Композиция филлера для мягких тканей для инъекции и способ ее получения
Группа изобретений относится к медицине. Предложен способ получения композиции филлера для мягких тканей для инъекции для облегчения или лечения повреждения кожи вследствие механических или физиологических причин, включающий стадии: 1) переваривания аутологичной дермальной ткани, выделенной из собственной кожи пациента путем обработки раствором панкреатина/EDTA, и разделения на отдельные клетки; 2) культивирования и пролиферации выделенных дермальных клеток посредством бессывороточной культивации in vitro в среде, содержащей фактор роста и активационный фактор для получения аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения, содержащего дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки, дермальные фибробласты и коллаген; 3) центрифугирования аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения для отделения аутологичного клеточного осадка дермального происхождения; и 4) суспендирования аутологичного клеточного осадка дермального происхождения в глюкозном растворе для инъекции или произвольном растворе для инъекции с получением суспензии для инъекции. Предложена композиция, полученная указанным способом, которая содержит от 1×107 до 8×107 клеток/мл аутологичных клеток дермального происхождения и от 10 до 100 мг/мл коллагена в качестве эффективного ингредиента. Изобретение обеспечивает терапевтический эффект за короткий период времени и сохраняет его в течение длительного времени. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 8 ил.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции филлера для мягких тканей для инъекции, которую получают перевариванием аутологичной дермальной ткани, выделенной из собственной кожи пациента, разделением на отдельные клетки, культивированием in vitro и пролиферацией разделенных клеток в бессывороточной среде. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу получения вышеупомянутой композиции.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Обычные способы филлинга, используемые для заживления дефектов кожи, разделяют на две группы, т.е. дермальный филлинг и подкожный филлинг. Все компоненты филлера, используемые в указанных способах, как правило, содержат биологические синтетические материалы или гетерологичные белки, вместо того, чтобы полностью состоять из аутологичных активаторов тканевого происхождения. Парафин впервые использовали в качестве материала для филлинга в 19 веке. Однако он вызывал очень много побочных эффектов, и эффект филлинга с его помощью оказался неудовлетворительным. Впоследствии был разработан способ с использованием экзогенных белков в качестве материала для филлинга. В частности, обнаружено, что средство для филлинга с использованием бычьего коллагена приводит к быстрому наступлению терапевтического эффекта. Однако проблема состояла в том, что при однократной имплантации коллаген постепенно всасывался обратно в кожу после 3-6 месяцев. Получение и применение бычьего коллагена описано в патентах США No. 3949073, 4424208 и 4488911. Бычий коллаген поступил на рынок под торговым названием Зидерм I, II и III, в котором содержание коллагена находится в диапазоне от 35 мг/мл до 65 мг/мл. Однако обнаружено, что Зидерм не дает удовлетворительных результатов, так как антитела к бычьему коллагену образуются у 90% пациентов после лечения Зидермом (и у от 1 до 3% из них наблюдают выраженные аллергические реакции). Для разрешения этих проблем разработан инъецируемый коллаген, поперечно-сшитый глутаральдегидом, и его продают под торговым названием Зипласт. Указанный белок не вызывает никаких аллергических реакций, но его вязкость слишком велика для получения хороших терапевтических эффектов (патенты США No. 4582640 и 4642117).
Более того, в патентах США No. 4969912 и 5332802 описан способ с использованием аутологичного инъецируемого человеческого коллагена для предотвращения иммунной реакции вследствие использования бычьего коллагена, который доступен под торговым названием АУТОЛОГЕН. Однако его терапевтический эффект сохраняется только в течение нескольких месяцев. Фибрел создан на основе свиного коллагена. Фактически, для получения Фибрела объединены три компонента, т.е. свиной желатин, аминокапроновая кислота и плазма от субъекта, подлежащего лечению. Фибрел обладает желательными эффектами у некоторых пациентов. Однако большинство подвергнутых лечению пациентов склонны к образованию припухлости в участке инъекции, и невозможно сохранять его терапевтические эффекты в течение длительного времени.
БОТОКС, который одобрен FDA в апреле 2002 для проведения клинических испытаний, представляет собой раствор для инъекций для временного удаления морщин. БОТОКС обладает терапевтическими эффектами при удалении морщин путем анестезирования мимической мускулатуры и обладает несколькими преимуществами, такими как простота использования и непосредственное наступление терапевтических эффектов. Однако многочисленные проблемы состоят в том, что выражение лица пациента становится застывшим после лечения, продолжительность терапевтического эффекта оказывается слишком незначительной. Более того, существует риск паралича лицевого нерва.
Артеколл представляет собой комплекс искусственно синтезированных частиц и бычий коллаген, который благополучно применяют в Канаде, Мексике и Европе в течение нескольких лет. Артеколл обладает пролонгированными терапевтическими эффектами путем образования аутологичного коллагена посредством стимуляции местной дермы. Однако он также создает проблемы тем, что субъект после лечения может ощущать присутствие частиц, и в участке лечения может возникать припухлость.
Как упомянуто выше, указанные гетерологичные материалы для филлинга вызывают побочные эффекты, такие как возможность аллергических реакций и реакций отторжения, и ограниченная продолжительность терапевтических эффектов.
В патентах США No. 5591444, 5665372 и 5660850, принадлежащих Isolagen Technologies, Inc., описан способ лечения дефектов кожи и мягкой ткани с использованием аутологичных фиброцитов кожи. В частности, в указанных патентах описан способ проведения инъекции посредством: получения аутологичной дермальной ткани от подлежащего лечению субъекта; культивирования in vitro этой ткани в среде, содержащей бычью сыворотку; и помещения культивируемых аутологичных фиброцитов в раствор Рингера. Указанная инъекция не вызывает никаких аллергических реакций и реакций гетерологичного отторжения, но она не свободна от проблемы безопасности вследствие использования сыворотки животного происхождения. Более того, так как раствор Рингера не способствует длительному поддержанию активности действующего ингредиента, указанную инъекцию необходимо провести в течение короткого периода времени после его получения, что вызывает неудобство в терминах практического использования.
В Beijing Yiling Bioengineering Co., Ltd, разработан способ лечения морщин и рубцов с использованием инъекции, которую получают: выделением аутологичной кожи от подвергаемого лечению субъекта; ее культивированием и пролиферацией in vitro; и суспендированием культивируемых клеток в растворе глюкозы для инъекций (раствор Рингера) или растворе, ему соответствующем (Китайский патент No. 03155833.X).
Эффективный ингредиент инъекции, описанный в китайском патенте No. 03155833.X, получен культивированием аутологичного образца кожи в среде с частичным добавлением сыворотки животного происхождения. Однако у этого способа существует несколько недостатков. Во-первых, так как содержание коллагена в указанной инъекции, которое отвечает за незамедлительное наступление терапевтических эффектов, настолько мало, эффекты исчезновения морщин и рубцов наступают поздно с точки зрения потраченных усилий, таким образом, занимая от 4 до 6 месяцев для получения удовлетворительных терапевтических эффектов. Более того, подвергаемый лечению субъект может испытывать беспокойство относительно безопасности в связи с использованием сыворотки животного происхождения в качестве компонента культуральной среды.
