Противоопухолевое средство тритерпеновой природы, полученное путем модификации глицирретовой кислоты

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к метиловому эфиру 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты формулы (1):

которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием. 1 табл., 3 ил.

 

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретно к метиловому эфиру 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты формулы (1):

которое может быть использовано в медицине в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием.

Онкологические заболевания являются одной из основных проблем современной медицины, поскольку даже при благоприятном течении заболевания в большинстве случаев не удается достичь полного выздоровления пациента, существенно увеличить продолжительность и улучшить качество его жизни. Предлагаемые на данный момент схемы лечения различного типа злокачественных опухолей используют хирургические методы в комплексе с высокодозной агрессивной терапией, серьезным недостатком которой является высокая токсичность современных противоопухолевых препаратов в отношении жизненно важных органов и систем организма. Сопутствующие побочные эффекты снижают эффективность, а в ряде случаев ограничивают применение противоопухолевых средств. Другой проблемой в лечении онкологических заболеваний является проблема остаточного опухолевого клона. Опухолевые клетки, пережившие химиотерапию, обычно проявляют лекарственную устойчивость к широкому кругу препаратов и вызывают рецидив заболевания в более тяжелой форме. В связи со всем вышесказанным актуальной задачей является поиск новых противоопухолевых препаратов, обеспечивающих высокую избирательность и эффективность лечения.

Одним из важных направлений медицинской химии, позволяющим получать новые эффективные противоопухолевые препараты, является использование синтетических трансформаций растительных метаболитов. Наиболее приемлемым считается исследование растительных метаболитов, о биологической активности которых имеются достоверные сведения и которые являются доступными в настоящее время или станут доступными в ближайшем будущем по мере формирования сырьевой базы. К данному классу соединений относятся тритерпеновые кислоты, широкий спектр биологической активности которых (противовоспалительная, противовирусная, противоопухолевая, иммуностимулирующая и т.д.) приковывает к ним пристальный интерес исследователей.

Задачей изобретения является создание нового эффективного, низкотоксичного лекарственного средства, обладающего противоопухолевым действием и получаемого из доступного растительного сырья.

Поставленная задача решается новым соединением, а именно метиловым эфиром 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты формулы (1):

Из литературы известно, что некоторые производные тритерпеноидов перспективны как противоопухолевые препараты [Honda Т., Janosik Т., Honda Y., Han J., Liby К.Т., Williams Ch. R., Couch R.D., Anderson A.C., Sporn M.В., Gribble G.W. // J. Med. Chem. 2004, 47, 4923-4932]. Так, например, синтетический тритерпеноид CDDO (2-циано-3,12-диоксоолеан-1,9-диен-28-овая кислота), полученный из олеаноловой кислоты, проявляет высокую противоопухолевую активность в отношении широкого спектра раковых клеток (IC₅₀ 10^-6-10^-9 М) [Suh N., Wang Y., Honda Т., Gribble G.W., Dmitrovsky E., Hickey W.F., Maue R.A., Place A.E., Porter D.М., Spinella М.J., Williams Ch.R., Wu G., Dannenberg A.J., Flanders K.C., Letterio J.J., Mangelsdorf D.J., Nathan C.F., Nguyen L., Porter W.W., Ren R.F., Roberts А.В., Roche N.S., Subbaramaiah K., Sporn М.B. // Cancer Res. 1999, V. 59, P. 336-341]. В том числе CDDO вызывает апоптоз клеток миелоидной лейкемии (IC₅₀ ~10^-6 М) [Konopleva М., Tsao Т., Estrov Z., Lee Ruey-min, Wang Rui-Yu, Jackson C.E., McQueen Т., Monaco G., Munsell М., Belmont J., Kantarjian H., Sporn М.В., Andreeff М. // Cancer Res. 2004, V.64, P.7927-7935], ингибирует рост клеток эпителиальной карциномы яичников (IC₅₀ 1.1-3.0×10^-6 М) [Melichar В., Konopleva М., Hu Wei, Melicharova K., Andreeff М., Freedman R.S. // Gynecologic Oncology. 2004, V.93, P.149-154]. Обстоятельством, повышающим привлекательность тритерпенов, является их широкое распространение в природе и во многих случаях относительная простота технологии получения из многотоннажного растительного сырья.

Одним из таких доступных соединений с ярко выраженными физиологическими свойствами является 18βН-глицирретовая кислота формулы (2) - агликон глицирризиновой кислоты - преобладающего гликозида корня солодки (~90% от общего количества тритерпеновых гликозидов). [Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Гранкина В.П., Кондратенко P.M., Толстикова Т.Г. Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине. Новосибирск, Академическое издание «ГЕО», 2007, 312 с.]

Метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (метиловый эфир 11-циано-2,4а,6а,6b,9,9,12а-гептаметил-10,14-диоксо-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,12а,14,14а,14b-октадекагидропицен-2-оловой кислоты) формулы (1) был получен нами в результате комбинированной модификации колец А и С 18βН-глицирретовой кислоты формулы (2):

Модификацию проводили согласно схеме 2. В качестве исходного соединения был взят ацетат 18βН-глицирретовой кислоты (3), полученный в результате дегликолизации глицирризиновой кислоты в уксусной кислоте [Толстяков Г.А. Синтетические исследования в области физиологически активных высших терпеноидов и стероидов. Дис. работа д-ра хим. наук. Уфа. 1969]. Метиловый эфир ацетата 18βН-глицирретовой кислоты (4) получали взаимодействием соединения (3) с диазометаном. Первоначально провели модификацию кольца С. Взаимодействие соединения (4) с цинком и соляной кислотой приводит к восстановлению карбонильной группы при С-11 до метиленовой. Окисление соединения (5) перекисью водорода в уксусной кислоте формирует карбонильную группу при С-12, последующее взаимодействие полученного кетона с бромом в уксусной кислоте (в результате реакции бромирования - дегидробромирования) приводит к 9,11-двойной связи - соединение (6). Дальнейшая 6-стадийная модификация кольца А (окисление гидроксильной группы в кетоннную при С-3, формилирование, конденсация с гидроксиламином, расщепление изоксазольного кольца и окисление дихлордицианхиноном) приводит к образованию 2-циано-3-оксо-1-енового фрагмента и, соответственно, к соединению (1).

