Вакцина против тейлериоза
Группа изобретений относится к области ветеринарной микробиологии. Способ получения вакцины включает выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, осуществляют от животного, зараженного шизонтами Theileria annulata в виде супернатанта из измельченных клещей или в виде консервированной культуры, культивирование зараженных клеток осуществляют в среде для роста, которая представляет собой RPMI 1640, дополненную сывороткой в количестве от 10 до 20%, выбранной из эмбриональной сыворотки теленка, сыворотки новорожденного теленка или нормальной бычьей сыворотки; раствором антибиотиков, содержащим бензилпенициллин натрия 100 ME на мл, сульфат стрептомицина 100 мкг на мл и микостатин 10 ME на мл, а также 200 мМ L-глутамином на мл, при этом все компоненты предварительно стерилизованы фильтрацией и очищены от любого загрязнения микроорганизмами стандартными методами. Размножение культивированных клеток in vitro осуществляют методом серийных пассажей, при этом осуществляют до 100 пассажей с периодичностью два или три раза в неделю, а плотность посева клеток поддерживают соответственно 1×105 или 2×105 клеток на мл, или методом предельных разведений их в «cupark» планшетах и выращивание клонированных культур из одной клетки пассированием культур до 200 раз в режиме два/три раза в неделю. Подращивают культуры до больших объемов для получения вакцины. Тестирование эффективности вакцины в широких полевых условиях осуществляют на коровах Bos Taurus, скрещенных с коровами Bos Indicusy, a также на новорожденных телятах, телятах возрастом до двух месяцев и беременных коровах. Вакцина безопасна для всех возрастных групп крупного рогатого скота, включая новорожденных телят и беременных коров, обладает высокой иммуногенной активностью. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 табл.
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к вакцине против тейлериоза и способу ее получения. Эта вакцина безопасна для всех экзотических пород, их гибридов во всех возрастных группах крупного рогатого скота, даже включая новорожденных телят и беременных коров, а также телят данной местности, и обладает способностью защищать вакцинированных животных от тропического тейлериоза жвачных животных.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Экзотические породы крупного рогатого скота, их гибриды и молодые телята данной местности в высокой степени подвержены тропическому тейлериозу жвачных животных, который представляет собой крайне опасное заболевание крупного рогатого скота, передаваемое клещами. Это заболевание неблагоприятно воздействует на рабочие свойства быков, племенные качества быков и молочную продуктивность коров, приводя к огромным экономическим потерям. Наряду с прямыми потерями, большие расходы также идут на лечение заболевших животных. Возникновение этого заболевания является сезонным, в течение лета и дождливых месяцев, т.е. с апреля по октябрь. Соответствующими признаками болезни являются лимфоаденопатия, лихорадка, анемия, слабость, лежачее положение и специфичная особенность, связанная с непрерывным потреблением пищи и жеванием, проявляющаяся у экзотических и гибридных пород крупного рогатого скота до поздних стадий заболевания. Наблюдаемыми необычными признаками являются гемоглобинурия и кожная сыпь, главным образом у взрослых особей крупного рогатого скота, а также выступающие глазные яблоки и вовлечение в патологический процесс головного мозга у гибридных телят. Диагноз подтверждается демонстрацией макрошизонтов в мазках при биопсии лимфатических узлов и пироплазм в эритроцитах.
Уровень заболеваемости приближается почти к 100 процентам, а уровень смертности - к 60-80 процентам. В основном от этого заболевания страдают молодые животные, главным образом моложе 2-месячного возраста. Впоследствии животные продолжают получать повторяющиеся природные инфекционные инокуляты через повторяющиеся клещевые инвазии и остаются иммунными к этому заболеванию и устойчивыми даже к вирулентным провокациям. Однако в результате любого стресса, такого как беременность, роды, лактация, интеркуррентное заболевание и т.д., во время последующей жизни остаточная инфекция в их организме может перерасти в заболевание с клинической симптоматикой. Это заболевание предположительно представляет угрозу для 250 миллионов особей крупного рогатого скота на Средиземноморском побережье, в Северной Африке, на Ближнем и Среднем Востоке, на Индийском субконтиненте и Центральной Азии.