Более того, в международной публикации No. WO 2003/094837 описана композиция, содержащая аутологичные, пассированные фибробласты и мышечные клетки (не обязательно, биоразлагаемые компоненты неклеточного матрикса/биоразлагаемые неклеточные филлеры (например, коллаген)). В ней далее описан способ восстановления тканей, которые подверглись дегенерации у субъекта в результате заболевания, расстройства или дефекта. Далее, в международной публикации No. WO 2004/048557 описана композиция, содержащая: (i) аутологичные недифференцированные мезенхимальные клетки (UMC) и аутологичные фибробласты; (ii) аутологичные UMC; или (iii) аутологичные фибробласты и аутологичные кератиноциты в качестве эффективного ингредиента. В ней также описан способ их получения и способ восстановления тканей с их использованием. Однако все композиции, описанные в указанных патентах, в существенной степени состоят из аутологичных мышечных клеток, аутологичных UMC или аутологичных кератиноцитов, которые полностью отличаются от композиции филлера для мягких тканей, содержащей дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки и дермальные фибробласты, описанные ниже.
Таким образом, авторы настоящего изобретения постарались преодолеть проблемы предшествующего уровня техники и разработали аутологичный клеточный культуральный материал дермального происхождения, содержащий дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки и дермальные фибробласты, полученные при бессывороточной культивации in vitro из аутологичной ткани кожи вместе с большим количеством коллагена в качестве комплексного филлера. Более того, подтверждено, что таким образом полученный комплексный филлер обладает терапевтическими эффектами по удалению и излечению морщин и рубцов за короткий период времени и сохраняет эти терапевтические эффекты в течение длительного времени.
ОПИСАНИЕ
Техническая проблема
Соответственно основная цель настоящего изобретения состоит в получении новой композиции филлера для мягких тканей для инъекции, где отсутствует проблема с точки зрения безопасности вследствие того, что в ней не используют сыворотку животного происхождения. Оно также направлено на получение композиции, которая очень эффективна для удаления морщин и рубцов посредством незамедлительного наступления и длительного поддержания терапевтических эффектов, и которую можно эффективно использовать для улучшения цвета и упругости кожи. Настоящее изобретение также относится к способу получения вышеупомянутой композиции.
Техническое решение
Согласно одному из аспектов настоящего изобретения представлен способ получения композиции филлера для мягких тканей для инъекции, который включает стадии:
1) переваривания аутологичного кожного биоптата, выделенного из собственной кожи пациента, и разделения на отдельные клетки;
2) культивирования и пролиферации выделенных дермальных клеток посредством бессывороточной культивации in vitro для получения аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения, содержащего дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки, дермальные фибробласты и коллаген;
3) центрифугирования аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения для отделения аутологичного клеточного осадка дермального происхождения; и
4) суспендирования аутологичного клеточного осадка дермального происхождения в глюкозном растворе для инъекции или произвольном растворе для инъекции для получения суспензии для инъекции.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения представлена композиция филлера для мягких тканей для инъекции, полученная указанным способом.
Далее настоящее изобретение описано более подробно.
В начале аутологичный кожный биоптат, используемый на стадии 1), получают дезинфицированием спиртом выбранного участка кожи подвергаемого лечению пациента, местным анестезированием, вырезанием из него эпидермиса и дермы размером от 1 до 30 мм2 и затем хранением их в маточном растворе для тканей. Ткань кожи, подходящая для бессывороточной культивации и пролиферации in vitro аутологичных дермальных клеток, на этой стадии может включать любую кожу, эпидермис и дерму, полученные из задней части уха, бровей, нижней части глаз и других областей. Таким образом полученный образец аутологичной дермальной ткани подвергают процедурам переваривания ткани и выделения клеток. В частности, образец аутологичной дермальной ткани можно поместить в чашку для культивирования и подвергнуть перевариванию ткани обработкой раствором панкреатина/EDTA. Далее переваривание ткани можно остановить добавлением раствора DMEM, содержащего 10% FBS. Переваренную ткань в реакционном растворе можно разрушить и разделить на отдельные клетки применением осторожной повторной аспирации с использованием отсасывающей пипетки и центрифугированием для удаления супернатанта, таким образом, получая клеточный осадок.
На стадии 2) клетки, полученные на стадии 1), культивируют in vitro в бессывороточной среде согласно общепринятому способу в данной области, такому как способ культивирования переваренной ткани или способ культивирования фрагмента ткани.
Способ культивирования клеток по настоящему изобретению отличается от способов предшествующего уровня техники с точки зрения использования бессывороточной культуральной среды. В частности, способ культивирования клеток по настоящему изобретению отличается: использованием бессывороточной культуральной среды с добавлением факторов роста (например, эпидермального фактора роста и дермального фактора роста) и активационных факторов (например, кортикального гормона и экстракта гипофиза быка) вместо добавления сыворотки животного происхождения, такой как бычья сыворотка, к основной среде; культивированием клеток в бессывороточной культуральной среде в течение от 6 до 10 недель; и индуцированием клеточной пролиферации и удовлетворительной секреции коллагена. Подтверждено, что активность и морфология клеток, культивируемых в бессывороточной культуральной среде, содержащей факторы роста и активационные факторы вместо сыворотки животного происхождения согласно способу по настоящему изобретению, являются нормальными. В особенности, таким образом полученный культуральный раствор содержит большое количество коллагена, а также аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения, содержащего дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки и дермальные фибробласты в качестве эффективного ингредиента. В случае получения филлера с использованием культурального раствора содержание коллагена в филлере может варьировать от 10 до 100 мг/мл.
Базальную среду, пригодную для настоящего изобретения, можно получить с использованием общепринятых компонентов сред, хорошо известных рядовому специалисту в данной области, например «Cell Experimental Protocols» (2001, Science Press, Chief editor: D.L. Speycutter, Translation: Huang Peitang).
Бессывороточная культуральная среда, факторы роста и активационные факторы, применяемые по настоящему изобретению, могут включать все продукты, коммерчески доступные в данной области. Факторы роста, которые можно добавлять к бессывороточной культуральной среде по настоящему изобретению, могут включать эпидермальный фактор роста (EGF), дермальный фактор роста, основный фактор роста фибробластов (bFGF) и т.п. Указанные факторы можно использовать по отдельности или в форме их смесей. Концентрация факторов роста в бессывороточной культуральной среде может предпочтительно варьировать от 0,1 до 5 нг/мл и более, предпочтительно от 0,5 до 2 нг/мл. Более того, активационные факторы, которые можно добавлять к бессывороточной культуральной среде по настоящему изобретению, могут включать кортикальный гормон, экстракт гипофиза быка (BPE), инсулин, гидрокортизон и т.п. Указанные факторы можно использовать по отдельности или форме их смесей. Концентрация активационных факторов в бессывороточной культуральной среде может предпочтительно варьировать от 0,1 до 1% и более, предпочтительно от 0,2 до 0,5%.
Дермальные клетки, выделенные из аутологичной дермальной ткани, инокулируют в бессывороточную культуральную среду и культивируют в инкубаторе при 37°C в 5% CO2 в течение от 6 до 10 недель. В течение этого времени предпочтительно заменять среду на свежую с интервалами в 3 суток.