Элементный состав полученных веществ определяли из масс-спектров высокого разрешения, записанных на приборе DFS (Double Focusing Sector) фирмы Thermo Electron Corporation.

В работе использовался ацетат метилового эфира глицирретовой кислоты (3) 94%-ной чистоты (ВЭЖХ).

Спектры ЯМР ¹Н и ¹³С регистрировали на спектрометрах АМ-400 (рабочие частоты 400.13 МГц для ¹Н и 100.61 МГц для ¹³С) и DRX-500 (500.13 МГц и 125.76 МГц соответственно) фирмы Broker для растворов веществ в CDCl₃. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ_Н 7.24 и δ_С 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР ¹Н с привлечением спектров двойного резонанса ¹H-¹Н и двумерных спектров гомоядерной ¹H-¹H корреляции, а также анализа спектров ЯМР ¹³С, записанных в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным подавлением протонов и двумерных спектров гетероядерной ¹³C-¹H корреляции на прямых и на дальних константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, ¹J_C,H 135 Гц и COLOC, ^2,3J_C,H 10 Гц, соответственно).

Было исследовано влияние заявляемого метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека, клеток нейробластомы человека и опухолевых клеток почки эмбриона человека.

В результате было показано, что заявляемое соединение (1) проявляет высокую противоопухолевую активность по отношению ко всем использованным опухолевым клеточным культурам, включая карциномную линию клеток КВ-8-5, обладающую фенотипом множественной лекарственной устойчивости. При исследовании цитотоксичности соединения (1) по отношению к использованным опухолевым клеткам были получены значения LD50, концентрации соединения, при котором наблюдается гибель 50% клеток. Показано, что значения LD50 для соединения (1) имеют сходный порядок величины для всех опухолевых клеток и лежат в диапазоне от 5×10^-6 (для линии клеток MCF-7) до 0.4×10^-6 (для линии клеток HeLa). Полученные данные по противоопухолевой активности соединения (1) позволяют рассматривать его как перспективное лекарственное средство.

Кроме того, при сравнении заявляемого соединения (1) с известным и широко испытываемым противоопухолевым агентом CDDO можно отметить следующее. При практически одинаковой противоопухолевой эффективности заявляемое соединение дешевле агента CDDO, так как 18βН-глицирретовая кислота - исходный продукт при синтезе соединения (1) - является гораздо более доступным и более дешевым соединением по сравнению с олеаноловой кислотой, исходным соединением для синтеза CDDO (стоимость олеаноловой кислоты более чем в 60 раз превышает стоимость 18βН-глицирретовой кислоты).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение ацетата метилового эфира 18βН-глицирретовой кислоты (4)

К смеси ацетата 18βН-глицирретовой кислоты (3) (10 г, 19.0 ммоль) в 200 мл метанола при перемешивании прибавили эфирный раствор диазометана до тех пор, пока раствор не окрасился в бледно-желтый цвет. После полного разложения диазометана (исчезновения характерной окраски) растворитель отогнали на ротационном испарителе и полученный осадок перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Масса полученного соединения (4) 9.1 г (выход 88.6% (96% в пересчете на чистое вещество)). Т. пл. 303-304°С. Найдено, m/z: 526.3649 [M]⁺. C₃₃H₅₀O₅. Вычислено М 526.3653. Спектр ЯМР ¹Н соединения (4), δ, м.д. (J, Гц): 0.76 д.д (H^5a, J_5a,6a 12.5, J_5a,6a 1.5 Гц), 0.76 с (С²⁸Н₃), 0.84 с (6Н, С²³Н₃, С²⁴Н₃), 0.97 д.м (H^15e, J_15e,15a 13.8 Гц), 1.01 д.д.д (H^1a, J_1a,1e 13.5, J_1a,2a 13.5, J_1a,2e 3.7 Гц), 1.08 с (C²⁶H₃), 1.10 с (C²⁹H₃), 1.12 с (С²⁵Н₃), 1.14 д.м. (H^16e, J_16e,16a 13.8 Гц), 1.23-1.39 м (Н⁷, H^21a, 2Н²²), 1.32 с (С²⁷Н₃), 1.41 д.д.д.д (H^6a, J_6a,6e 13.5, J_6a,7a 13.5, J_6a,5a 12.0, J_6a,7e 3.2 Гц), 1.51-1.66 м (H^6e, H^2e, Н^7'), 1.57 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.5, J_19a,l8a 13.5 Гц), 1.66 д.д.д.д (H^2a, J_2a,2е 13.5, J_2a,1a 13.5, J_2a,3a 11.7, J_2a,1e 3.7 Гц), 1.78 д.д.д (H^16a, J_16a,16e, 13.8, J_l6a,15a 13.8, J_16a,15e 4.5 Гц), 1.88 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.5, J_19e,l8a 4.2, J_19e,21e 2.7 Гц), 1.95 д.м (H^21e, J_21e,21a 10 Гц), 1.98 д.д.д (H^15a, J_15a,15e 13.8, J_15a,16a 13.8, J_15a,16e 4.8 Гц), 2.00 с (С³³Н₃), 2.04 д.д (H^18a, J_18a,19a 13.5, J_18a,19e 4.2), 2.32 с (H^9a), 2.76 д.д.д (H^1e, J_1e,1a 13.5, J_1e,2a 3.7, J_1e,2e 3.0 Гц), 3.64 с (ОС³¹Н₃), 4.47 д.д (H^3a, J_3a,2a 11.7, J_3a,2е 4.7 Гц), 5.62 с (Н¹²). Спектр ЯМР ¹³С соединения (4), δ, м.д.: 38.63 т (С¹), 23.41 т (С²), 80.45 д (С³), 37.88 с (С⁴), 54.88 д (С⁵), 17.22 т (С⁶), 32.55 т (С⁷), 43.03 с (С⁸), 61.56 д (С⁹), 36.78 с (С¹⁰), 199.85 с (С¹¹), 128.34 д (С¹²), 169.01 с (С¹³), 45.23 с (С¹⁴), 26.26 т (С¹⁵), 26.31 т (С¹⁶), 31.67 с (С¹⁷), 48.25 д (С¹⁸), 40.93 т (С¹⁹), 43.87 с (С²⁰), 30.98 т (С²¹), 37.59 т (С²²), 27.89 к (С²³), 16.52 к (С²⁴), 16.24 к (С²⁵), 18.52 к (С²⁶), 23.17 к (С²⁷), 28.36 к (С²⁸), 28.15 к (С²⁹), 176.73 с (С³⁰), 51.58 к (С³¹), 170.77 с (С³²), 21.13 к (С³³).