Различные химиотерапевтические агенты, подобные беренилу, имидокарбу, лактату галофугинона, бупарваквону, наряду с поддерживающей терапией были испробованы с различными уровнями успешного исхода. Из этих данных было обнаружено, что бупарваквон является наиболее эффективным в лечении клинических случаев тейлериоза. Однако это лекарственное средство необходимо импортировать и оно является очень дорогостоящим. Имея в виду распространенность этого заболевания и невозможность контроля за клещами-переносчиками в полевых условиях, необходимость разработки подходящих иммунопрофилактических средств ощущалась в Индии и в различных других странах, в которых проводят интенсивные программы по скрещиванию пород для увеличения продукции молока, контролируя это страшное заболевание. Время от времени с различным успехом были испробованы различные способы иммунизации. Эти способы иммунизации включают в себя лучевую обработку, неспецифическую иммунизацию, клеточную культуральную вакцину и т.д. Клеточная культуральная вакцина в настоящее время опробована в некоторых странах, тогда как другие способы были использованы в прошлом и имели их собственные преимущества и недостатки.
Существующий на рынке продукт под названием Rakshavac-T не рекомендуется ни телятам моложе 2-месячного возраста, ни беременным коровам. Несмотря на то, что эпидемиологические исследования подтвердили, что это заболевание встречается в первую очередь у этого поголовья скота.
В патенте DE2914813 описана живая вакцина против тейлериоза у крупного рогатого скота, содержащая лимфоидные клетки крупного рогатого скота, инфицированные шизонтами аттенуированного штамма Theileria annulata. Эту вакцину вводят в виде дозы, содержащей 0,1-3 миллиона живых инфицированных клеток. Эту вакцину готовили путем выращивания T. Annulata, выделенного из клещей Hyalomma detritum, в лимфоидных клетках крупного рогатого скота, используя питательную среду в течение 20-100 дней, предпочтительно осуществляя более 6-12 пассажей при 37,5-38,5°C. Затем шизонты собирали и замораживали в присутствии подходящего криопротектора, предпочтительно глицерина, при температуре ниже -60°C.
Недостатком вышеуказанной вакцины является то, что она содержит только от 0,1 до 3 миллионов клеток по сравнению с вакциной по настоящему изобретению, в которой содержится 5 миллионов клеток. Другим отличием от вышеуказанной вакцины является то, что используемым криопротектором является глицерин при -60°C, тогда как криопротектором, используемым в настоящем изобретении, является диметилсульфоксид (DMSO) и материал замораживают в жидком азоте при -179°C. Кроме того, количество пассажей, при котором получали вакцину по настоящему изобретению, составляет 200, и она представляет собой клонированную культуру, развившуюся из одной клетки, в отличие от культуры, используемой при 6-12 пассажах в вакцине, указанной в патенте DE2914813.
В патенте EP2228 A описан терапевтический препарат для лечения клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец, где препарат содержит 2-циклоалкил-3-гидрокси-1,4-нафтохинон. Недостаток состоит в том, что он представляет собой лекарственное средство, предназначенное для лечебных целей, а не вакцину для профилактики и контроля за заболеванием.
Ограничением вышеуказанных препаратов, следовательно, является то, что они подходят только для клинических случаев тейлериоза у крупного рогатого скота и овец и не имеют профилактического применения.
ОБЪЕКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации экзотического и гибридного крупного рогатого скота, а также телят данной местности против тропического тейлериоза жвачных животных, вызываемого Theileria annulata.
Другим объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая является безопасной для всех пород и для всех возрастов и стадий развития крупного рогатого скота, в частности экзотического и гибридного крупного рогатого скота, и может защищать их от тяжелой формы заражения клещами.