На стадии 3) раствор с культурой аутологичных клеток дермального происхождения, полученный выше, центрифугируют при температуре, варьирующей от 4 до 32°C, при скорости, варьирующей от 800 до 1200 об/мин, для удаления супернатанта, таким образом, получая только аутологичный клеточный осадок дермального происхождения, содержащий пролиферирующие дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки, дермальные фибробласты и секретируемый ими коллаген.
Культивируемые и пролиферирующие дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки и дермальные фибробласты, и секретируемый ими коллаген согласно настоящему изобретению можно подтвердить, как указано далее.
Дермальные фибробластные стволовые клетки: их можно анализировать согласно способу с антителами с BrDU (5-бромдезоксиуридином), описанному в литературе
Нормальная морфология дермальных фибробластных стволовых клеток при наблюдении в оптический микроскоп при увеличении 100× представляет собой утонченную, вытянутую веретеновидную форму. Они окрашиваются в темно-коричневый цвет согласно способу с антителами с BrdU (см. фиг.1).
Дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки: нормальная морфология дермальных фибробластных переходных делящихся клеток при наблюдении в оптический микроскоп при увеличении 100x представляет собой утонченную и небольшую, вытянутую веретеновидную форму, сходную с дермальными фибробластными стволовыми клетками. Они окрашиваются в коричневый цвет согласно способу с антителами с BrdU (см. фиг.2).
Дермальные фибробласты: нормальная морфология дермальных фибробластов при наблюдении в оптический микроскоп при увеличении 100× представляет собой вытянутую веретеновидную форму, обладающую многими отростками (см. фиг.3).
Коллаген: концентрацию коллагена можно измерить согласно способу измерения коллагена, описанному в литературе (Ministry of Health P.R.China, Pharmacopoeia Committee, «Chinese Pharmacopoeia» (2nd Ed.), Beijing Chemical Industry Press, 2000).
Стадия 4) состоит в получении композиции филлера для мягких тканей для инъекции суспендированием аутологичного клеточного осадка дермального происхождения, содержащего выделенные выше эффективные ингредиенты, в глюкозном растворе для инъекции в концентрации 5% или общем растворе для инъекции. При этом таким образом полученная суспензия может далее включать подходящие дополнительные ингредиенты. Композиция филлера для мягких тканей по настоящему изобретению в качестве эффективного ингредиента содержит культивируемые дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки и дермальные фибробласты, выделенные из собственной ткани пациента вместе с секретируемым ими коллагеном. Конечная концентрация эффективных клеток в инъекции предпочтительно варьирует от 1×107 до 8×107 клеток/мл, и содержание коллагена предпочтительно варьирует от 10 до 100 мг/мл, более предпочтительно от 20 до 60 мг/мл.
Композицию филлера для мягких тканей по настоящему изобретению можно получать в составе инъецируемых продуктов, предназначенных для кожи человека, которые можно получать согласно общепринятому способу, хорошо известному рядовому специалисту в данной области. Например, композиция по настоящему изобретению может находиться в форме раствора, вязкого раствора, суспензии или геля. Указанная композиция может дополнительно содержать подходящие эксципиенты, адаптированные для инъекции в кожу. Подходящие эксципиенты должны быть хорошо переносимыми, стабильными и получаться в консистенции, которая обеспечивает легкое и приятное использование. В данной работе подходящие примеры эксципиента включают в качестве неограничивающих примеров фосфатный буферный солевой раствор, бактериостатический солевой раствор, пропиленгликоль, крахмал, сахарозу и сорбит.
Далее композиция филлера для мягких тканей по настоящему изобретению может дополнительно содержать дополнительное вещество, такое как инертный и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, эксципиент, загуститель, эмульгирующее средство, консервант и их смесь. Подходящие примеры вышеупомянутых дополнительных веществ, как правило, включают такие вещества, которые обычно используют в фармацевтических препаратах и препаратах по уходу за кожей. Более конкретно, такие примеры инертного и фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя включают в качестве неограничивающих примеров солевой раствор и очищенную воду. Подходящие загустители включают coполимеры акриламида, карбомер, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту и поливиниловый спирт, но, безусловно, не ограничены ими.
Подходящие эмульгирующие средства включают каприловый/каприновый триглицерид, цетеарет-7, цетиловый спирт, цетилфосфат, изостеарат-11 и изостеарат натрия, но не ограничены ими. Консерванты придают композиции по настоящему изобретению устойчивость к микробному воздействию и токсичность по отношению к микроорганизмам. Подходящие примеры включают спирты, любой из парабенов, диазолидинилмочевину, DMDM-гидантоин, феноксиэтанол и иодпропилбутилкарбамат, но не ограничены ими. Примеры вышеупомянутых дополнительных веществ, отличных от перечисленных, можно также применять в вариантах осуществления этого изобретения, как будет принято во внимание рядовым специалистом в данной области.
Композиция филлера для мягких тканей для инъекции, получаемая согласно способу по настоящему изобретению, содержит большое количество коллагена, который функционирует, удаляя морщины и рубцы непосредственно в области инъекции. Более того, другие эффективные ингредиенты в композиции филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению играют важную роль в удалении морщин и рубцов одновременно с функционированием по улучшению локального окружения в коже посредством непрерывной продукции коллагена. Это придает молодость и красоту подвергаемому лечению субъекту.
Соответственно композицию филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению можно эффективно использовать не только для излечения всех типов морщин и рубцов на лице и шее, стрий после беременности, морщин на тыльной поверхности руки и т.п., но также для усиления толщины, упругости и текстуры кожи.
Так как композиция филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению содержит аутологичные клетки дермального происхождения в качестве эффективного ингредиента, она не вызывает никакой аллергической реакции и реакции гетерологичного отторжения. Более того, так как в настоящем изобретении не используют сыворотку животного происхождения в ходе получения композиции филлера для мягких тканей для инъекции, отсутствует возможность вызывания инфекционных заболеваний или побочных эффектов. Соответственно композиция филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению может непосредственно вызывать хорошие косметико-терапевтические эффекты, обеспечивать естественное выражение лица подвергаемого лечению субъекта после инъекции и сохранять выраженные терапевтические эффекты в течение длительного времени.
Полезный эффект
Композиция филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению обладает пролонгированными терапевтическими эффектами без вызывания какого-либо иммунного ответа и побочного эффекта вследствие использования аутологичных дермальных клеток. Более того, так как она полностью устраняет риск использования сыворотки животного происхождения посредством бессывороточной культивации in vitro и непосредственно вызывает терапевтические эффекты продуцированием значительного количества коллагена, композицию филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению можно эффективно применять для улучшения цвета и упругости кожи, а также разглаживания и удаления морщин и рубцов.