Пример 2. Получение ацетата метилового эфира 11-дезоксоглицирретовой кислоты (5)

К раствору ацетата метилового эфира глицирретовой кислоты (4) 9.1 г (17.3 ммоль) и 18.2 г цинковой пыли в 300 мл диоксана при 5°C в течение 2 ч по каплям прибавляли 50 мл концентрированной соляной кислоты. Поддерживая температуру в интервале 5-10°С, перемешивали еще 3 ч. Затем в вакууме отогнали половину объема диоксана и вылили в 1 л воды. Полученный осадок отфильтровали, высушили на воздухе, после чего хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - бензол с градиентом хлороформа 0-100%). Выход 6.8 г (76.8%). Для получения аналитически чистого образца 100 мг соединения (5) перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Т. пл. 265-267°С. Найдено, m/z: 512.3649 [M]⁺. C₃₃H₅₂O₄. Вычислено М 512.3653. Спектр ЯМР ¹Н соединения (5), δ, м.д. (J, Гц): 0.74 с (С²⁸Н₃), 0.81 д.д. (H^5a, J_5a,6a 12.0, J_5a,6e 1.6 Гц), 0.83 с (С²⁴Н₃), 0.84 с (С²³Н₃), 0.93 с (С²⁵Н₃, C²⁶H₃), 0.94 д.м (H^15e, J_15e,15a 13.5 Гц), 1.02 м (Н¹), 1.09 с (С²⁹Н₃), 1.10 с (С²⁷Н₃), 1.17-1.35 м (Н⁷, Н²¹, 2Н²²), 1.39 м (H^6a), 1.44-1.64 м (Н^1', 2Н², H^6e, Н^7', H^2e, Н¹⁹), 1.73 д.д.д (H^15a, J_15a,15e 13.5, J_15a,16a 13.5, J_15a,16e 4.6 Гц), 1.79-1.93 м (2H¹¹, Н¹⁸, Н^19', Н^21'), 1.92 м (H^16a), 2.01 с (С³³Н₃), 3.64 с (ОС³¹Н₃), 4.47 д.д (H^3a, J_3a,2a 10.0, J_3a,2е 6.0 Гц), 5.23 т (Н¹², J_12,11 3.6 Гц). Спектр ЯМР ¹³С соединения (5), δ, м.д.: 38.13 т (С¹), 23.42 т (С²), 80.74 д (С³), 37.56 с (С⁴), 55.13 д (С⁵), 18.11 т (С⁶), 32.46 т (С⁷), 39.65 с (С⁸), 47.42 д (С⁹), 36.70 с (С¹⁰), 23.34 т (С¹¹), 122.34 д (С¹²), 144.23 с (С¹³), 41.38 с (С¹⁴), 25.99 т (С¹⁵), 26.82 т (С¹⁶), 31.79 с (С¹⁷), 48.05 д (С¹⁸), 42.68 т (С¹⁹), 44.12 с (С²⁰), 31.15 т (С²¹), 38.25 т (С²²), 27.89 к (С²³), 16.54 к (С²⁴), 15.41 к (С²⁵), 16.64 к (С²⁶), 25.77 к (С²⁷), 28.03 к (С²⁸), 28.38 к (С²⁹), 177.46 с (С³⁰), 51.35 к (С³¹), 170.77 с (С³²), 21.13 к (С³³).

