Композиции пептидного конъюгата и способы для профилактики и лечения болезни альцгеймера

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой фармацевтические композиции и способ для лечения заболеваний, ассоциированных с амилоидными отложениями Аβ в головном мозге пациента, таких как болезнь Альцгеймера. Способ включают введение иммуногенного фрагмента Aβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способного вызывать эффективный иммунный ответ в форме антител к Аβ. Фармацевтические композиции включают иммуногенный фрагмент, химически связанный с молекулой носителем, который может вводиться с адъювантом. Настоящее изобретение эффективно в качестве вакцины от болезни Альцгеймера. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для профилактики и лечения амилоидогенных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Болезнь Альцгеймера (БА (AD)) характеризуется прогрессирующим поражением памяти и когнитивными нарушениями. Ее отличительными патологическими изменениями являются отложения амилоида (сенильные бляшки), нейрофибриллярные клубки и потеря нейронов в специфических областях головного мозга. Отложения амилоида состоят из бета-пептидов амилоида (Аβ) из 40-43 остатков аминокислот, которые являются протеолитическими продуктами белка предшественника амилоида (АРР). Нейрофибриллярные клубки представляют собой внутриклеточные агрегаты волокон гиперфосфорилированных тау-белков (Selkoe, Science, 275: 630-631, 1997).

Патогенез БА до конца не ясен, но предполагают, что он представляет собой многофакторное явление. Считают, что накопление и агрегация Аβ играют основную роль в патологическом процессе, что также известно как гипотеза амилоидного каскада (Golde, Brain Pathol., 15: 84-87, 1995). В соответствии с этой гипотезой Аβ, особенно Аβ₄₂, склонен к образованию различных форм агрегатов, варьирующихся от небольших олигомеров до крупных, длинных структур профибрилл. Такие агрегаты являются нейротоксичными и отвечают за патологию синапсов, ассоциированную с потерей памяти и когнитивными нарушениями на ранних стадиях заболевания (Klein et al., Neurobiol. Aging, 25: 569-580, 2400). В недавней публикации предположили, что снижение Аβ в тройной трансгенной модели на мышах также предотвращает внутриклеточное отложение тау (Oddo et al., Proc.Neuron, 43: 321-332, 2004). Такое открытие предполагает, что внеклеточное отложение амилоида может быть причиной последующего образования нейрофибриллярных клубков, что может, в свою очередь, приводить к потере нейронов.

Иммунизация АРР-трансгенных мышей Аβ антигеном может уменьшать отложения Аβ в головном мозге и смягчать прогрессирование болезни. Это впервые было описано Shenk et al., Nature, 400: 173-177, 1999, и в настоящее время подтверждено большим количеством исследований, включающих различные трансгенные модели на животных, различные активные вакцины, а также пассивную иммунизацию Аβ-специфическими моноклональными антителами (Bard et al., Nature Med, 6: 916-919, 2000; Janus et al., Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 98: 8850-8855, 2001; Bacskai et al., J.Neurosci., 22: 7873-7878, 2002; Wilcock et al., J.Neurosci., 23: 3745-3751, 2003). Согласуясь с такими данными о животных, три опубликованных исследования посмертных тканей человеческого головного мозга от пациентов, которые ранее получили активную иммунизацию пре-агрегированным Аβ(1-42) иммуногеном (AN1792, Betabloc), показали локальное исчезновение сенильных бляшек (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004; Mesliah et al., Neurology, 64: 129-131, 2005). Эти данные в общем показывают, что вакцины, которые эффективно устраняют иммунный ответ на Аβ антигены, являются эффективными в отношении патологических сенильных бляшек, образующихся при БА. Однако механизм вакцины или иммунная эффективность остаются неясными.

Наиболее современной основанной на иммунотерапии программой для БА в общественном пользовании было исследование II Фазы вакцины по активной иммунизации с использованием AN1792 (Betabloc), вакцины, состоящей из заранее агрегированного Аβ (1-42), вводимого совместно с добавкой, QS-21^TM (Antigenics, New York, NY. В январе 2002 это исследование было завершено, когда у четырех пациентов появились симптомы, соответствующие менингоэнцефалиту (Senior, Lancet Neurol., 1:3, 2002). В конечном счете, у 18 из 298 получавших лечение пациентов развились признаки менингоэнцефалита (Orgogozo et al., Neurology, 61: 46-54, 2003). Не было обнаружено корреляции между энцефалитом и титром антител, и сообщили, что вероятным причинным механизмом этого эффекта была активация Т-клеток против ауто-иммуногена, особенно серединной и карбокси концевой части пептида Аβ₄₂ (Monsonego et al., J.Clin.Invest., 112: 415-422, 2003). В поддержку этого заключения, посмертное исследование ткани головного мозга от двух получавших вакцину, у которых развился энцефалит, выявило существенную менингеальную инфильтрацию CD4+ Т-клетками у одного пациента (Nicoll et al., Nature Med., 9:448-452, 2003) и CD4+, CD8+, CD3+, CD5+, CD7+ Т-клетками у другого (Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004).

Существующие доказательства предполагают, что увеличение уровня Аβ плазмы после пассивной или активной иммунизации отражает начало периферического падения как предшественника последующего снижения Аβ в головном мозге. Периферическое падение относится к изменению в равновесии запасов Аβ в головном мозге и плазме, приводящих к суммарному оттоку центрального Аβ на периферию (см., например, Deane et al., J.Neurosci., 25: 11495-11503, 2005; DeMattos et al., Pro.Natl.Acad.Sci.USA, 98:8931-8932, 2001). Другие исследования предполагают, что такое повышение Аβ плазмы, наблюдаемое после анти-Аβ иммунотерапии, является необходимым для развития последующего снижения центрального Аβ (Cribbs et al., 7^th International Conference on AD/PD, Sorrento, Italy, 2005). Следовательно, когда в Аβ замещены две аминокислоты (например, так как происходит при мутациях Dutch и Iowa), пептид больше неспособен проходить из центрального в периферический отделы (Davis et al., Neurobiol Aging, в печати, доступная on-line с 18 августа 2005). Когда иммунизировали мышей, экспрессирующих такую мутантную форму Аβ и мутацию Swedish, не обнаруживали повышения Аβ плазмы и не было отмечено последующего снижения Аβ в головном мозге. Наоборот, мыши, экспрессирующие последовательность человеческого Аβ дикого типа плюс мутацию Swedish, отвечали на активную иммунизацию и увеличением Аβ плазмы и последующим снижением центрального Аβ (Cribbs et al., 7^th International Conference on AD/PD, Sorrento, Italy, 2005). Cоответственно ожидают, что любой активный иммуноген вакцины, способный вызывать иммунный ответ, который приводит к повышению уровня Аβ плазмы, будет применимым для лечения болезни Альцгеймера и связанных заболеваний, характеризующихся повышением уровня Аβ в головном мозге.

Заявители неожиданно обнаружили, что антиген, из которого удаляют Т-клеточные эпитопы, чтобы избежать Т-клеточного ответа, является иммуногенным и повышает уровень Аβ плазмы. Это представляет собой потенциальное средство для получения безопасной и эффективной вакцины для БА. Заявители в настоящем изобретении предоставляют такой антиген и композицию для применения в качестве вакцины от БА.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном варианте осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, содержащую иммуногенный фрагмент Аβ, не имеющий Т-клеточного эпитопа, способный индуцировать иммунный ответ в форме антител к Аβ. В одном аспекте такая композиция включает линейные пептиды из 8 аминокислот (8-меры) Аβ. В еще одном аспекте такая композиция содержит поливалентные линейные 8-меры с вставленным по меньшей мере одним линкером или поливалентные разветвленные множественные антигенные пептиды (МАР). Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины от БА и связанных амилоидных заболеваний.