Еще одним объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая не имеет побочных реакций и может быть безопасно использована даже у телят в возрасте нескольких дней, а также у беременных животных и высокопродуктивного крупного рогатого скота без каких-либо побочных эффектов.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является вакцина против тейлериоза и способ ее получения для иммунизации крупного рогатого скота против тропического тейлериоза жвачных животных, которая является экономически выгодной, поскольку основана на природных ингредиентах.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ получения вакцины против тейлериоза, включающий в себя стадии выделения лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, присутствующими в инфицированном животном, культивирования инфицированных клеток в среде для роста, размножения указанных культивированных клеток путем серийных пассажей in vitro, выращивания клонированных культур из одной клетки методом предельных разведений и их дополнительного пассирования, кариотипирования этих клеток в среде для установления их диплоидности, и получения жизнеспособных клеток с максимальной инфицирующей способностью, определения числа ядер шизонта, замораживания некоторого количества жизнеспособных диплоидных клеток в жидком азоте в присутствии криопротектора в указанной среде для роста с получением суспензии жизнеспособных клеток, тестирования различных пассажей этих культур и различных уровней доз для установления их патогенности/антигенности в группах телят, определения уровня пассажа и дозы для безопасной и эффективной кандидатной вакцины, ее безопасного использования у новорожденных телят и беременных коров, времени, необходимого для индукции иммунитета, серологических реакций и воздействия на гематологические параметры, и тестирования ее эффективности в широких полевых условиях у восприимчивого поголовья скота.
Кроме того, в соответствии с этим изобретением также предлагается вакцина против тейлериоза, содержащая шизонт T. annulata в криопротекторе и среде для роста.
Способ получения вакцины против тейлериоза включает в себя выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, из инфицированного животного, выращивание в среде для роста in vitro, замораживание и получение вакцины против тейлериоза, где указанное выращивание in vitro проводят два/три раза в неделю серийными пассажами до потери культурой патогенности, но сохранения ее антигенности, где указанная среда для роста содержит RPMI-1640, дополненную 10-20% по объему бычьей сывороткой, выбранной из эмбриональной бычьей сыворотки, сыворотки новорожденного теленка и нормальной бычьей сыворотки; раствор антибиотика, содержащий бензилпенициллин натрия 100 МЕ на мл, стрептомицина сульфат 100 мкг на мл, микостатин 10 МЕ на мл, и 200 мM/мл L-глутамина, а указанное замораживание осуществляют с использованием криопротектора, выбранного из диметилсульфоксида (DMSO) или глицерина, и указанную вакцину против тейлериоза готовят путем доведения концентрации клеток до 5·106 жизнеспособных клеток на мл в указанной среде для роста, содержащей 10% DMSO, помещая аликвоты клеточной суспензии в предварительно помеченные стерильные криопробирки объемом один мл, и переноса этих пробирок в газовую фазу жидкого азота.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении вакцина против тейлериоза была получена способом, включающим следующие стадии:
(a) Приготовление супернатанта, полученного из измельченных клещей (GUTS), зараженных Theileria annulata
Инфицированные взрослые особи клещей Hyelomma предварительно выкармливались на теленке в течение 72 часов и их собирали в стерильные стеклянные пробирки. Клещей тщательно промывали водой и 1% раствором цетавлона, а затем физиологическим раствором и RPMI-1640, и клещей замораживали в течение 5-10 минут. Известное количество клещей тонко измельчают пестиком в пастообразную массу в стерильной ступке путем добавления морского песка или стеклянного волокна. Достаточное количество среды RPMI-1640 дополняют 3,6% бычьим сывороточным альбумином в виде порошка и добавляют антибиотики. Пастообразную массу собирают в стерильную культуральную пробирку. Хорошо перемешивают и центрифугируют при 4°C при 250g. Надосадочную жидкость, в дальнейшем называемую супернатантом, полученным из измельченных клещей (GUTS), содержащую спорозоиды T. annulata берут в аликвотном количестве в зависимости от количества инфицированных клещей, взятых в качестве инфицирующей дозы. GUTS используют для инициализации инфекционного процесса или для проверки иммунности вакцинированных животных либо в свежем виде, либо сохраненными в жидком азоте, добавляя глицерин/диметилсульфоксид (DMSO) в качестве криопротектора до использования в качестве консервированной культуры.
