Средство, обладающее иммуностимулирующим действием
Владельцы патента RU 2406519:
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии наук (ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН) (RU)
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО СибГМУ) (RU)
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию средства, обладающего иммуностимулирующим действием, представляющего собой жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученный методом реперколяции 40% этанолом. Средство расширяет арсенал иммуностимулирующих средств, усиливает гуморальный иммунный ответ, фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную систему.
В настоящее время в комплексной терапии хронических, вялотекущих и рецидивирующих заболеваний применяют ряд препаратов, усиливающих иммунный ответ [6, 10]. К синтетическим иммуностимуляторам относится левамизол, метилурацил, лейкоген, ряд пептидных иммуностимуляторов (тимоген, иммунофан и др.) [5]. Однако использование препаратов, полученных методом химического синтеза, зачастую невозможно в силу их узконаправленного действия и массы побочных эффектов, в частности развития аллергических, аутоиммунных и лейкопролиферативных заболеваний. Из растительных препаратов, стимулирующих реакции иммунитета, наиболее известны препараты на основе эхинацеи пурпурной (иммунал, иммунорм, доктор Тайсс настойка эхинацеи) [7, 8, 12]. Препараты иммунал и иммунорм содержат сок, полученный из свежесобранной травы цветущей эхинацеи пурпурной, Доктор Тайсс - настойку листьев эхинацеи. Использование лекарственных растений представляется перспективным направлением дальнейшего развития, совершенствования методов иммунореабилитации, так как препараты природного происхождения не обладают токсическими свойствами, характерными для синтетических лекарственных средств, и не вызывают дисбаланса системы иммунитета [1, 2].
Целью изобретения является расширение арсенала иммуностимулирующих средств.
Поставленная цель достигается использованием в качестве иммуностимулирующего средства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола.
Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ X1, том 2, стр.160). Основными биологически активными веществами корней лопуха большого и войлочного являются полисахариды (инулин до 45%), фенилпропаноиды, жирные кислоты, соли калия, кальция и магния. В современной медицинской практике корни лопуха большого и войлочного используются в качестве противовоспалительного, обволакивающего и отхаркивающего средства [5].
Новым в предлагаемом изобретении является то, что жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, полученный с использованием сырья в соотношении 1:1, с помощью 40% этанола впервые предложен для использования в качестве иммуностимулирующего средства.
Использование жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола с использованием сырья в соотношении 1:1, в качестве иммуностимулирующего средства в литературе не описано. Применение по новому назначению стало возможно благодаря обнаружению у него новых свойств, а именно стимуляции гуморального иммунного ответа и неспецифической резистентности. Данное свойство явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. Жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного можно использовать у больных с хроническими, вялотекущими и рецидивирующими инфекционными заболеваниями, на фоне лучевой терапии и лечения цитостатиками.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленная применимость".
Новые свойства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного были обнаружены благодаря экспериментальным исследованиям.
Для установления иммуностимулирующих свойств жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола было изучено его влияние на гуморальный иммунный ответ, а также на неспецифическую резистентность организма. Жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного получали методом реперколяции с помощью 40% этанола в соотношении используемого сырья 1:1. Для получения экстракта: 0,450 кг воздушно-сухого сырья корней лопуха измельчают на измельчителе типа траворезки до частиц размером 3-4 мм. Затем измельченное сырье при помощи сита со стороной отверстия 0,25 мм освобождают от пыли (частиц менее 0,25 мм) и получают 0,400 кг готового сырья. Экстракцию ведут методом реперколяции в 4 перколяторах. Для этого 0,100 кг измельченного и освобожденного от пыли сырья помещают в перколятор 1 и заливают 500 мл 40% этанола до образования "зеркала" и оставляют на 12 ч при температуре 18-20°С. После 12 часов настаивания из перколятора 1 сливают 500 мл извлечения и заливают им 0,100 кг готового сырья в перколяторе 2 до образования "зеркала" с одновременной подачей в перколятор 1 аликвотного количества свежего экстрагента. После 12 часов настаивания из перколяторов 1 и 2 сливают последовательно по 500 мл извлечения. При этом перколятор 1 пополняется свежим экстрагентом, а перколятор 2 - извлечением из перколятора 1, перколятор 3 - извлечением из перколятора 2. Таким образом, повторяют операцию до четвертого перколятора через каждые 12 ч. После 12 часов настаивания осуществляют последовательную передвижку извлечений в объеме 500 мл от перколятора 1 к перколятору 4, из перколятора 4 сливают в отдельную склянку 100 мл извлечения - готового продукта стадии экстракции сырья, а из перколятора 1 сливают остатки извлечения (побочный продукт) в отдельную емкость, после чего оставшийся в сырье этанол вымывают двукратным количеством воды (рекуперат). Перколятор 1 освобождают от отработанного сырья. Далее в таком же порядке через каждые 12 часов производят передвижку извлечений, исключая из работы сырье из перколятора 2, 3, и производят слив готового продукта (жидкого экстракта) из перколятора 4. В остановочном периоде из последнего перколятора (4) через 12 часов сливают 100 мл извлечения и объединяют с извлечениями, полученными в рабочий период, и получают 400 мл жидкого экстракта, который отстаивают при температуре 3-5°С в течение 3-4 суток и фильтруют через 3 слоя бязи. Перед введением экстракт подвергают деалкоголизации путем выдерживания в термостате при температуре 37°С в течение 30 минут.
