспомогательные лечебные средства, такие как гемореологическая и вазоактивная терапия, которые обеспечивали некоторый положительный эффект не только в хронической стадии язвы, но также и при ее повторном обострении, однако это лечение не распространялось на лечение диабетической стопы. Гемореологическая терапия основана на доказанном существовании у пациентов, страдающих диабетом, гемореологических нарушений и эффекте их усиления при инфекциях. С другой стороны, вазоактивную терапию применяли при нарушениях местной перфузии, которые являются следствием макро- или микроангиопатии, при которых некоторые простаноиды действуют на тканевом уровне.

При некоторых состояниях применяли ингибиторы агрегации тромбоцитов и тромболитические агенты. С другой стороны, методика реваскуляризации у пациента с ишемией (диабетической или не диабетической) является рискованной, дорогостоящей и не подходит для всех пациентов. Показания для нее очень ограничены, так же, как и для эндоваскулярной хирургии, которая показала недостаточную эффективность, не только в аорто-подвздошном, но также и в бедренно-подколенном артериальных секторах, связанную с кальцификацией и повышенной секторизацией очагов поражения. Другим изобретением для лечения распространенных острых поражений кожи, таких как венозные язвы, является создание искусственных заменителей кожи человека. Однако информация относительно их применения при ишемических диабетических язвах стопы ограничена, и не понятно, как эти изделия способны контролировать ишемический процесс, который лежит в основе, как причина нарушения заживления раны (New Skin for Old. Developments in Biological Skin Substitutes. Arch Dermatol. 1998 134:344-348).

Другим альтернативным вариантом было применение факторов роста. Недавно Управление по контролю за продуктами и лекарствами Соединенных Штатов (FDA) одобрило применение человеческого рекомбинантного тромбоцитарного фактора роста (PDGF) для стимуляции заживления диабетических нейропатических язв ног.

Несмотря на это, последнее рандомизированное двойное слепое мультицентровое клиническое исследование, в котором гелевую композицию PDGF наносили на поверхность поражений, демонстрирует только 50% эффективность (Wieman T.J., Smiell J.M., Su Y. (1998). Эффективность и безопасность местной гелевой композиции рекомбинантного человеческого тромбоцитарного фактора роста BB (бекаплермин) у пациентов с хроническими нейропатическими диабетическими язвами. III фаза рандомизированного плацебо контролируемого двойного слепого исследования. Diabetes Care. 21(5):822-7). Кроме того, поражения, леченые в этом клиническом испытании были только до степени злокачественности и IV, с обычным снабжением артериальной кровью. Кроме того, была высока скорость развития рецидивов, наблюдаемых в этом исследовании (30% через три месяца). Самые удовлетворительные результаты лечения нейропатических диабетических язв ног с применением эпидермального фактора роста (EGF) были описаны Berlanga J., и др. (WO 03/053458 A1). Это изобретение демонстрирует высокую эффективность (более 50%) лечения поражений более высокой степени тяжести (IV и V) с тяжелым ишемическим компонентом, таким образом предотвращая ампутацию диабетической стопы. В этом клиническом исследовании, EGF инфильтрировали в очаги поражения и вокруг них с помощью игл для подкожного введения. Этот способ инфильтрации очень эффективен для введения EGF, так как с помощью него можно доставить высокое количество EGF непосредственно в жизнеспособную ткань. Тем не менее, инъекция имеет недостаток, так как вызывает боль; в результате чего некоторые пациенты могут отказаться от лечения, и этот способ также вызывает риск развития сепсиса.

Липосомы были предложены для применения в различных местных способах введения, так как они облегчают абсорбцию лекарственных средств через кожу, уменьшают связанную с лекарственным средством токсичность и обеспечивают замедленное высвобождение лекарственных средств в течение более длительного периода времени. Коллоидные свойства липосом, которые определяют их эффективность транспорта лекарственных средств при местном пути введения, зависят среди других факторов в основном от их липидного состава. В основном, установлено, что традиционные липосомы, состоящие из фосфолипидов и стеринов, модулируют проникновение лекарственных средств через кожу, поскольку эти везикулы, несмотря на то, что они не способны проникать через жизнеспособную кожу, могут накапливаться в ороговевающем слое и других слоях, находящихся ближе к поверхности кожи (Barry B.W. (2001) Новые механизмы и устройства для возможности эффективной чрескожной доставки лекарственных средств. Eur J Pharm Sci. 14(2):101-14; van den Bergh, B.A.I., de Vries, I.S., Bouwstra, J.A., (1998). Взаимодействия между липосомами и ороговевающим слоем кожи человека, изученные с помощью электронной микроскопии с замораживанием-замещением. Int. J. Pharm. 167, 57-67). Если в липосомы включают тензоактивные агенты, такие как детергенты, такие везикулы проявляют большую способность к деформации (деформирующиеся липосомы), что позволяет им проникать, в интактной форме и более эффективно, через поры ороговевшего слоя в более глубокие жизнеспособные слои кожи (Cevc G., Schatzlein A., Richardsen H. (2002), Ультрадеформирующиеся липидные везикулы могут проникать через кожу и другие полупроницаемые барьеры, оставаясь нефрагментированными. Доказательства, полученные в двухмаркерных CLSM экспериментах и непосредственные определения размеров. Acta 1564(1 ):21-30; Cevc G. (2004). Липидные везикулы и другие коллоиды в качестве средства доставки лекарственных средств на кожу. Adv Drug Deliv Rev. 56(5):675-711). Однако, эффективность традиционных липосом, состоящих из фосфолипидов и стеринов, для введения EGF с помощью местного пути, продемонстрирована в способах применения, которые значительно отличаются по своей природе от описанных в настоящем изобретении. В частности Uster, P.S. и др. (US 4944948) сообщали, что объединение EGF с дисперсией липосом высокой вязкости может пролонгировать поддержание местной концентрации EGF в участке введения у кроликов. Кроме того, показано, что композиция EGF с Su Yu Ping, в которой липосома является главным компонентом, усиливает, по сравнению с EGF в отдельности, заживление у пациентов ожоговых ран II степени при применении с помощью местного пути введения (Liao Y., Guo L, Ding E.Y. (2003). Сравнительное исследование заживления ожоговых ран при лечении с помощью различных способов применения рекомбинантного человеческого эпидермального фактора роста. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 17(4):301-2). С другой стороны, не было описано или предложено применение деформируемых липосом для местного нанесения EGF на очаги хронического ишемического поражения кожи, приводящие к высокому риску ампутации у пациентов с диабетической стопой. Несмотря на то, что показано, что эти липосомы, загруженные помимо EGF другими активными компонентами, способны более эффективно проникать через обычную кожу, из этих опытных данных нельзя заключить, могут ли везикулы транспортировать EGF с достаточной эффективностью к областям, находящимся глубоко ниже нейропатических и ишемических хронических кожных очагов поражения IV или V степени тяжести, для возможности их заживления и профилактики ампутации стопы. Поскольку структура кожи в пределах этих типов поражений значительно отличается от структуры обычной кожи, очевидно, что проницаемость и целостность липосом в пределах очагов поражения такого типа могут значительно изменяться. Кроме того, поскольку ткань такого типа очагов поражения диабетической стопы содержит намного больший уровень протеолитических ферментов, чем в обычной коже (Yager D.R., Chen S.M., Ward S.I., et al. (1997) способность жидкостей хронических ран разлагать пептидные факторы роста связана с повышенными уровнями активности энастазы и пониженными уровнями ингибиторов протеиназ (Wound Rep. Reg. 5:23-32), активные фармацевтические композиции могут в значительной степени подвергаться ферментативному расщеплению.