В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция представляет собой средство, повышающее Аβ плазмы, включающее иммуногенный фрагмент Аβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способный индуцировать иммунный ответ в форме антител к Аβ, который повышает уровень Аβ плазмы. Фармацевтическая композиция может быть использована в качестве вакцины против БА и связанных амилоидных заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем Аβ в головном мозге.

В еще одном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция связана с молекулой-носителем с образованием конъюгата, где носитель помогает выявить иммунный ответ, включающий антитела к фрагменту Аβ. В предпочтительном варианте осуществления изобретения носителем является белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitides (OMPC).

В следующем варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят с фармацевтически приемлемым адъювантом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения адъювантом является алюминиевый адъювант (адъювант квасцы Merck, MAA) или адъювант на основе сапонина (ISCOMATRIX®, CSL Ltd., Parkville, Australia).

В еще одном варианте осуществления изобретение предоставляет способы для профилактики или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента. Такие заболевания включают болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, когнитивные нарушения или другие формы сенильной деменции. Способ включает введение иммуногенного фрагмента Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, выбираемого из группы, состоящей из линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров), поливалентных линейных пептидов, соединенных с, по меньшей мере, одним линкером, и поливалентных разветвленных множественных антигенных пептидов (МАР). В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммунногенный фрагмент включает поливалентный линейный пептид с полиэтиленгликолевым (PEG) линкером. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенный фрагмент включает поливалентный разветвленный МАР, Аβ (3-10)/(21-28) конъюгат, Конструкт № 12, Фиг.6А, конъюгированный с ОМРС.

Такие способы предусматривают введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, пациентам, нуждающимся в таком лечении, что вызовет иммунный ответ в форме антител к Аβ. Указанный ответ антител способен повышать уровень Аβ плазмы. В другом аспекте настоящего варианта осуществления изобретения вводимый иммуногенный фрагмент связан с молекулой носителем. В еще одном аспекте настоящего изобретения иммуногенный фрагмент вводят с адъювантом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой синтетические пептиды из 8 аминокислот (8-меры) (SEQ ID №№ 2-36), полученные из Аβ (1-42) (SEQ ID № 1), из которых выбирали пептиды для проведения линейного пептидного сканирования для определения эпитопов Аβ.

Фиг.2 представляет собой 8-меры, выбранные для конъюгации с KLH (фиг.2А) и OMPC (Фиг.2В).

Фиг.3 представляет собой иммуногенность выбранных конъюгатов Аβ, описанных на фиг.2, после первой (PD1), второй (PD2) и третьей (PD3) дозы.

Фиг.4 представляет собой перекрестную реакцию сыворотки, полученной от морской свинки, ранее иммунизированной конъюгатом Аβ (3-10)-KLH (SEQ ID № 40) с тканью головного мозга человека при БА. На фиг.4А показана иммуногенность анти Аβ моноклонального антитела 6F3D (которое распознает аминокислоты 8-17 Аβ). Вид окрашивания выявляет выраженную амилоидную патологию в такой ткани головного мозга. На фиг.4В продемонстрировано отсутствие иммунной реакции того же головного мозга с до-иммунной сывороткой от иммунизированной морской свинки до иммунизации. На фиг.4С показана иммунная реакция сыворотки от иммунизированной морской свинки после иммунизации.

На фиг.5 показаны характерные поливалентные линейные 8-мерные пептиды, которые выбирают на основании иммуногенности отдельных 8-меров в исследованиях на морских свинках (Пример 3). Такие конъюгаты синтезировали, как описано, и конъюгировали с ОМРС (Пример 1.J. и 1.K).

На фиг.6 показаны характерные поливалентные разветвленные МАР конъюгаты, которые были выбраны на основании иммуногенности отдельных 8-меров в исследованиях на морских свинках (Пример 3). На фиг. 6А показаны характерные двухвалентные МАР, и на фиг. 6В показаны характерные бромацетилцистеиновые МАР. Такие конъюгаты синтезировали, как описано, и конъюгировали с ОМРС (Пример 2).

Фиг.7 представляет собой титр анти-Аβ₄₀ из сыворотки, полученной от резус-макак после 1 (PD1) или 2 (PD2) инъекций пептида Аβ(1-18), конъюгированного с ОМРС, рецептированного только в квасцах Merck или в квасцах Merck и IMX (ISCOMATRIX®, CSL, Ltd., Parkville, Australia) в качестве добавки.

Фиг.8 представляет собой увеличение уровня Аβ плазмы после введения конъюгата Аβ. На фиг.8А показано более чем трехкратное повышение после введения МАР конструкта, включающего Аβ(3-10)/(21-28) (Конструкт № 12, Фиг.6А), конъюгированный с ОМРС по сравнению с мономерными конструктами, Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69) и Аβ(21-28) (SEQ ID № 73) (□ Конструкт № 12, Фиг.6А; ● Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69), ▲ Аβ(21-28) (SEQ ID № 73). На фиг.8В показано, что уровень Аβ плазмы не зависит от уровня титра ((□ Конструкт № 12, Фиг.6А; ● Аβ(3-10) ((SEQ ID № 69), ▲ Аβ(21-28) (SEQ ID № 73).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин «8-мер» относится к пептиду из восьми аминокислот, который соответствует фрагменту Аβ, аналогу естественного пептида Аβ или пептидомиметику. Один или более 8-меров могут быть скомбинированы с, по меньшей мере, одним линкером для получения поливалентного линейного пептида или для получения поливалентного разветвленного МАР.

Термин «Аβ-конъюгат» обозначает 8-мер или иммуногенный фрагмент Аβ, который химически или биологически связан с носителем, таким как гемоцианин фиссуреллы или белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitidies (OMPC).

Термин «Аβ-пептид» обозначает любой из Аβ пептидов, описанных в настоящем описании, включая, но не ограничиваясь, линейные 8-меры, поливалентные линейные пептиды с, по меньшей мере, одним линкером, и поливалентные антигенные пептиды (МАР).

Термин «эпитоп» относится к участку на антигене, на который реагируют В- или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть образованы и из заменимых аминокислот и из незаменимых аминокислот, соединенных третичной структурой белка. Эпитопы, образованные из заменимых аминокислот, обычно сохраняются от воздействия денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные третичной структурой, обычно теряются при обработке денатурирующими растворителями. Т-клеточный эпитоп состоит из пептидов, которые способны образовывать комплексы с молекулами МНС организма-хозяина. Т-клеточные эпитопы для человеческих молекул МНС I класса, которые отвечают за индукцию CD8+ Т-клеточного ответа, обычно включают от 9 до 11 аминокислотных остатков, тогда как эпитопы для человеческих молекул МНС II класса, которые отвечают за CD4+ Т-клеточный ответ, обычно включают 12 или более аминокислотных остатков (Bjorkman et al., Nature 329: 506-512, 1987; Madden et al., Cell 75: 693-708; Batalia and Collins; Engelhard Annu Rev Immunol., 12: 181-207-622. 1995; Madden, Annu. Rev. Immunol., 13: 587-622. 1995). В отличие от Т-клеток, В-клетки способны распознавать пептиды, такие небольшие, как 4 аминокислоты в длину. Рецепторы Т-клеток распознают комплексы Т-клеточных эпитопов/МНС, приводя к активации Т-клеток.

Термин «иммуногенный фрагмент Аβ» или «иммуногенный фрагмент Аβ с отсутствием Т-клеточного ответа», как используется в настоящем описании, относится к 8-меру или фрагменту Аβ, который способен вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ, но такой ответ не включает Т-клеточного ответа на сам антиген, Аβ.

Термин «иммунологический», или «иммунный», или «иммуногенный» ответ относится к развитию гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованному антиген-специфичными Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против антигена у позвоночного. Такой ответ может быть активным ответом, индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом, индуцированным введением антитела.