Стандартизацию экстракта проводили по сухому остатку (ГФ XI, том 2, стр.160). В качестве препарата сравнения использовали настойку эхинацеи пурпурной («ГаленоФарм», г.Санкт-Петербург, разрешена к применению на территории России, рег. №000167.01-2000).
Эксперименты по изучению влияния экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, на гуморальный иммунный ответ были проведены на 60 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 20 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 20 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 20 мышей получали деалкоголизированный ЭЛ, который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. При изучении гуморального иммунного ответа мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) - 6×108/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл) в конце 5-дневного курса введения ЭЛ, ЭП или дистиллированной воды [9]. На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общепринятыми методами [4] общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×106) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей по методу Cunningham [11] и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови с помощью стандартной реакции гемагглютинации (РГА) [3].
Эксперименты по изучению влияния экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, на неспецифическую резистентность организма были проведены на 30 мышах-самцах линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Животные были разделены на 3 группы: 10 мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); 10 мышей получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 1) - прототип; 10 мышей получали деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (опыт 2) - предлагаемое средство. Оценку неспецифической резистентности проводили путем изучения фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови и перитонеальных макрофагов в тесте поглощения частиц латекса [4].
Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета статистических программ Statistica for Windows (версия 5.0) с предварительной оценкой нормальности распределения и использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты, подтверждающие иммуностимулирующие свойства жидкого экстракта корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола.
Пример 1. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Затем мышей всех групп иммунизировали эритроцитами барана - 6×108/мышь (однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл). На 4-е и 7-е сутки после иммунизации определяли общую клеточность селезенки (ОКС), а также относительное (%) и абсолютное (×106) количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей и титр антител IgM и IgG в сыворотке крови. Курсовое введение настойки эхинацеи пурпурной приводило к достоверному увеличению относительного количества антителообразующих клеток на 4-е и 7-е сут после иммунизации и абсолютного числа антителопродуцентов на 4-е сут эксперимента по сравнению с контролем (табл.1). Кроме того, отмечалось повышение титра иммуноглобулинов класса G на 4-е сут. Анализ результатов, представленных в таблице 1, показывает, что курсовое 5-дневное введение экстракта корней лопуха большого и войлочного приводило к увеличению общей клеточности лимфоидного органа, относительного и абсолютного числа антителообразующих клеток и титра IgM относительно животных контрольной и 1-й опытной групп во все сроки исследования.
| Таблица 1 | |||
| Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на гуморальный иммунный ответ мышей линии СВА/Са Lac, (X±m) | |||
| Группа мышей | Показатели | Сроки исследования | |
| 4 сут | 7 сут | ||
| Контроль (ЭБ) | ОКС, 106/орган | 159,20±16,50 | 149,8±7,71 |
| АОК, % | 7,36±0,10 | 7±0,21 | |
| АОК, 106/орган | 11,72±1,23 | 10,47±0,57 | |
| IgM, log2T | 2±0,32 | 2,2±0,32 | |
| IgG, log2T | 8,4±0,75 | 7,30±0,50 | |
| Опыт 1 (ЭП+ЭБ) | ОКС, 106/орган | 190,00±22,67 | 163,00±10,85 |
| АОК, % | 11,44±0,49* | 5,64±0,19* | |
| АОК, 106/орган | 21,89±3,20* | 9,22±0,77 | |
| IgM, log2T | 2±0,32 | 1,2±0,49 | |
| IgG, log2T | 10,4±0,25* | 10±0,32 | |
| Опыт 2 (ЭЛ+ЭБ) | ОКС, 106/орган | 208,6±10,74* | 224,6±10,04*# |
| АОК, % | 14,76±0,67*# | 12,76±0,31*# | |
| АОК, 106/орган | 30,67±1,55*# | 28,76±1,91*# | |
| IgM, log2T | 4,8±0,26*# | 3,9±0,22*# | |
| IgG, log2T | 8,2±1,12 | 9,2±0,50 | |
| Примечания: здесь и в табл.2 | |||
| * - различия с соответствующими значениями контроля достоверны; | |||
| # - различия с соответствующими значениями группы «опыт 1» достоверны. |
Пример 2. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно (контроль); животные 1-ой опытной группы получали деалкоголизированную настойку эхинацеи пурпурной (ЭП), которую вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно; мыши 2-ой опытной группы получали деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ), который вводили животным в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. На 4 и 7 сут после окончания введения оценивали фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент нейтрофилов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ) и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ).