Вследствие этого, эффективная композиция, которая содержит EGF, для лечения хронических ишемических язв диабетической стопы, в которой достигается высокая биодоступность EGF в ткани глубоко ниже очага поражения, подобно достигаемой с помощью инфильтрации EGF с применением игл для подкожных инъекций, которая предотвращает ампутацию конечности и в то же время позволяет избежать развития боли и риска инфекции, связанной с инъекцией, до настоящего времени не представлена.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение решает вышеупомянутую проблему с помощью композиций для местного применения, которые содержат EGF, инкапсулированный или связанный деформируемыми или традиционными липосомами, которые обеспечивают высокую биодоступность EGF в ткани глубоко ниже кожных очагов поражения, подобно биодоступности, достигаемой при инфильтрации EGF с помощью игл для подкожных инъекций. Эти композиции для местного применения наносятся на поверхность и вокруг хронических ишемических очагов поражения кожи и имеют преимущество в том, что они позволяют избежать болевых ощущений от инъекции и сопутствующего риска инфицирования.

Другой аспект настоящего изобретения связан с фармацевтической композицией для местного применения, которая содержит эффективное количество EGF, инкапсулированного в или связанного деформируемыми или обычными липосомами, где липосома состоит из одного или более фармацевтически приемлемых липидов. Когда EGF наносят с помощью этих композиций, он эффективно транспортируется к жизнеспособной ткани глубоко ниже очагов поражения и эффективно защищает от опосредованного протеазами разложения, что очень важно, поскольку эти ферменты находятся в значительном количестве в этом виде очагов поражения диабетической стопы.

В предпочтительном варианте осуществления эффективное количество EGF составляет от 0,025 до 0,075 мг/грамм субстанции. Эти композиции обеспечивают необратимое заживление хронических кожных очагов поражения, таким образом, предотвращая произведение ампутации, которая иначе была бы единственной альтернативой для ишемизированной конечности.

В другом предпочтительном варианте осуществления, липосома фармацевтической композиции для местного применения состоит из одного или более фармацевтически приемлемых липидов, выбранных из группы, состоящей из нейтрального липида, отрицательно заряженного липида, положительно заряженного липида, липида, конъюгированного с полиэтиленгликолем, или липида, конъюгированного с углеводом. Такие липосомы могут также состоять из одного или более фармацевтически приемлемых липидов и одного или более неионных, цвиттер-ионных, анионоактивных или катионных поверхностно-активных агентов.

Краткое описание чертежей

На чертеже показано расположение язв, индуцированных в животной модели.

Подробное описание вариантов осуществления/примеров

Пример 1. Производство EGF-нагруженных липосом

Фосфатидилхолин, в концентрации 10 мг/мл, растворяли в беспримесном этаноле в круглодонных колбах объемом 50 мл. Растворитель удаляли с помощью ротационного выпаривания до тех пор, пока на стенках колбы не образовалась сухая липидная пленка. Для инкапсулирования EGF в липосомы сухую липидную пленку гидратировали буферным водным раствором, содержащим EGF, и гомогенизировали с помощью встряхивания. Для уменьшения размера везикул суспензию несколько раз подвергали экструдированию посредством пропускания через поликарбонатную мембрану с размером пор 100 нм до тех пор, пока средний размер везикул не составил приблизительно 100 нм. Суспензию EGF-нагруженных липосом центрифугировали при 100000×г в течение 40 минут при 4°C для отделения неинкапсулированного EGF от инкапсулированного. Супернатант переместили в чистую пробирку, и гранулу ресуспендировали в солевом растворе с фосфатным буфером с pH 7,2. Шаг центрифугирования повторили еще раз при тех же условиях, и супернатант переместили в чистую пробирку и смешали с супернатантом из первого шага центрифугирования. Гранулы (содержащие EGF-нагруженные липосомы) ресуспендировали в солевом растворе с фосфатным буфером с pH 7,2. Эту конечную композицию сохраняли при 4°C до применения.