Описание чертежей
Вышеупомянутые и другие цели и характеристики настоящего изобретению станут очевидными из следующего описания изобретения, взятого в сочетании со следующими сопроводительными чертежами, на которых соответственно представлено:
Фиг.1 представляет собой фотографию (× 100), наблюдаемую в оптический микроскоп, на которой представлены дермальные фибробластные стволовые клетки, пролиферирующие при бессывороточной культивации in vitro из аутологичных дермальных клеток согласно способу по настоящему изобретению;
Фиг.2 представляет собой фотографию (×100), наблюдаемую в оптический микроскоп, на которой представлены дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки, пролиферирующие при бессывороточной культивации in vitro из аутологичных дермальных клеток согласно способу по настоящему изобретению;
Фиг.3 представляет собой фотографию (×100), наблюдаемую в оптический микроскоп, на которой представлены дермальные фибробласты, пролиферирующие при бессывороточной культивации in vitro из аутологичных дермальных клеток согласно способу по настоящему изобретению;
Фиг.4 представляет собой результат сравнения морфологии аутологичного культурального клеточного материала дермального происхождения (B), полученного согласно способу по настоящему изобретению, с морфологией клеток, происходящих из жировой ткани (A), с использованием фазово-контрастного микроскопа;
Фиг.5 представляет собой результат иммунофлуоресцентного анализа, в котором сравнивают профили экспрессии нестина и фибронектина в аутологичном клеточном культуральном материале дермального происхождения (A), полученном согласно способу по настоящему изобретению, с профилями экспрессии в клетках, происходящих из жировой ткани (B), где нестин детектируют в виде красного пятна при 594 нм, фибронектин детектируют в виде зеленого пятна при 488 нм, и ядра клеток детектируют в виде голубого пятна при окрашивании DAPI;
Фиг.6 представляет собой результат иммунофлуоресцентного анализа, в котором сравнивают профили экспрессии нестина и виментина в аутологичном клеточном культуральном материале дермального происхождения (A), полученном согласно способу по настоящему изобретению, с профилями экспрессии в клетках, происходящих из жировой ткани (B), где нестин детектируют в виде красного пятна при 594 нм, виментин детектируют в виде зеленого пятна при 488 нм, и ядра клеток детектируют в виде голубого пятна при окрашивании DAPI;
Фиг.7 представляет собой результат иммунофлуоресцентного анализа, в котором сравнивают профили экспрессии нестина и FSP1 в аутологичном клеточном культуральном материале дермального происхождения (A), полученном согласно способу по настоящему изобретению, с профилями экспрессии в клетках, происходящих из жировой ткани (B), где нестин детектируют в виде красного пятна при 594 нм, FSP1 детектируют в виде зеленого пятна при 488 нм, и ядра клеток детектируют в виде голубого пятна при окрашивании DAPI; и
Фиг.8 представляет собой результат полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR), в которой анализируют профиль экспрессии маркерных белков предшественника нервных клеток в аутологичном клеточном культуральном материале дермального происхождения, полученном согласно способу по настоящему изобретению.
Лучший вариант
Настоящее изобретение сейчас будет более подробно описано со ссылкой на следующие примеры, которые не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1. Получение композиции филлера для мягких тканей
1-1. Способ получения
После того, как заднюю часть уха продезинфицировали 70% спиртом, и ее местную поверхностную область анестезировали 10% лидокаином и адреналином (1:100000), из нее удалили образец ткани эпидермиса и дермы размером 4 мм2, и его хранили в маточном растворе (маточный раствор для клеток DMEM, Hyclone, USA).
Образец ткани помещали в 35 мм чашку для культивирования, в нее добавляли 2 мл раствора 0,05% панкреатина/EDTA, и затем чашку для культивирования помещали в CO2-инкубатор при 37°C на 10 минут для индукции переваривания клеток. Реакцию переваривания останавливали добавлением 5 мл DMEM с добавлением 10% FBS.
Переваренный образец ткани измельчали на кусочки и разрушали с помощью осторожной аспирации с использованием отсасывающей пипетки, чтобы, таким образом, разделить его на отдельные клетки. Разделенные дермальные клетки центрифугировали при 25°C, 1000 об/мин в течение 5 минут для удаления супернатанта, таким образом, получая только клеточный осадок.
К клеточному осадку, полученному выше, добавляли 1 мл среды для культивирования дермальных клеток (Cascade, Cat. No. 106, с добавлением 1 нг/мл EGF в качестве фактора роста и 0,2% BPE в качестве активационного фактора, USA), и смесь подвергали первичному культивированию в CO2-инкубаторе при 37°C с 5% CO2.
Культуральную среду заменяли на свежую с интервалами от 2 до 3 суток, и первично культивируемые клетки подвергали вторичному субкультивированию до тех пор, пока их конфлуентность не достигнет диапазона от 50 до 70%. Полученный раствор с культивируемыми клетками переваривали панкреатином, центрифугировали для удаления супернатанта и дополнительно культивировали при пролиферативном индексе 1:3.
Культуральный раствор, полученный при бессывороточном субкультивировании in vitro в течение от 4 до 6 недель, центрифугировали для отделения клеточного осадка дермального происхождения с последующим суспендированием в 5% глюкозном растворе для инъекции, таким образом, получая от 1 до 4 мл композиции филлера для мягких тканей для инъекции, содержащей аутологичные клетки дермального происхождения в концентрации от 2×107 до 6×107 клеток/мл в качестве эффективного ингредиента.
1-2. Тесты на вирусную инфекцию и иммунный ответ
Для исследования на наличие вирусной инфекции в клеточном культуральном материале дермального происхождения, полученном при культивировании аутологичного образца ткани в течение от 4 до 6 недель в примере «1-1», 1 мл клеточного культурального материала дермального происхождения подвергали тестированию на HIV и инфекцию вирусным гепатитом согласно общепринятому протоколу KFDA, которым подтвердили, что культуральный клеточный материал по настоящему изобретению свободен от вирусов.
Далее, подтвердили, что клеточный культуральный материал дермального происхождения не вызывает какого-либо иммунного ответа, посредством подкожного эксперимента, предназначенного для кожи подвергаемого лечению пациента, с использованием 0,1 мл культурального клеточного материала. В данной работе такой подкожный эксперимент проводили модифицированием кожного теста на аллергию к пенициллину, в котором определяли образец, не обладающий значительной областью симптома красного припухания, как отрицательный после наложения 0,05 мл суспензии пенициллина на эпидермис внутренней части запястья и наблюдения в течение 30 минут. Кроме того, в результате асептического теста согласно Chinese Biological Product Regulation (2000 Ed.), General Principle «Biological Product Aseptic Test Regulation», Article A/B, подтверждено, что аутологичный клеточный культуральный материал дермального происхождения по настоящему изобретению соответствует требованию медицинской асептики.
Композиция филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению, подтвержденная на безопасность, как описано выше, представляла собой светлую белую суспензию. В результате теста с антителами с BrDU
доля дермальных фибробластных стволовых клеток в композиции филлера находилась в диапазоне от 10 до 20%. Морфологическое исследование клеток показало, что доли дермальных фибробластных переходных делящихся клеток и дермальных фибробластов находятся в диапазоне от 30 до 40% и от 50 до 70% соответственно. Далее, в результате измерения количества коллагена согласно способу, описанному в литературе (Ministry of Health P.R.China, Pharmacopoeia Committee, «Chinese Pharmacopoeia» (2nd Ed.), Beijing Chemical Industry Press, 2000), содержание коллагена в композиции филлера по настоящему изобретению находилось в диапазоне от 20 до 60 мг/мл.
