Применение антагонистов рецептора св1 для получения композиции, пригодной для лечения заболеваний печени

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается применения антагониста рецептора СВ1, представляющего собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей, при получении композиции для лечения печеночных фиброзов. Также раскрыт способ лечения печеночного фиброза у млекопитающих. Изобретение направлено на создание средства для лечения печеночного фиброза. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Это изобретение относится к новому применению антагонистов для рецептора СВ1 для получения композиции, пригодной для лечения заболеваний печени.

Уровень техники

Фиброз печени представляет собой общую реакцию на хроническое поражение печени, в конечном счете приводящее к циррозу и его осложнениям, портальной гипертензии, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциноме. Фиброгенный процесс следует за интенсивной пролиферацией и накоплением печеночных миофибробластов, которые синтезируют фиброзные компоненты и ингибиторы разрушения матрикса (Friedman, S. L., J. Biol. Chem. 275, 2247-50 (2000)).

Гашиш Cannabis Sativa содержит свыше шестидесяти соединений, из которых наиболее активным является (-)Δ⁹-тетрагидроканнабинол (ТГК). Кроме того, были охарактеризованы эндогенные природные каннабиноиды, анандамид и 2-арахидонилглицерин, которые являются липидами - производными арахидоновой кислоты (Piomelli, D. и др., Trends Pharmacol. Sci. 21, 218-24. (2000)). Каннабиноиды связываются с двумя G протеин-сопряженными рецепторами (ПСР), СВ1 и СВ2, которые в равной степени связываются с ТГК (Pertwee, R. G., Curr. Med. Chem. 6, 635-64. (1999)). Таким образом, СВ1 представляет собой один из двух известных клеточных рецепторов для каннабиноидов. Известно, что этот рецептор, будучи G протеин-сопряженным трансмембранным рецептором, экспрессируется в мозгу и кровеносных сосудах (Pertwee, R.G., Curr. Med. Chem. 6, 635-64 (1999)), но не в клетках печени (Guzman, М. & Sanchez, С., Life Sci. 65, 657-64 (1999)). СВ1 является медиатором психотропного действия гашиша. Напротив, рецепторы СВ2 главным образом экспрессируются в иммунной системе и лишены психотропного действия (Friedman, S.L., J. Biol. Chem, 275, 2247-50 (2000)). Кроме психотропного действия каннабиноиды проявляют центральное анальгетическое и противорвотное действие и возбуждают аппетит (Harrold, J.A. & Williams, G. Br. J. Nutr. 90, 729-34 (2003)). Более того, каннабиноиды также проявляют противовоспалительные свойства и релаксируют сосуды (Kumar, R. N., Chambers, W.A. & Pertwee., Anaesthesia 56, 1059-68. (2001)). Кроме того, в некоторых исследованиях предполагается, что каннабиноиды могут быть сильными противоопухолевыми агентами благодаря их способности индуцировать регрессию экспериментальных опухолей различного типа, в том числе глиом или кожных опухолей. Эта противоопухолевая активность главным образом объясняется их антипролиферативными и апоптозными свойствами (Bifuico, М. и др., Faseb. J. 29. 29 (2001); Casanova, M.L. и др., J. din. Invest. 111, 43-50, (2003); Sanchez, С. и др., Cancer Res. 61, 5784-9. (2001)).

Существует только немного данных относительно действия каннабиноидов на печень. Рецепторы СВ1 и СВ2 не экспрессируются в клетках печени (Guzman, М. & Sanchez, С.Life Sci. 65, 657-64 (1999)). Однако рецепторы СВ1 присутствуют в эндотелиальных клетках, выделенных из печеночных артерий, и их экспрессия возрастает в ходе цирроза (Batkai, S. и др. Nat. Med. 7, 827-32. (2001)).

Были выделены две изоформы рецептора СВ1: длинная изоформа (соответствующая SEQ ID №1) и короткая изоформа, укороченная в терминальной части -NH₂ и соответствующая сплетенному варианту (соответствует SEQ ID №2), которые отличаются степенью сродства к своим лигандам (Shire и др., J. Biol. Chem, (1995); Rinaldi-Carmona и др., J. Pharmacol. Exp.Ther. (1996)). Кроме того, существуют 5 отдельных типов нуклеотидного полиморфизма в области кодирования гена рецептора СВ1. Из них только три приводят к отдельным изменениям аминокислот в рецепторе СВ1 (а именно: в SEQ ID №1, замещение фенилаланина (Phe) на лейцин (Leu) в положении 200, замещение изолейцина (II) на валин (Val) в положении 216 и замещение валина на аланин (Ala) в положении 246 и в соответствующих положениях в SEQ ID №2). Существует согласованность 7-доменной последовательности для рецептора СВ1, которая строго сохраняется у позвоночных животных, но не появляется в других каннабиноидных рецепторах (Attwood, Т.К. и Findlay, J.В.С., Protein Eng. 7 (2) 195-203 (1994), Attwood, T.К. и Findlay, J.В.С., 7ТМ, Volume 2, п/ред. G.Vriend и В.Bywater, (1993), Birnbaumer. L., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 30, 675-705 (1990), Casey, P.J. и Oilman, A.G., J. Biol. Chem. 263 (6) 2577-2580 (1988), 5. Attwood, Т.К. и Findlay, J.В.С, Protein Eng. 6 (2) 167-176 (1993), Watson, S. и Arkinsall. S, в книге «The G Protein-Linked Receptor Factshook», Academic press, 1994, pp.80-83). Эта согласованная аминокислотная последовательность включает в себя 7 протеиновых доменов от SEQ ID №3 до SEQ ID №9.

Антагонисты рецептора СВ1, которые включают в себя возвратные или инверсные агонисты, были описаны ранее. Они включают в себя замещенные амиды, описанные в документе WO 03/077847, замещенные ариламиды, описанные в документе WO 03/087037, замещенные имидазолы, описанные в документе W003/063781, бициклические амиды, описанные в документе WO 03/086288, терфенильные производные, описанные в документе WO 03/084943, N-пиперидоно-3-пиразолкарбоксамид и N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид, описанные в документе ЕР-В-656354, арилбензо[b]тиофеновые и бензо[b]фурановые соединения, описанные соответственно в патентах США №№5596106 и 5747524, азетидиновые производные, описанные в патенте FR 2805817, 3-аминоазетидин, описанный в FR 2805810, или производные 3-замещенных или 3,3-дизамещенных 1-(ди-((гетеро)арил)метил)азетидинов, описанные в FR 2805818. Эти документы включены в изобретение как ссылки. Другие антагонисты имеются в продаже, такие как N-(пиперидин-1-ил)-1-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-иодфенил)-4-метил-1H-пиразол-3-карбоксамид, известный на рынке как АМ251 и соединение, известное под названием LY-320135.

Известно применение этих антагонистов рецепторов СВ1 для лечения сексуальной дисфункции (заявка на патент WO 03/082256), или диареи (заявка на патент WO 01/85092), или нейровоспалительных заболеваний, или осложнений от неправильного употребления лекарства, ожирения, астмы, запора (заявка на патент WO 03/077847).

В документах US 5939429, WO 03/077847, WO 03/084930, WO 03/084943, WO 03/063781 и WO 03/087037 раскрыто, что антагонисты СВ1 могут обращать системные гемодинамические изменения у крыс с цирротической портальной гипертензией.

Раскрытие изобретения

Однако в указанных выше документах нигде не описано, что антагонисты СВ1 могут ослабить фиброгенез при печеночных заболеваниях любого происхождения (алкогольные, вирусные, токсические). Более того, отсутствуют известные вовлечения рецепторов СВ1 или эффектов антагонистов СВ1 в неалкогольный стеатогепатит и печеночный карциногенез.

В этом изобретении авторы неожиданно обнаружили, что антагонисты СВ1 обладают сильной антифиброзной активностью в печени, которая может быть использована для лечения печеночных заболеваний и предпочтительно печеночных заболеваний, которые вызывают печеночный фиброз.

Соответственно, настоящее изобретение на основе открытия, что подавление активности рецепторов СВ1 может ослабить печеночный фиброгенез, связанный с поражением или заболеванием печени, обеспечивает множество способов и композиций для лечения печеночных заболеваний и предпочтительно печеночных заболеваний, которые приводят к печеночному фиброзу.

Таким образом, это изобретение относится к:

1. Применению антагониста рецептора СВ1 при получении композиции для лечения печеночных заболеваний.

2. Применению в соответствии с пунктом 1, где антагонист рецептора СВ1 представляет собой специфический антагонист рецептора СВ1.

3. Применению в соответствии с пунктами 1 или 2, где печеночное заболевание приводит к печеночному фиброзу.

4. Применению в соответствии с пунктами 1-3, где печеночным заболеванием является алкогольный цирроз печени.

5. Применению в соответствии с пунктами 1-3, где печеночным заболеванием является хронический вирусный гепатит.

6. Применению в соответствии с пунктами 1-3, где печеночным заболеванием является неалкогольный стеатогепатит.

7. Применению в соответствии с пунктами 1-3, где печеночным заболеванием является первичный рак печени.