Производство EGF-нагруженных деформируемых липосом

Всего 85,8 мг фосфатидилхолина и 11,7 мг дезоксихолата натрия растворили в 100 мкл теплого беспримесного этанола, разбавили 900 мкл фосфатного буфера и встряхивали до тех пор, пока не была получена однородная суспензия молочного вида. Эту липосомальную композицию несколько раз подвергли экструдированию посредством пропускания через поликарбонатную мембрану с размером пор 100 нм до тех пор, пока средний размер везикул не составил приблизительно 100 нм. Для загрузки EGF в деформируемые липосомы 100 мкл липосомальной суспензии смешали с 25 мкл раствора, содержащего различные (250, 500 или 1000 мкг) количества EGF, и смеси инкубировали в течение 24 часов при 4°C.

Пример 2. Определение эффективности инкапсулирования EGF в липосомы

Для определения эффективности инкорпорирования EGF в липосомы суспензии липосом центрифугировали на высокой скорости и определяли содержание белка в полученной грануле (EGF-нагруженные липосомы), и супернатанта (свободные EGF). Суспензию липосом центрифугировали на 100000×г в течение 40 минут при 4°C. Супернатант переместили в чистую пробирку, и гранулу ресуспендировали в солевом растворе с фосфатным буфером с pH 7,2. Шаг центрифугирования повторили еще раз при тех же условиях, и супернатант переместили в чистую пробирку и смешали с супернатантом от первого шага центрифугирования. Гранулы (содержащие EGF-нагруженные липосомы) ресуспендировали в 500 мкл солевого раствора с фосфатным буфером с pH 7,2. Затем белок гранул или супернатанта извлекли и отделили от липидов с помощью добавления 0,5% (об./об.) к образцам Triton X-100 и подвергая их жидкостной хроматографии высокого разрешения обратной фазы (RP-HPLC). Содержание белка определяли на основе области под кривой хроматограммы, полученной с помощью RP-HPLC при длине волны поглощения 226 нм. Эффективность инкорпорирования EGF в липосомы определяли как отношение содержания белка в грануле (EGF-нагруженные липосомы) к общему содержанию белка, добавленного в начале процесса инкапсулирования, × 100%.

Таблица 1
Эффективность инкорпорирования EGF в липосомы
Количество добавленного EGF
(мкг)
Эффективность инкорпорирования(%) (Ave ± STDEV, n=3)
Традиционные липосомы Деформируемые липосомы
250 7,6±1,2 18,2±1,5
500 10,4±0,8 25,7±3,3
1000 8,2±1 23,4±5,2

Пример 3. Определение размера и морфологии липосом.

Образцы липосом анализировали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии для определения размера и морфологии липосом. Липосомы визуализировались при негативном окрашивании с помощью уранилацетата. Негативно окрашенные образцы наблюдали под трансмиссионным электронным микроскопом Jeol-JEM 2000EX, действующим при 80 кВ. Электронные микрофотографии, соответствующие каждому препарату на основе липосом, оцифровали с помощью сканера, и диаметр липосом определяли с помощью программного обеспечения DIGIPAT Версии 3.3 (EICISOFT, Havana, Cuba). Размер частиц усредняли относительно общего количества липосом, присутствующих на каждой микрофотографии, и выражали как значение ± стандартное отклонение трех независимых определений.

Препараты деформируемых или традиционных липосом, загруженных EGF, состояли из однородной популяции везикул сферической или эллипсоидальной формы. Средний размер везикул составлял 130±7 нм и 123±4 нм для традиционных и деформируемых липосом, соответственно.

Пример 4. Производство гелевой композиции, содержащей EGF-нагруженные липосомы

Суспензию деформируемых или традиционных липосом, загруженных EGF, разбавили в 1,5 раза фосфатным буфером с pH 7,2, и добавили Carbomer (Carbopol 940), забуференный на pH 7,2, в конечной концентрации 1,25% (мас./об.). Эта композиция также содержала 0,02% (мас./об.) бутилгидрокситолуола (BHT), 0,1% (мас./об.) EDTA, 0,25% (мас./об.) метилпарагидроксибензоата, 0,525% (мас./об.) бензилового спирта, 0,2% (мас./об.) гидроксида натрия и 3% (мас./об.) глицерина.

Гелевые композиции традиционных и деформируемых липосом имели вязкость приблизительно 840 мПа·с и 730 мПа·с соответственно.

Пример 5. Демонстрация эффекта защиты EGF, инкапсулированного в липосомы, от ферментативного расщепления EGF in vitro

Этот эксперимент был направлен на оценку того, является ли предпочтительным инкапсулирование EGF в традиционные или в деформируемые липосомы для сохранения целостности EGF в протеолитической среде ткани диабетической стопы. Для этой цели биоптаты, забранные из ткани язв стопы диабетических пациентов после местной анестезии, ресуспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе c pH 7,2. В общем 25 мкг свободного EGF или инкапсулированного в липосомы EGF добавили к образцам и инкубировали в течение 20, 40, или 60 минут при 37°C. Затем, 50% (об./об.) уксусной кислоты добавили для остановки реакции. После добавления 5% (об./об.) Triton X-100, образцы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут и профильтровали через поликарбонатные фильтры с размером пор 0,2 или 0,45 мкм. Содержание EGF в образцах определяли количественно с помощью корреляции с областью под кривой хроматограммы, полученной при 226 нм с помощью RP-HPLC. Процент EGF, остающегося после инкубации, рассчитывали как отношение содержания EGF, остающегося в образцах после инкубации, к содержанию EGF, добавленного первоначально, ×100%. Данные, представленные в Таблице 2, свидетельствуют о том, что, после воздействия на биоптаты диабетической стопы, в образцах, содержащих EGF, инкапсулированный в липосомы (традиционные или деформируемые), сохраняется более высокое количество интактного EGF, чем в образцах, содержащих неинкапсулированный EGF.