Пример 3. Получение ацетата метилового эфира 12-оксо-11-дезоксоглицирретовой кислоты (6)

К раствору 3.0 г (5.7 ммоль) ацетата метилового эфира 11-дезоксоглицирретовой кислоты (5) в 100 мл ледяной уксусной кислоты при 80°С по каплям в течение 1 ч прибавляли смесь 25 мл перекиси водорода (~30%) и 25 мл уксусной кислоты. Охладили и реакционную смесь вылили в 0.5 л воды. Выпавший осадок отфильтровали и высушили на воздухе. Масса полученного соединения (6) 2.9 г (выход 96%). Для получения аналитически чистого образца 300 мг соединения (6) перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Т. пл. 296-299°С. Найдено, m/z: 528.3649 [М⁺]. C₃₃H₅₂O₅. Вычислено М 528.3653. Спектр ЯМР ¹Н соединения (6), δ, м.д. (J, Гц): 0.79-0.88 м (H^5a, H^16e), 0.82 с (С²⁸Н₃), 0.83 с (С²⁴Н₃), 0.84 с (С²³Н₃), 0.86 с (С²⁵Н₃), 0.90 с (С²⁷Н₃), 0.92-1.01 м (Н¹, H^15e), 1.09 с (С²⁹Н₃), 1.10 с (C²⁶H₃), 1.19 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.4, J_19a,18 13.4 Гц), 1.18-1.27 м (H^21a, H^22e), 1.31-1.47 м (2Н⁷, H^22a, Н⁶), 1.49-1.64 м (Н^1', 2Н², Н^6'), 1.64 д.д (H^9a, J_9a,11a 13.0, J_9a,11e 5.1 Гц), 1.74 М (Н¹⁸), 1.76 М (H^15a), 1.85 д.д.д (H^16a, J_16a,16е 13.2, J_16a,l5a 13.2, J_16a,15e 4.2 Гц), 1.91 д.м (H^21e, J_21e,21a 13.2 Гц), 2.00 с (С³³Н₃), 2.12 д.д (H^11e, J_11e,11a 17.0, J_11a,9a 13.0 Гц), 2.23 д.д (H^11e, J_11e,11a 17.0, J_11e,9a 5.1 Гц), 2.54 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.4, J_19e,18 3.4, J_19e,21e 2.8 Гц), 2.72 д (Н¹³, J_13,18 4.4 Гц), 3.68 с (ОС³¹Н₃), 4.44 д.д (H^3a, J_3a,2a 11.4, J_3a,2e 4.8 Гц). Спектр ЯМР ¹³С соединения (6), δ, м.д.: 37.50 т (С¹), 23.26 т (С²), 80.28 д (С³), 37.60 с (С⁴), 55.04 д (С⁵), 18.05 т (С⁶), 31.63 т (С⁷), 41.41 с (С⁸), 49.32 д (С⁹), 36.67 с (С¹⁰), 38.28 т (С¹¹), 211.91 с (С¹²), 50.08 д (С¹³), 41.90 с (С¹⁴), 25.84 т (С¹⁵), 26.29 т (С¹⁶), 32.01 с (С¹⁷), 38.41 д (С¹⁸), 34.05 т (С¹⁹), 43.97 с (С²⁰), 31.19 т (С²¹), 38.33 т (С²²), 27.75 к (С²³), 16.30 к (С²⁴), 15.16 к (С²⁵), 15.95 к (С²⁶), 20.78 к (С²⁷), 26.83 к (С²⁸), 28.59 к (С²⁹), 177.44 с (С³⁰), 51.36 к (С³¹), 170.70 с (С³²), 21.09 к (С³³).

Пример 4. Получение ацетата метилового эфира 12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (7)

К раствору ацетата метилового эфира 12-оксо-11-дезоксоглицирретовой кислоты (6) (4.0 г, 7.6 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (150 мл) при 80°С в течение 1 ч по каплям прибавляли 3%-ный раствор брома в ледяной уксусной кислоте (50.0 мл, 9.8 ммоль). Реакционную смесь выдерживали 1 ч при той же температуре, охладили и вылили в 1.5 л холодной воды. Полученный осадок отфильтровали, промыли водой и сушили на воздухе. Перекристаллизацией из смеси метанол-хлороформ был получено 3.0 г продукта (7) (выход 75.3%). Т. пл. 298°С. Найдено, m/z: 526.3490 [M]⁺. C₃₃H₅₀O₅. Вычислено М 526.3653. Спектр ЯМР ¹H соединения (7), δ, м.д. (J, Гц): 0.84 м (H^16a), 0.85 с (С²⁴Н₃), 0.86 с (6Н: С²³Н₃, С²⁸Н₃), 0.91 с (С²⁷Н₃), 0.94 д.м (H^5a, J_5a,6a 10 Гц), 1.01 д.м (H^15e, J_15e,l5a 13.2 Гц), 1.07 с (C²⁹H₃), 1.16 с (С²⁵Н₃), 1.20 д.д (H^19a, J_19a,l9e 13.3, J_19a,18 13.3 Гц), 1.16-1.27 м (H^21a, H^22e), 1.32 с (C²⁶H₃), 1.35-1.44 м (H^1a, H^7e), 1.46 д.д.д (H^22a, J_22a,22e 14.0, J_22a,21a 14.0, J_22a,21e 4.2 Гц), 1.55-1.73 м (2Н⁶, H^7a, 2Н²), 1.77 м (H^15a), 1.83 м (H^16a), 1.90 д.м (H^1e, H^21e), 1.93 д.м (Н¹⁸, J_18,19a 13.3), 2.00 с (С³³Н₃), 2.16 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.3, J_19e,18 3.4, J_19e,21e 2.8 Гц), 2.92 д (Н¹³, J_13,18 4.7 Гц), 3.69 с (ОС³¹Н₃), 4.43 д.д (H^3a, J_3a,2a 11.7, J_3a,2е 4.5 Гц), 5.52 с (Н¹¹). Спектр ЯМР ¹³С соединения (7), δ, м.д.: 35.86 т (С¹), 23.66 т (С²), 79.49 д (С³), 37.95 с (С⁴), 50.08 д (С⁵), 17.67 т (С⁶), 32.66 т (С⁷), 45.29 с (С⁸), 177.61 с (С⁹), 39.59 с (С¹⁰), 122.89 д (С¹¹), 201.14 с (С¹²), 47.70 д (С¹³), 41.61 с (С¹⁴), 26.03 т (С¹⁵), 26.03 т (С¹⁶), 31.87 с (С¹⁷), 37.81 д (С¹⁸), 33.69 т (С¹⁹), 43.88 с (С²⁰), 31.10 т (С²¹), 38.13 т (С²²), 27.77 к (С²³), 16.46 к (С²⁴), 23.79 к (С²⁵), 23.85 к (С²⁶), 21.84 к (С²⁷), 26.90 к (С²⁸), 28.45 к (С²⁹), 177.22 с (С³⁰), 51.32 к (С³¹), 170.59 с (С³²), 21.01 к (С³³).