8. Применению в соответствии с пунктами 1-7, где антагонист представляет собой соединение формулы II или одной из фармацевтически приемлемых солей этого соединения, где g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ и W₂, W₃, W₄, W₅ и W₆ являются одинаковыми или различными и независимо представляют собой атом водорода, хлора или брома, (C₁-С₃)алкил, (С₁-С₃)алкокси, трифторметил или нитро-группу и g₄ необязательно является фенильной группой; R₄ представляет собой водород или (С₁-С₃)алкил; Х представляет собой или простую связь или группу -(СН₂)_x-N(R₃)-, в которой R₃ представляет собой водород или (С₁-С₃)алкил и x означает нуль или единицу; R представляет собой: группу -N(R₁R₂), в которой R01₁ и R₂ независимо означают (С₁-С₆)алкил; неароматический (С₃-C₁₅) карбоциклический радикал, который необязательно является замещенным, причем указанный заместитель (заместители) отличается от замещенного карбонила; амино(С₁-С₄)алкильную группу, в которой амин необязательно является дизамещенным (C₁-С₃)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)алкил, в котором циклоалкил означает С₃-С₁₂; фенил, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; фенил(С₁-С₃)алкил; дифенил(С₁-С₃)алкил; нафтил; антраценил; насыщенный 5-8-членный гетероциклический радикал, который является незамещенным или замещенным (С₁-С₃)алкилом, гидроксилом или бензилом; 1-адамантилметил; ароматический гетероцикл, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; (С₁-С₃)алкил, который является замещенным ароматическим гетероциклом, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; или еще R₁ означает водород и R₂ является таким, как определено выше; или еще R₁ и R₂ образуют насыщенный 5-8-членный гетероциклический радикал с атомом азота, с которым они связаны, причем указанный гетероциклический радикал отличается от морфолина, когда все w₂, w₃, w₄, w₅, w₆, g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ означают атом водорода; группа R₂ такая, как определено выше, когда Х означает -(CH₂)_XN(R₃)-; группа R₅, когда Х означает простую связь, R₅ означает (С₁-С₃)алкил; (С₃-С₁₂)циклоалкил, который является незамещенным или замещенным (С₁-С₅)алкилом; фенил(С₁-С₃)алкил, который является незамещенным или замещенным атомом галогена или (С₁-С₅)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)алкил, в котором циклоалкил означает С₃-С₁₂ и является незамещенным или замещенным (С₁-С₅)алкилом; или 2-норборнилметил

9. Применению в соответствии с пунктами 1-7, где антагонист представляет собой N-пиперидоно-3-пиразолкарбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей.

10. Применению в соответствии с пунктами 1-7, где антагонист представляет собой N-пиперидино-5-(4-бромфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-этилпиразол-3-карбоксамидили одну из его фармацевтически приемлемых солей.

11. Применению в соответствии с пунктами 1-7, где антагонист представляет собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей.

12. Применению по любому из предшествующих пунктов, где рецептор СВ1 выбирают из группы, состоящей из:

a) протеина, имеющего аминокислотную последовательность (SEQ), которая включает в себя SEQ ID №1 или часть SEQ ID №1, имеющего биологическую функцию G протеин-сопряженного клеточного рецептора, способного связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал;

b) протеина, имеющего аминокислотную последовательность, которая включает в себя SEQ ID №2 или часть SEQ ID №2, имеющего биологическую функцию G протеин-сопряженного клеточного рецептора, способного связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал;

c) аллели протеина, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №1 или SEQ ID №2, имеющего биологическую функцию G протеин-сопряженного клеточного рецептора, способного связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал;

d) протеина, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №1 с замещением фенилаланина на лейцин в положении 200; и/или замещением изолейцина на валин в положении 216; и/или замещением валина на аланин в положении 246;

e) протеина, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID №2 с замещением фенилаланина на лейцин в положении 139; и/или замещением изолейцина на валин в положении 155; и/или замещением валина на аланин в положении 185; и

f) протеина, который включает в себя аминокислотные последовательности SEQ ID №3, SEQ ID №4, SEQ ID №5, SEQ ID №6, SEQ ID №7, SEQ ID №8 и SEQ ID №9 или аминокислотные последовательности на 80% гомологичные приведенным, причем указанный протеин имеет биологическую функцию G протеин-сопряженного клеточного рецептора, способного связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал.

13. Применению в соответствии с пунктами 1-11, где рецептор СВ1 является протеином, обладающим гомологичностью на аминокислотном уровне с SEQ ID №I, по меньшей мере, равной 45%, и имеющим биологическую функцию G протеин-сопряженного клеточного рецептора, способного связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал.

14. Применению по предшествующему пункту, где гомологичность составляет, по меньшей мере, 60%, предпочтительно 70%, более предпочтительно 80%, еще более предпочтительно 90% и более предпочтительно 95%.

15. Применению по любому из предшествующих пунктов, где суточная доза антагониста рецептора СВ1 составляет от 0,01 мг до 500 мг, предпочтительно от 1 мг до 100 мг.

16. Применению последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей протеин, содержащий SEQ ID №1, или SEQ ID №2, или часть SEQ ID №1, или часть SEQ ID №2, для получения композиции для лечения печеночных заболеваний с помощью понижающей регуляции или подавления СВ1 рецептора.

17. Способу лечения печеночных заболеваний у млекопитающих, заключающийся во введении терапевтически эффективного количества, по меньшей мере, одного антагониста рецептора СВ1 млекопитающему, нуждающемуся в лечении.

18. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктом 17, где антагонист рецептора СВ1 представляет собой соединение формулы II или одну из его фармацевтически приемлемых солей, в которой g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ и w₂, w₃, w₄, w₅ и w₆ являются одинаковыми или различным и означают независимо водород, атом хлора или брома, (С₁-С₃)алкил, (С₁-С₃)алкокси, трифторметил или нитро-группу и g₄ необязательно представляет собой фенильную группу; R₄ представляет собой водород или (С₁-С₃)алкил; Х представляет собой или простую связь или группу -(СН₂)_x-N(R₃)-, в которой R₃ представляет собой водород или (С₁-С₃)алкил и x означает нуль или единицу; R представляет собой: группу -N(R₁R₂), в которой R₁ и R₂ независимо означают (С₁-С₆)алкил; неароматический (С₃-С₁₅) карбоциклический радикал, который необязательно является замещенным, причем указанный заместитель (заместители) отличается от замещенного карбонила; амино(С₁-С₄)алкильную группу, в которой амин необязательно является дизамещенным (С₁-С₃)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)алкил, в котором циклоалкил означает С₃-C₁₂; фенил, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; фенил(С₁-С₃)алкил; дифенил(С₁-С₃)алкил; нафтил; антраценил; насыщенный (5-8)-членный гетероциклический радикал, который является незамещенным или замещенным (С₁-С₃)алкилом, гидроксилом или бензилом; 1-адамантилметил; ароматический гетероцикл, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; (С₁-С₃)алкил, который является замещенным ароматическим гетероциклом, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (C₁-С₅)алкокси-группой; или еще R₁ означает водород и R₂ является таким, как определено выше; или еще R₁ и R₂ образуют насыщенный (5-8)-членный гетероциклический радикал с атомом азота, с которым они связаны, причем указанный гетероциклический радикал отличается от морфолина, когда все w₂, w₃, w₄, w₅, w₆, g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ означают атом водорода; группа R₂ такая, как определено выше, когда Х означает -(CH₂)_XN(R₃)-; группа R₅, когда Х означает простую связь, R₅ означает (С₁-С₃)алкил; (С₃-С₁₂)циклоалкил, который является незамещенным или замещенным (С₁-С₅)алкилом; фенил(С₁-С₃)алкил, который является незамещенным или замещенным атомом галогена или (С₁-С₅)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)алкил, в котором циклоалкил означает С₃-С₁₂ и является незамещенным или замещенным (С₁-С₅)алкилом; или 2-норборнилметил

19. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктом 17, где антагонист рецептора СВ1 представляет собой N-пиперидоно-3-пиразолкарбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей.

20. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктом 17, где антагонист рецептора СВ1 представляет собой N-пиперидино-5-(4-бромфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-этилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей..

21. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктом 17, где антагонист рецептора СВ1 представляет собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей..

22. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-21, где печеночным заболеванием является фиброз печени.

23. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-21, где печеночным заболеванием является алкогольный цирроз печени.

24. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-21, где печеночным заболеванием является хронический вирусный гепатит.

25. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-21, где печеночным заболеванием является неалкогольный стеатогепатит.

26. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-21, где печеночным заболеванием является первичный рак печени.

27. Способу лечения печеночных заболеваний в соответствии с пунктами 17-26, где суточная доза антагониста СВ1 рецептора составляет от 0,01 мг до 500 мг, предпочтительно от 1 мг до 100 мг.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. На гистограмме показано содержание печеночного TGFβ-1 (трансформирующего фактора роста) в пикограммах (пг) на 1 мг растворимого протеина (график А) и показана экспрессия альфа актина гладкой мышцы печени в виде процентной доли окрашенной поверхности от площади всего сечения (график В) для типа диких мышей (обозначено как WT), а также для мышей с дефицитом СВ1 (обозначено как СВ1-/-). Обозначение OO относится к группе мышей, получивших только оливковое масло, в то время как обозначение ССl₄ показывает результаты для мышей, отравленных ССl₄.

Измеряют продуцирование печеночного TGFβ-1 (статистическая значимость p<0,05). Для оценки альфа актина гладкой мышцы используют количественное окрашивание на 4-5 срезах ткани печени для каждого животного (статистическая значимость p<0,05).

Фигура 2. На гистограммах показана относительная жизнеспособность печеночных миофибробластов (график А) и активность типа Caspase-3 (график В) как в начале, так и спустя 48 часов после потери сыворотки для мышей дикого типа (обозначено как WT), а также для мышей с дефицитом СВ1 (обозначено как СВ1КО). Апоптоз клеток индуцируется путем потери сыворотки в течение 48 ч. Результаты для жизнеспособности печеночных миофибробластов выражены как средняя доля (в %) выживших клеток ± СКО (среднеквадратичная ошибка) из 6-9 экспериментов, выполненных на клетках, выделенных из печени трех WT и двух СВ1-/- мышей (статистическая значимость p ниже, чем 0,05 для СВ1-/-). Результаты активности типа Caspase-3 выражены в виде кратности активности по сравнению с начальной активностью, измеренной на день 0 (средняя величина ± СКО получена из 6-9 экспериментов, выполненных на клетках, выделенных из печени 3 WT и 3 СВ1-/- мышей).

Статистически p ниже 0,05.

Фигура 3. Показано влияние увеличения количества антагониста SR141716 для СВ1 на синтез ДНК в печеночных миофибробластах человека (график А) и у диких мышей (обозначено как WT) и мышей с дефицитом СВ1 (обозначено как СВ1КО) (график В). Синтез ДНК выражен на графике в виде доли (в %) синтеза ДНК в клетках, обработанных носителем для SR 141716, в зависимости от возрастающей концентрации SR 141716 в наномоль/л (нМ). Клетки печеночных миофибробластов человека стимулируют в течение 30 ч при различных концентрациях антагониста SR 141716 для рецептора СВ1 в присутствии 20 нг/мл PDGF-BB (фактор роста, полученный из тромбоцитов). Внедрение меченного тритием [³H]-тимидина в ДНК измеряют как среднюю величину (±СКО) из 3-6 экспериментов и выражают в процентах от контрольного значения (p ниже чем 0,05). На графике показаны полосы ошибки. Печеночные миофибробласты мышей (данные для диких мышей показаны кругами, а для мышей с дефицитом СВ1 обозначены ромбами) стимулируют в течение 30 ч при различных концентрациях антагониста SR 141716 для рецептора СВ1, в присутствии 20 нг/мл PDGF-BB. Внедрение [³H]-тимидина в ДНК измеряют как среднюю величину (±СКО) из 3-6 экспериментов, выполненных на клетках, выделенных из печени 3 WT и 3 СВ1-/- мышей, и выражены в виде процента от контрольного значения (p меньше чем 0,05). На графиках показаны полосы ошибки.