(b) Получение инфицирующих культур Theileria annulata
Восприимчивых животных подвергали инфицированию тропическим тейлериозом жвачных животных с использованием инфицирующих GUTS/консервированных культур. Кровь и материал биопсии лимфатических узлов собирали в тот момент, когда у телят появлялись клинические признаки заболевания. В асептических условиях лейкоциты отделяли от крови и культивировали в среде для роста, описанной ниже. Клетки, полученные из лимфатического узла, дважды промывали средой RPMI-1640 и культивировали в среде для роста. Как только клетки, инфицированные Т. annulata, начали расти во флаконах для тканевых культур, их инфицирующую способность оценивали, как описано ниже. Как только клетки, инфицированные Т. annulata, становятся конфлюэнтными, их пересаживают в другой флакон для тканевых культур, как описано ниже.
(c) Размножение in vitro
Длительное культивирование T. annulata in vitro осуществляют с помощью серийных пассажей с различными интервалами до достижения стадии, на которой культура теряет свою патогенность и сохраняет свою иммуногенность на желаемом уровне. Культуры пересаживают либо два, либо три раза в неделю и как стабильные культуры, где среду меняют в том же флаконе два раза в неделю. В культурах, пересаживаемых два раза в неделю, и в стабильных культурах 9 мл свежей среды для роста добавляют к 1 мл старой культуры, таким образом, поддерживая плотность посева 1·105 клеток на мл. В культурах, пересаживаемых три раза в неделю, 8 мл свежей среды для роста добавляют к 2 мл старой культуры с плотностью посева 2·105 клеток на мл. Культуры, пересаживаемые два и три раза в неделю, размножают вплоть до 100 пассажей и их замораживают в различных пассажах, таким образом, чтобы заморозить маточный раствор на всех уровнях. В дальнейшем клонированные культуры выращивали и пересаживали до 200 раз и замораживали в различных пассажах. Стабильные культуры поддерживали до одного года и культуры замораживали в различные промежутки времени 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и один год. Криопротектор, используемый для этих культур, представляет собой диметилсульфоксид (DMSO).
(d) Клонирование клеток
Проверяли эффективность культивирования этих культур и клонировали популяции клеток, инфицированных шизонтами T. annulata в виде суспензионных культур, развившихся из одной клетки, используя метод предельных разведений, в котором культуру в определенном пассаже разводят таким образом, что получается клеточная популяция 1·103 клеток на мл. Для этой цели использовали культуры, уже перенесшие до 90-100 пассажей в режиме либо два раза в неделю, либо три раза в неделю. Разведенные таким образом культуры затем помещают в «cupark» планшеты, а затем наблюдают под микроскопом. Те лунки, которые содержали единичные клетки, метили, а другие оставляли, как есть. Лунки, содержащие единичные клетки, ежедневно подвергали мониторингу и выращивали клонированную клеточную популяцию. Эти единичные клетки, таким образом, оставляли для размножения и дальнейшего роста. Когда через несколько дней образовывалась масса клеток, клетки вместе со средой переносили в большую по размеру лунку планшета costar, добавляли среду и клетки оставляли для дальнейшего роста. При увеличении их количества затем клетки переносили во флакон объемом 25 см3 и подвергали дальнейшему мониторингу с ежедневным добавлением свежей среды. Когда такие культуры вырастают до полной популяции, их затем пересаживают в новый флакон. В случае трансформации, их пересаживали во флаконы большего объема и подращивали, как описано здесь, и замораживали в жидком азоте при различных уровнях пассажей.
(e) Среда для роста
Используемая среда для роста представляет собой RPMI-1640, дополненную исходно эмбриональной сывороткой теленка, а затем ее заменяли сывороткой новорожденного теленка или нормальной бычьей сывороткой, взятой в количестве 10-20% по объему. К этой среде добавляли антибиотики в форме бензилпенициллина натрия 100 МЕ на мл, сульфата стрептомицина 100 мкг на мл и микостатина 10 МЕ на мл. Помимо этого также добавляют 200 мM L-глутамина. Все компоненты предварительно стерилизуют фильтрацией и освобождают от любого загрязнения микроорганизмами стандартным способом.