Пример 5 Получение метилового эфира 12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (8)

Раствор ацетата метилового эфира 12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (7) (6.2 г, 11.8 ммоль) и КОН (41 г, 732 ммоль) в метаноле (400 мл) кипятили в течение 2 ч. Реакционную смесь охладили и отогнали большую часть метилового спирта на вакууме, затем добавили этилацетат (100 мл) и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали смесью хлороформ-этилацетат (1:4) (3×75 мл). Объединенный экстракт промывали раствором гидрокарбоната натрия (3×50 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×50 мл). Сушили сульфатом магния. Масса полученного продукта (8) 5.13 г (выход 90.0%). Для получения аналитически чистого образца 130 мг продукта перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Т. пл. 202-203°С. Найдено, m/z: 484.3385 [M]⁺. C₃₁H₄₈O₄. Вычислено М 484.3396. Спектр ЯМР ¹Н соединения (8), δ, м.д. (J, Гц): 0.80 с (С²⁴Н₃), 0.89 с (С²⁸Н₃), 0.94 с (С²⁷Н₃), 1.01 с (С²³Н₃), 1.08 с (С²⁹Н₃), 1.16 с (С²⁵Н₃), 1.35 с (С²⁶Н₃), 0.83-0.91 м (H^5a, H^16e), 1.04 д.м (H^15e, J_15e,15a 12.8 Гц), 1.23 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.2, J_19a,18 13.2 Гц), 1.18-1.25 м (H^21a), 1.27 д.м (H^22e, J_22e,22a 14.0), 1.31 м (H^1a), 1.44 д.м (H^7e, J_7e,7a 9.8 Гц), 1.49 д.д.д (H^22a, J_22a,22e 14.0, J_22a,21a 14.0, J_22a,21e 4.2 Гц), 1.55-1.76 м (2Н⁶, H^7a, 2Н²), 1.80 м (H^15a), 1.83 м (H^16a), 1.89-2.00 м (H^1e, H^21e, Н¹⁸), 2.19 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.2, J_19e,18 3.2, J_19e,21e 2.7 Гц), 2.95 д (Н¹³, J_13,18 4.7 Гц), 3.18 д.д (H^3a, J_3a,2a 11.7, J_3a,2e 4.4 Гц), 3.71 с (ОС³¹Н₃), 5.76 с (Н¹¹). Спектр ЯМР ¹³С соединения (8), δ, м.д.: 36.22 т (С¹), 27.38 т (С²), 77.83 д (С³), 39.11 с (С⁴), 50.06 д (С⁵), 17.87 т (С⁶), 32.79 т (С⁷), 45.39 с (С⁸), 178.10 с (С⁹), 39.81 с (C¹⁰), 122.85 д (С¹¹), 201.36 с (С¹²), 47.76 д (С¹³), 41.70 с (С¹⁴), 26.14 т (С¹⁵), 26.12 т (С¹⁶), 31.95 с (С¹⁷), 37.88 д (С¹⁸), 33.79 т (С¹⁹), 43.95 с (С²⁰), 31.17 т (С²¹), 38.21 т (С²²), 27.96 к (С²³), 15.44 к (С²⁴), 23.81 к (С²⁵), 23.87 к (С²⁶), 21.99 к (С²⁷), 26.96 к (С²⁸), 28.52 к (С²⁹), 177.33 с (С³⁰), 51.43 к (С³¹).

Пример 6. Получение метилового эфира 3,12-диоксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (9)