Фигура 4. На графике показано влияние SR141716 или его носителя на смертность мышей, вызванную четыреххлористым углеродом. Доля выживших мышей, обработанных ССl₄ или агентом SR141716 (пунктирная линия) или без обработки (сплошной линией показано введение одного носителя без антагониста СВ1), показана относительно времени в сутках. Момент введения CCl₄ показан стрелкой.

Подробное описание вариантов воплощения изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции (такие как фармацевтические композиции) для лечения печеночных заболеваний, которые включают фиброз печени. Кроме того, печеночные заболевания включают в себя (но не ограничиваются) алкогольный цирроз печени, хронический вирусный гепатит, неалкогольный стеатогепатит и первичный рак печени.

Заявители показали, что лечение различных типов фиброза печени заключается в понижающей регуляции рецептора СВ1 и применении антагониста или возвратного агониста рецептора СВ1. Это продемонстрировано в нескольких экспериментах.

Во-первых, изучена роль рецепторов СВ1 в продвижении вперед фиброза печени мышей с крайне низким содержанием рецептора СВ1, созданных в отсутствие экспрессии рецептора СВ1 (СВ1KО, n=15), и у эквивалентных мышей дикого типа (WT, n=12) в модели хронической интоксикации четыреххлористым углеродом, вызывающей фиброз. Фиброз и воспалительный некроз оценивают с помощью количественного показателя полученного METAVIR. Для мышей СВIKО наблюдается уменьшение фиброза по сравнению с животными дикого типа (оценка фиброза: 2,59±0,13 против 3.33±0,13, p<0,05). Соответственно, печеночный коллаген, оцениваемый с помощью гидроксипролина, уменьшается на 40% у мышей СВIКО по сравнению с WT животными (0,46±0,06 против 0,73±0,11 мг/мг ткани, p<0,05). Оценка воспалительного некроза была близкой для обеих групп. Такое подавление активности рецептора СВ1 является фенотипически эквивалентным совершенному антагонистическому блокированию рецептора СВ1 фармацевтическими средствами. Фиброз печени сильно подавляется у мышей с крайне низким содержанием СВ1 по сравнению с контрольными мышами, что подтверждается данными гистологического исследования печени и измерением содержания гидроксипролина - специфического биохимического маркера коллагеновых отложений. Кроме того, показано, что после обработки ССl₄ экспрессия TGF-β1 и α-актина гладкой мышцы снижается для мышей с дефицитом СВ1 по сравнению с мышами дикого типа. В заключение было показано, что инактивация СВ1 увеличивает апоптоз мышиных печеночных миофибробластов. Следовательно, подавление активности рецептора СВ1 снижает печеночный фиброз.

Во-вторых, было проведено иммунное гистохимическое маркирование нормальных из цирротической печени и культивированных печеночных миофибробластов человека. Иммунохимически продемонстрирована слабая экспрессия рецепторов СВ1 в нормальной печени (n=3) в отличие от заметной подрегуляции в цирротических образцах различного происхождения (n=13), главным образом, в непаренхиматозных клетках внутри и с краю фиброзной мембраны. При двойном иммунном гистохимическом анализе идентифицированы миофибробласты как основной источник рецепторов СВ1 и соответственно рецепторы СВ1 также экспрессируются в культивированных печеночных миофибробластах человека. Рецепторы СВ1 слабо экспрессируются внутриполостными клетками в нормальной печени и подвергаются заметной подрегуляции в ходе хронических заболеваний печени. При двойном иммунном гистохимическом анализе выявлены печеночные миофибробласты в качестве заметного типа клеток, экспрессирующих рецепторы СВ1 в цирротической печени. Следовательно, экспрессия рецептора СВ1 и его активность коррелируют с печеночным фиброзом.

В-третьих, были проведены эпидемиологические исследования в группе пациентов с хроническим гепатитом С и было показано, что ежедневное курение гашиша является фактором риска для развития фиброза при хроническом гепатите С, поскольку у таких пациентов скорость фиброза была выше по сравнению с пациентами, не курящими гашиш. Это указывает на участие трансдукции каннабиноидного сигнала в фиброзе печени. Следовательно, проводящий путь каннабиноидной сигнализации вовлечен в печеночный фиброз.

В-четвертых, в искусственных условиях были выполнены исследования влияния рецепторного (СВ1) антагониста, N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамида, известного под торговым названием SR 141716 (или SR 141716А) или римонабант, на культуры человеческих, а также мышиных печеночных миофибробластов, которые продемонстрировали, что антагонист СВ1 может ингибировать рост печеночных миофибробластов. Это соединение и его получение описаны в заявке на европейский патент ЕР656354-А1 и представлено формулой I

Такой антагонист для СВ1 и его фармацевтически приемлемые соли могут быть получены в соответствии с европейской заявкой на патент ЕР 656354, и фармацевтические композиции также могут быть получены в соответствии с описанием указанного патента.

В-пятых, in vivo исследование на мышах продемонстрировало, что антагонист SR141716 для СВ1 может снизить летальность, вызванную введением четыреххлористого углерода, что представляет собой модель индуцированного фиброза печени.

В этом изобретении антагонисты рецептора СВ1 определены как соединения, способные ингибировать активацию или экспрессию рецептора СВ1.

В частности, соединения, способные ингибировать активацию рецептора СВ1, включают те, которые способны взаимодействовать с агонистами рецепторов СВ1, ингибируя связывание указанных агонистов, или ингибируя активацию рецепторов СВ1, являющуюся результатом указанного связывания.

В частности, подходящие антагонисты рецептора СВ1 могут быть специфичными или неспецифичными по отношению к СВ1 и включают в себя возвратные агонисты. Эти антагонисты также включают в себя замещенные амиды, описанные в документе WO 03/077847, замещенные ариламиды, описанные в документе WO 03/087037, замещенные имидазолы, описанные в документе WO 03/063781, бициклические амиды, описанные в документе WO 03/086288, терфенильные производные, описанные в документе WO 03/084943, N-пиперидоно-3-пиразолкарбоксамид и N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид, описанные в ЕР-В-656354, арилбензо[b]-тиофеновые и бензо[b]фурановые соединения, описанные соответственно в патентах US 5596106 и US 5747524, азетидиновые производные, описанные в патенте FR 2805817, 3-аминоазетидин, описанный в FR 2805810, или 3-замещенные или 3,3-дизамещенные производные 1-(ди-((гетеро)арил)метил)азетидина, описанные в FR 2805818, N-(пиперидин-1-ил)-1-(2,4-дихлорфенил)-5-(4-иодфенил)-4-метил-1Н-пиразол-3-карбоксамид (известен как АМ251) и соединения, известные как LY-320135. Кроме того, подходящие антагонисты СВ включают Н-пиперидино-5-(4-бромфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-этилпиразол-3-карбоксамид, описанный в патенте ЕР 1150961.

Другие подходящие антагонисты СВ1, описанные в патенте ЕР576357, включают в себя соединения формулы II, в которой g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ и w₂, w₃, w₄, w₅ и w₆ являются одинаковыми или различными и независимо означают атом водорода, хлора или брома, (С₁-С₃)алкил, (С-С₃)алкокси, трифторметил или нитро-группу и g₄ необязательно представляет собой фенильную группу; R₄ означает водород или (С₁-С₃)алкил; Х означает или простую связь, или группу -(СН₂)_x-N(R₃)-, в которой R₃ означает водород или (C₁-С₃)алкил и x означает нуль или 1; R представляет собой: группу -NR₁R₂, в которой R₁ и R₂ независимо означают (С₁-С₆)-алкил; неароматический (С₃-C₁₅) карбоциклический радикал, который является необязательно замещенным, причем указанный заместитель (заместители) отличаются от замещенного карбонила; амино(С₁-С₄)алкильную группу, в которой амин необязательно является дизамещенным (С₁-С₃)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)-алкилом, в котором циклоалкил означает С₃-C₁₂; фенил, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; фенил(С₁-С₃)алкил; дифенил(С₁-С₃)алкил; нафтил; антраценил; насыщенный (5-8)-членный гетероциклический радикал, который является незамещенным или замещенным (С₁-С₃)алкилом, гидроксилом или бензилом; 1-адамантилметил; ароматический гетероцикл, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (С₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; (C₁-С₃)алкил, который замещен ароматическим гетероциклом, который является незамещенным, или монозамещенным, или полизамещенным атомом галогена, (C₁-С₅)алкилом или (С₁-С₅)алкокси-группой; или еще R₁ означает водород и R₂ является таким, как определено выше; или еще R₁ и R₂ образуют насыщенный (5-8)-членный гетероциклический радикал с атомом азота, с которым они связаны, причем указанный гетероциклический радикал отличается от морфолина, когда все w₂, w₃, w₄, w_u, w₆, g₂, g₃, g₄, g₅ и g₆ означают атом водорода; группа R₂ является такой, как определено выше, когда Х означает -(CH₂)_XN(R₃)-; группа R₅, когда Х является простой связью, причем R₅ представляет собой (С₁-С₃)алкил; (С₃-С₁₂)циклоалкил, который является незамещенным или замещенным (С_t-С₅)алкилом; фенил(С₁-С₃)алкил, который является незамещенным или замещенным атомом галогена или (С₁-С₅)алкилом; циклоалкил(С₁-С₃)алкил, в котором циклоалкил означает С₃-C₁₂ и является незамещенным или замещенным (С₁-С₅)алкилом; или 2-норборнилметил

Эти результаты относятся не только к людям и могут быть использованы вообще для всех млекопитающих.