(f) Подращивание культур
Замороженную посевную культуру размораживают непосредственно до 37°C из жидкого азота, промывают путем ресуспендирования в 10 мл среды для роста и центрифугируют при 400g в течение 10 минут. Супернатант отбрасывают. Осадок, содержащий клетки, ресуспендируют в 10 мл среды для роста, засеянной в 25 см2 флаконах для тканевых культур, и инкубируют в термостате при 37°C. Культура достигает фазы экспоненциального роста через 24 часа. После подсчета количества клеток культуру высевают во флаконы для тканевых культур объемом 80 или 250 см2 с плотностью 2·105 клеток на мл в 25 или 100 мл среды для роста соответственно, и инкубируют при 37°C. Через 48 часов в каждый флакон добавляют равное количество среды для роста. На следующий день флаконы проверяют на рост шизонтов T. annulatа. Две аликвоты по 100 мкл из каждого флакона берут для подсчета жизнеспособных и нежизнеспособных клеток и инфицирующей способности. Инфицирующая способность в культурах составила более 99 процентов. Регистрировали митотические индексы и подсчитывали число ядер макрошизонтов. Кариотипирование показало, что клетки в культурах сохраняют свой диплоидный характер.
Оценка инфицирующей способности
Инфицирование мононуклеарных клеток шизонтами T. annulatа во флаконах оценивали, получая клеточный мазок с помощью центрифугирования, из 100 мкл культуры. Клеточный мазок сразу же сушили на воздухе, фиксировали метанолом, окрашивали по Гимза и изучали под иммерсионным микроскопом. Более 99% клеток в своей цитоплазме имели шизонты T. annulatа.
Оценка жизнеспособности
Количество жизнеспособных клеток в каждом флаконе оценивали стандартным методом исключения с помощью 0,1-процентного трипанового синего, и подсчитывали в гемоцитометре. При доступности могут быть использованы другие современные автоматические и полуавтоматические методы, такие как с использованием счетчика Coulter Counter и т.п. Оценка жизнеспособности показала более высокую жизнеспособность на 2-3 день.
(g) Получение вакцинных доз
Клетки из всех флаконов объединяют и их клеточную концентрацию доводят до 10·106 жизнеспособных клеток на мл. Общий объем измеряют и смешивают с равным количеством среды для роста, содержащей 20% диметилсульфоксида (DMSO) до получения конечной концентрации клеток 5·106 жизнеспособных клеток на мл в среде для роста, содержащей 10% DMSO. Клеточную суспензию разливают аликвотами в предварительно меченые стерильные криопробирки, объемом один мл, и сразу же переносят в контейнер, содержащий газовую фазу жидкого азота. Флаконы можно переносить в контейнер с жидкой фазой жидкого азота на следующее утро для длительного хранения до использования.
ИССЛЕДОВАНИЕ КУЛЬТУР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ
(a) Тестирование культур на патогенность/антигенность
Различные клеточные линии, инфицированные шизонтами T. annulata, полученными различными путями размножения, тестировали в различных пассажах, т.е. 10, 20, 60, 100, 160 и 200 с различными уровнями доз, вводимыми подкожно в виде единичной инъекции для установления их патогенности и/или защитной эффективности в группах восприимчивых телят, которых содержали в контролируемых условиях без клещей в экспериментальных помещениях для животных. Телят инфицировали клеточными культурами после быстрого оттаивания при 37°C из жидкого азота, а контрольным телятам вводили плацебо. Затем всех телят заражали инфицирующими супернатантами, полученными из измельченных клещей (GUTS) или консервированными культурами, чтобы получить кандидатную линию клеточной культуры в соответствующем пассаже и при соответствующем уровне дозы, неспособную вызвать заболевание, но способную вызвать иммунитет у скота, подверженного этому заболеванию. Используя несколько испытаний на животных, включающих в себя группы телят, надлежащий уровень пассажа культур, титрование дозы клеток для иммунизации, путь заражения и время, необходимое для развития иммунитета и т.п., устанавливали в тех случаях, когда вакцина давала желаемый уровень защиты от заражения летальными дозами клещевого материала. Таким образом, была разработана кандитатная клеточная культуральная вакцина из клонированной культуры в 200 пассаже, которая не вызывала какого-либо заболевания у животных, которым вводили вакцину, но защищала их от тропического тейлериоза при заражении GUTS или консервированной культурой. Эту группу сравнивали с животными, которым вводили плацебо, у которых было показано тяжелое клиническое заболевание при заражении GUTS или консервированной культурой. Таким образом, было установлено, что клонированная культура в 200 пассаже, содержащая 5·106 клеток в качестве дозы, взятой в виде единичной инъекции, введенной подкожно, была безопасной и иммуногенной в качестве вакцины.