Термин «поливалентный пептид» относится к пептидам, имеющим более чем одну антигенную детерминанту.

Термин «фармацевтическая композиция» обозначает химическую или биологическую композицию, подходящую для введения млекопитающему. Как используется в настоящем описании, он относится к композиции, включающей 8-меры, иммуногенные фрагменты Аβ и конъюгаты Аβ, описанные в настоящем описании для введения необязательно вместе с адъювантом или без него.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано ранее, доклинические исследования предполагают, что активная иммунизация, приводящая к ответу анти-Аβ поликлональных антител, обеспечивает эффективность против патологических и когнитивных симптомов, ассоциированных с БА, у трансгенных мышей, у которых чрезмерно экспрессируется белок предшественник амилоида (Bard et al., Nature Med., 6: 916-919, 2000; Janus et al., Nature, 408: 979-982, 2000; Morgan et al., Nature, 408: 982-985, 2000; DeMattos et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 98: 8850-8855, 2001; Bacskai et al., J.Neurosci., 22: 7873-7878, 2002; Wilcoc et al., J.Neurosci., 23: 3745-3751, 2003). Такие доклинические исследования поддерживаются единственным клиническим исследованием, где агрегированную форму Аβ₄₂ использовали в качестве активного иммуногена. Предварительные доказательства из этого исследования предполагают, что после лечения были обнаружены патологические (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14:11-20, 2004; Masliah et al., Neurology, 64: 129-131, 2005) и когнитивные улучшения (Gilman et al., Neurology 64 (9): 1553-1562, 2005). Тогда как такие открытия являются обнадеживающими и согласующимися с доклиническими исследованиями, лечение оказалось небезопасным и было прекращено после возникновения менингоэнцефалита у приблизительно 6% пациентов, получавших лечение (Orgogozo et al., Neurology, 61: 46-54, 2003). Следовательно, существует необходимость в методиках активной иммунизации, дающих эффективный иммунный ответ и лишенных нежелательных проблем с безопасностью.

В этом предварительном клиническом исследовании был осуществлен прогресс в понимании природы нежелательных явлений. В настоящее время несколько исследователей сообщают о присутствии CD4+ и CD8+ положительных менингеальных инфильтратов при посмертном исследовании (Nicoll et al., Nature Med., 9: 448-452, 2003; Ferrer et al., Brain Pathol., 14: 11-20, 2004), предполагающих Т-клеточный ответ, направленный на собственный пептид Аβ_42. Однако тогда как специалист в области техники понимает необходимость избегать самонаправленного Т-клеточного ответа при поддержании существенного ответа антител (опосредованного В-клетками), средства для получения агента, обладающего таким свойством, неизвестны. Подобная проблема осложняется отсутствием предсказуемых моделей на животных или других доклинических анализов с предсказуемой значимостью для таких действий.

С этой целью заявители в настоящем описании использовали отличающуюся природу эпитопов Т и В клеток для создания пептидов, применимых для изобретения. Были созданы конструкты вакцин вырезанием линейного пептида размером до восьми аминокислот и, если необходимо, удалением любого потенциального С-концевого якорного остатка Т-клеточного эпитопа.

Соответственно одним аспектом настоящего изобретения была идентификация фрагментов Аβ, которые являются иммуногенными, но не имеют Т-клеточного эпитопа, для применения в качестве вакцины от БА. До настоящей заявки не было точно известно, какие аминокислотные фрагменты пептида Аβ дадут иммуногенный ответ, которые также не будут иметь Т-клеточного эпитопа. Специалист в области техники понимает, что предыдущие указания в области техники не прогнозируют, например, что 8-мер даст иммунный ответ, и не различают применимость фрагментов из различных участков пептида Аβ. См., например, патенты США №№ 6808712 и 6787144.

Дополнительный аспект изобретения далее включает определение агентов, повышающих Аβ плазмы, включающих иммуногенный фрагмент Аβ, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, которые вызывают ответ в форме антител к Аβ и которые повышают уровень Аβ плазмы. Такие агенты могут быть использованы в качестве вакцины от БА и для связанных амилоидных заболеваний, характеризующихся повышенным уровнем Аβ в головном мозге. До создания данного изобретения не было известно или прогнозируемо, какие иммуногенные фрагменты Аβ будут приводить к повышенному уровню Аβ плазмы. Без связи с какой-либо теорией считают, что агенты, повышающие Аβ плазмы, описанные в настоящем описании, действуют, индуцируя иммунный ответ в форме антител к Аβ, которые, в соответствии с теорией периферического падения клиренса Аβ, дают повышенные уровни Аβ плазмы, что приводит к последующему снижению Аβ в головном мозге. Более того, тогда как отдельные 8-меры или иммуногенные фрагменты Аβ могут быть способны вызывать иммунный ответ, так что уровни Аβ плазмы повышаются, Заявители обнаружили, что поливалентный разветвленный МАР, Аβ(3-10)/(21-28) (Конструкт №12, Фиг.6А), конъюгированный с ОМРС, был особенно эффективным в повышении уровня Аβ плазмы относительно его составляющих мономерных конструктов, Аβ (3-10) (SEQ ID № 69) или Аβ (21-28) (SEQ ID № 73).

Амилоидные заболевания

Изобретение обеспечивает композиции и способы для профилактики и терапевтического лечения заболеваний, характеризующихся накоплением отложений амилоида. Отложения амилоида включают пептид, агрегированный до нерастворимой массы. Природа пептида варьируется при различных заболеваниях, но в большинстве случаев агрегат имеет β-складчатую структуру и окрашивается красителем Конго Красный. Заболевания, характеризующиеся отложениями амилоида, включают болезнь Альцгеймера (БА) с поздним и с ранним началом. При обоих заболеваниях отложения амилоида включают пептид, называемый амилоид бета (Аβ), который накапливается в головном мозге пораженного человека. Следовательно, термин «амилоидное заболевание» также относится к заболеванию, характеризующемуся повышенным уровнем Аβ в головном мозге.

Терапевтические агенты

Терапевтические агенты для применения в настоящем изобретении индуцируют иммунный ответ в форме антител к Аβ. Индукция иммунного ответа может быть активной, когда иммуноген вводят для индукции антител или Т-клеток, реагирующих с Аβ у пациента, или пассивной, когда вводят антитело, которое само связывается с Аβ у пациента.

Терапевтический агент для использования в предотвращении или лечении амилоидных заболеваний, таких как БА, включает пептидные фрагменты Аβ, которые могут быть любой из естественных форм (т.е. Аβ39, Аβ40, Аβ41, Аβ42 или Аβ43). Такие последовательности известны в области техники, см., например, Hardy et al., TINS 20: 155-158, 1997.

Как используется в настоящем описании, терапевтическим агентом является, в предпочтительном варианте осуществления, иммуногенный фрагмент с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способный вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ. Иммуногенный фрагмент Аβ может быть в форме 8-мера, поливалентного линейного конъюгата Аβ, имеющего по меньшей мере один PEG линкер или поливалентный разветвленный конъюгат Аβ МАР. Терапевтический агент можно вводить в форме фармацевтической композиции. В другом варианте осуществления изобретения терапевтическим агентом является агент, повышающий Аβ плазмы, способный вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ, и который повышает уровень Аβ плазмы у пациента. Такие агенты могут включать фрагмент естественного пептида или могут включать один или более заместителей, добавлений или делеций и могут включать синтетические или ненатуральные аминокислоты. Фрагменты и конструкты могут быть оценены в отношении профилактической и терапевтической эффективности в анализах, описанных в приведенных здесь примерах.