Композиции, содержащие антагонист (антагонисты) СВ1, могут быть использованы для профилактического и/или терапевтического лечения. Активный компонент (например, антагонист (антагонисты) рецептора СВ1) присутствует в фармацевтической композиции в "эффективном количестве». Термин "эффективное количество" фармацевтической композиции означает достаточное, но нетоксичное количество агента, которое обеспечивает желаемый эффект. Этот термин относится к количеству, которое достаточно для лечения субъекта (например, млекопитающего, в том числе человека). Таким образом, выражение "терапевтическое количество" относится к количеству, достаточному для лечения болезненного состояния или симптомов путем предупреждения, препятствования, замедления или обращения развития заболевания или любых других каких бы то ни было нежелательных симптомов. Выражение "профилактически эффективное" количество относится к количеству, введенному пока здоровому субъекту, и таким образом это количество эффективно предупреждает, препятствует или задерживает начало заболевания.

В области терапевтического применения композиции назначаются пациенту, уже страдающему от заболевания, как описано, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, частичного прекращения симптомов заболевания и его осложнений. Подходящая доза фармацевтической композиции легко определяется в соответствии с любым из нескольких хорошо обоснованных протоколов. Например, для определения максимально допустимой дозы биологически активного агента на килограмм веса обычно используют лабораторных животных (например, мышей или крыс). Обычно, по меньшей мере, один вид испытуемых животных относится к млекопитающим. Результаты исследования на животных можно экстраполировать для того, чтобы определить дозы, применяемые для других видов, например, таких как люди. Кроме того, состав эффективной дозы зависит от характера и серьезности заболевания или обстановки и от общего состояния здоровья пациента.

В области профилактического применения композиции, содержащие, например, антагонисты рецептора СВ1, назначаются пациенту, восприимчивому к печеночным заболеваниям или иначе рискующему заболеть. Такое количество определяется как "профилактически эффективное" количество или доза. При таком использовании точное количество зависит от состояния здоровья пациента и его веса.

При терапевтическом, а также профилактическом лечении антагонист, содержащийся в фармацевтической композиции, может быть введен в виде нескольких доз или в виде однократной дозы, пока не будет достигнут желаемый эффект. Обычно ход лечения контролируется, и в случае необходимости могут быть назначены повторные дозы. Соединения изобретения можно принимать в соответствии с установленными режимами дозирования, всякий раз, когда требуется подавление активности рецепторов СВ1.

Суточная доза продуктов для взрослых может изменяться в широком диапазоне от 0,01 до 1000 мг в день. Предпочтительно композиции содержат 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 и 500 мг активного компонента для симптоматической корректировки дозы лечащемуся пациенту. Обычно лекарственный препарат содержит приблизительно от 0,01 мг до 500 мг активного компонента, предпочтительно от 1 мг до приблизительно 100 мг активного компонента. Эффективное количество лекарственного препарата обычно подают при уровне суточной дозировки приблизительно от 0,0002 мг/кг до 20 мг/кг веса тела, особенно приблизительно от 0,001 мг/кг до 10 мг/кг веса тела, в сутки. Однако следует понимать, что конкретный уровень дозы и частота приема доз могут изменяться для каждого конкретного пациента, и это будет зависеть от множества факторов, в том числе активности конкретного используемого соединения, стабильности в условиях обмена веществ и длительности действия этого соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, режима и времени введения, скорости выведения, сочетания лекарственных препаратов, серьезности конкретного состояния и совокупности видов терапии, которой подвергается пациент.

В фармацевтических композициях настоящего изобретения для перорального, подъязычного, внутрикожного, внутримышечного, внутривенного, трансдермального, местного или ректального введения активный компонент, индивидуально или в сочетании с другим активным веществом, может быть назначен животным и людям в форме единичной дозы, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Подходящие формы единичной дозы включают в себя формы для перорального введения, такие как таблетки, желатиновые капсулы, порошки, гранулы и пероральные суспензии или растворы, подъязычные и щечные формы приема внутрь, аэрозоли, имплантаты, подкожные, трансдермальные, местные, внутрибрюшинные, внутримышечные, внутривенные, подкожные, трансдермальные, интратекальные, внутриносовые и ректальные формы приема внутрь.

Подходящие единичные формы для приема внутрь включают в себя формы для перорального приема, такие как таблетки, желатиновые капсулы, порошки, гранулы и растворы или суспензии, которые можно принимать перорально, формы для подъязычного и щечного приема, аэрозоли, имплантанты, формы для подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутриносового или внутриглазного введения и формы для ректального введения.

В фармацевтических композициях настоящего изобретения активное вещество обычно входит в рецептуру в виде единичных доз, содержащих от 0,5 до 1000 мг, предпочтительно от 1 до 500 мг, более предпочтительно от 2 до 200 мг, указанного активного вещества в единичной дозе для ежедневного приема.

При получении твердой композиции в форме таблеток к активному веществу, необязательно тонко измельченному, может быть добавлено смачивающее вещество, такое как лаурилсульфат натрия, и затем эти вещества смешивают с фармацевтическим носителем, таким как диоксид кремния, желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, арабская камедь или т.п. Таблетки могут быть покрыты сахарозой, различными полимерами или другими подходящими веществами или, кроме того, они могут быть обработаны таким образом, чтобы они обладали длительной или замедленной активностью и чтобы они непрерывно выделяли заданное количество активного вещества.

Препарат в форме желатиновых капсул получают путем смешивания активного вещества с разбавителем, таким как сложный эфир гликоля или глицерина, и заливки полученной смеси в мягкие или жесткие желатиновые капсулы.

Препарат в форме сиропа или эликсира может содержать активное вещество вместе с подслащивающим веществом, которое предпочтительно является некаллорийным, метилпарабен и пропилпарабен, в качестве антисептического средства, ароматизирующее вещество и подходящий краситель.

Диспергируемые в воде порошки или гранулы могут содержать активное вещество, смешанное с диспергаторами, или смачивающими веществами, или суспендирующими агентами, такими как поливинилпирролидон, а также с подслащивающими веществами или вкусовыми добавками.

Ректальный прием внутрь осуществляется с использованием свечей, полученных со связующими веществами, которые плавятся при температуре тела, например масло какао или полиэтиленгликоли.

Парентеральный, внутриносовой или внутриглазной прием внутрь осуществляется с использованием водных суспензий, изотонических физиологических растворов или стерильных растворов для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые диспергаторы и/или смачивающие вещества, например пропиленгликоль, бутиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Так, для приготовления водного раствора для инъекций внутривенным путем может быть использован сорастворитель, например спирт, такой как этанол, или гликоль, такой как полиэтиленгликоль или пропиленгликоль, и гидрофильное поверхностно-активное вещество, такое как Tween RTM. 80. Активное вещество может быть солюбилизировано с помощью триглицерида или сложного эфира глицерина, чтобы получить масляный раствор для инъекций внутримышечным путем.

Трансдермальный прием внутрь осуществляется с использованием многослойных кусочков пластыря или емкостей, в которых активное вещество находится в форме спиртового раствора.

Ингаляционный прием внутрь осуществляется с использованием аэрозоля, содержащего, например, триолеат сорбита или олеиновую кислоту вместе с трихлорфторметаном, дихлортетрафторэтаном или любым другим биологически совместимым распыляющим газом.

Активное вещество также может быть введено в рецептуру в виде микрокапсул или микросфер, необязательно с одним или несколькими носителями или добавками.

Среди форм длительного выделения, которые применяются в случае хронического лечения, могут быть использованы имплантаты. Они могут быть получены в форме масляных суспензий или в форме суспензии микросфер в изотонической среде.

Кроме того, активное вещество может быть представлено в форме комплекса с циклодекстрином, например альфа-, бета- или гамма-циклодекстрином, 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрином или метил-бета-циклодекстрином.

Другой подходящий антагонист рецептора СВ1 может содержать антитело, ориентированное на рецептор СВ1, которое препятствует связыванию агониста с рецептором СВ1.

Существуют различные изоформы рецепторов СВ1 и других вариантов. Следовательно, применение антагонистов для любого из этих вариантов рецептора СВ1 будет входить в объем защиты этого изобретения. Обобщенно и в дополнение к идентичности или гомологичности аминокислотной последовательности, биологическая функция рецептора СВ1 может быть определена следующим образом: будучи G протеин-сопряженным клеточным рецептором, он способен связывать ТГК и преобразовывать клеточный сигнал. Специалист в этой области техники сможет протестировать функцию рецептора СВ1 по известным стандартным методикам. Они могут включать экспрессию предполагаемой СВ1 к ДНК в клетках СНО, последующее испытание с использованием лигандов СВ1 и измерение активности клеточной сигнализации предполагаемого активированного рецептора СВ1, например, путем измерения продуцирования циклического AMP (аденозинмонофосфата).

Альтернатива уменьшению сигнальной трансдукции каннабиноидов через рецептор СВ1 с помощью фармакологических агентов заключается в понижающей регуляции или подавлении этого рецептора. Существуют различные известные методики понижающей регуляции или подавления экспрессии генов, которые могут быть использованы специалистом в этой области техники. Ограниченный перечень методик включает подавление активности путем гомологичной рекомбинации (Gossen, J. trends Genet. 9: 27-31, 1993), интерференцию РНК (Elbashir S. M., Nature. 2001 May 24; 411 (6836): 428-9), экспрессию доминирующих негативных рецепторов (Dosil, M. и др., Mol Клетк Biol. 1998 Oct, 18 (10): 5981-91) и трансгенную экспрессию факторов подавления транскрипции.

Кроме того, возможен скрининг антагонистов СВ1 с селективными антифиброзными свойствами, используя миофибробластные культуры, полученные путем разрастания эксплантатов, приготовленных из хирургических препаратов нормальной печени человека, как описано ранее (Li, L. и др., Gastroenterology 125, 460-9 (2003), Davaille J и др., J. Biol. Chem. (2002)). В частности, способ скрининга антагонистов СВ1 с селективными антифиброзными свойствами включает в себя стадии:

a) приготовления разнообразных клеточных культур миофибробластов,

b) экспозиции каждой из клеточных культур одним из соединений, которые будут испытаны,

c) оценки влияния соединений на фиброгенные свойства миофибробластов путем определения влияния соединений на выживание и рост этих клеток,

d) выбора одного из испытанных соединений.