Таблица 2
EGF, остающийся после его инкубации с биоптатами тканей язвы стопы от диабетических пациентов
Остающийся EGF (%)
20 мин 40 мин 60 мин
EGF, инкапсулированный в традиционные липосомы 95,1±1,1 83,4±47 58,6±3,4
EGF, инкапсулированный в деформируемые липосомы 93,4±2,1 80,6±3,8 55,9±2,5
Свободный EGF 82,5±2,5 66,9±3,6 3,78±1,3

Пример 6. Демонстрация эффективности EGF-содержащих композиций в экспериментальных моделях острых и контролируемых неактивных очагов поражения.

Экспериментальная модель контролируемых острых очагов поражения

Следующий эксперимент был выполнен с целью оценки ранозаживляющего эффекта новой фармацевтической композиции для местного применения, которая основана на EGF-нагруженных (деформируемых или традиционных) липосомах, в острых очагах поражения с удовлетворительным прогнозом.

Экспериментальная биологическая модель: самцы крыс Wistar с весом тела 225-250 граммов. Животных удерживали в контролируемых зонах вивария при CIGB при непрерывном режиме освещения 12×12 часов, циклами воздухообмена и свободным доступом к пище. Крыс разместили по отдельности в коробки T3 с замещением подложки каждые 48 часов после ее обеззараживания.

Индукция образования язв: Животных анестезировали с помощью интраперитонеальной инъекции кетамина/ксилазина. Спинку крыс, включающую область от позадилопаточного пространства до крестца, механически и химически лишили волос. Эту область стерилизовали с помощью раствора повидон-йода и изопропилового спирта. Область на коже, выбранную для индукции язв, отметили черной тушью для индуцирования циркулярных очагов поражения по всей ширине с помощью биотомов диаметром 9 мм (AcuDrem, Fl, USA). Как показано на фигуре 1, шесть симметричных и равноотстоящих очагов поражения индуцировали у каждого животного. Очаги поражения промыли стерильным физиологическим раствором, и их внутреннюю границу очертили постоянными чернилами для последующего вычисления раневой зоны в нулевой момент времени. Перед нанесением любого лекарственного средства очаги поражения всех животных подвергали гигиенической обработке ежедневно с помощью 70% этанола и стерильного солевого раствора.

Экспериментальные группы

Язвы, созданные у животных, рандомизированно распределили по следующим экспериментальным группам лечения с помощью входной перекрестной таблицы назначение/группа:

Группа I - отсутствие лечения.

Группа II - плацебо (композиция пустых деформируемых липосом без EGF), применяемое местно.

Группа III - инфильтрация раствора, содержащего EGF в количестве 75 микрограммов на миллилитр, с помощью игл для подкожных инъекций. Инфильтрации выполняли на границе и в основание ран.

Группа IV - лечение с помощью композиции из традиционных липосом, содержащих 25 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно.

Группа V - лечение с помощью композиции из традиционных липосом, содержащих 75 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно.

Группа VI - лечение с помощью композиции из деформируемых липосом, содержащих 25 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно.

Группа VII - лечение с помощью композиции из деформируемых липосом, содержащих 75 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно.

Каждая группа состояла из 10 крыс; поэтому были изучены 60 ран на группу. Лечение проводили ежедневно, после седации животных с помощью диазепама, вводимого посредством интраперитонеального пути.

Определение уровня закрытия раны

Гистологический процессинг

Очаги поражения скопировали на прозрачные ацетатные листы для вычисления кинетики контракции ран за следующие периоды времени: Время 0 - означает 100% открытой области очага поражения и контракцию раны на 0%, Время через 1-72 часа после индукции очагов поражения, Время через 2-5 дней после индукции очагов поражения, Время через 3-7 дней после индукции очагов поражения, Время через 4-9 дней после индукции очагов поражения. Девятый день был установлен как конец этого исследования, в который животных умерщвляли, согласно предшествующим данным о кинетике спонтанного заживления этих очагов поражения. Изображения со скопированными границами очагов поражения оцифровали. Область очагов поражения и процент контракции рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа изображений DIGIPAT. Статистические анализы каждого параметра выполняли с упаковкой SPSS с помощью непараметрического Mann Whitney U теста, с допустимым уровнем достоверности p<0,05.

Животных умерщвляли с помощью интраперитонеальной инъекции повышенной дозы фенобарбитала натрия (250 мг/кг). Очаг поражения высушивали от panniculus carnosus и фиксировали в 10% нейтральном формалине для дальнейшего помещения в парафин. Применяли гематоксилин/эозин, трихромные красители van Giesson's и Masson's. Для каждой группы определили число животных со 100% эпителизацией очага поражения и со стратифицированным и дифференцированным эпидермисом. Кинетика контракции раны показана в таблице 3 (значения сокращения в мм выражены в пересчете на процентное изменение размера раны относительно размера раны в нулевой момент времени).

Таблица 3
Значения кинетики контракции контролируемых острых язв
Контракция (%)
Группы Время 0 Время 1 Время 2 Время 3 Время 4
Группа I 0 5,3±1,8 9,6±1,1 31,5±2 59,8±2,1
Группа II 0 6,1±1,2 9,3±0,7 30,2±1,6 61,2±3
Группа III 0 12,3±2,1*a 23±2,7*a 67,5±3,1*a 76,5±2,2*а
Группа IV 0 14,6±1,8*b 31,6±1,2** 74,5±2,4** 86,2±1,7**
Группа V 0 15,9±1,5*b 33,2±1,9** 78,2±4,1** 88,6±2,2**
Группа VI 0 16,1±1,7*b 35,4±2,5** 81,7±3,6** 90,5±1,3**
Группа VII 0 16,5±1,6*b 36,7±1,9** 85,2±4,1** 94,3±1,8**
(*a) Это означает статистически достоверное отличие с p<0,05 от групп I и II.
(*b) Это означает статистически достоверное отличие с p<0,05 от групп I, II и III.
(**) Это означает статистически достоверное отличие с p<0,01 от групп I, II и III.