Композицию филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению хранили и транспортировали при 4°C с использованием специфического контейнера, и хранили в условиях окружающей среды там, где прохладно и сухо, возможно хранение вдали от непосредственного воздействия солнечных лучей и в отсутствие вызывающего коррозию газа и высокого давления.
Пример 2. Терапевтический эффект филлера для мягких тканей по удалению морщин
Терапевтический эффект композиции филлера для мягких тканей для инъекции, полученной в примере 1, по удалению морщин, клинически исследовали так, как следует далее.
Добровольцами для этого клинического теста стали подлежащие лечению пациенты, которым 60 лет или меньше, и страдающие от морщин на лице, таких как лобные морщины, глабеллярные бороздки (пространство между бровями и выше носа), носогубные складки, марионеточные линии и т.п. Среди добровольцев исключали пациентов, которые обладали аутоиммунным заболеванием, хроническим кожным расстройством, заболеванием, передаваемым контактным путем, острым и хроническим инфекционным заболеванием, инфекцией в области морщин, беременностью, тяжелыми заболеваниями сердца, печени и почек, чувствительным телосложением и т.п. У окончательно отобранных 20 пациентов брали анализы крови и мочи, делали им электрокардиограмму, тестировали функции печени и почек, тестировали на наличие HIV и HBs Ag и т.п.
Область морщин пациента стерилизовали 70% спиртом с последующим анестезированием дермы пациента инъекцией 1% лидокаина. 1,5 мл композиции филлера для мягких тканей, полученной в примере «1-1», наполняли 3 мл шприц, снабженный иглой 4,5 длиной 2,2 см. Иглой производили уколы в нескольких точках анестезированной дермы, наклоненной с одной стороны, и затем композицию инъецировали между верхним слоем и средним слоем дермы. При этом угол между иглой шприца и областью инъекции на коже сохранялся в диапазоне от 20 до 45°. В ходе обработки кожу полностью оттягивали до тех пор, пока она не становилась бледной, и оставляли в этом положении для обеспечения свободного пространства в области инъекции. После обработки область инъекции массировали пузырем со льдом в течение 2 часов. Суммарно повторяли три инъекции в той же дозе инъекции один раз в две недели, как описано выше. Затем за областью инъекции наблюдали в течение 12 месяцев.
Наличие патологических симптомов в области инъекции обследовали наблюдением за местными или системными состояниями пациента, и пациенты принимали витамин C два раза в сутки (200 мг на прием, 400 мг/сутки) в течение 6 месяцев. Пациентам было указано, что необходимо предотвращать прямое воздействие на область инъекции солнечных лучей и контактирование с раздражающей косметикой в течение 3 суток после лечения.
Эффект на излечение морщин оценивали согласно следующим стандартам.
Прекрасно: морщины исчезли, и кожа полностью восстановилась.
Хорошо: произошло уменьшение и явное оздоровление морщин.
Плохо: отсутствует излечение морщин.
В результате наблюдения за морщинами на лице после лечения терапевтические эффекты в моменты времени 3, 6, 9 и 12 месяцев после лечения составляли 68,3%, 79,2%, 88,1% и 91,7% соответственно. Терапевтический индекс для каждой области морщин на лице составил 91,4% для морщин, 94,9% для тонких морщин, 93% для глабеллярных бороздок, 88,2% для губного желобка и 88,9% для носогубных складок и марионеточных линий, и среднее время продолжительности терапевтических эффектов составило 3,5 месяца. Все подвергнутые лечению пациенты обладали значительно более высокой удовлетворенностью в статистическом анализе по сравнению с контролем. Более того, отсутствовали значимые побочные эффекты за исключением временного покраснения кожи в области инъекции.
Пример 3. Терапевтический эффект филлера для мягких тканей по удалению рубцов
Композицию филлера для мягких тканей для инъекции получали согласно тому же способу, как описано в примере «1-1», за исключением того, что субкультуру клеток вели в течение 8 недель. Таким образом полученная композиция филлера содержала аутологичные клетки дермального происхождения в концентрации, варьирующей от 3×107 до 7×107 клеток/мл в качестве эффективного ингредиента.
Безопасность композиции филлера для мягких тканей, полученной выше, подтверждали осуществлением тестов на вирусную инфекцию и иммунный ответ, и асептического теста согласно тем же способам, как описано в примере «1-2».
Далее, в результате исследования распределения клеток для аутологичных клеток дермального происхождения в композиции филлера для мягких тканей, полученной культивированием в течение 8 недель, доля дермальных фибробластных стволовых клеток находилась в диапазоне от 15 до 20%, доля дермальных фибробластных переходных делящихся клеток находилась в диапазоне от 20 до 50%, и доля дермальных фибробластов находилась в диапазоне от 30 до 50%. Кроме того, содержание коллагена в композиции филлера находилось в диапазоне от 30 до 80 мг/мл.
Терапевтический эффект композиции филлера для мягких тканей для инъекции, полученной в примере 1, по удалению рубцов клинически исследовали так, как указано далее.
Двадцать добровольцев, обладающих рубцами, вызванными лицевыми угрями или раной, отбирали согласно тем же условиям и подвергали предварительному тестированию согласно тем же способам, как описано в примере 2. Таким образом отобранных субъектов подвергали лечению композицией филлера для мягких тканей в области рубцов один раз в две недели. Суммарно повторяли три инъекции в той же самой дозе в течение 6 недель, как описано в примере 2, и за областью инъекции наблюдали в течение 12 месяцев после инъекции. При этом эффект по излечению рубцов оценивали согласно следующим стандартам.
Прекрасно: рубцы исчезли, и кожа полностью восстановилась.
Хорошо: произошло уменьшение и явное оздоровление рубцов.
Плохо: отсутствует излечение рубцов.
В результате терапевтический эффект по удалению рубцов в моменты времени 3, 6, 9 и 12 месяцев после лечения составил 67,5%, 92,5%, 92,5% и 92,5% соответственно, и среднее время продолжительности этих терапевтических эффектов составило 3,4 месяца. Все подвергнутые лечению пациенты обладали значительно более высокой удовлетворенностью в статистическом анализе по сравнению с контролем. Более того, отсутствовали значимые побочные эффекты, за исключением временного покраснения кожи в области инъекции.
Пример 4. Улучшение текстуры кожи и косметические эффекты филлера для мягких тканей
Композицию филлера для мягких тканей для инъекции получали согласно тому же способу, как описано в примере «1-1», за исключением того, что субкультивирование клеток проводили в течение 8 недель. Таким образом полученная композиция филлера содержала аутологичные клетки дермального происхождения в концентрации, варьирующей от 1,5×107 до 5,5×107 клеток/мл в качестве эффективного ингредиента.
Безопасность композиции филлера для мягких тканей, полученной выше, подтверждали осуществлением тестов на вирусную инфекцию и иммунный ответ, и асептического теста согласно тем же способам, как описано в примере «1-2».