Альтернативный способ может быть таким, как указано выше, в котором стадия с) включает оценку влияния соединений на фиброгенные свойства миофибробластов путем определения влияния соединений на способность синтеза внеклеточного матрикса и компонентов, которые ингибируют его разложение.

Альтернативный способ может быть таким, как указано выше, в котором стадия с) включает оценку влияния соединений на фиброгенные свойства миофибробластов путем определения продуцирования и миграции цитокина.

Специалист в этой области техники сможет выполнить эти индивидуальные стадии, используя хорошо известные методики, такие, как описаны в работах Li L. и др., Gastroenterology 125, 460-9 (2003), Davaille J. и др., J. Biol. Chem. (2002), Li L. и др., J. Biol. Chem. 2001 и Davaille, J. и др., J. Biol. Chem. 275, 34628-33 (2000).

Затем соединения, выделенные такими приемами, могут быть использованы для получения композиции для лечения печеночных заболеваний.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Подрегуляция рецепторов СВ1 в цирротической печени человека

Материалы

Культуральные среды и реагенты получены от фирмы Gibco (Invitrogen, France), плодную сыворотку теленка (ПСТ) из JBio Laboratories (France). Объединенную АВ положительную сыворотку человека поставлял Национальный центр переливания крови. Кроличья анти-СВ1 рецепторная антисыворотка (выращена против остатков 1-14 рецептора СВ1) и пептид, блокирующий СВ1 (остатки 1-14 рецептора СВ1 человека) получены от фирмы Cayman (Spibio, France).

Препарат РНК и RT-ПСР (протеин-сопряженный рецептор)

Цельную РНК экстрагируют из конфлюэнтных покоящихся клеток в 100 мм чашках, используя набор RNeasy (Qiagen, France). кДНК синтезируют из цельной РНК (2 пг) путем возвратной транскрипции в течение 1 ч при 37°С, используя 200 единиц M-MLV возвратной транскриптазы (Invitrogen, France), в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 0,05 мкг/мкл олиго(dТ)_12-18праймера (Invitrogen, France), 0,5 мМ dNTPs (Promega, France) и 10 мМ дитиотреитола в первом свивающем буфере (Invitrogen, France). Для проверки возможных геномных загрязнений ДНК выполняют контрольные синтезы в тех же самых условиях, без возвратной транскриптазы. Полимеразные цепные реакции (PCR) осуществляют с 2 мкл реакционной смеси возвратной транскрипции, используя 1,25 единиц AmpliTaq Gold ДНК полимеразы (Applied Biosystems, France) и соответствующий буфер, дополненный 2 мМ MgCl₂, 0,2 мМ dNTPs, и 25 пикомоль каждого праймера в суммарном объеме 50 мкл. Проводят 40 циклов PCR в устройстве термических циклов GeneAmp 2700 (Applied Biosystems, France), причем каждый цикл включает в себя денатурирование при 95°С в течение 45 с, отжиг при 58°С в течение 45 с и распространение при 72°С, 30 с, причем первый цикл включает длительный период денатурирования (10 мин) для активации полимеразы и последний цикл включает длительный период элонгации (10 мин). Используются следующие олигонуклеотидные праймеры (MWG Biotech, France) для СВ1: смысловой праймер СВ1 - 5'-TTTGGCTACACAATTGGAAGTCTAAGAACCC-3' и антисмысловой праймер СВ1, 5'-GСАСАСАТTGАСАСGТАТССАСТGСТTG-3' с ожидаемым продуктом PCR из 287 пар оснований (bp). Амплифицированные продукты PCR анализируют на 1,5%-ном геле агарозы и блоттируют на мембране Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotech, France). После предварительной гибридизации в буфере, содержащем 6XSSC, 5 мМ ЭДТУК рН 8, 5Х denhardt, 0,1% додецилсульфата натрия (ДСН) и 0,1 мг/мл ссДНК, в течение 2 ч при 42°С мембрану гибридизируют в течение ночи при 42°С в том же самом буфере, содержащем 50 нг СВ1 олигонуклеотидного зонда 5'-CCTGTGAGATGTGTATCAGTGTTTATGTGC-3', меченного изотопом [γ-³²P] аденозинтрифосфата (АТР), используя Т4 киназу (Invitrogen, France). После гибридизации блот трижды промывают в 0,1% ДСН, 1XSSC в течение 30 мин при комнатной температуре и анализируют с помощью устройства для фосфоровизуализации (Molecular Dynamics, France).

Препарат печени человека

Небольшие фрагменты замороженной печени после хирургической резекции у 13 пациентов (8 мужчин, 5 женщин, средний возраст 55 лет в диапазоне 39-72 лет) были подвергнуты ретроспективному исследованию. Образцы нормальной печени собирали у 3 женщин, претерпевших резекцию печени в связи с колоректальным метастазом (n=3). Образцы цирротической печени получены от 8 пациентов, претерпевших трансплантацию печени, и от 2 пациентов, претерпевших резекцию печени в связи с гепатоцеллюлярной карциномой. Цирроз был последствием хронического вирусного заболевания гепатитом С (HCV, n=1) или гепатитом В (HBV, n=2), первичного билиарного цирроза печени (n=1), алкогольного заболевания печени (n=4) или болезни Вильсона (n=1) и в одном случае криптогенный цирроз печени.

Иммунногистохимическое детектирование рецепторов СВ1 в нормальной и цирротической печени

Замороженные срезы (5-7 мкм) сушат на воздухе и фиксируют в ледяном ацетоне в течение 10 мин при -20°С. Неспецифическое связывание блокируют путем преинкубации срезов в течение 1 ч при комнатной температуре с 20%-ной человеческой сывороткой в физиологическом растворе с Tris-буфером (TBS, 50 мМ) рН 7,6. Срезы дополнительно культивируют в течение ночи при 4°C с кроличьей поликлональной антисывороткой рецептору СВ1 человека (Cayman, Spibio, France), разбавленной 1/2000 в разбавителе антител (Dakopatts, France).

После тройной промывки в TBS срезы культивируют в течение 45 мин при комнатной температуре с мышиными моноклональными анти-кроличьими антителами иммуноглобулина G (Dakopatts, France), разбавляют в 50 раз, три раза промывают в TBS, дополнительно культивируют в течение 30 мин при комнатной температуре с кроличьими анти-мышиными антителами иммуноглобулина (Dakopatts, France), разбавляют в 50 раз и затем обрабатывают, используя комплексный иммуноферментный метод щелочной фосфатазы-анти-щелочной фосфатазы (АРААР), который описан в работе Li, L. и др, Gastroenterology 125, 460-9 (2003). Для подтверждения специфичности первичного антитела привлечены контрольные образцы с предварительной адсорбцией первичного антитела и соответствующим синтетическим пептидом (100 мкг/мл, 1 ч при комнатной температуре) или без первичного антитела. Для определения возможности экспрессии СВ1 протеина печеночными миофибробластами осуществляют двойное иммунное окрашивание СВ1 и α-актина гладкой мышцы. Сначала срезы обрабатывают для иммунного окрашивания СВ1, используя обычный трехступенчатый метод биотин-стрептавидин иммунопероксидазы. Вкратце, эндогенную пероксидазу закаливают путем инкубации фиксированных в ацетоне срезов в смеси TBS/0,3% Н₂O₂ в течение 30 мин, затем промывают в TBS. Неспецифическое связывание блокируется путем преинкубации срезов в среде TBS/20% человечьей сыворотки в течение 30 мин. Затем срезы культивируют в течение 15 мин в авидине и после этого 15 мин в биотине (Vector Laboratories, Авидин/Биотиновый набор для блокирования) и дополнительно культивируют в течение ночи при 4°C с антисывороткой анти-CB1. Затем срезы промывают в TBS и последовательно культивируют с вторичными биотинилированными козлиными анти-кроличьими антителами (Dakopatts, France) (1/500) и с комплексом стрептавидин-пероксидаза хрена (1/50) (Pierce, Perbio, Interchim, France), no 30 мин в каждом случае. Активность пероксидазы оценивают, используя модифицированный металлом диаминобензидиновый (DAB) субстрат (Pierce, Interchim, France). Все стадии проводят при комнатной температуре, если не указано иное. Затем выполняют иммунное окрашивание α-актина гладкой мышцы, используя описанный выше метод АРААР, с разбавлением 1/5000 моноклональным антителом для α-актина гладкой мышцы (Sigma, France). Предметные стекла подвергают противоокрашиванию водным гематоксилином. Одинарное и двойное окрашивание визуализируют методом светлопольной фотомикрографии на микроскопе Axioplan (Zeiss, Oberkochen, Germany), оборудованном цифровой системой визуализации изображения (аппарат для цветной фотографии Hamamatsu 3CCD, Hamamatsu Photonics, France).

Выделение и культивирование печеночных миофибробластов человека

Печеночные миофибробласты человека получают путем разрастания эксплантатов, приготовленных из хирургических препаратов нормальной печени, полученных при хирургии доброкачественных или злокачественных опухолей печени, как описано в работе Davaille, J. и др., J. Biol. Chem. 275, 34628-33 (2000). Клетки культивируют в среде Dulbecco, модифицированной Eagle's (DMEM), содержащей 10% сыворотки (5% плодной сыворотки теленка и 5% человеческой сыворотки, DMEM 5/5), и используют между третьим и седьмым переносом.

Эксперименты проводят на клетках, которые приведены в состояние покоя путем инкубации (48 ч) в среде Waymouth, не содержащей сыворотки, если не указано иное. Природу миофибробластов этих клеток исследуют, как описано в работе Davaille, J. и др., J. Biol. Chem. 275, 34628-33 (2000), и они демонстрируют фенотипические и функциональные характеристики фиброгенных клеток, обнаруженных in situ в ходе печеночного фиброгенеза (Win, К.М. и др., Hepatology 18, 137-45 (1993). Обнаружено, что культуры экспрессируют α-актин гладкой мышцы и два маркера печеночных миофибробластов, фибулин-2 и интерлейкин-6 (Davaille, J. и др., J. Biol. Chem. 275, 34628-33 (2000)).