К раствору метилового эфира 12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (8) (5.0 г, 10.3 ммоль) в ацетоне (500 мл) по каплям прибавляли 5 мл реагента Джонса (бихромат натрия в 33%-ной серной кислоте). Перемешивали 2.5 ч, затем добавили 50 мл этилового спирта и перемешивали еще 30 мин для разложения хромовой кислоты. Реакционную смесь упарили в вакууме до объема ~100 мл и вылили в воду (1 л). Выпавший осадок отфильтровали и высушили на воздухе. Для очистки вещество растворяли в хлороформе и фильтровали через слой окиси алюминия. Масса полученного соединения (9) 4.7 г (выход 94.4%). Для получения аналитически чистого образца 200 мг продукта перекристаллизовали из смеси метанол-хлороформ. Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Т. пл. 189-192°С. Найдено, m/z: 482.3235 [М]⁺. C₃₁H₄₆O₄. Вычислено М 482.3240. Спектр ЯМР ¹Н соединения (9), δ, м.д. (J, Гц): 0.88 с (С²⁸Н₃), 0.94 с (С²⁷Н₃), 1.05 с (С²⁴Н₃), 1.07 с (С²⁹Н₃), 1.08 с (С²³Н₃), 1.27 с (С²⁵Н₃), 1.38 с (C²⁶H₃), 0.89 м (H^16e), 1.06 м (H^15e), 1.21 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.3, J_19a,18 13.3 Гц), 1.17-1.29 м (H^21a, H^22e), 1.43-1,50 м (H^5a, Н⁷), 1.48 д.д.д (H^22a, J_22a,22e 14.0, J_22a,21a 14.0, J_22a,21e 4.3 Гц), 1.60-1.72 м (2Н⁶, Н^7'), 1.75 м (H^1a), 1.80 м (H^15a), 1.85 м (H^16a), 1.92 м (H^21e), 1.96 д.д.д (Н¹⁸, J_18,19a 13.3, J_18,13 4.7, J_18,19e 3.2 Гц), 2.16 м (H^1e), 2.17 д.д.д (H^19e, J_19e,l9a 13.3, J_19e,18 3.2, J_19e,21e 2.8 Гц), 2.44 д.д.д (H^2e, J_2e,2a 15.8, J_2e,1a 7.2, J_2e,1e 3.8 Гц), 2.60 д.д.д (H^2a, J_2a,2e 15.8, J_2a,1a 11.5, J_2a,1e 7.3 Гц), 2.98 д (Н¹³, J_13,18 4.7 Гц), 3.70 с (ОС³¹Н₃), 5.78 с (Н¹¹). Спектр ЯМР ¹³С соединения (9), δ, м.д.: 36.80 т (С¹), 33.97 т (С²), 215.57 с (С³), 47.35 с (С⁴), 50.73 д (С⁵), 18.97 т (С⁶), 31.90 т (С⁷), 45.46 с (С⁸), 176.36 с (С⁹), 39.23 с (С¹⁰), 124.10 д (С¹¹), 200.78 с (С¹²), 47.86 д (С¹³), 41.78 с (С¹⁴), 26.13 т (С¹⁵), 26.11 т (С¹⁶), 31.90 с (С¹⁷), 37.82 д (С¹⁸), 33.76 т (С¹⁹), 43.90 с (С²⁰), 31.12 т (С²¹), 38.14 т (С²²), 26.10 к (С²³), 21.25 к (С²⁴), 23.69 к (С²⁵), 23.75 к (С²⁶), 21.81 к (С²⁷), 26.94 к (С²⁸), 28.45 к (С²⁹), 177.19 с (С³⁰), 51.37 к (С³¹).

Пример 7. Получение метилового эфира 2-гидроксиметилен-3,12-диоксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (10)

К перемешиваемому раствору метилового эфира 3-оксо-12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксогидроглицирретовой кислоты (9) (4.5 г, 9.3 ммоль), этилформиата (3.25 мл, 39.5 ммоль) в бензоле (48 мл) порциями прибавляли метилат натрия (2.1 г, 38.9 ммоль). Перемешивали 2 ч при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавили диэтиловый эфир (100 мл) и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали смесью хлороформ-диэтиловый эфир (1:3) (3×50 мл). Объединенный экстракт промывали раствором гидрокарбоната натрия (3×50 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×50 мл). Сушили сульфатом магния. Масса полученного продукта (10) 4.5 г (выход 95.0%). Для получения аналитически чистого образца 100 мг реакционной смеси очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - гексан с градиентом этилацетата 10-25%). Для дальнейших превращений продукт использовали без дополнительной очистки. Найдено, m/z: 510.3101 [М]⁺. С₃₂Н₄₆О₅. Вычислено M 510.3177. Спектр ЯМР ¹Н соединения (10), δ, м.д. (J, Гц): 0.90 с (С²⁸Н₃), 0.96 с (С²⁷Н₃), 1.09 с (С²⁹Н₃), 1.13 с (С²⁴Н₃), 1.15 с (С²⁵Н₃), 1.20 с (С²³Н₃), 1.38 с (C²⁶H₃), 0.91 м (H^16e), 1.07 м (H^15e), 1.23 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.3, J_19a,18 13.3 Гц), 1.18-1.31 м (H^21a, H^22e, H^5a), 1.49 д.д.д (H^22a, J_22a,22e 14.0, J_22a,21a 14.0, J_22a,21e 4.1 Гц), 1.47-1.53 м (Н⁷), 1.59-1.67 м (2Н⁶, Н^7'), 1.82 м (H^15a), 1.86 м (H^16a), 1.94 д.д.д.д (H^21e, J_21e,21a 13.3, J_21e,22a 4.1, J_21e,22e 3.4, J_21e,19e 2.7 Гц), 1.99 д.д.д (Н¹⁸, J_18,19a 13.3, J_18,13 4.6, J_18,19e 3.3 Гц), 2.21 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.3, J_19e,18 3.3, J_19e,21e 2.7 Гц), 2.26 д (Н¹, J_1,1' 14.5 Гц) и 2.58 д (Н^1', J_1',1 14.5 Гц) - система АВ, 3.02 д (Н¹³, J_13,18 4.6 Гц), 3.71 с (ОС¹³Н₃), 5.90 с (Н¹¹), 8.70 д (Н³², J_32,OH 2.4 Гц), 14.81 д (ОН, J_OH,32 2.4 Гц). Спектр ЯМР ¹³С соединения (10), δ, м.д.: 36.85 т (С¹), 104.80 с (С²), 188.08 с (С³), 40.32 с (С⁴), 48.07 д (С⁵), 18.80 т (С⁶), 31.25 т (С⁷), 45.55 с (С⁸), 175.36 с (С⁹), 38.89 с (С¹⁰), 124.37 д (С¹¹), 200.73 с (С¹²), 47.86 д (С¹³), 41.80 с (С¹⁴), 26.22 т (С¹⁵), 26.14 т (С¹⁶), 31.93 с (С¹⁷), 37.82 д (С¹⁸), 33.74 т (С¹⁹), 43.93 с (С²⁰), 31.14 т (С²¹), 38.18 т (С²²), 28.14 к (С²³), 20.65 к (С²⁴), 23.36 к (С²⁵), 23.23 к (С²⁶), 21.82 к (С²⁷), 26.96 к (С²⁸), 28.48 к (С²⁹), 177.22 с (С³⁰), 51.42 к (С³¹), 189.65 д (С³²).