Тогда как в предпочтительном варианте осуществления изобретения терапевтические агенты включают пептидный фрагмент Аβ, такие агенты также могут включать пептиды и другие соединения, которые необязательно имеют значительное средство последовательности аминокислот с Аβ, но, тем не менее, могут служить миметиками Аβ и индуцировать сходный иммунный ответ. Например, пептиды и белки, образующие β-складчатые структуры, могут быть исследованы в отношении соответствия настоящему изобретению. Подобным образом, комбинаторные библиотеки и другие соединения могут быть исследованы в отношении соответствия настоящему изобретению.

Такие определенные терапевтические средства могут быть связаны или химически, или биологически с носителем для облегчения их применения в качестве иммуногена. Такие носители включают альбумины сыворотки, гемоцианин фиссуреллы (KLH), молекулы иммуноглобулина, овальбумин, белок столбнячного токсина или токсин от других патогенных бактерий, таких как дифтерия, E. сoli, холера или H.pylori или аттенуированное производное токсина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения носителем является белковый комплекс наружной мембраны Neisseria meningitides (OMPC).

Данное изобретение также предусматривает применение таких терапевтических средств в фармацевтической композиции, включающей 8-мер или иммуногенный фрагмент Аβ, которые могут быть связаны с носителем, для введения необязательно с адъювантом. Подходящие адъюванты включают соли алюминия (квасцы), липид, такой как 3 де-О-ацетилированный монофосфориллипид А (MPL), или адъювант на основе сапонина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения адъювантом является алюминиевый адъювант (Merck alum adjuvant, MAA) или адъювант на основе сапонина (ISCOMATRIX®, CSL Ltd., Parkville, Australia).

Схемы лечения

Эффективные дозы композиций по настоящему изобретению для профилактического или терапевтического лечения БА и других амилоидных заболеваний будут варьироваться в зависимости от множества факторов, включая, но не ограничиваясь, средства введения, целевое место, физиологическое состояние пациента, другие вводимые препараты и является ли лечение терапевтическим, т.е. после появления симптомов заболевания, или профилактическим, т.е. для предотвращения развития симптомов заболевания. В предпочтительном варианте осуществления изобретения пациентом является человек, и терапевтическое средство вводят инъекционно.

Количество используемого иммуногена или терапевтического агента также будет зависеть от того, вводится ли адъювант одновременно или последовательно, с использованием более высоких доз в отсутствие добавки.

Количество используемого иммуногена или терапевтического агента будет варьироваться, но количества, варьирующиеся от 0,5 до 50 мкг пептида (на основании содержания пептида Аβ) на инъекцию, рассматриваются для применения у человека. Специалист в области техники знает, как рецептировать композиции, включающие антигены типа, описанного в настоящем описании.

Схема введения будет состоять из первичной иммунизации с последующими бустерными (поддерживающими) инъекциями с установленными интервалами. Интервалы между первичной иммунизацией и повторной иммунизацией, интервалы между повторными инъекциями и количество повторных инъекций будет зависеть от титра и длительности существования антител, вызванных вакциной. Также это будет зависеть от функциональной эффективности ответа антител, а именно уровня титра антител, требуемого для предотвращения развития БА или проявления терапевтических эффектов у пациентов с БА. Обычная схема будет состоять из исходной серии инъекций через 1, 2 и 6 месяцев. Другая схема будет состоять из исходных инъекций через 1 и 2 месяца. Для каждой схемы повторные инъекции будут вводиться каждые шесть месяцев или ежегодно, в зависимости от титра и продолжительности существования антител. Схема введения также может быть основываясь на необходимости, что определяют по наблюдению за иммунным ответом у пациента.

Определение эпитопов вакцины от БА

С целью определения, какие фрагменты из 8 аминокислот («8-меры») пептида Аβ были достаточны для получения иммунного ответа, заявители систематически исследовали полную длину Аβ₄₂ с небольшими (8 аминокислот) перекрывающимися синтетическими пептидами, полученными из естественной последовательности Аβ (SEQ ID № 1), как показано на фиг.1 (SEQ ID №№ 2-37). Были синтезированы двадцать девять перекрывающихся пептидов из восьми аминокислот, охватывающие полную длину Аβ₄₂ (фиг.2А) для применения в качестве антигенов. Для улучшения растворимости несколько пептидов были модифицированы добавлением тройных остатков лизина (ККК) (SEQ ID №№ 52, 53, 54, 56, 59, 60, 62, 64 и 65) или глутамина (ЕЕЕ) (SEQ ID №№ 50, 51 и 61) или с применением полиэтиленгликолевого линкера (PEG) (SEQ ID №№ 55 и 63). По той причине пептиды, охватывающие последовательность Аβ, соответствующую остаткам (11-18) и (13-20), получали во множестве форм, первую с линкером 6-аминогексановой кислоты (Aha) плюс функциональная группа для химической сшивки на N-конце, и другую форму - с Aha и функциональной группой на С-конце. В качестве контроля заявители включали более длинный пептид, Аβ(1-18).

Как используется в настоящем описании, иммуногенными фрагментами могут быть 8-мерные пептиды (остатки восьми аминокислот), полученные из естественных источников, т.е. дикого типа, или синтетического Аβ (SEQ ID № 1), или их любые мутации или варианты. Такие мутации или варианты могут быть получены синтетическими или рекомбинантными средствами, известными обычному специалисту в области техники. Одним примером такого варианта является EV субстрат (EVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) (SEQ ID № 66), пептид, соответствующий Аβ (1-42), в котором положения 1 и 2 Аβ дикого типа были изменены.

Конъюгаты Аβ для применения в композициях вакцин

Выбор конъюгатов Аβ для применения в рецептировании вакцин был основан на иммуногенности 8-меров. С целью определения иммуногенности 8-мера у видов с последовательностью, идентичной последовательности человеческого Аβ, 29 пептидов (фиг.2А) были конъюгированы с KLH для получения конъюгата Аβ и протестированы у морских свинок (фиг.3). В качестве контрольного иммуногена в этот анализ включали Аβ (1-18)-KLH (SEQ ID № 37).

Морских свинок иммунизировали, как описано в примере 3В, конъюгированными иммуногенами, рецептированными в квасцах плюс 50 мкг ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). С целью отличия иммуногенного от неиммуногенного фрагмента Аβ₄₂ морских свинок иммунизировали три раза с интервалами в четыре недели. Через три недели после каждой иммунизации брали образцы крови и исследовали посредством ELISA в отношении титров антител к пептиду Аβ₄₀. Такие титры показаны на фиг.3 как после 1 введения (PD1), после 2 введения (PD2) и после третьего введения (PD3) соответственно.

После первой инъекции (PD1) некоторые участки пептидов давали существенные титры антител, как 18-мерный контроль. В частности, конъюгаты Аβ, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 и 33-40, все давали титры в избытке 1:800. После второй инъекции (PD2) 15 конъюгатов Аβ давали титры антител в избытке 1:1000. Анализ после 3 инъекции (PD3) дополнительно подтвердил, что определенные участки Аβ являются более иммуногенными относительно остальных. Одиннадцать участков продемонстрировали титры более чем 1:6000. Они включают участки, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 и 29-36. Из этих участков пять участков были высокоиммуногенными (>1:10000), включая: участки 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 и 29-36. Полученные данные предполагают, что определенные участки Аβ из 8 аминокислот являются высокоиммуногенными, тогда как другие участки (например, 5-12, 25-32, 31-38 и 35-42) являются неиммуногенными (титры <1:300). Результаты также демонстрируют, что тогда как конъюгаты Аβ способны вызывать ответ антител, специфических к пептиду Аβ₄₀, не все фрагменты Аβ являются в равной степени иммуногенными.