Mann-Whitney U тест

Как показано в таблице 3, композиции на основе липосом обеспечивали самый сильный эффект контракции краев раны, другими словами, это означает, что липосомальные композиции производили самый благоприятный эффект усиления полного заживления раны, так как контракция представляет собой конвергенцию нескольких объединенных событий, которые приближают рану к фазе ремоделирования.

Процент области, закрытой зрелой и организованной грануляционной тканью для каждой экспериментальной группы представлен в таблице 4. Вычисление этого параметра производили применяя образцы, забранные в момент времени 6, с помощью подсчета в каждом образце числа полей зрения микроскопа, с одновременно позитивными реакциями с трихромными красителями Giesson's and Masson's. Два патолога осуществляли эти оценки независимым и слепым методом.

Таблица 4
Процент гранулированной области во Время 4 для каждой экспериментальной группы
% области, покрытой зрелой грануляционной тканью
Группа I 53,2±3,15
Группа II 51,8±2,6
Группа III 66,7±3,22
Группа IV 89,8±3,14
Группа V 91,2±1,63
Группа VI 94,8±2,08
Группа VII 96,1±1,75

Исследование 60 ран на группу, с применением позитивных реакций на волокна коллагена

Как показано в таблице 4, обработка очагов поражения композициями на основе липосом оказывает самый сильный эффект на процесс созревания и образования грануляционной ткани, этот результат согласуется с уже описанным для контракции ран.

Также было изучено влияние лечения на процесс эпителизации очагов поражения. Оценивали внешний вид стратифицированного эпителия, рассматривая ре-эпителизацию язвы, присутствие стратифицированного эпителия и наличие слоя кератина. Для изучения очагов поражения под микроскопом их подвергали продольной центральной гемисекции и помещали в один и тот же парафиновый блок. В общей сложности были изучены 120 гистологических участков, что соответствовало 60 очагам поражения. Результаты этого исследования представлены в Таблице 5.

Таблица 5
Влияние лечения на эпителизацию раны
Число ран с 100% эпителизацией Число ран со зрелым эпителием
Группа I 27 22
Группа II 29 26
Группа III 37 25
Группа IV 53 45
Группа V 55 47
Группа VI 55 48
Группа VII 57 50

Как показано в таблице 5, группы IV, V, VI и VII, получавшие лечение липосомальными композициями, показывают лучшие индикаторы эпителиальной реакции, что выражается посредством общей реэпителизации и зрелости эпителия.

Поэтому можно сделать вывод, что обработка очагов поражения липосомальными композициями улучшает (i) процесс контракции острых контролируемых ран; (ii) процесс грануляции и его созревание; процесс эпидермальной реэпителизации и дифференцировки и (iv) эти процессы не были связаны с образованием аберрантной грануляционной ткани, гранулем или инородных образований.

Экспериментальная модель хронических кожных язв

Следующий эксперимент был направлен на оценку ранозаживляющего эффекта новой фармацевтической композиции для местного применения, которая основана на традиционных или деформируемых липосомах, содержащих EGF в хронических очагах поражения с плохим прогнозом, которые моделируют очаги поражения у пациентов с диабетом.

Экспериментальная биологическая модель: самцы крыс Wistar с массой тела 225-250 грамм. Животных содержали в контролируемых зонах вивария при CIGB при непрерывном режиме освещения 12×12 часов, циклах воздухообмена и свободном доступе к пище. Крыс разместили по отдельности в коробки T3 с замещением подложки каждые 48 часов после ее обеззараживания. Животных предварительно обрабатывали в течение двух месяцев 0,01% раствором метилглиоксаля для создания среды гликозилирования, подобной той, что имеется у пациента с длительным развитием диабета.

Среди других органических повреждений, это приводит к замедлению грануляции и ремоделированию ран (Berlanga J., Cibrian D., и др. (2005). Применение метилглиоксаля индуцирует диабетоподобные микроваскулярные изменения и нарушает процесс заживления кожных ран. Clin Sci (Lond). 109(1):83-95).

Индукция язв

Индукция образования язв

Животных анестезировали с помощью интраперитонеальной инъекции кетамина/ксилазина. Спинку крыс, включающую область от позадилопаточного пространства до крестца, механически и химически лишили волос. Эту область стерилизовали с помощью раствора повидон-йода и изопропилового спирта. Область на коже, выбранную для индукции язв, отметили черной тушью для индуцирования циркулярных очагов поражения по всей ширине с помощью биотомов диаметром 9 мм (AcuDrem, Fl, USA). Как показано на чертеже, шесть симметричных и равноотстоящих очагов поражения индуцировали у каждого животного. Очаги поражения промыли стерильным физиологическим раствором, и их внутреннюю границу очертили постоянными чернилами для последующего вычисления раневой зоны в нулевой момент времени. Перед нанесением любого лекарственного средства очаги поражения всех животных подвергали гигиенической обработке ежедневно с помощью 70% этанола и стерильного солевого раствора.

Экспериментальные группы

Язвы, созданные у животных, рандомизированно распределили по следующим экспериментальным группам лечения с помощью входной перекрестной таблицы назначение/группа:

Группа I - отсутствие лечения.

Группа II - плацебо (композиция пустых деформируемых липосом без EGF), применяемое местно.