(b) Кандидатная вакцина
Клонированную культуру в 200 пассаже использовали в объеме 1,0 мл, содержащем 5·106 клеток в качестве кандидатной вакцины, вводимой подкожно в виде единичной дозы.
(c) Опыты по иммунизации
Все вакцинированные животные оставались клинически здоровыми после инъекции вакцины. Не было клинических симптомов у животных, вакцинированных клеточными культурами шизонтов при уровне дозы 5·106 клеток на мл, при подкожном введении в 200 пассаже. Гематологические показатели были в пределах нормы у всех вакцинированных животных. В сыворотке этих животных была показана выработка антител против этого организма. Даже после очень мощного заражения GUTS или консервированной культурой, вызывающими клиническое заболевание у животных, которым вводили плацебо, у животных, которым вводили клеточные культуры шизонтов в 200 пассаже, не вызывало симптома заболевания или какого-либо изменения в гематологических показателях. Немногочисленные шизонты и пироплазмы можно увидеть у небольшого процента животных после вакцинации. Эта чрезвычайно низкая паразитемия может указывать на установление клеточно-опосредованного иммунного ответа у вакцинированных животных. Титры антител определяли серологически уже на первой неделе после вакцинации и пик титров антител наблюдали через четыре недели после вакцинации. Защитный иммунитет индуцировался в течение 15 дней после вакцинации. Вакцина успешно применялась даже у новорожденных телят и беременных коров, которые наиболее подвержены этому заболеванию, и оказалась безопасной и обладающей защитными свойствами.
(d) Тестирование вакцины Индийским советом по научным исследованиям в области сельского хозяйства
Полученная таким образом клеточная культуральная вакцина также была протестирована в слепом испытании, проводимом Координационной группой Индийского совета по научным исследованиям в области сельского хозяйства (ICAR) Всеиндийского координированного научно-исследовательского проекта (AICRP) по одноклеточным организмам, паразитирующим в крови. Это независимое агентство также сообщило о том, что эта вакцина была безопасной для восприимчивых животных и индуцировала защитный иммунитет против тропического тейлериоза жвачных животных.
ПРИМЕР
В этот эксперимент были включены двенадцать молодых гибридных бычков в возрасте примерно от 2 до 4 месяцев, выращенных в защищенных от клещей условиях. В слепом испытании 6 из них инъекционно вводили клеточную культуральную вакцину шизонтов Theileria, разработанную HAU центром. Один мл этой вакцины вводили подкожно на левой стороне шеи 30.10.90, а остальные 6 особей оставляли в качестве контроля. Все 10 выживших телят (другие два теленка из контрольной группы умерли от других причин) подвергали заражению 17.12.90 путем введения на правой стороне шеи T. annulata в виде суспензии инфицированных измельченных клещей. Вакцинирование и заражение проводили сотрудники H.A.U. Центра. Ответ организма-хозяина на вакцинацию и заражение контролировали с помощью Координатора проекта и его сотрудников в соответствии с протоколом, разработанным данным научно-исследовательским проектом.
НАБЛЮДЕНИЯ
Все 6 вакцинированных телят выжили. Вакцина не вызывала развития какой-либо клинической и паразитологической реакции, за исключением лихорадки в течение суток у 2 телят.
Ответы организма-хозяина на заражение
а) Иммунизированная группа: у одного теленка наблюдалась лихорадка в течение суток, и он умер на 12 день без видимой паразитемии. После смерти не было обнаружено типичных для тейлериоза повреждений. Следовательно, смерть этого теленка объясняется любой другой причиной, кроме тейлериоза. Оставшиеся 5 телят выжили.
b) Контрольная группа: для всех практических целей только 2 теленка приняли участие в этом эксперименте. Из них один теленок страдал тяжелым тейлериозом и умер от него на 15 день. Несколько перфорированных некротических язв, типичных для тейлериоза, было видно на слизистой оболочке сычуга после смерти. Второй теленок страдал тейлериозом в легкой степени, но умер на 33 день от анемии. Геморрагические перфорированные некротические язвы на слизистой оболочке сычуга отсутствовали.