Иммуногенность конъюгатов Аβ пептида-KLH

С целью продемонстрировать, что иммунная сыворотка, полученная от морских свинок после иммунизации конъюгатами Аβ пептида-KLH подходит при человеческой БА, было проведено исследование для оценки иммунореактивности поликлональной сыворотки от морских свинок, иммунизированных конъюгатом Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40). Образцы сыворотки, полученные через четыре недели после второй инъекции конъюгата Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40) от морских свинок, исследовали в отношении реакции с тканями головного мозга при человеческой БА посредством иммуногистохимии (пример 4).

Как изображено на фиг.4, иммуногенный ответ, вызванный конъюгатом Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40), давал ответ антител, который был направлен против человеческой ткани головного мозга с БА. На фиг.4А продемонстрирована иммунореактивность моноклонального анти-Аβ антитела 6F3D (Vector Laboratories). Как показано, в таком головном мозге имеются избыточные отложения Аβ таким образом, который считается типичным для человеческой БА. На фиг.4В продемонстрировано отсутствие иммунной реакции сыворотки от заранее иммунизированных морских свинок. На фиг.4С показана положительная иммунная реакция сыворотки от той же морской свинки после двух инъекций конъюгата Аβ(3-10)-KLH (SEQ ID № 40). В целом, полученные данные демонстрируют, что иммуногенность, обнаруженная ELISA, включает существенный ответ антител, направленный против человеческого Аβ, обнаруженного в этой ткани с БА. Такие результаты подтверждают и расширяют неожиданное открытие различной иммуногенности, проявляемой определенными фрагментами Аβ, что далее демонстрирует, что такой ответ направлен образом, согласующимся с терапевтическим применением.

Получение конъюгатов ОМРС и множественных антигенных конъюгатов

На основании иммуногенности у морских свинок, относительного расположения пептидных фрагментов в аминокислотной последовательности Аβ₄₂, растворимости фрагментов Аβ и возможности использования ОМРС в качестве белка носителя Заявители выбрали семь 8-меров (фиг.2В) для конъюгирования с ОМРС. Такие пептидные фрагменты соответствовали следующим аминокислотным участкам Аβ: 1-8, 2-9, 3-10, 7-14, 17-24, 21-28 и 33-40.

Изобретение, описанное в настоящем описании, включает поливалентные пептидные конъюгаты, такие как показанные на фиг.5, 6А и 6В. Поливалентные, разветвленные МАР-ОМРС конъюгаты (фиг. 6А и 6В) получали с использованием лизиновой основы, тогда как поливалентные линейные конъюгаты 8-меров-ОМРС (фиг.5) получали с использованием PEG-линкера. Специалист в области техники понимает, что PEG-линкер, по сравнению с обычными аминокислотными линкерами, которые могут быть использованы в настоящем описании, дает преимущество более низкой иммуногенности и большей растворимости пептида. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенным фрагментом является поливалентный МАР, конъюгированный с ОМРС. Специалисту должно быть понятно в области техники, что такое конъюгирование не является соотношением пептида и носителя 1:1. Скорее, множество пептидов прикреплено сферическим образом к каждой молекуле ОМРС. Кроме того, специалист в области техники должен понимать, что применение поливалентных линейных конструктов с МАР усилит растворимость, стабильность состава, иммуногенность и разнообразие поликлонального ответа.

Иммуногенность вакцин конъюгата ОМРС

В попытке оценить иммуногенность конъюгата Аβ пептида-ОМРС и для дальнейшей оценки преимущества добавки с таким конструктом вакцины заявители начали исследование у макак-резус. Резус-макак вакцинировали конъюгатом Аβ(1-18)-ОМРС (дозировка на основании содержания пептида Аβ), который рецептировали или с квасцами Merck (MAA) в качестве адъюванта или MAA и ISCOMATRIX® (CSL., Ltd., Parkville, Australia). Образцы крови получали и использовали для определения титров антител против Аβ₄₀. Промежуточный анализ этого продолжающегося исследования продемонстрировал, что после 1 введения (PD1) у макак, получивших 5 мкг вакцины в квасцах, не развились какие-либо определяемые титры, тогда как у получивших 30 мкг вакцины в квасцах развились низкие специфические титры к Аβ₄₀. У всех макак, которые получили композицию квасцов плюс ISCOMATRIX®, развились значительные титры специфических антител. После 2 введения (PD2) обе дозы конъюгата Аβ только в квасцах давали сходные титры антител, тогда как в группе, получившей квасцы плюс ISCOMATRIX®, появились титры антител в 10 раз выше относительно группы только с квасцами. Результаты этого исследования подтверждают, что конъюгат Аβ-ОМРС является иммуногенным у нечеловекообразных приматов. Данные, кроме того, демонстрируют, что эффективность такой конъюгированной вакцины существенно увеличивается адъювантом на основании сапонина, такой как ISCOMATRIX®.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Получение конъюгатов Аβ

Этот пример описывает получение пептидных фрагментов Аβ, в последующем используемых для конъюгатов Аβ для индукции иммунного ответа в форме антител к Аβ.

А. Получение пептидов Аβ (8-меров) (SEQ ID №№ 37-65; фиг.2А)

Пептиды, предназначенные для конъюгации с белками-носителями, полученными их малеимида, синтезировали с цистеиновым остатком на карбокси-конце. Линкер, Aha (6-аминогексановая кислота) включали между первичной последовательностью пептида и карбоксиконцевым цистеином в качестве структурного элемента для минимизации стерической доступности в отношении белка-носителя во время конъюгации. Кроме того, растворяющие остатки, представленные ЕЕЕ, ККК или PEG, вводили на С-конец в последовательностях 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. PEG компонент вводили как О-(N-Fmoc-2-аминоэтил)-O'-(2-карбоксиэтил)ундекаэтиленгликоль [Fmoc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)₁₀CH₂CH₂OCH₂CH₂CO₂H].

Начиная с смолы Rink Amide MBHA, получали пептиды Аβ твердофазным синтезом на автоматическом пептидном синтезаторе с использованием протоколов химии Fmoc, поставляемых производителями (Applied Biosystems, Foster City, CA). После сборки пептид, связанный со смолой, депротектировали и отщепляли от смолы с использованием смеси 94,5% трифторуксусной кислоты, 2,5% 1,2-этандиола, 1% триизопропилсилана и 2,5% Н₂О. После двух часов обработки реакционную смесь фильтровали, концентрировали и полученное масло растирали с этиловым эфиром. Твердый продукт фильтровали, растворяли в 50% уксусной кислоте/Н₂О и лиофилизировали. Очистку получистого продукта достигали с помощью ОФ-ВЭЖХ с использованием градиента 0,1% ТФУ/Н₂О/ацетонитрила на С-18 подложке. Фракции оценивали аналитической ВЭЖХ. Чистые фракции (>98%) собирали и лиофилизировали. Соответствие подтверждали аминокислотным анализом и масс-спектральным анализом.

В. Получение конъюгатов Аβ пептида -KLH (SEQ ID №№ 37-65; фиг.2А)

Для получения конъюгатов KLH Аβ пептиды (8-меры), 2 мг, содержащие С-концевой цистеин, суспендировали в 1 мл коммерческого малеимидного буфера для конъюгации (83 мМ фосфата натрия, 0,1М ЭДТА, 0,9 М NaCl, 0,02% азида натрия, рН 7,2 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). 2 мг образца коммерческого малеимид-активированного KLH (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) добавляли к пептиду и позволяли реагировать при 25°С в течение четырех часов. Конъюгат отделяли от непрореагировавшего пептида и реагентов откачивающим диализом против PBS буфера с использованием диализной трубки 100000 Да. Количество пептида, включенное в конъюгат, оценивали аминокислотным анализом после 70 часов кислого гидролиза. Концентрации пептидов определяли как от 0,24 до 0,03 мг/мл.