Иммунноцитохимическое детектирование рецепторов СВ1 в культивированных миофибробластах печени человека

Миофибробласты печени человека высеивают (в количестве 10000/см²) в 35 мм чашках, выращивают в среде, содержащей сыворотку в течение 24 ч, в среде без сыворотки в течение 48 ч, промывают TBS и фиксируют в 4%-ом параформе в течение 10 мин. После одной промывки в TBS клетки культивируют в TBS, содержащем 20% сыворотки человека в течение 30 мин при комнатной температуре, и дополнительно культивируют с анти-СВ1 антисывороткой (разбавление 1/500 в смеси TBS/20% сыворотки человека) в течение 3 ч при комнатной температуре и в течение ночи при 4°С в увлажнительной камере. Затем клетки экстенсивно промывают в TBS, культивируют с Су3-конъюгированным козлиным анти-кроличьим иммуно-гамма-глобулином (IgG) (Sigma, France) (разбавление 1/50 в смеси TBS/20% сыворотки человека) при комнатной температуре, в темноте, в течение 30 мин, промывают, покрывают средой VECTASHIELD Mounting (Vector Laboratories, Burlingame, CA) и осматривают под флуоресцентным микроскопом. Для подтверждения специфичности первичного антитела привлечены контрольные образцы с предварительной адсорбцией синтетического пептида (100 мкг/мл, в течение 1 ч при комнатной температуре) или без первичного антитела.

Экспрессию рецептора СВ1 исследуют методом иммунной гистохимии с поликлональным антителом, ориентированным против рецептора СВ1 человека, на замороженных тканевых срезах, полученных из хирургических препаратов нормальной (n=3) и цирротической печени (n=10) различного происхождения (хронический HCV, n=1 или HBV, n=2, первичный билиарный цирроз печени, n=1, алкогольного заболевания печени, n=4 или болезни Вильсона, n=1, и в одном случае криптогенный цирроз печени). В нормальной печени обнаружена дискретная, акцентированная иммунная реакционная способность СВ1 вдоль синусоидальных стенок. В цирротической печени общая интенсивность иммунного окрашивания СВ1 заметно увеличивается, независимо от этиологии цирроза. Главным образом, СВ1 наблюдается в многочисленных веретенообразных клетках, распределенных вдоль фиброзных мембран. Кроме того, экспрессия рецептора СВ1 обнаружена в других не паренхиматозных клетках, в том числе в воспалительных клетках и в канальчатых пролиферирующих клетках, расположенных вдоль фиброзной мембраны. Специфичность антитела продемонстрирована по отсутствию сигнала в срезах, культивированных в присутствии блокирующего пептида СВ1 или в отсутствие первого антитела.

При двойном иммунном гистохимическом анализе с использованием антитела анти-СВ1 рецептора и антитела анти-α-актина гладкой мышцы ясно выявляются печеночные миофибробласты внутри фиброзных мембран в качестве заметного типа клеток, экспрессирующих рецепторы СВ1. Соответственно, рецепторы СВ1 также экспрессируются в культивированных миофибробластах печени человека, что продемонстрировано методами RT-PCR, а также иммунной цитохимии.

Пример 2. Уменьшение фиброгенной реакции у мышей с дефицитом СВ1

Животные и план эксперимента

Самцы CD1 мышей, несостоятельные для рецепторов СВ1. и сопряженный приплод дикого типа произведены, как описано ранее в публикации Ledent С.и др., Science 283, 401-4(1999).

Гетерозиготных мышей разводят для более чем пятнадцати поколений на основе CD1 до разведения мышей дикого типа (WT) и мутантных мышей, использованных в данном исследовании. Используют сорок самцов: WT (n=20) и СВ1 -/- (n=20), в возрасте 8-10 недель, и животных разделяют на следующие группы: WT (оливковое масло, n=8); WT CCl₄ (n=12); имитационные СВ1-/- (оливковое масло, n=5); СВ1-/- ССl₄ (n=15). Животных размещают в клетках с регулируемой температурой и влажностью, поддерживая 12-часовой цикл света/темноты и предоставляя неограниченное количество пищи и воды, если не указано иное. Фиброз был индуцирован путем введения четыреххлористого углерода (CC1₄) (Sigma, St Quentin- Fallavier, France) смешанного с оливковым маслом (1:10 по объему), в дозе 0,5 мл/кг веса тела, путем внутрибрюшинной инъекции (IP), дважды в неделю, в альтернативе с равным объемом этанола, смешанного с Cremophor и фосфатным буферным раствором (PBS) (5/5/90), три раза в неделю. Имитационные животные вместо CCl₄ получали оливковое масло. Спустя 4 недели животных лишают пищи в течение ночи и умерщвляют через 48 ч после последней инъекции CCl₄. Образцы печени отбирают из нескольких долей и либо i) быстро замораживают в жидком азоте и гомогенизируют в экстрационном растворе РНК, ii) гомогенизируют в воде и быстро замораживают в жидком азоте для определения гидроксипролина либо iii) фиксируют в буферном растворе формалина.

Быстро замороженные образцы хранят при -80°С до употребления. Образцы крови также собирают в силиконизированные пробирки, содержащие барьер инертного геля и диск-активатор свертывания крови (Venoject, Terumo, France); сыворотку, выделенную с помощью центрифугирования, хранят при -20°С до употребления.

Тесты на функционирование печени

Общепринятые тесты на функционирование печени (содержание билирубина, щелочной фосфатазы и аспартат трансаминазы) были выполнены на автоматизированном анализаторе.

Оценка фиброза, воспаления и некроза

Препараты печени фиксируют в 10%-ном формалине и заливают парафином. Тканевые срезы (толщиной 4 мкм) окрашивают гематоксилин-эозином (Н&Е) для общепринятого обследования или красным Picro-Sirius для визуализации отложений печеночного коллагена. Гистологическую классификацию (некроза и воспалительной инфильтрации) и определение стадии (фиброза) оценивают неотчетливо, по меньшей мере, на 4 фрагментах из различных областей каждой печени независимые патологоанатомы. Стадии фиброза определяют по шкале от 0 до 4 согласно полуколичественной модифицированной системе подсчета баллов METAVIR следующим образом: отсутствие фиброза =0, портальный фиброз без мембран =1, немного мембран =2, многочисленные мембраны без цирроза =3 и цирроз =4. Неоднородность фиброза по всей области печени, если она имеется, принимают во внимание путем оценки доли площади, соответствующей уровню индивидуальной оценки в каждом фрагменте, и путем комбинирования данных для каждой печени. Некроз, определяемый по ацидофильным телам, по баллонирующей дегенерации и/или рассеянным очагам гепатоцеллюлярного некроза, ранжируется следующим образом: отсутствие =0, мягкий =1 (вовлечение 1/3 долек или узелков), умеренный =2 (вовлечение 1/3-2/3 долек или узелков), заметный =3 (вовлечение больше чем 2/3 долек или узелков). Воспалительная инфильтрация ранжируется от 0 до 3: отсутствие =0, мягкая =1 (портальная и/или лобулярная) воспалительная инфильтрации меньше чем в 1/3 долек или узелков, умеренная =2 (портальная и/или лобулярная) воспалительная инфильтрация включает в себя 1/3-2/3 долек или узелков, заметная = 3 (портальная и/или лобулярная) воспалительная инфильтрация включает в себя больше чем 2/3 долек или узелков. Все образцы оценивались одновременно.

Содержание гидроксипролина

Содержание гидроксипролина оценивают, как описано ранее в публикации Grenard, Р. и др., J. Hepatol. 26, 1356-62 (1997). Три небольших фрагмента от каждой печени объединяют, гомогенизируют в дистиллированной воде, лиофилизируют и в течение ночи гидролизуют в 6 н. НСl при 110°С (10 мг сухого порошка печени на 1 мл 6 н. НСl). Затем продукт гидролиза обрабатывают активированным углем, фильтруют, выпаривают и снова суспендируют в дистиллированной воде. Используют аликвоты продукта гидролиза для того, чтобы спектрофотометрически определить содержание гидроксипролина (HP) путем взаимодействия реагента Эрлиха согласно методу Весснера (Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys. 93, 440-7 (1961)), модифицированному, как описано в публикации Creemers, L.В. и др., Biotechniques 22, 656-8 (1997). Содержание гидроксипролина в печени выражается в виде микрограмм на 1 миллиграмм ткани (сухая масса).

Изоляция и культивирование печеночных миофибробластов мышей.

Мышиные миофибробласты изолируют путем перфузии коллагеназы и очищают по градиенту плотности в устройстве Nicodenz, как описано в работе Vrochides, D. и др., Hepatology, 1996. 23 (6): р.1650-5. После изоляции клетки культивируют в среде DMEM, содержащей 20% плодной сыворотки теленка. Спустя сутки остатки клеток и клетки, не прилипшие к субстрату, удаляют путем промывания и клетки дополнительно культивируют в среде DMEM, содержащей 10% ПСТ. Клетки используют между третьим и девятым переносом, причем была обнаружена экспрессия альфа-актина гладкой мышцы, фибулина-2 и интерлейкина-6.

Измерение активности типа Caspase-3

Анализы апоптоза были выполнены на не-конфлюэнтных клетках, которым дали связаться в течение ночи в среде DMEM, содержащей 10% ПСТ, и лишают питания в течение указанного времени. Активность типа Caspase-3 определяют на продуктах лизиса клеток, используя в качестве субстрата AC-DEVD-AFC, как описано ранее (Davaille, J. и др., J. Biol. Chem., 2002, 277 (40): p.37323-30; Li, L., и др., J. Biol. Chem., 2001, 276 (41): p.38152-8).

Оценка жизнеспособности клеток

Печеночным миофибробластам мышей (по 7000 клеток/лунка в планшетах на 96-лунок) давали связаться в течение ночи в среде DMEM 10%, лишенной питательной сыворотки в течение указанного времени. В каждую лунку добавляют водный раствор реагента CellTiter 96 и регистрируют ИК-поглощение при длине волны 490 нм.