Далее, в результате исследования распределения клеток для аутологичных клеток дермального происхождения в композиции филлера для мягких тканей, полученной культивированием в течение 8 недель, доля дермальных фибробластных стволовых клеток находилась в диапазоне от 5 до 20%, доля дермальных фибробластных переходных делящихся клеток находилась в диапазоне от 20 до 50%, и доля дермальных фибробластов находилась в диапазоне от 30 до 70%. Кроме того, содержание коллагена в композиции филлера находилось в диапазоне от 30 до 60 мг/мл.
Улучшение текстуры кожи и косметические эффекты композиции филлера для мягких тканей для инъекции, полученной в примере 1, клинически исследовали так, как указано далее.
Двадцать добровольцев, обладающих грубой и морщинистой текстурой кожи и бледным цветом кожи, или тех, кто желал увеличить губы или фильтр (желобок между верхней губой и носом), отбирали согласно тем же условиям и подвергали предварительному тестированию согласно тем же способам, как описано в примере 2. Таким образом отобранных субъектов подвергали лечению композицией филлера для мягких тканей в выбранной области один раз в две недели. Суммарно повторяли три инъекции в той же дозе в течение 6 недель, как описано в примере 2, и за областями инъекции наблюдали в течение 12 месяцев после инъекции.
В результате подтверждено, что обработанная кожа пациентов становится более гладкой и ровной, тонкие морщины на ней исчезают. Более того, упругость кожи восстанавливается, кожа становится гладкой к моменту времени 3 месяца после лечения. Также улучшилось очевидным образом качество и произошло увеличение губ, и бороздка между верхней губой и носом стала более плоской.
Сравнительный пример 1
Композицию филлера для мягких тканей для инъекции для удаления морщин и рубцов получали согласно способу, описанному в китайской патентной заявке No. 03155833.X, и исследовали ее терапевтический эффект по удалению морщин и рубцов. В частности, композицию филлера получали согласно тому же способу, как описано в примере «1-1», за исключением того, что клетки культивировали в среде DMEM для культивирования дермальных клеток (D5546, Sigma, USA) с добавлением фетальной бычьей сыворотки в течение 5 недель. Таким образом полученная композиция филлера содержала клетки в концентрации, варьирующей от 1×107 до 2×107 клеток/мл в качестве эффективного ингредиента.
Безопасность композиции филлера для мягких тканей, полученной выше, подтверждали осуществлением тестов на вирусную инфекцию и иммунный ответ, и асептического теста согласно тем же способам, как описано в примере «1-2».
В результате исследования распределения клеток для клеток в композиции филлера для мягких тканей, полученной культивированием в течение 5 недель, доля дермальных фибробластных стволовых клеток находилась в диапазоне от 5 до 15%, доля дермальных фибробластных переходных делящихся клеток находилась в диапазоне от 30 до 50%, и доля дермальных фибробластов находилась в диапазоне от 40 до 60%. Кроме того, содержание коллагена в композиции филлера находилось в диапазоне от 2 до 5 мг/мл.
Для исследования терапевтического эффекта по удалению морщин и рубцов композиции филлера для мягких тканей, полученной выше, проводили клинический тест для двадцати восьми добровольцев согласно тому же способу, как описано в примере 2.
В результате обнаружено, что композиция филлера обладает выраженными терапевтическими эффектами по удалению морщин и рубцов только с момента времени от 6 до 9 месяцев после лечения. Спустя 6 месяцев после лечения тонкие морщины в углах глаз исчезли, лобные линии стали меньше или исчезли, и произошло улучшение текстуры и эластичности кожи.
Далее, для подтверждения того, что клетки, входящие в состав аутологичного культурального клеточного материала дермального происхождения, полученного согласно способу по настоящему изобретению, являются клетками, происходящими из предшественника нервных клеток, обладающими характеристиками, специфическими для фибробластов дермального происхождения, которые отличают их от стволовых клеток мезенхимального происхождения, следующие эксперименты осуществили с использованием в качестве сравнительного контроля клеток, происходящих из жировой ткани.
Пример 5. Морфологическое сравнение клеток дермального происхождения с клетками, происходящими из жировой ткани
Для получения клеточного культурального материала дермального происхождения согласно настоящему изобретению образец ткани размером от 3 до 4 мм2 отбирали из задней части уха. Этот образец ткани подвергали перевариванию ткани добавлением раствора панкреатина/EDTA, который останавливали добавлением DMEM с добавлением 10% FBS. Переваренный образец ткани измельчали на кусочки и разделяли на отдельные клетки пипетированием несколько раз, и центрифугировали для удаления супернатанта, таким образом, получая только клеточный осадок. Таким образом выделенный клеточный осадок ресуспендировали в бессывороточной культуральной среде и культивировали в 5% CO2-инкубаторе при 37°C. При этом бессывороточную культуральную среду получали добавлением 1 г/мл гидрокортизона, 10 нг/мл hEGF, 3 нг/мл bFGF и 10 г/мл гепарина к культуральной основной среде для фибробластов (DMEM или 106; Cascade). Морфологию клеток исследовали в фазово-контрастный микроскоп (Olympus IX 71) в момент времени 3 недели после культивирования и регистрировали с помощью системы цифровой камеры.
Тем временем стволовые клетки, происходящие из жировой ткани, получали следующим способом, т.е. раствор с аспирационным жиром, полученный после липосакции, подвергали лизису обработкой 0,1% коллагеназой при 37°C в течение 45 минут с последующим центрифугированием полученного раствора для удаления супернатанта, таким образом, получая только клеточный осадок. Таким образом выделенный клеточный осадок ресуспендировали в DMEM с добавлением 10% FBS и культивировали в 5% CO2-инкубаторе при 37°C. Морфологию клеток исследовали в фазово-контрастный микроскоп (Olympus IX 71) в момент времени 3 недели после культивирования и регистрировали с помощью системы цифровой камеры.
В результате, как представлено на фиг.4, в то время как клетки дермального происхождения согласно настоящему изобретению обладали фибробластоподобной вытянутой формой, клетки, происходящие из жировой ткани, обладали уплощенной формой, распростертой во всех направлениях. Такая морфология каждой клетки совпадала с морфологией, ранее приведенной в литературе (Patricia A. ZUK et al., Tisseu Engineering 7:211-228, 2001; и Patricia A. ZUK et al., Molecular Biology of Cell 13:4279-4295, 2002).
Пример 6. Иммунологическое сравнение клеток дермального происхождения с клетками, происходящими из жировой ткани
6-1. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием нестина и фибронектина в качестве маркера
Клетки дермального происхождения культивировали в бессывороточной культуральной среде с течение 2 недель согласно тому же способу, как описано в примере 5. При достижении клетками дермального происхождения конфлуентности 90% к культуральному раствору добавляли раствор 0,25% трипсина/EDTA для открепления клеток от культуральной чашки с последующим ресуспендированием клеток в бессывороточной культуральной среде. Из таким образом полученной клеточной суспензии делали мазок на предметном стекле и инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°C в течение от 12 до 16 часов. Когда клетки пролиферировали до соответствующей концентрации, предметное стекло промывали DPBS, высушивали и затем использовали в качестве образца для последующего иммунофлуоресцентного анализа.