С. Синтез бромоацетилированных Аβ пептидов (SEQ ID №№ 67-77; фиг.2В)

Бромацетилированные пептиды получали стандартным t-Boc твердофазным синтезом с использованием протокола двойного связывания для введения аминокислот на автоматическом синтезаторе Applied Biosystems модель 430А. Начиная с п-метилбензгидриламиновой смолы карбоксиконцевую аминокислоту t-Boc-Lys-(Fmoc)-OH вводили с последующими аминокислотами в последовательности. Вводили Aha, как линкер, ко всем таким последовательностям и PEG единицу в последовательности 35 и 37, чтобы помочь растворимости в воде. PEG единицу вводили как О-(N-Boc-2-аминоэтил)-О'-(N-дигликолил-2-аминоэтил)гексаэтиленгликоль [Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H]. Аминоконец закрывали связыванием уксусной кислоты. После сборки первичной последовательности Fmoc защитную группу на эпсилон-аминогруппе карбоксиконцевого лизина удаляли обработкой пиперидином. Впоследствии N^ε аминогруппа реагировала с бромуксусным ангидридом в метиленхлориде в качестве растворителя в течение 30 минут. Депротектирование и удаление пептида с подложки смолы достигали обработкой жидкой фтористоводородной кислотой и 10% анизолом в качестве акцептора. Пептиды очищали препаративной ВЭЖХ на С-18 колонках обратной фазы из диоксида кремния с использованием градиента 0,1% ТФУ/ацетонитрила. Соответствие и однородность пептидов подтверждали аналитической ВЭЖХ и масс-спектральным анализом.

D. Синтез бромацетилированного двухвалентного МАР, Конструкт № 8, фиг.6А.

Синтез бромацетилированных разветвленных множественных антигенных пептидов (МАР) является сходным с таковым, описанным в примере 1С. После связывания карбосиконцевого Fmoc-Lys(ivDde)-OH[ivDde=1,(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)-3-метилбутил] с смолой MHBA α-амино Fmoc защитную группу удаляли с использованием пиперидина и синтез продолжали с введением t-Boc-Lys(Fmoc)-OH. После депротектирования t-Boc группы последовательность удлиняли следующими t-Boc защищенными аминокислотами: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E и аминоконцом, закрытым связыванием уксусной кислоты, на ABI синтезаторе. Fmoc защищенную группу боковых цепей лизина удаляли пиперидином и N^ε группу лизина удлиняли на ABI синтезаторе с введением следующих защищенных аминокислот: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D и аминоконца, закрытого связыванием уксусной кислоты. Удаление ivDde защитной группы осуществляли обработкой 5% гидразином в диметилформамиде в течение 5 минут, обеспечивая разблокированную N^ε аминогруппу на карбоксиконцевом лизине, который затем обрабатывали бромуксусным ангидридом, как описано в примере 1С. Отщепление пептида от смолы, его последующая очистка и характеристика соответствуют описанным в примере 1С.

Е. Синтез бромацетилированных МАР, Конструкты №№ 11 и 12, фиг.6А

МАР конструкты 11 и 12 получали, как описано в Примере 1D.

F. Синтез цистеинового поливалентного МАР, Конструкт № 9, фиг.6А

Начиная с МВНА смолы следующие t-Boc защищенные аминокислоты собирали на автоматизированном синтезаторе ABI С, Lys(Fmoc), Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E с последующим связыванием с уксусной кислотой. N^ε амино Fmoc защитную группу лизина удаляли и синтез продолжали с введением следующих t-Boc защищенных аминокислот: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D с последующим связыванием с уксусной кислотой. Пептид, связанный со смолой, выделяли, очищали и характеризовали, как в Примере 1С. Обратите внимание: Вместо 10% анизола, как в примере 1С, в качестве уловителя во время HF отщепления использовали смесь 1:1 п-крезол:п-тиокрезол.

G. Синтез цистеиновых двухвалентных МАР, конструкты №№ 10, 13 и 14, фиг.6А

Двухвалентные МАР, Конструкты №№ 10, 13 и 14, фиг.6А получали, как описано в примере 6F. PEG единицу вводили как О-(N-Boc-2-аминоэтил)-O'-(N-дигликоль-2-аминоэтил)гексаэтиленгликоль (t-Boc-NHCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)CH₂CH₂NHCOCH₂OCH₂CO₂H).

H. Синтез бромацетилированного поливалентного МАР, Конструкт № 16, фиг.6В

С использованием автоматического синтезатора ABI Fmoc-Lys(t-Boc)-OH связывали с МВНА смолой. После удаления t-Boc защитной группы на N^ε аминогруппе лизина последовательность удлиняли введением следующих t-Boc защищенных аминокислот: Aha, Y, G, S, D, H, R, F, E с последующим связыванием уксусной кислоты. Nα F-moc защитную группу на лизине удаляли ручной обработкой пиперидином. Последовательность далее обрабатывали (на ABI синтезаторе) введением Fmoc-Lys(t-Boc)-OH с последующими t-Boc защищенными аминокислотами: Aha, H, H, V, E, Y, G, S, D и связыванием уксусной кислоты. Лизин Fmoc N^α аминозащитную группу удаляли, как описано ранее, и синтез продолжали с введением Fmoc-Lys(t-Boc)-OH с последующими t-Boc защищенными аминокислотами: Aha, K, N, S, G, V, D, E, A и связыванием уксусной кислоты. N^α Fmoc защитную группу на лизине удаляли и синтез продолжали с введением Fmoc-Lys(t-Boc)-OH с последующими t-Boc защищенными аминокислотами: Aha, V, V, G, G, V, M, L, G со связыванием уксусной кислоты. После удаления N^α Fmoc защитной группы лизина пептид, связанный со смолой, реагировал с бромуксусным ангидридом, как в Примере 1С. Выделение и характеристика конечного продукта были, как в примере 1С.

I. Синтез поливалентных МАР, Конструкты №№ 15 и 17, фиг.6В

Синтез МАР Аβ конъюгатов, конструкты №№ 15 и 17, фиг.6В осуществляли, как описано в примере 1F и 1Н.

J. Синтез бромацетилированного поливалентного линейного пептида, конструкт № 1, фиг.5

Начиная со смолы МВНА, первичную последовательность синтезировали с использованием химии t-Boc на автоматическом синтезаторе ABI, как описано в примере 6А. Промежуточные PEG единицы вручную вводили в виде Fmoc-1-амино-4,7,10-триокса-13-тридеканаминянтарной кислоты [Fmoc-NHCH₂CH₂CH₂O(CH₂CH₂O)CH₂CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂CO₂H] с использованием ВОР реагента в качестве связывающего агента. Пиперидин использовали для депротектирования Fmoc группы. Бромацетилирование аминоконца проводили, как описано в примере 1С. Выделение и характеристику желаемого продукта проводили, как в примере 1С.

К. Синтез поливалентных линейных Аβ пептидов, Конструкты №№ 2, 5, 6 и 7, фиг.5

Синтез поливалентных линейных Аβ пептидов, Конструкты №№ 2, 5, 6 и 7 проводили, как описано в Примере 1J.

ПРИМЕР 2

Химическая конъюгация Аβ пептидов с ОМРС

Этот пример представляет собой химическую конъюгацию пептидов, полученных из человеческого Аβ₄₂, с очищенным белковым комплексом наружной мембраны (ОМРС) Neisseria meningitides, тип В. Химической природой связывания является реакция между галоацетил-модифицированным пептидом и тиол-модифицированным белком мембранного комплекса. Амилоидные пептиды синтезировали, как описано выше, с бромацетильной функциональной группой на N-конце для двухвалентных линейных пептидов эпитопов, или на С-конце, или прикрепляли через эпсилон-аминогруппу остатка лизина для одновалентных линейных и разветвленных форм МАР. BrAc группу отделяли от зрелого пептида линкером, состоящим из 6-аминогексановой кислоты (Aha). Ссылка на последовательности, описанные выше. Конъюгация будет описана для характерного пептида, Аβ-(3-10). Все манипуляции с растворами, содержащими ОМРС, проводили в среде с ламинарным потоком с последующими стандартными асептическими методиками.