Определение печеночного TGFβ-1

Содержание печеночного TGFβ-1 (трансформирующего фактора роста) определяют в цельных печеночных гомогенатах, активированных кислотой. Образцы замороженной печени гомогенизируют в лизисном буфере (25 мМ HEPES с рН 7,4, 1% NP40, 5 мМ MgCl₂, 1,3 мМ ЭДТУК, 1 мМ ЭГТУК, ингибиторы фосфатазы и протеазы) в течение 30 мин при 4°С. После центрифугирования с ускорением 12000 g в течение 10 мин при 4°С собирают осветленные продукты лизиса ткани и хранят их при -80°С до анализа. Концентрацию протеина определяют с помощью анализатора протеинов ВСА (Pierce), используя в качестве стандарта альбумин бычьей сыворотки (BSA). Для активации латентной формы TGFβ-1 в иммуннореактивную форму продукты лизиса ткани подкисляют в равном объеме 2,5 н. уксусной кислоты и 10М раствора мочевины при комнатной температуре в течение 10 мин с последующей нейтрализацией, используя 2,7 М раствор NaOH в 1М HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-этансульфокислота). Иммуноферментный анализ ELISA осуществляют, используя мышиный TGF-β1 Quantikine (R&D Systems, France), следуя инструкциям изготовителя. В качестве стандарта используют мышиный рекомбинантный протеин TGF-β1. Результаты выражены в пикограммах (пг) TGF-β1 на 1 мг растворимого протеина.

Иммунное гистохимическое окрашивание для α-актина гладкой мышцы

Ткань печени фиксируют в формалине и заливают в парафин. Иммунное гистохимическое окрашивание для α-актина гладкой мышцы осуществляют, используя иммуннодетектирующий набор Vector М. О. М. в соответствии с протоколом, указанным изготовителем (Vector Laboratories).

Вкратце, залитые парафином срезы освобождают от парафина и повторно гидратируют из ксилола и этанола в буфере TBS (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, pH 7,6). Предметные стекла обрабатывают микроволнами (мощность 700 Вт) в цитратном буфере, каждое по два раза в течение 5 мин. Затем гасят активность эндогенной пероксидазы путем инкубации в течение 1 часа в 0,3% растворе H₂O₂ в буфере TBS. После блокирования неспецифического связывания путем предварительной инкубации срезов с 1,5% лошадиной сыворотки в TBS в течение 1 часа срезы культивируют в течение 15 мин в авидине и затем 15 мин в биотине (Авидин/биотиновый набор для блокирования Vector Laboratories) и дополнительно культивируют в течение 1 ч в блокирующем растворе MOM мышиного иммуноглобулина (Ig). Впоследствии срезы промывают в TBS и последовательно культивируют с разбавленным раствором MOM в течение 5 мин, с разбавлением 1:1000 моноклонального антитела относительно α-актина гладкой мышцы в течение 30 мин (Sigma, France), с биотинилированным анти-мышиным IgG реагентом MOM в течение 10 мин и в заключение с реагентом Vectastain ABC в течение 5 мин. Активность пероксидазы обнаруживают, используя модифицированный металлом диаминобензидиновый (DAB) субстрат (Pierce, Interchim, France). Все стадии проводят при комнатной температуре. Для контрольных предметных стекол, обработанных разбавителем MOM вместо первичного антитела, не обнаружено какое-либо позитивное окрашивание. Площадь позитивного окрашивания для каждого животного определяют на 4-5 фрагментах печени, используя систему морфометрического анализа с программным обеспечением Image-Pro Plus (MediaCybernetics, MicroMecanique, France).

Статистические данные

Результаты для n экспериментов выражены в виде: средняя величина ± СКО. Результаты анализируют с помощью двустороннего анализа расхождений (ANOVA) с последующими парными сопоставлениями, скорректированными по методу Student-Newmann-Keuls. В качестве минимального уровня достоверности взята величина p<0,05.

Мыши с дефицитом рецептора СВ1 (СВ1-/-) и их приплод дикого типа (WT) подвергают хронической обработке четыреххлористым углеродом, СС1₄. Имитационные мыши (СВ1-/- и WT) получали оливковое масло. Как видно из табл.1, величины среднего веса тела, веса печени и отношения веса печени к весу тела незначительно отличаются между четырьмя экспериментальными группами.

Таблица 1
Существенные параметры и данные тестов на функционирование печени для мышей дикого типа (WT) и мышей с дефицитом СВ1 после 4 недель обработки ССl4
Параметр	WT, оливковое масло	WT CCl4	СВ1-/-, оливковое масло	СВ1-/-, ССl4
Вес тела (г)	36,3±1,7	35,2±0,8	34,8±2,1	36,6±0,9
Вес печени (г)	1,9±0,1	2,1±0,1	1,8±0,1	2,1±0,1
Отношение вес печени/вес тела (x 100)	5,26±0,45	6,0±0,3	54±0,4	5,7±0,1
Аспартат-трансаминаза (IU 1-1)	94,7±9,2	1887,2±656,6*	139,6±24,3	1341,9±457,1#
Щелочная фосфатаза (IU 1-1)	37,9±5,9	55,0±6,2*	33,6±2,0	56,4±4,6#
Общий билирубин	3,5±1,0	15,1±4,2*	3,6±0,9	10,0±3,4#
Результаты выражены так: средняя величина ± СКО. *p<0,05 относительно WT, оливковое масло; #p<0,05 относительно СВ1-/-, оливковое масло

У мышей WT фиброз печени развивается через 4 недели после обработки ССl₄, как показывает гистологический анализ срезов ткани печени, окрашенных красным PicroSirius. В печени WT мышей, обработанных ССl₄, обнаружено образование многочисленных мембран с некоторым количеством узелков. Поразительно, что для мышей СВ1-/-, обработанных ССl₄ наблюдается более слабая фиброгенная реакция с меньшим образованием фиброзных мембран. Соответственно, оценка фиброза была значительно ниже для мышей СВ1-/-, обработанных ССl₄, по сравнению с группой WT, обработанной ССl₄ (соответственно 2,59±0,13 и 3,33±0,13, p<0,05). Более того, содержание печеночного коллагена, оцениваемое по определению гидроксипролина в печени, было заметно ниже (на 40%) у мышей с дефицитом СВ1, обработанных ССl₄, по сравнению с их WT аналогами (соответственно 0,45±0,06 и 0,73±0,11 мг/мг ткани (в сухом виде); p<0,05). В заключение, как видно из табл.2, некроз и воспаление незначительно различаются для мышей WT и СВ1-/-, обработанных ССl₄.

Таблица 2
Некроз и воспаление у мышей дикого типа (WT) и СВ1-/- после 4 недель обработки ССl4
Параметр	WT CCl4	СВ1-/-СС14
Некроз	1,3±0,3	1,3±0,2
Воспаление	1,4±0,3	1,5±0,2

Результаты выражены так: средняя величина ± СКО.

Измеряют содержание фиброгенного цитокина TGF-β1 в печени и оценивают экспрессию α-актина гладкой мышцы, который является маркером печеночных миофибробластов и активированных звездообразных клеток печени. У животных продуцирование TGF-β1 снижается для мышей с дефицитом СВ1 по сравнению с их аналогами дикого типа (фиг.1А). Кроме того, у мышей СВ1-/- заметно ослабляется α-актин гладкой мышцы по сравнению с WT животными, обработанными ССl₄ (1,23±0,09 против 2,5 8±0,23; p<0,05) (фиг.1В).

В заключение для того чтобы оценить, снижает ли подавление активности СВ1 накопление печеночных миофибробластов за счет уменьшения их пролиферации и/или апоптоза, используются печеночные миофибробласты, изолированные из мышей WT и СВ1-/-. В качестве стимула апоптоза используется потеря сыворотки. Депривация сыворотки едва ли оказывает влияние на жизнеспособность печеночных миофибробластов, изолированных из мышей дикого типа (WT) (фиг.2). Напротив, лишение сыворотки (как пищи) дает цитотоксический эффект в отношении печеночных миофибробластов, изолированных из животных СВ1-/-, что видно по скруглению, сморщиванию и разъединению клеток и снижению их жизнеспособности (фиг.2А). Кроме того, потеря сыворотки усиливает стимуляцию активности типа Caspase-3 в клетках СВ1-/- по сравнению с клетками WT (фиг.2В). Таким образом, для печеночных миофибробластов из мышей СВ1-/- наблюдается более высокая скорость апоптоза, чем для клеток из мышей WT.

Эти результаты демонстрируют, что несостоятельность рецептора СВ1 повышает чувствительность печеночных миофибробластов к апоптозу.

Пример 3. Ежедневное курение гашиша представляет собой фактор риска для развития фиброза при хроническом гепатите С

Обследовались 195 неотобранных простых пациентов с датированной выявляемостью (мужчины/женщины: 140/55, возраст 42±10). Собранные данные включали в себя употребление гашиша, спиртного и табака в ходе заболевания, возраст в момент заражения, пол, путь передачи, генотип, BMI, стеатоз, активность и фиброз (METAVIR), и скорость развития фиброза (среднее значение составляет 0,08 в год).

По данным одномерного анализа скорость развития фиброза выше 0,08/год связана с курением гашиша, как показано в табл.3, потребление спирта, равное или больше чем 30 г/день (64%, р=0,03), умеренный или заметный стеатоз (65%, р=0,004), возраст в момент заражения, равный или больше чем 25 лет (63%, p<0,01), и гистологическая активность, равная или больше чем А2 (65%, p<0,001). При многомерном анализе скорость развития фиброза выше 0,08 независимо связана с ежедневным курением (OR=3,8; 95% CI (1,7-8,7)), потребление спирта, равное или больше чем 30 г/день (OR=2,1; 95% CI (1,0-4,6)), возраст в момент заражения, равный или больше чем 25 лет (OR=4,0; 95% CI (1,9-8,4)), и активность, равная или больше чем А2 (OR=7,5; 95% CI (3,5-16,1)). Следовательно, существует причинная связь между ежедневным потреблением гашиша и развитием фиброза.

Таблица 3
Влияние потребления гашиша на развитие фиброза
Потребление гашиша	Скорость развития фиброза выше 0,08/год	p
Нет, n=102 (52%)	43 (42%)
Нерегулярно, n=30 (16%)	15 (50%)	0,029
Ежедневно, n=63 (32%)	40 (63%)

Пример 4. Культуры печеночных миофибробластов в присутствии антагонистов рецептора СВ1

Изоляция культуры печеночных миофибробластов человека

Печеночные миофибробласты человека получают путем разрастания эксплантатов, приготовленных из хирургических препаратов нормальной печени, полученных при хирургии доброкачественных или злокачественных опухолей печени, как описано ранее. Эту процедуру осуществляют в соответствии с этическими нормами, продиктованными французским законодательством. Клетки культивируют в среде Dulbecco, модифицированной Eagle's (DMEM), содержащей 10% сыворотки (5% плодной сыворотки теленка и 5% человеческой сыворотки, DMEM 5/5), и используют между третьим и седьмым переносом. Эксперименты проводят на клетках, которые приведены в состоянии покоя путем инкубации (48 ч) в среде Waymouth, не содержащей сыворотки, если не указано иное.