Оставшиеся 4 теленка контрольной группы умерли - 2 из них до заражения и 2 теленка на 2 и 9 день после заражения.
Подробности представлены в следующей таблице.
Таблица демонстрирует ответы организма-хозяина на заражение.
| Категория | Число телят | Продолжительность лихорадки (дни) | Максималь-ная парази-темия (%) | Максимальное содержание лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами в биопсийном материале (%) | Снижение Hb (%) | Снижение PCV (%) | Примечания |
| Иммунизированная группа | 6 | 1-2 | L1-2 | L1 | 20-25 | 16-30 | *Один умер на 12 день |
| Контрольная группа | 2 | 5 и 6 | 5 и 80 | 2 и 30 | 45 и 22 | 46 и 30 | Один умер на 15 день. Один умер на 33 день |
| * Смерть не обусловлена тейлериозом. Отсутствие паразитемии |
Заключение
Эта вакцина считается безопасной для иммунизации гибридных телят в возрасте от 2 до 4 месяцев, поскольку не вызывала клинического заболевания. Эта вакцина давала достаточную защиту для устойчивости к тяжелому заражению GUTS, эквивалентному 10 клещам.
(e) Объем исследований иммунизации
Полученную таким образом клеточную культуральную вакцину против тропического тейлериоза жвачных животных использовали в полевых условиях на организованных животноводческих фермах, а также в фермерских хозяйствах в различных частях Харияны, Пенджаба, Мадхья Прадеш и Махараштры. Крупный рогатый скот всех экзотических пород и их гибриды всех возрастных групп были включены в эти испытания. Вакцина оказалась безопасной и эффективной в полевых условиях, поскольку вакцинированные животные были защищены от тропического тейлериоза жвачных животных, тогда как в этих областях у невакцинированных животных наблюдались клинические случаи заболевания. Было отмечено, что телята, родившиеся от племенных коров, вакцинированных на поздней стадии беременности, были подвержены этому заболеванию.
1. Способ получения вакцины против тейлериоза, включающий стадии выделения лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, присутствующими у инфицированного животного, культивирование зараженных клеток в среде для роста, размножения культивированных клеток in vitro методом серийных пассажей, замораживание диплоидных жизнеспособных клеток в жидком азоте в присутствии диметилсульфоксида в качестве криопротектора в указанной среде для роста для получения суспензии жизнеспособных клеток, тестирование исходных культур, а также культур с различными уровнями пассажей и в различных дозах в группах телят для определения их патогенности/антигенности, определение уровня пассажа и дозы для безопасной и эффективной кандидатной вакцины, ее безопасного использования у новорожденных телят и беременных коров, времени, необходимого для индукции иммунитета, серологических реакций и воздействия на гематологические параметры, и тестирование ее эффективности в широких полевых условиях у поголовья скота, подверженного этому заболеванию, отличающийся тем, что
выделение лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, осуществляют от животного, зараженного шизонтами Theileria annulata в виде супернатанта из измельченных клещей или в виде консервированной культуры,
культивирование зараженных клеток осуществляют в среде для роста, которая представляет собой RPMI 1640, дополненную сывороткой в количестве от 10 до 20%, выбранной из эмбриональной сыворотки теленка, сыворотки новорожденного теленка или нормальной бычьей сыворотки; раствором антибиотиков, содержащим бензилпенициллин натрия 100 ME на мл, сульфат стрептомицина 100 мкг на мл и микостатин 10 ME на мл; а также 200 мМ L-глутамином на мл, при этом все компоненты предварительно стерилизованы фильтрацией и очищены от любого загрязнения микроорганизмами стандартными методами;
размножение культивированных клеток in vitro осуществляют методом серийных пассажей, при этом осуществляют до 100 пассажей с периодичностью два или три раза в неделю, а плотность посева клеток поддерживают соответственно 1·105 или 2·105 клеток на мл, или методом предельных разведений их в «cupark» планшетах и выращивание клонированных культур из одной клетки пассированием культур до 200 раз в режиме два/три раза в неделю;
подращивание культуры до больших объемов для получения вакцины;
тестирование эффективности вакцины в широких полевых условиях осуществляют на коровах Bos Taurus, скрещенных с коровами Bos Indicusy, a также на новорожденных телятах, телятах возрастом до двух месяцев и беременных коровах.
2. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что пассирование культуры два раза в неделю состоит в добавлении 8-9 мл среды для роста к 1-2 мл старой культуры в новый флакон для получения общего объема приблизительно 10 мл, и пассирование культуры три раза в неделю состоит в добавлении 7-8 мл свежей среды для роста к 2-3 мл старой культуры в новом флаконе, а в случае стационарной культуры - добавлением 8-9 мл свежей среды к 1-2 мл старой культуры дважды в неделю в том же флаконе для сохранения общего объема приблизительно 10 мл в течение периода времени до одного года, с последующим пассированием в больший по объему флакон, подращиванием и криоконсервацией культур, пассируемых два/три раза в неделю, в различных пассажах и в различные интервалы времени в случае стационарных культур.
3. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что в качестве сыворотки, которой дополняют среду для роста RPMI 1640, исходно используют эмбриональную сыворотку теленка, которую впоследствии заменяют нормальной бычьей сывороткой или сывороткой новорожденного теленка.
4. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что концентрацию клеток в клеточной суспензии доводят до 9-11·106 жизнеспособных клеток на мл, определяют суммарный объем и смешивают с равным количеством среды для роста, содержащей 20% DMSO, чтобы получить конечную концентрацию клеток 4,5-5,5·106 жизнеспособных клеток на мл в среде для роста, содержащей 10% DMSO.
5. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что подращивание культуры осуществляют путем быстрого нагревания посевной культуры до 37°C из газовой фазы жидкого азота, промывания путем ресуспендирования в 9-10 мл среды для роста, центрифугирования при 400g в течение 10 мин, отбрасывания супернатанта, посева во флаконы для клеточных культур в приблизительно 10 мл среды для роста и инкубирования при 37°C, последовательно высевая во флаконы для клеточных культур объемом 80 или 250 см2 при 1,5-2·105 кл/мл в 25 или 100 мл среды для роста соответственно, и инкубирования при 37°C, и добавления через 48 ч равного количества среды для роста в каждый флакон.
6. Способ получения вакцины против тейлериоза по п.1, отличающийся тем, что на стадии размножения in vitro различные клеточные линии паразитирующих организмов, выращенные пассированием в режиме два или три раза в неделю, тестируют для различных уровней пассажей, т.е. 10-15, 20-25, 50-55 для исходных культур и 100-105, 150-155 и 200-205 для клонированных культур, с различными уровнями доз, и определяют, что клонированная культура в пассаже 200-205 с 4,5-5·106 клетками на мл в виде единичной дозы является безопасной и иммуногенной в качестве вакцины.
7. Способ выращивания клонированных культур из единичной клетки, инфицированной шизонтами Theileria annulata, включающий
отбор культур лимфоидных клеток, инфицированных шизонтами Theileria annulata, которые перенесли 90-100 пассажей;
получение клеточной популяции из 1·103 клеток на мл методом конечных разведений;
помещение полученной разведенной культуры в «cupark» планшеты;
мечение лунок «cupark» планшета, содержащих единичную клетку и выращивание клонированной клеточной популяции;
перенос растущей клонированной клеточной популяции вместе со средой для дальнейшего роста в большую по объему лунку «costar» планшета и добавление среды;
при увеличении клонированной клеточной популяции добавляют свежую среду и переносят во все большие и большие флаконы;
замораживание клонированной клеточной популяции при различных уровнях пассажей в контейнере с жидким азотом и использованием в качестве криопротектора 10%-ного раствора диметилсульфоксида.
8. Вакцина против тейлериоза, полученная способом по любому из пп.1-6, с концентрацией 4,5-5,5·106 жизнеспособных клеток на мл среды для роста.