Группа III - инфильтрация раствора, содержащего EGF в количестве 75 микрограммов на миллилитр, с помощью игл для подкожных инъекций. Инфильтрации выполняли на границе и в основание ран

Группа IV - лечение с помощью композиции из традиционных липосом, содержащих 25 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно

Группа V - лечение с помощью композиции из традиционных липосом, содержащих 75 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно

Группа VI - лечение с помощью композиции из деформируемых липосом, содержащих 25 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно

Группа VII - лечение с помощью композиции из деформируемых липосом, содержащих 75 микрограммов EGF на грамм субстанции, применяемой местно

Каждая группа состояла из 10 крыс; поэтому были изучены 60 ран на группу. Лечение проводили ежедневно, после седации животных с помощью диазепама, вводимого посредством интраперитонеального пути.

Определение уровня закрытия раны

Гистологический процессинг

Очаги поражения скопировали на прозрачные ацетатные листы для вычисления кинетики контракции ран за следующие периоды времени: Время 0 - обозначает 100% открытой области очага поражения и контракцию раны на 0%, Время через 1-72 часа после индукции очагов поражения, Время через 2-5 дней после индукции очагов поражения, Время через 3-7 дней после индукции очагов поражения, Время через 4-9 дней после индукции очагов поражения. Девятый день был установлен как конец этого исследования, в который животных умерщвляли, согласно предшествующим данным о кинетике спонтанного заживления этих очагов поражения. Изображения со скопированными границами очагов поражения оцифровали. Область очагов поражения и процент контракции рассчитывали с помощью программного обеспечения для анализа изображений DIGIPAT. Статистические анализы каждого параметра выполняли с упаковкой SPSS с помощью непараметрического Mann Whitney U теста, с допустимым уровнем достоверности p<0,05.

Животных умерщвляли с помощью интраперитонеальной инъекции повышенной дозы фенобарбитала натрия (250 мг/кг). Очаг поражения высушивали от panniculus carnosus и фиксировали в 10% нейтральном формалине для дальнейшего помещения в парафин. Применяли гематоксилин/эозин, трихромные красители van Giesson's и Masson's. Для каждой группы определили число животных со 100% эпителизацией очага поражения, и со стратифицированным и дифференцированным эпидермисом. Кинетика контракции раны показана в таблице 3 (значения сокращения в мм выражены в пересчете на процентное изменение размера раны относительно размера раны в нулевой момент времени).

Таблица 6
Значения кинетики контракции хронических язв
Контракция (%)
Группы Время 1 Время 2 Время 3 Время 4 Время 6
Группа 1 3,1±1,1 4,1±1,15 5,23±1,3 11,5±2,6 16,8+2,4
Группа II 4,1±2,2 3,77±1,6 6,3±1,13 12,2±1,04 18,6+1,6
Группа III 6,55±1,14 10,25+3,1* 25±2,7* 53,5+3,5* 61,7+2,14*
Группа IV 13,7+0,9** 24,2+0,78** 30,3+2,4** 68,6±1,08** 80,3+1,87**
Группа V 14,6+1,6** 25,8+0,81** 31,4+3,2** 69,5+3,4** 83,2+2,12**
Группа VI 15,3±2,3** 27,3±1,1** 33±2,5** 70,52+2,2** 83+3,14**
Группа VII 16,7+1,8** 28,6±0,95** 35+3,8** 73,7+2,15** 86+4,1**
(*) Означает статистическое различие с p<0,05 от групп I и II. (**) Означает статистическое различие с p<0,01 от групп I, II и III. Mann-Whitney U тест.

Как показано в таблице 6, композиции на основе липосом обеспечивали самый сильный эффект контракции краев раны, другими словами, это означает, что липосомальные композиции производили самый благоприятный эффект усиления полного заживления раны, так как контракция представляет собой конвергенцию нескольких объединенных событий, которые приближают рану к фазе ремоделирования. Необходимо отметить, что эти экспериментальные раны моделируют биохимическую микросреду диабетических ран, в которых механизм контракции частично или полностью патологически нарушен.

Определение концентрации EGF в жизнеспособной ткани, расположенной глубоко ниже кожных очагов поражения

Для определения концентрации EGF, выполнили гистологические срезы ткани глубоко ниже (1 см) кожных очагов поражения через 20 минут, 1 час, 4 часа, 8 часов, 16 часов и 24 часа после индукции очагов поражения. Ткань гомогенизировали в фосфатно-солевом буферном растворе. Концентрацию EGF определяли с помощью Иммуносорбентного анализа с применением фиксированных ферментов (ELISA). Как показано в таблице 6a, композиции EGF на основе липосом обеспечивали транспорт значительных количеств EGF (экспериментальные группы IV, V, VI и VII) к областям ткани глубоко ниже очагов поражения, подобно результату, полученному при инфильтрировании EGF с помощью игл для подкожных инъекций (экспериментальная группа).

Таблица 6a
Концентрация EGF в жизнеспособной ткани глубоко ниже кожных очагов поражения
Концентрация EGF (мкг/мл)
Группы 20 мин 1 час 4 час 8 час 16 час 24 час
Группа 1 0,01±0,003 0,012±0,005 0,008±0,002 0,009±0,003 0,007±0,002 0,008±0,003
Группа II 0,013±0,002 0,01±0,001 0,012±0,005 0,009±0,002 0,01±0,003 0,008±0,001
Группа III 27,55±0,14* 5,47±0,1* 1,55+0,1* 0,26+0,04* 0,07±0,01* 0,02±0,005*
Группа IV 1,1±0,4* 2,8±0,2* 3,9±0,2** 9,1±0,3** 2,9±0,1** 0,08+0,01**
Группа V 5,6±0,7* 8,2±0,3* 11,3±0,5** 20,1±1,6** 9,6±1,7** 0,23±0,05**
Группа VI 1,5+0,3* 4,3±0,7* 7,7±0,2** 11,1±0,8** 4,6±0,2** 0,1±0,03**
Группа VII 8,8±0,4* 12,7±1,1* 19,5±2,9** 28,6+1,6** 13,2+2,1** 0,42±0,06**
(*) Означает статистические отличие с p<0,05 от групп II и II. (**) Это означает статистическое отличие с p<0,01 от групп I, II и III. Mann-Whitney U тест.