Изоляция культуры печеночных миофибробластов мышей

Мышиные миофибробласты изолируют путем перфузии коллагеназы и очищают по градиенту плотности в описанном выше устройстве Nicodenz. После изоляции клетки культивируют в среде DMEM, содержащей 20% плодной сыворотки теленка. Спустя сутки остатки клеток и клетки, не прилипшие к субстрату, удаляют путем промывания и клетки дополнительно культивируют в среде DMEM, содержащей 10% ПСТ. Клетки используют между третьим и девятым переносом

Анализ апоптоза

Анализы апоптоза были выполнены на не-конфлюэнтных клетках, которым дали связаться в течение ночи в среде DMEM 5/5 и выдерживали без сыворотки в течение 48 ч, как описано в работе Davaille J. и др., J. Biol. Chem. 2002; 277: 37323-30, и Li L. и др., J. Biol. Chem. 2001; 276: 38152-8. Морфологию ядер анализируют, используя окрашивание DAPI, активность типа Caspase-3 анализируют на продукте клеточного лизиса, используя в качестве субстрата AC-DEVD-AFC, и роспуск петель ДНК анализируют методом электрофореза на геле агарозы цельной ДНК, экстрагированной с использованием набора Apoptotic DNA Ladder Kit.

Жизнеспособность клеток

Клеткам (по 7000 клеток/лунка в планшетах на 96-лунок) давали связаться в течение ночи в среде DMEM 5/5, выдерживали 48 ч в DMEM, лишенной питательной сыворотки, без фенольного красителя и обрабатывали указанными эффекторами в течение 16 ч. В каждую лунку добавляли водный раствор реагента CellTiter 96 и регистрировали ИК-поглощение при длине волны 490 нм.

Определение синтеза ДНК

Синтез ДНК измеряют в трех лунках путем введения [³H]-тимидина, как описано ранее (Tao J. и др., J. Biol. Chem, 1999. 274 (34): p.23761-23769). Конфлюэнтные миофибробласты печени человека выдерживают без питательной сыворотки в течение 48 ч и дополнительно стимулируют 20 нг/мл PDGF-BB в течение 30 ч. Конфлюэнтные миофибробласты мышиной печени выдерживают без питательной сыворотки в течение 24 ч в присутствии 0,1% BSA и дополнительно стимулируют 20 нг/мл PDGF-BB в течение 30 ч в присутствии 0,01% BSA. В течение последних 20 ч инкубации добавляют [³H]-тимидин (по 0,5 пикоКюри в лунку).

Культивирование клеток осуществляют, как описано в примере 1 этого изобретения. Клеточные культуры печени человека, а также мыши подвергают воздействию возрастающих доз антагониста SR 141716 для рецептора СВ1 и определяют синтез ДНК печеночных миофибробластов.

В печеночных миофибробластах человека, в зависимости от дозы, SR 141716 ингибирует синтез ДНК, вызванный 20 нг/мл PDGF-BB (фиг.3А), причем в присутствии 300-400 нМ антагониста наблюдается 50% ингибирование от максимального значения.

Антагонист SR 141716 также ингибирует синтез ДНК, вызванный 20 нг/мл PDGF-BB, в мышиных миофибробластах, изолированных из мышей дикого типа, в то время как он лишь в самой малой степени влияет на пролиферацию клеток в СВ1-/- (фиг.3В).

Эти результаты демонстрируют, что антагонист SR141716 для СВ1 вызывает ингибирование роста печеночных миофибробластов у людей и мышей, причем он действует через рецепторы СВ1.

Пример 5. Оценка терапевтического эффекта SR 141716 на индуцированный фиброз печени

Оценивают антифиброгенный потенциал антагониста SR 141716 для СВ1 в экспериментальной модели фиброза печени, индуцированного хронической интоксикацией четыреххлористым углеродом.

Введение лекарственного препарата

Препарат SR 141716 (10 мг/кг веса тела) растворяют в носителе непосредственно перед использованием (2 капли Tween 80 в 10 мл раствора PBS, содержащего 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 5% этанола) и обрабатывают ультразвуком.

Животные и план эксперимента

Мышей CD1 получают от фирмы Janvier (France). Все эксперименты проводят, используя принятые этические нормы. Используют 36 самцов мышей в возрасте 10-12 недель и животных разделяют на следующие группы: группа, обработанная носителем, оливковое масло (n=3); группа, обработанная носителем, ССl₄ (n=14); группа, обработанная SR 141716, оливковое масло (n=3); группа, обработанная SR 141716A, CCl₄ (n=16). Животных размещают в клетках с регулируемой температурой и влажностью, поддерживая 12-часовой цикл света/темноты и предоставляя неограниченное количество пищи и воды, если не указано иное. Фиброз был индуцирован путем введения четыреххлористого углерода (ССl₄) (Sigma, St Quentin-Fallavier, France), смешанного с оливковым маслом (1:10 по объему), в дозе 0,5 мл/кг веса тела, путем внутрибрюшинной инъекции, дважды в неделю, в течение одного месяца. Препарат SR 141716 или носитель вводят ежедневно путем внутрибрюшинной инъекции. Обработка препаратом/носителем начинается за 7 суток до инъекции четыреххлористого углерода (ССl₄) и продолжается в ходе обработки CCl₄.

Совместное введение ССl₄ с носителем (PBS, содержащий 10% ДМСО, 5% этанола, 0,1% Tween 80) вызывает массовую смерть животных, доля которых спустя один месяц достигает 50% от популяции (смотрите фиг.4). Напротив, совместное введение мышам ССl₄ вместе с 10 мг/кг SR 141716 связано с более высокой степенью выживания через один месяц (83%). Среди имитационных животных, обработанных или SR141716, или носителем, не было смертных случаев.

Следовательно, эти результаты указывают на гепатозащитное действие SR141716 как антагониста СВ1.

Пример 6. Оценка оптимального режима для перорального введения SR141716 при лечении фиброза печени

Для определения оптимальных условий долгосрочного лечения препаратом SR141716 выполнено следующее исследование.

Самцов мышей CD1 (40) разделяют на следующие группы: имитационная (оливковое масло, n=3); группа ССl₄ (n=12); имитационная группа, обработанная SR 141716 (оливковое масло, n=3); две группы SR 141716, обработанные ССl₄ (n=2, 12 раз). Животных размещают в клетках с регулируемой температурой и влажностью, поддерживая 12-часовой цикл света/темноты и предоставляя неограниченное количество пищи и воды, если не указано иное. Фиброз был индуцирован путем введения четыреххлористого углерода (ССl₄) (Sigma, St Quentin-Fallavier, France), смешанного с оливковым маслом (1:10 по объему), в дозе 0,5 мл/кг веса тела, путем внутрибрюшинной инъекции, дважды в неделю. Имитационным животным вместе с ССl₄ дают оливковое масло. Препарат SR 141716 вводят в корм RM1 для мышей (DIETEX, France) в концентрации 65 мг/кг и дают группе, обработанной SR 141716. Приняв, что мышь весом 30 г может съесть 5 г корма в сутки, ожидаемая конечная доза введенного препарата SR 141716 составит 10 мг/кг. Лечение SR 141716 начинается либо за 7 суток до инъекции четыреххлористого углерода (ССl₄) (12 мышам), либо начинается спустя 7 суток после первой инъекции (12 мышам) и продолжается в ходе всей обработки четыреххлористым углеродом. Спустя 5 недель животных лишают пищи в течение ночи и умерщвляют через 48 ч после последней инъекции ССl₄. Образцы печени отбирают из нескольких долек и либо i) быстро замораживают в жидком азоте и гомогенизируют в растворе, экстрагирующем РНК, ii) гомогенизируют в воде и быстро замораживают в жидком азоте для определения гидроксипролина либо iii) фиксируют в буферном растворе формалина. Быстро замороженные образцы будут храниться при -80°С до употребления. Кроме того, собирают образцы крови в силиконизированные пробирки, содержащие барьер инертного геля и диск-активатор свертывания крови (Venoject, Terumo, France); сыворотку, выделенную с помощью центрифугирования, хранят при -20°С до употребления. Результаты используют для оценки концентрации, при которой токсичность является терапевтически приемлемой.

1. Применение антагониста рецептора СВ1, представляющего собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей, при получении композиции для лечения печеночных фиброзов.

2. Применение по п.1, где антагонист рецептора СВ1, представляющий собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одну из его фармацевтически приемлемых солей, является специфическим антагонистом рецептора СВ1.

3. Применение по п.1, где печеночный фиброз вызван алкогольным циррозом печени.

4. Применение по п.1, где печеночный фиброз вызван хроническим вирусным гепатитом.

5. Применение по п.1, где печеночный фиброз вызван неалкогольным стеатогепатитом.

6. Применение по п.1, где печеночный фиброз вызван первичным раком печени.

7. Применение по п.1, где суточная доза антагониста рецептора СВ1 составляет от 0,01 до 500 мг, предпочтительно от 1 до 100 мг.

8. Способ лечения печеночного фиброза у млекопитающих, который заключается во введении терапевтически эффективного количества нуждающемуся в лечении млекопитающему, по меньшей мере, одного антагониста рецептора СВ1, представляющего собой N-пиперидино-5-(4-хлорфенил)-1-(2,4-дихлорфенил)-4-метилпиразол-3-карбоксамид или одной из его фармацевтически приемлемых солей.

9. Способ по п.8, где печеночный фиброз вызван алкогольным циррозом печени.

10. Способ по п.8, где печеночный фиброз вызван хроническим вирусным гепатитом.

11. Способ по п.8, где печеночный фиброз вызван неалкогольным стеатогепатитом.

12. Способ по п.8, где печеночный фиброз вызван первичным раком печени.

13. Способ по п.9, где суточная доза антагониста рецептора СВ1 составляет от 0,01 до 500 мг, предпочтительно от 1 до 100 мг.