Далее, клетки, происходящие из жировой ткани, культивировали в DMEM с добавлением 10% FBS согласно тому же способу, как описано в примере 5. При достижении клетками, происходящими из жировой ткани, конфлуентности 90%, к культуральному раствору добавляли раствор 0,25% трипсина/EDTA для открепления клеток от культуральной чашки с последующим ресуспендированием клеток в DMEM с добавлением 10% FBS. Из таким образом полученной клеточной суспензии делали мазок на предметном стекле и инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°C в течение от 12 до 16 часов. Когда клетки пролиферировали до соответствующей концентрации, предметное стекло промывали DPBS, высушивали и затем использовали в качестве образца для последующего иммунофлуоресцентного анализа.
Каждое предметное стекло, полученное выше, помещали в 3,7% параформальдегид в PBS в качестве растворителя на 10 минут при покачивании для фиксирования клеток и промывали 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут. Каждое предметное стекло затем помещали в 0,5% тритон X-100 в PBS на 10 минут при покачивании для усиления клеточной проницаемости с последующей отмывкой 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
Нестин (антикроличьи поликлональные антитела, CHEMICON) и фибронектин (мышиные поликлональные антитела к фибронектину, Santa cruz) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 соответственно. Каждый из растворов разведенных маркеров добавляли на предметное стекло и оставляли взаимодействовать в течение 1 часа при покачивании. После этого предметное стекло промывали три раза 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
Alexa 594 (антикроличьи антитела IgG, Molecular probe) и Alexa 488 (антимышиные антитела IgG, Molecular probe) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 соответственно. Каждый из растворов разведенных антител добавляли на предметное стекло и оставляли взаимодействовать в течение 30 минут при покачивании.
DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндолдигидрохлорид, SIGMA) разводили PBS 1:20000. Предметное стекло затем помещали в раствор DAPI для окрашивания клеток и отмывали три раза DPBS в течение 10 минут. Отмытое предметное стекло исследовали во флуоресцентный микроскоп (Olympus IX 71) и регистрировали с помощью системы цифровой камеры.
В результате, как описано на фиг.5, нестин и фибронектин экспрессировались в клетках дермального происхождения согласно настоящему изобретению. Затем исследовали клетки, экспрессирующие оба из них. Однако в клетках, происходящих из жировой ткани, детектировали экспрессию фибронектина, но нестин не экспрессировался. Эти результаты подтверждают, что, так как клетки дермального происхождения, культивируемые согласно способу по настоящему изобретению, обладают профилем экспрессии клеточных маркеров, отличным от клеток, происходящих из жировой ткани, и экспрессируют нестин (маркер клеток-предшественников нервных клеток), они обладают иммунологическими характеристиками, соответствующими стволовым клеткам, происходящим из предшественника нервных клеток, и не соответствующими стволовым клеткам мезенхимального происхождения (Toma et al., Stem Cells 23:727-737, 2005; Fernandes et al., Nature 6:1082-1093, 2004; и Toma et al., Nature 3:778-784, 2001).
6-2. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием нестина и виментина в качестве маркера
Образцы предметных стекол с клетками дермального происхождения и клетками, происходящими из жировой ткани, для иммунофлуоресцентного анализа получали согласно тому же способу, как описано в примере «6-1» соответственно и обрабатывали параформальдегидом для фиксации клеток с последующей обработкой тритоном X-100 для улучшения клеточной проницаемости.
Нестин (антикроличьи поликлональные антитела, CHEMICON) и виментин (мышиные моноклональные антитела к виментину, CHEMICON) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 соответственно. Каждый из растворов разведенных маркеров добавляли на предметное стекло и оставляли взаимодействовать в течение 1 часа при покачивании. После этого предметное стекло промывали три раза 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
Alexa 594 (антикроличьи антитела IgG, Molecular probe) и Alexa 488 (антимышиные антитела IgG, Molecular probe) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 соответственно. Каждый из растворов разведенных антител добавляли на предметное стекло и оставляли взаимодействовать в течение 30 минут при покачивании.
DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндолдигидрохлорид, SIGMA) разводили PBS 1:20000. Предметное стекло затем помещали в раствор DAPI для окрашивания клеток и отмывали три раза DPBS в течение 10 минут. Отмытое предметное стекло исследовали во флуоресцентный микроскоп (Olympus IX 71) и регистрировали с помощью системы цифровой камеры.
В результате, как проиллюстрировано на фиг.6, нестин и виментин экспрессировались в клетках дермального происхождения по настоящему изобретению. Затем исследовали клетки, экспрессирующие оба из них. Однако в клетках, происходящих из жировой ткани, детектировали экспрессию виментина, но нестин не экспрессировался. Эти результаты идентичны предыдущему сообщению, как описано в литературе (Toma et al, Stem Cells 23:727-737, 2005; Fernandes et al., Nature 6:1082-1093, 2004).
6-3. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием нестина и поверхностного белка фибробластов 1 (FSP1) в качестве маркера
Образцы предметных стекол с клетками дермального происхождения и клетками, происходящими из жировой ткани, для иммунофлуоресцентного анализа получали согласно тому же способу, как описано в примере «6-1» соответственно и обрабатывали параформальдегидом для фиксации клеток с последующей обработкой тритоном X-100 для улучшения клеточной проницаемости.
FSP1 (моноклональные антитела к поверхностному белку фибробластов человека, клон 1B10, SIGMA) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 и добавляли на предметное стекло. Предметное стекло оставляли взаимодействовать в течение 1 часа при покачивании. После этого предметное стекло промывали три раза 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
После отмывки каждое предметное стекло помещали в 3,7% параформальдегид в PBS на 10 минут при покачивании для фиксирования клеток и отмывали 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут. Предметное стекло помещали в 0,5% тритон X-100 в PBS на 10 минут для усиления клеточной проницаемости с последующей отмывкой 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
Нестин (антикроличьи поликлональные антитела, CHEMICON) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:1000 и добавляли на предметное стекло. Предметное стекло оставляли взаимодействовать в течение 1 часа при покачивании и затем отмывали три раза 1% обезжиренным молоком в PBS в течение 10 минут.
Alexa 594 (антикроличьи антитела IgG, Molecular probe) и Alexa 488 (антимышиные антитела IgG, Molecular probe) разводили 1% обезжиренным молоком в PBS 1:500 соответственно. Каждый из растворов разведенных антител добавляли на предметное стекло и оставляли взаимодействовать в течение 30 минут при покачивании.
DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндолдигидрохлорид, SIGMA) разводили PBS 1:20000. Предметное стекло затем помещали в раствор DAPI для окрашивания клеток и отмывали три раза DPBS в течение 10 минут. Отмытое предметное стекло исследовали во флуоресцентный микроскоп (Olympus IX 71) и регистрировали с помощью системы цифровой камеры.
В результате, как описано на фиг. 7, нестин и FSP1 экспрессировались в клетках дермального происхождения по настоящему изобретению. Затем исследовали клетки, экспрессирующие оба из них. Однако в клетках, происходящих из жировой ткани, детектировали экспрессию FSP1, но нестин не экспрессировался.