В таблице 7, представлен процент области, покрытой зрелой и организованной грануляционной тканью, для каждой экспериментальной группы. Вычисление этого параметра производили, применяя образцы, забранные в момент времени 6, с помощью подсчета в каждом образце числа полей зрения микроскопа, с одновременно позитивными реакциями с трихромными красителями Giesson's and Masson's. Два патолога осуществляли эти оценки независимым и слепым методом.

Как показано в таблице 7, обработка очагов поражения композициями на основе липосом оказывает самый сильный эффект на процесс созревания и образования грануляционной ткани, этот результат согласуется с уже описанным для контракции ран.

Таблица 7
Процент гранулированной области в момент времени 4 для каждой экспериментальной группы
% области, закрытый зрелой грануляционной тканью
Группа I 33,1±4
Группа II 28,6±1,16
Группа III 41,7±2,25
Группа IV 63,8±2,3
Группа V 65,1±1,8
Группа VI 68,7±2,2
Группа VII 69,6±1,15

Исследование 60 ран на группу, применяющую волокна коллагена позитивные реакции.

Также было изучено влияние лечения на процесс эпителизации очагов поражения. Внешний вид стратифицированного эпителия оценивали с обсуждением реэпителизации язвы, наличием стратифицированного эпителия и существования слоя кератина. Для изучения очагов поражения под микроскопом их подвергли продольной центральной гемисекции и поместили в тот же парафиновый блок. В общей сложности были изучены 120 гистологических участков, что соответствовало 60 очагам поражения. Не было необходимости в устранении любого очага поражения вследствие бактериального обсеменения. Результаты этого исследования представлены в таблице 8.

Таблица 8
Влияние лечения на эпителизацию раны
Число ран со 100% эпителизацией Число ран со зрелым эпителием
Группа I 0 0
Группа II 0 0
Группа III 16 11
Группа IV 29 24
Группа V 31 27
Группа VI 33 28
Группа VII 35 30

Как показано в таблице 8, группы IV, V, VI и VII, получавшие лечение композициями на основе липосом, показывают лучшие индикаторы эпителиальной реакции, что выражается посредством общей реэпителизации и зрелости эпителия.

Из этого следует, что обработка липосомальными композициями улучшает (i) процесс контракции хронических ран, которые точно моделируют биохимическую микросреду язв пациентов с диабетом; (ii) процесс грануляции и его созревание. Необходимо отметить, что лечение позволяет образоваться новой сосудистой сети и (iii) стимулирует процесс эпидермальной реэпителизации и дифференцировки очагов поражения, которые обычно резистентны к реэпителизации.

Пример 7. Демонстрация эффективности EGF-нагруженных липосомальных композиций для местного применения у больных с прогрессирующими диабетическими язвами стопы

Введение с целью сравнения композиций для местного применения на основе традиционных или деформируемых липосом, содержащих 25 или 75 микрограммов EGF на грамм субстанции у больных с прогрессирующими диабетическими язвами стопы показало результаты, подобные полученным при инфильтрации EGF с помощью игл для подкожных инъекций, что позволяет избежать развития боли и риска инфекции, связанной с инъекцией.

Новую композицию из деформируемых липосом, содержащих 75 микрограммов EGF на грамм субстанции, вводили пациенту с диабетической язвой стопы, с признаками нарушенного кровотока и риска большой ампутации. Продукт наносили местно после полного хирургического удаления омертвевших тканей язвы. Очаг поражения закрыли перевязочным средством и стерильным бандажом на период времени между этими двумя обработками. Развитие очага поражения было удовлетворительным, с признаком формирования грануляционной ткани и контракции границ язвы с первой недели после начала лечения. Фармацевтический продукт был эффективен в достижении полной эпителизации очага поражения и профилактики ампутации ног. Побочные эффекты, связанные с лечением, не наблюдались.

Другой пациент с диабетом с ишемическими кожными очагами поражения на нижней конечности с областью, превышающей 20 см2, и глубиной, нарушающей работу надкостницы, получал лечение традиционной композицией на основе липосом, содержащей 75 микрограммов EGF на грамм субстанции. Продукт наносили местно, три раза в неделю, после полного хирургического удаления омертвевших тканей язвы. Очаг поражения закрыли перевязочным средством и стерильным бандажом на период времени между лечением.

После четвертого введения композиции наблюдалось реальное изменение внешнего вида очага поражения, продуктивная грануляционная ткань стала преобладать, которая через несколько дней был покрыта эпителием. В конце лечения и полной пересадки кожи пациента выписали из больницы и он находился в удовлетворительном состоянии без какого-либо рецидивирования.

С другой стороны, другой пациент с диабетом с погрессирующими язвами, который не способен переносить местные инъекции EGF и отказавшийся от лечения с помощью инфильтрации после третьего введения, начал введение новой композиции из деформируемых липосом, содержащих 25 микрограммов EGF.

Этот пациент продолжил при этом лечение с удовлетворительной динамикой до достижения полного закрытия очага поражения. Этот пациент не сообщал ни о каком осложнении, связанном с его заболеванием или любым побочным эффектом, связанным с лечением.

1. Применение эффективного количества эпидермального фактора роста, инкапсулированного или связанного с деформируемыми или обычными липосомами, для производства фармацевтической композиции для местного применения для лечения диабетических язв стопы IV и V степени тяжести у пациентов с диабетом.