Пример 8. Получение метилового эфира изоксазоло[4,5-b]-12-оксо-11(9)-ен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (11)

Смесь метилового эфира 2-гидроксиметилен-3-оксо-11-дезоксоглицирретовой кислоты (10) (4.4 г, 8.6 ммоль), этилового спирта (120 мл) и гидрохлорида гидроксиламина (6.0 г, 86.0 ммоль) и воды (12 мл) кипятили с обратным холодильником 2 ч. Реакционную смесь охладили, спирт удалили на ротационном испарителе, добавили воды, экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенный экстракт промыли раствором гидрокарбоната натрия (3×25 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×25 мл), сушили сульфатом магния. Реакционную смесь хроматографировали на колонке с силикагелем (элюент - гексан с градиентом этилацетата 10-20%). Масса полученного продукта 3.2 г (выход 73.3%). Найдено, m/z: 507.3164 [M]⁺. C₃₂H₄₅NO₄. Вычислено М 507.3181. Спектр ЯМР ¹Н соединения (11), δ, м.д. (J, Гц): 0.91 с (С²⁸Н₃), 0.98 с (С²⁷Н₃), 1.10 с (С²⁹Н₃), 1.15.с (С²⁵Н₃), 1.24 с (С²⁴Н₃), 1.32 с (С²³Н₃), 1.40 с (C²⁶H₃), 0.91 м (H^16е), 1.06-1.11 м (H^15e), 1.24 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.2, J_19a,18 13.2 Гц), 1.19-1.34 м (H^21a, H^22e), 1.44-1.57 м (H^5a, H^22a, Н⁷), 1.64-1.79 м (2Н⁶, Н^7'), 1.84 м (H^15a), 1.88 м (H^16a), 1.95 д.д.д.д (H^21e, J_21e,21a 13.3, J_21e,22a 4.2, J_21e,22e 3.2, J_21e,19e 2.7 Гц), 2.00 д.д.д (H¹⁸, J_18,19a 13.2, J_18,13 4.6, J_18,19e 3.2 Гц), 2.21 д.д.д (H^19e, J_19e,19a 13.2, J_19e,18 3.2, J_19e,21e 2.7 Гц), 2.38 д (Н¹, J_1,1' 15.0 Гц) и 2.75 д (Н^1', J_1',1 15.0 Гц) - система АВ, 3.04 д (Н¹³, J_13,18 4.6 Гц), 3.73 с (ОС³¹Н₃), 5.89 с (Н¹¹), 8.04 с (Н³²). Спектр ЯМР ¹³С соединения (11), δ, м.д.: 33.42 т (С¹), 108.38 с (С²), 171.94 с (С³), 35.01 с (С⁴), 49.53 д (С⁵), 18.16 т (С⁶), 31.24 т (С⁷), 45.75 с (С⁸), 175.87 с (С⁹), 41.09 с (С¹⁰), 124.65 д (С¹¹), 200.77 с (С¹²), 47.90 д (С¹³), 41.79 с (С¹⁴), 26.27 т (С¹⁵), 26.13 т (С¹⁶), 31.95 с (С¹⁷), 37.85 д (С¹⁸), 33.79 т (С¹⁹), 43.95 с (С²⁰), 31.16 т (С²¹), 38.18 т (С²²), 28.65 к (С²³), 21.26 к (С²⁴), 24.52 к (С²⁵), 23.28 к (С²⁶), 21.87 к (С²⁷), 26.99 к (С²⁸), 28.51 к (С²⁹), 177.26 с (С³⁰), 51.47 к (С³¹), 150.06 д (С³²).

Пример 9. Расщепление изоксазольного кольца в соединении (11)

К перемешиваемому раствору соединения (11) (3.0 г, 5.9 ммоль), диэтилового эфира (170 мл) и метанола (85 мл) при охлаждении на ледяной бане порциями прибавляли метилат натрия (11 г). Смесь перемешивали 1 ч при комнатной температуре. Затем добавили этилацетат (~50 мл) и 5%-ный раствор соляной кислоты. Экстрагировали этилацетатом (2×50 мл). Объединенный экстракт промыли раствором гидрокарбоната натрия (3×50 мл) и насыщенным раствором хлорида натрия (3×50 мл), сушили сульфатом магния. Масса реакционной смеси (смесь таутомеров) (12) 3.0 г (количественный выход).

Пример 10. Получение метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1)