Этими результатами подтверждено, что клеточный культуральный материал дермального происхождения, полученный культивированием в бессывороточной среде согласно настоящему изобретению, обладает сигналами для фибронектина и FSP-1, известного как маркерный белок фибробластов, а также для нестина, известного как маркерный белок стволовых клеток, происходящих из предшественника нервных клеток, которые очевидным образом отличаются от стволовых клеток мезенхимального происхождения, таких как клетки, происходящие из жировой ткани.
Пример 7. RT-PCR для исследования профиля экспрессии маркерных белков предшественника нервных клеток в клетках дермального происхождения
Клетки дермального происхождения культивировали в бессывороточной культуральной среде в течение 2 недель согласно тому же способу, как описано в примере 5. При достижении клетками дермального происхождения конфлуентности 90% к культуральному раствору добавляли раствор 0,25% трипсина/EDTA для открепления клеток от культуральной чашки с последующим выделением РНК с использованием набора для выделения РНК (Purelink Micro to-midi, Invitrogen).
Реакционный раствор получали смешиванием таким образом выделенной РНК, dNTP и 20-мерного праймера олиго-dT и доведением конечного объема до 10 мкл. Реакционный раствор инкубировали при 65°C в течение 5 минут с последующим хранением при 0°C в течение минуты. После того, как в него добавляли 10 мкл смеси для синтеза кДНК (10× буфер для RT, 25 мМ MgCl2, 0,1 M DTT, не содержащий РНКазы, Superscript III RT), полученный раствор подвергали обратной транскрипции при 50°C в течение 50 минут и 85°C в течение 20 минут. К реакционному раствору добавляли 1 мкл РНКазы H и оставляли при 37°C в течение 20 минут, чтобы, таким образом, синтезировать кДНК.
PCR осуществляли для исследования профилей экспрессии p75NTR, Pax3, Snail, Slug, нестина и виментина, известного как маркерный белок предшественника нервных клеток, с использованием синтезированной кДНК в качестве матрицы. Условия PCR являлись такими, как указано далее, т.е. начальная денатурация при 95°C в течение 2 минут с последующими 35 циклами из 95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 1 минуты. При этом GAPDH использовали в качестве контроля, и пары прямых и обратных праймеров, используемых в PCR для амплификации каждого маркерного белка, являлись такими, как указано далее:
SEQ ID NO:1 нестина-1 и SEQ ID NO:2 нестина-2 для амплификации нестина
SEQ ID NO:3 виментина-1 и SEQ ID NO:4 виментина-2 для амплификации виментина
SEQ ID NO:5 p75NTR-1 и SEQ ID NO:6 p75NTR-2 для амплификации p75NTR
SEQ ID NO:7 pax3-1 и SEQ ID NO:8 pax3-2 для амплификации Pax3
SEQ ID NO:9 snail-1 и SEQ ID NO:10 snail-2 для амплификации Snail
SEQ ID NO:11 slug-1 и SEQ ID NO:12 slug-2 для амплификации Slug
SEQ ID NO:13 GAPDH-I и SEQ ID NO:14 GAPDH-2 для амплификации GAPDH
В результате, как проиллюстрировано на фиг.8, подтверждено, что p75NTR, Pax3, Snail, Slug, нестин и виментин экспрессируются на уровне мРНК в клетках дермального происхождения по настоящему изобретению. В частности, виментин в значительном количестве экспрессировался в клетках дермального происхождения по настоящему изобретению. Эти результаты показывают на уровне мРНК, что клеточный культуральный материал дермального происхождения по настоящему изобретению содержит стволовые клетки, происходящие из предшественника нервных клеток.
Промышленная применимость
Как описано выше, композиция филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению обладает пролонгированными терапевтическими эффектами без вызывания какого-либо иммунного ответа и побочных эффектов вследствие использования аутологичных дермальных клеток. Более того, так как в ней полностью устраняется риск использования сыворотки животного происхождения посредством бессывороточной культивации in vitro, и она обладает непосредственными терапевтическими эффектами посредством продуцирования большого количества коллагена, композицию филлера для мягких тканей для инъекции по настоящему изобретению можно эффективно применять для улучшения цвета и упругости кожи, а также разглаживания и удаления морщин и рубцов.
1. Способ получения композиции филлера для мягких тканей для инъекции для облегчения или лечения повреждения кожи вследствие механических или физиологических причин, включающий стадии:
1) переваривания аутологичной дермальной ткани, выделенной из собственной кожи пациента путем обработки раствором панкреатина/EDTA, и разделения на отдельные клетки;
2) культивирования и пролиферации выделенных дермальных клеток посредством бессывороточной культивации in vitro в среде, содержащей фактор роста и активационный фактор для получения аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения, содержащего дермальные фибробластные стволовые клетки, дермальные фибробластные переходные делящиеся клетки, дермальные фибробласты и коллаген;
3) центрифугирования аутологичного клеточного культурального материала дермального происхождения для отделения аутологичного клеточного осадка дермального происхождения и
4) суспендирования аутологичного клеточного осадка дермального происхождения в глюкозном растворе для инъекции или произвольном растворе для инъекции с получением суспензии для инъекции.
2. Способ по п.1, в котором аутологичную дермальную ткань со стадии 1) подвергают размораживанию один раз после того, как дермальная ткань, выделенная из собственной кожи пациента, лиофилизирована и хранилась.
3. Способ по п.1, в котором композиция филлера для мягких тканей содержит от 1×107 до 8×107 клеток/мл аутологичных клеток дермального происхождения и от 10 до 100 мг/мл коллагена в качестве эффективного ингредиента.
4. Способ по п.1, в котором процентное соотношение дермальных фибробластных стволовых клеток, дермальных фибробластных переходных делящихся клеток и дермальных фибробластов в композиции филлера для мягких тканей составляет 5-20:20-50:30-70.
5. Способ по п.1, в котором фактор роста является одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из эпидермального фактора роста, дермального фактора роста, bFGF (основного фактора роста фибробластов) и их смеси.
6. Способ по п.5, в котором содержание фактора роста находится от 0,1 до 1 нг/мл.
7. Способ по п.1, в котором активационный фактор является одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из кортикального гормона, экстракта гипофиза быка (ВРЕ), инсулина, гидрокортизона и их смеси.
8. Способ по п.7, в котором содержание активационного фактора находится от 0,1 до 1%.
9. Способ по п.1, в котором бессывороточную культивацию in vitro проводят от 6 до 10 недель.
10. Композиция филлера для мягких тканей для инъекции для облегчения или лечения повреждения кожи вследствие механических или физиологических причин, которую получают способом по п.1, где композиция филлера для мягких тканей содержит от 1×107 до 8×107 клеток/мл аутологичных клеток дермального происхождения и от 10 до 100 мг/мл коллагена в качестве эффективного ингредиента.
11. Композиция филлера для мягких тканей для инъекции по п.10, которая предназначена для облегчения или лечения морщин или рубцов в области, содержащей повреждение кожи вследствие кожных дефектов.
12. Композиция по п.11, где лечение повреждения кожи вследствие кожных дефектов предназначено для уменьшения морщин, удаления рубцов или увеличения губ.
13. Композиция по п.12, где морщины включают морщины на лице и шее, стрии после беременности и морщины на тыльной стороне руки.