А. Тиолирование ОМРС

Очищенный, стерильный ОМРС, полученный способом, таким как описанный Fu, патент США № 5494808, используемый для продукции RedvaxHIB® и пневмококковой конъюгированной вакцины, тиолировали на части его поверхностно-доступных остатков лизина с использованием реагента N-ацетилгомоцистеинтиолактона (NAHT, Aldrich, St. Louis, MO), ОМРС в воде, 117 мг, осаждали центрифугированием при 289000 х g в течение 60 минут при 4°С и надосадочную жидкость сливали. N2-барботированный буфер для активации (0,11 М борат натрия, рН 11) добавляли в центрифужные пробирки и осадок удаляли стеклянной мешалкой. Суспензию переносили в стеклянный гомогенизатор Dounce и ресуспендировали с 30 движениями поршня. Центрифужную пробирку промывали и промывные воды обрабатывали в гомогенизаторе Даунса 30 движениями поршня. Ресуспендированный осадок и промывные воды комбинировали в чистом сосуде для получения концентрации ОМРС 10 мг/мл. Твердый DTT и ЭДТА растворяли в N₂-барботированном активирующем буфере и загружали в реакционный сосуд в соотношении 0,106 мг DTT/мг ОМРС и 0,57 мг ЭДТА/мг ОМРС. После аккуратного смешивания NAHT растворяли в N₂-барботированной воде и загружали к реакции в соотношении 0,89 мг NAHT/мг ОМРС. Реакция протекала в течение трех часов при комнатной температуре, защищенной от света в N₂-окружении. При завершении ОМРС осаждали, как описано выше, и ресуспендировали в 6 мг/мл посредством гомогенизации Dounce в N₂-барботированном буфере для конъюгации (25 мМ бората натрия, рН 8,5, 0,15 М NaCl) для промывки осадка. Для окончательного ресуспендирования ОМРС осаждали, как описано выше, и ресуспендировали при 10 мг/мл гомогенизацией Dounce в N₂-барботированном буфере для конъюгации. Аликвоту удаляли свободным тиоловым определением анализом Ellman и партию продукта хранили на льду в темноте до применения. Измеренное содержание тиола составляло от 0,2 до 0,3 мкмоль/мл.

В. Конъюгация Аβ пептида с ОМРС

Функциональное содержание BrAc пептида предполагали как 1:1 на молярной основе. Достаточное количество пептида взвешивали для получения 1,6 молярного избытка BrAc над общим тиолом. Целевой общий ОМРС белок для каждой конъюгации составлял 15 мг. Пептиды ресуспендировали в N₂-барботированном буфере для конъюгации при 2,6 мг/мл и медленно добавляли к тиолированному раствору ОМРС. Реакционную смесь защищали от света и инкубировали при комнатной температуре в течение около 22 часов. Остаточные свободные тиоловые группы ОМРС гасили 5-кратным молярным избытком N-этилмалеимида в течение 18 часов при комнатной температуре. Тиолированный контроль только ОМРС проводили через протокол конъюгации параллельно. После завершения гашения конъюгат и контроль переносили в отсекающие по 100000 Да по молекулярной массе диализаторы и диализировали полностью от по меньшей мере пяти смен буфера для конъюгации. После завершения диализа образцы переносили в 15 мл полипропиленовые центрифужные пробирки и центрифугировали при 2280 х g в течение пяти минут при 4°С для удаления какого-либо агрегированного вещества. Аликвоты удаляли для анализа и запас хранили при 4°С.

С. Анализ конъюгатов Аβ пептида-ОМРС

Общий белок определяли модифицированным анализом Lowry и образцы конъюгата и контроля анализировали количественным аминокислотным анализом (ААА). Молярные соотношения пептида к ОМРС определяли из количественной оценки уникальных остатков S-карбоксиметилцистеина, который высвобождался при кислом гидролизе образующейся связи пептид-ОМРС. ОМРС-специфическую концентрацию определяли по гидролиз-стабильным остаткам, которые отсутствовали в пептидной последовательности и, следовательно, были уникальны для ОМРС белка. Предполагая 1 моль пептида на каждый моль SCOMPC, соотношение SCOMPC/OMPC, следовательно, было эквивалентно содержанию пептид/ОМРС. Массовая нагрузка пептида может быть рассчитана из этого соотношения с использованием молекулярной массы пептида и средней массы ОМРС 40000000 Да.

Ковалентную природу конъюгации количественно подтверждали SDS-PAGE анализом с использованием 4-20% Трис-глицинового геля (Invitrogen, Carlsbad, CA), где наблюдали смещение подвижности вверх относительно контроля для полос конъюгата, окрашенного Coomassie.

Рассчитанные соотношения молярной нагрузки (моль пептида/моль ОМРС) для всех конъюгированных BrAc пептидов составили:

Пептид	ММ пептида	Пептид/ОМРС (моль/моль)
Аβ(3-10)-BrAc	1412	2793
Аb(7-14)-BrAc	1344	2283
Аb(21-28)-BrAc	1222	2126
Аb(17-24)-BrAc	1809	1795
Аb(33-40)-BrAc	1601	2139

A-D-MAP-BrAc	2498	2173
A-B-MAP-BrAc	2622	2147
BrAc-линейный-D-A	2649	2263
BrAc-линейный-B-A	2773	2178
Аb(1-8)-BrAc	1378	2759
F-D-MAP-BrAc	2463	1318
BrAc-линейный-D-F	2615	1812
F-G-A-D-MAP-BrAc	5111	636

ПРИМЕР 3

Иммуногенность Аβ конъюгатов

Этот пример описывает рецептирование и введение Аβ конъюгатов, способных вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ.

А. Рецептирование вакцинных конъюгатов

Вакцинные конъюгаты Аβ пептида-KLH рецептировали в ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). Все вакцинные конъюгаты Аβ пептид-ОМРС рецептировали в квасцах или с или без второго адъюванта, такого как адъювант на основе сапонина, ISCOMATRIX® (CSL, Ltd., Parkville, Australia). Все манипуляции с образцом проводили в стерильных условиях.

Для композиций квасцов, конъюгаты разводили один раз солевым раствором до обозначенной концентрации пептида и смешивали с двукратными квасцами (Merck, Product № 39943), которые соответствовали 900 мкг/мл квасцов Merck, полученным в стерильных условиях (150 мМ стерильного раствора хлорида натрия). Следовательно, целевая концентрация в вакцине составила 450 мкг/мл квасцов Merck или однократно квасцы Merck. Целевая концентрация пептида (антигена) для исследований на животных была следующая: для мышей - 12,1 мкг/мл (доза 0,1 мл); для обезьян - 10 мкг/мл или 60 мкг/мл (доза 0,5 мл) и для морских свинок - 12,5 мкг/мл (доза 0,4 мл). Смесь инкубировали в течение двух часов при комнатной температуре. Для получения дозы инъекции конъюгаты, абсорбированные на квасцах, разводили однократными квасцами для достижения целевой концентрации пептида. Когда необходима вторая добавка, т.е. ISCOMATRIX®, целевая концентрация была 10 мкг/мл для исследований у мышей, 0,100 или 200 мкг/мл для исследований у обезьян и 125 мкг/мл для морских свинок.