Раствор смеси таутомеров (12) (2.8 г, 5.5 ммоль) и 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4-бензохинона (DDQ) (1.5 г, 6.5 ммоль) в бензоле (160 мл) кипятили с обратным холодильником 4 ч. Отфильтровали, фильтрат упарили. Колоночной хроматографией на силикагеле (элюент - бензол с градиентом хлороформа 0-100%) был получен кристаллический осадок. Перекристаллизацией последнего из смеси метанол-хлороформ был получен целевой продукт (1) массой 1.7 г (выход 61%). Т. пл. 247-249°С. Найдено, m/z: 505.3025 [M⁺]. C₃₂H₄₃NO₄. Вычислено М 505.3181. Спектр ЯМР ¹Н соединения (1), δ, м.д. (J, Гц): 0.90 с (С²⁸Н₃), 0.96 с (С²⁷Н₃), 1.09 с (С²⁹Н₃), 1.14 с (С²⁴Н₃), 1.22 с (С²³Н₃), 1.44 с (С²⁶Н₃), 1.47 с (С²⁵Н₃), 0.93 д.м (H^16e, J_16e,16a 13.3 Гц), 1.08 м (H^15e), 1.20 д.д (H^19a, J_19a,19e 13.2, J_19а,18 13.2 Гц), 1.18-1.32 м (H^21a, H^22e), 1.48 д.д.д (H^22a, J_22a,22e 14.0, J_22a,2la 14.0, J_22a,21e 4.2 Гц), 1.55 д.м (H^7e, J_7e,7a 13.5 Гц), 1.67-1.79 м (2Н⁶, H^7a), 1.82 м (H^15a), 1.87 м (H^16a), 1.94 д.д.д.д (H^21e, J_21e,21a 13.3, J_21e,22a 4.2, J_21e,22e 3.2, J_21e,19e 2.8 Гц), 2.02 д.д.д (Н¹⁸, J_18,19a 13.2, J_18,13 4.7, J_18,19e 3.2 Гц), 2.17 д.д.д (H^19e, J_19e,19а 13.2, J_19e,18 3.2, J_19e,21e 2.8 Гц), 3.02 д (Н¹³, J_13,18 4.7 Гц), 3.72 с (ОС³¹Н₃), 5.97 с (Н¹¹), 8.01 с (Н³²). Спектр ЯМР ¹³С соединения (1), δ, м.д.: 165.65 д (С¹), 114.46 с (С²), 196.42 с (С³), 44.86 с (С⁴), 47.57 д (С⁵), 18.12 т (С⁶), 31.58 т (С⁷), 45.82 с (С⁸), 168.18 с (С⁹), 42.36 с (С¹⁰), 124.17 д (С¹¹), 199.52 с (С¹²), 48.04 д (С¹³), 42.10 с (С¹⁴), 26.03 т (С¹⁵), 26.00 т (С¹⁶), 31.88 с (С¹⁷), 37.75 д (С¹⁸), 33.61 т (С¹⁹), 43.91 с (С²⁰), 31.11 т (С²¹), 38.14 т (С²²), 26.88 к (С²³), 21.40 к (С²⁴), 26.61 к (С²⁵), 24.77 к (С²⁶), 21.81 к (С²⁷), 26.96 к (С²⁸), 28.46 к (С²⁹), 177.13 с (С³⁰), 51.48 к (С³¹), 114.22 с (С³²).

Пример 11. Влияние метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1) на жизнеспособность клеток карциномных линий человека

Клетки линии КВ-3-1 (эпидермоидная карцинома ротовой полости), КВ-8-5 (линия, производная КВ-3-1, обладающая фенотипом множественной лекарственной устойчивости), HeLa (эпителоидная карцинома шейки матки) и MCF-7 (аденокарцинома молочной железы) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С. Клетки линии КВ-8-5 культивировали в тех же условиях в присутствии 200 нМ винбластина.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением (1) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (15000 клеток на лунку для линий КВ-3-1, КВ-8-5 и MCF-7, 7000 клеток на лунку для линии HeLa). Через 24 ч в лунках меняли среду и к клеткам добавляли 0.1 М раствор соединения (1) в ДМСО до конечной концентрации в среде от 10^-4 до 10^-9 М. Клетки инкубировали в присутствии соединения (1) еще в течение суток в тех же условиях. По окончании инкубации, без смены среды, к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл ДМСО, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А₅₇₀ - поглощение формазана, а А₆₃₀ - фон клеток.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля. За единицу принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в течение 24 ч в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.2). Из данных, приведенных на фиг.1, видно, что обработка клеток различных карциномных линий соединением (1) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединения 10^-6 М. Значения LD₅₀ - концентрация соединения (1), при которой наблюдается гибель 50% клеток, - приведены в таблице.

Таблица
Значения LD50 для метилового эфира 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1) для различных карциномных линий клеток человека
Линия клеток	LD50 *)
КВ-3-1	0.7×10-6 М
КВ-8-5	1.1×10-6 M
HeLa	0.4×10-6 М
MCF-7	5×10-6 М
*) Клетки инкубировали в среде в присутствии соединения (1) в течение 24 ч.

Пример 12. Влияние инкубации клеток нейробластомы человека с метиловым эфиром 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1) на их жизнеспособность

Клетки линии SK-N-MC (нейробластома) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 11. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (30000 клеток на лунку). Далее как в примере 11.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля после их инкубации в присутствии соединения (1) в течение 24 ч. За 100% принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.2). Из данных, приведенных на фиг.2, видно, что обработка клеток линии SK-N-MC соединением (1) вызывает их эффективную гибель уже при концентрации соединения 10^-6 М. Значение LD₅₀, полученное для данной клеточной линии, составило 5×10^-6 М.

Пример 13. Влияние инкубации клеток почки эмбриона человека с метиловым эфиром 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1) на их жизнеспособность

Клетки линии 293 (почка эмбриона человека) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37°С.

Жизнеспособность клеток после инкубации с соединением определяли с помощью МТТ теста, как описано в примере 11. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (20000 клеток на лунку). Далее как в примере 11.

Данные представляли в виде количества живых клеток относительно контроля после их инкубации в присутствии соединения (1) в течение 24 ч. За единицу принимали количество клеток в контроле, где клетки инкубировали в отсутствие соединения, но в присутствии растворителя ДМСО (фиг.3). Из данных, приведенных на фиг.3, видно, что обработка клеток линии 293 соединением (1) вызывает их эффективную гибель при концентрации соединения выше 1×10^-6 М. Значение LD₅₀, полученное для данной клеточной линии, составило 5×10^-6 М.

Метиловый эфир 2-циано-3,12-диоксо-1(2),11(9)-диен-11-дезоксоглицирретовой кислоты (1)

обладающий противоопухолевой активностью.