Приведенные в таблице 2 результаты опытов показывают, что экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, существенно стимулирует поглотительную активность нейтрофилов периферической крови (по сравнению с контрольной группой) как за счет повышения доли нейтрофилов, способных поглощать латекс (ФИ), так и за счет увеличения количества поглощенных каждой клеткой частиц (ФЧ) на 4 сут эксперимента.
| Таблица 2 | ||||
| Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови мышей линии СВА/Са Lac (X±m) | ||||
| Группа мышей | 4 сут | 7 сут | ||
| ФИ (%) | ФЧ | ФИ (%) | ФЧ | |
| Контроль | 22±1,22 | 2,06±0,23 | 17,25±1,80 | 3,79±0,62 |
| Опыт 1 (ЭП) | 32±3,91* | 4,72±0,45* | 23,8±2,13 | 4,52±0,23 |
| Опыт 2 (ЭЛ) | 28,5±3,12* | 6,64±0,08*# | 21,6±0,98 | 4,93±0,31 |
Пример 3. Контрольным мышам вводили в течение 5 дней по 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 1-й опытной группы вводили деалкоголизированную настойку эхинацеи пурупурной (ЭП) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. Мышам 2-й опытной группы вводили деалкоголизированный экстракт корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) в течение 5 дней в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл дистиллированной воды внутрижелудочно. На 4 и 7 сут после окончания введения оценивали фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей всех групп по способности этих клеток поглощать частицы латекса (концентрация взвеси частиц - 60 млн/мл); учитывали процент макрофагов, поглотивших частицы (фагоцитарный индекс - ФИ), и среднее число частиц, поглощенное одной клеткой (фагоцитарное число - ФЧ). Введение животным экстракта из корней лопуха большого и войлочного приводило к выраженному усилению фагоцитарной активности макрофагов по обоим исследуемым показателям во все сроки эксперимента как по сравнению с контрольной, так и 1-й опытной группой. При этом применение настойки эхинацеи вызывало повышение фагоцитарного индекса относительно контрольных мышей лишь на 4 сут.
| Таблица 3 | ||||
| Влияние экстракта корней лопуха большого и войлочного (ЭЛ) и настойки эхинацеи пурпурной (ЭП) на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей линии СВА/Са Lac (X±m) | ||||
| Группа мышей | 4 сут | 7 сут | ||
| ФИ (%) | ФЧ | ФИ (%) | ФЧ | |
| Контроль | 24,6±3,59 | 2,18±0,18 | 24,4±1,63 | 2,64±0,29 |
| Опыт 1 (ЭП) | 32,8±2,48 | 2,02±0,16 | 32±2,30* | 2,20±0,21 |
| Опыт 2 (ЭЛ) | 41,4±2,05*# | 3,44±0,07*# | 48,8±1,32*# | 3,82±0,20*# |
Таким образом, жидкий экстракт из корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, и полученного методом реперколяции с помощью 40% этанола, проявляет иммуностимулирующие свойства, что выражается в усилении гуморального иммунного ответа (повышение общей клеточности лимфоидного органа, количества антителообразующих клеток и титра специфических гемагглютининов) и фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови, сравнимые по выраженности с настойкой эхинацеи пурпурной. По степени стимуляции фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов жидкий экстракт из корней лопуха большого и войлочного существенно превышает настойку эхинацеи пурпурной.
Источники литературы
1. Амосова Е.Н., Зуева Е.П., Разина Т.Г., Крылова С.Г. Лекарственные растения как средства дополнительной терапии для лечения опухолей // Бюл. экспер. биол. - 2003. - Прил.2. - С.24-34.
2. Вершинина С.Ф., Потявина Е.В. Применение природных биорегуляторов в онкологии // Вопросы онкологии. - 2003. - Т.49. - №2. - С.145-151.
3. Иммунологические методы / Под ред. Г.Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - С.211-218.
4. Иммунология: Практикум / Е.У.Пастер, В.В.Овод, В.К.Позур, Н.Е.Вихоть. - К.: Выща шк. Изд-во при Киев. ун-те, 1989. - С.202-204.
5. Кьосев П. А. Полный справочник лекарственных растений. - М.: Изд-во Эксмо, 2003. - 922 с.
6. Лесков В.П. Иммуностимуляторы // Аллергия, астма и клиническая иммунология. - 1999. - №4. - С.12-25.
7. Линов Б.М., Барнаулов О.Д., Крылов В.А. и др. Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока. - Томск, 1986. - С.89-90.
8. Самородов В.Н., Поспелов С.В., Моисеева Г.Ф. и др. Фитохимический состав представителей рода эхинацея (Echinacea Moench.) и его фармакологические свойства (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №4. - С.32-37.
9. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В. и соавт.Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фарм. Комитета. - 1999. - №1. - С.31-36.
10. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения // Клиническая медицина. - 1996. - Т.74. - №8. - С.7-12.
11. Cunningham A. J. A method of increased sensitivity for detecting single antibodyforming cells // Nature. - 1965. - V.207, №5001. - P.1106-1107.
12. Percival S.S. Use of echinacea in medicine // Biochem. Pharmacol. - 2000. - Vol.60. - №2. - Р.155-158.
Средство, обладающее иммуностимулирующим действием, характеризующееся тем, что оно представляет собой жидкий экстракт корней лопуха большого и войлочного, взятых в соотношении 1:1, полученный методом реперколяции 40% этанолом.