2. Применение по п.1, в котором высокая биодоступность эпидермального фактора роста достигается в ткани глубоко ниже очагов поражения.

3. Применение по п.1 или 2 для профилактики ампутации диабетической стопы, где композицию наносят на поверхность и вокруг хронических ишемических очагов поражения.

4. Фармацевтическая композиция для местного применения, которая содержит эффективное количество эпидермального фактора роста, инкапсулированного или связанного с деформируемыми или обычными липосомами, где липосома состоит из одного или более фармацевтически приемлемых липидов, обеспечивает высокую биодоступность эпидермального фактора роста в ткани глубоко ниже диабетических язв стопы, и эффективна для профилактики ампутации диабетической стопы.

5. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.4, в которой эффективное количество эпидермального фактора роста составляет от 0,025 до 0,075 мг/г субстанции.

6. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.4, в которой эффективное количество эпидермального фактора роста составляет 0,075 мг/г субстанции.

7. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.4, в которой липосома состоит из одного или более фармацевтически приемлемых липидов, выбранных из группы, состоящей из нейтрального липида, отрицательно заряженного липида, положительно заряженного липида, липида, конъюгированного с полиэтиленгликолем или липида, конъюгированного с углеводом.

8. Фармацевтическая композиция для местного применения по п.4, в которой липосома состоит из одного или более фармацевтически приемлемых липидов и одного или более неионных, цвиттер-ионных, анионных или катионных поверхностно-активных агентов.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине. .
Изобретение относится к области медицины, в частности к фармацевтическим средствам, применяемым для защиты кожного покрова от поражающих факторов химической и биологической природы, бактериальной или грибковой инфекций, для предупреждения возникновения профессиональных кожных заболеваний, для профилактики контактных дерматитов, в том числе аллергического характера, а также для оказания первой доврачебной помощи и дальнейшего лечения раневых дефектов кожи, мягких тканей или слизистой оболочки, и может быть использовано в промышленности, строительстве, сельском хозяйстве, медицине и быту.

Изобретение относится к медицине, а именно - к комбустиологии и хирургии. .

Изобретение относится к способу ускорения заживления ран у млекопитающего, включающему введение млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения, обладающего свойствами антагониста рецептора А2B, следующей формулы: , где R1 и R2 независимо представляют собой низший алкил, R3 представляет собой водород, Х представляет собой пиразолен, Y представляет собой низший алкилен и Z представляет собой фенил или пиридил, которые могут быть замещены трифторметилом.

Изобретение относится к медицине и представляет собой композицию для местного лечения гнойных ран и трофических язв, включающую использование медикаментов, соответствующих чувствительности микроорганизмов в ране, отличающуюся тем, что в нее включены антисептик, пектин свекловичный высокоочищенный и вода, при этом компоненты находятся в определенном массовом соотношении.
Изобретение относится к медицине, в частности к средствам, ускоряющим ранозаживление. .
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, обладающему ранозаживляющим действием. .
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к мази для лечения ожоговых заболеваний. .
Изобретение относится к разработке технологического процесса получения лекарственного средства для наружного применения, которое обладает ранозаживляющими, противовоспалительными, антисептическими свойствами, и может быть использовано в медицинской практике для лечения поражений кожи (ожогов, ран, порезов, воспалений, нагноений и т.д.) и для профилактической защиты кожи.
Изобретение относится к медицине и косметологии и представляет собой производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, для инъекции в качестве наполнителя мягкой ткани и/или для коррекции дефектов кожи, и/или для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза, где указанные производные выбраны из группы, включающей сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные и деацетилированные производные, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 50000 до 3×106 Да, липосомы образованы фосфолипидами, и концентрация фосфолипида находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и касается стабильной при хранении наносистемы с размером частиц до 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин растительного происхождения и мальтозу, предназначенной для включения в фосфолипидную наночастицу лекарственных средств, и способа ее получения и фосфолипидной композиции лекарственного средства в форме фосфолипидных наночастиц размером 10-30 нм, включающей фосфатидилхолин, мальтозу и лекарственное средство, и способа ее получения.
Изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения псориаза и экземы, содержащей экстракт магонии падуболистной в липосомной системе доставки. .

Изобретение относится к фармакологии, а именно к созданию новой меж- и внутри многослойной везикулярной композиции, содержащей лекарство от псориаза, дитранол. .

Изобретение относится к дерматологии и представляет собой композицию для наружного применения, которая предназначена для лечения атопического дерматита, содержащая аденозилкобаламин в липосоме в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый липосомный носитель или эксципиент.
Изобретение относится к медицине, в частности к косметологии, и представляет собой увлажняющую сыворотку для лица, содержащую гелеобразующий компонент, увлажняющий компонент глицерин, пропиленгликоль, триэтаноламин, консервант, отдушку, биологически активную добавку и воду, отличающуюся тем, что содержит в качестве биологически активной добавки суспензию ниосом размером до 100 нм с включенным в них экстрактом стволовых клеток плаценты свиньи, гиалуроновой кислотой, маслом авокадо, концентратом (Actiflow ), содержащим полисахариды и витамин РР, циклометикон DC 345, а в основу входят акрилатная эмульсия сополимера (Salcare SC80), кремнийорганический эластомер (DC 9045), и талая вода с ледников гор Северного Кавказа, при определенном содержании компонентов в мас.%.
Изобретение относится к медицине, в частности к косметологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения и профилактики особо опасных инфекционных заболеваний.
Изобретение относится к области фармации, а именно к способам анализа липосомных препаратов. .
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к применению эритропоэтина (ЭПО) для стимуляции структурной регенерации тканей, и может быть использовано в медицине.
Наверх