1. Получение ISCOMATRIX®

С использованием кассетной мембраны (Slide-A-Lyzer® Dialysis Cassett, 10K MWCO, Pierce, Rockfold, IL), ISCOMATRIX® диализировали в стерильный солевой раствор при 2-8°С. Стерильный солевой раствор меняли 2-3 раза в течение диализа. После завершения диализа ISCOMATRIX® фильтровали и стерилизовали с использованием шприцевого фильтра (0,22 мкМ Millex-GV шприцевой фильтр, Millipore, Billerica, MA). Концентрацию стерильного, диализированного ISCOMATRIX® определяли ОФ-ВЭЖХ. ISCOMATRIX® хранили стерильным при 2-8°С до использования.

2. Получение конъюгата Аβ пептида-ОМРС и квасцов Merck

Запас конъюгата Аβ пептида-ОМРС разводили в стерильном солевом растворе 1Х. Разведенные запасы конъюгата Аβ пептида-ОМРС затем добавляли к 2Х квасцам Merck в 1Х стерильном солевом растворе и смешивали в течение одного часа на вращающейся мешалке при комнатной температуре. Смеси позволяли оставаться на рабочем столе в течение 15 минут при комнатной температуре и затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение десяти минут. Надосадочную жидкость аккуратно сливали (Проводили УФ-анализ надосадочной жидкости для определения % связывания конъюгата Аβ пептида-ОМРС с квасцами) и осадок ресуспендировали в стерильном 1Х солевом растворе. Смесь разливали по аликвотам в стерильные 3 мл стеклянные пробирки и затем хранили при 2-8°С до окончательного рецептирования с ISCOMATRIX®.

3. Рецептирование вакцины Аβ пептида-ОМРС/квасцов и ISCOMATRIX®

Перед окончательным рецептированием с ISCOMATRIX® размер частиц Аβ пептида-ОМРС/квасцов в солевом растворе определяли статическим рассеянием света для подтверждения связывания и наблюдения за стабильностью частиц. Стерильный, диализированный ISCOMATRIX® в 1Х солевом растворе добавляли к Аβ пептиду-ОМРС/квасцам в стерильном 150 мМ NaCl при взбалтывании. Флаконы закупоривали, закрывали крышкой и закручивали до полной герметичности. Вакцину хранили при 2-8°С до введения. Перед инъекцией каждую вакцину встряхивали в течение 3-5 минут.

В. Иммуногенность конъюгатных вакцин у морских свинок

Самок морских свинок в возрасте от шести до десяти недель получали от Harlan Inc., Indianapolis, IA и держали в питомнике Merck research Laboratories в соответствии с руководствами института. Все эксперименты на животных были одобрены Merck Research Laboratories Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Антигены получали в фосфатном буферном растворе и рецептировали в обозначенном адъюванте.

Двух животных из группы иммунизировали конъюгатами Аβ пептида-KLH, показанными на фиг.2А, внутримышечно с 400 мкл конъюгатной вакцины (8 мкг по содержанию пептида или 50 мкг по общему конъюгату) в присутствии 40 мкг ISCOMATRIX®. Иммунизации проводили три раза с четырехнедельными интервалами. Образцы сыворотки получали после первой иммунизации (предварительные образцы крови) и через три недели после каждой иммунизации и хранили при 4°С до определения титра антител. Титры антител определяли ELISA в соответствии с протоколом, которому следовали с использованием Аβ в качестве целевого антигена.

Анализ на основании ELISA был следующий. Девяносто шести-луночные планшеты покрывали по 50 мкл на ячейку Аβ в концентрации 4 мкг/мл в 50 мМ бикарбонатном буфере, рН 9,6, при 4°С в течение ночи. Планшеты промывали фосфатным буферным раствором (PBS) и блокировали 3% снятым латексом в PBS, содержащем 0,05% Tween-20 (milk-PBST). Тестируемые образцы разводили в 4-кратных группах в PBST. 100 мкл разведенного образца добавляли к каждой ячейке и планшеты инкубировали при 24°С в течение двух часов и затем шесть раз промывали PBST. Пятьдесят мкл HRP-конъюгированных вторичных антител в разведении 1:5000 в milk-PBST добавляли в ячейку и планшеты инкубировали при 24°С в течение одного часа. Планшеты промывали три раза с 100 мкл 1 мг/мл дигидрохлорида о-фенилендиамина в 100 мМ цитрата натрия, рН 4,5, на ячейку. Через 30 минут инкубации при 24°С реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. H₂SO₄ на ячейку и планшеты считывали при 490 нм с использованием счетчика планшетов ELISA. Титр антител определяли как аналогичный наибольшему разведению, которое давало значение OD490 нм выше среднего плюс два стандартных отклонения контрольных ячеек конъюгата.

Результаты этого анализа, показанные на фиг.3, демонстрируют, что после первой инъекции (PD1) некоторые участки пептидов проявляли приемлемые титры антител, как 18-мер контроль. В частности, фрагменты Аβ пептида, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 2-9, 3-10, 17-24, 21-28 и 33-40, все давали титры в избытке 1:800. После второй инъекции (PD2) 15 из 8-мерных конъюгатов давали титры антител в избытке 1:1000. Анализ после 3 дозы (PD3) дополнительно подтвердил, что определенные участки Аβ пептида были более иммуногенными, чем другие. Одиннадцать участков продемонстрировали титры более чем 1:6000. Они включали участки, соответствующие аминокислотам Аβ 1-8, 3-10, 7-14, 11-18, 13-20, 15-22, 19-26, 21-28, 23-30, 27-34 и 29-36. Из этих участков пять участков были высокоиммуногенными (>1:10000), включая участки 1-8, 15-22, 21-28, 23-30 и 29-36. Результаты демонстрируют, что конъюгаты 8-меров способны вызывать ответ антител, специфичных к Аβ₄₀. Неожиданно и в противоречии с предыдущими результатами, не все фрагменты Аβ были в равной степени иммуногенными. Действительно, эти данные предполагают, что определенные 8-меры являются высокоиммуногенными, тогда как другие участки Аβ (например, 5-12, 25-32, 31-38 и 35-42) являются неиммуногенными (титры <1:300).

С. Иммуногенность конъюгатных вакцин у макак-резус

Исследование, сравнимое с таковым, проводимым у морских свинок, проводили у нечеловекообразных приматов, т.е. макак-резус, для определения, дают ли конъюгаты Аβ пептида-ОМРС и добавки квасцов и ISCOMATRIX® иммунный ответ. Макак-резус (Macaca mulatto) держали в соответствии с протоколами института по уходу за животными Merck Research Laboratories и New Iberia Research Center (The University of Louisiana at Lafayette, New Iberia, LA).

Заявители использовали Аβ пептиды, конъюгированные с ОМРС, в качестве модели антигенов, включая 8-меры, показанные на фиг. 2В: Аβ(1-8) (SEQ ID № 67), Аβ(3-10) (SEQ ID № 69), Аβ(7-14) (SEQ ID № 70), Аβ(17-24) (SEQ ID № 72), Аβ(21-28) (SEQ ID № 73) и Аβ(33-40) (SEQ.ID № 74); двухвалентные линейные пептиды, показанные на фиг.5: Аβ(3-10)(7-14) (Конструкт № 1), Аβ(3-10)(21-28) (Конструкт № 2), Аβ(1-8)(21-28) (Конструкт № 5); и поливалентные разветвленные МАР, показанные на фиг.6А: Аβ(3-10)(7-14) (Конструкт № 8), Аβ(1-8)(21-28) (Конструкт № 11), Аβ(3-10)(21-28) (Конструкт № 12).

Резус-макак (N=3) иммунизировали 5 мкг каждой из вакцин, рецептированных в адъюванте квасцов Merck (МАА) плюс 100 мкг ISCOMATRIX®, каждые четыре недели. Образцы сыворотки собирали через четыре недели после каждой инъекции и определяли специфический ответ Аβ антител посредством ELISA. В соответствии с результатами исследований на морских свинках было обнаружено, что все конъюгаты являются иммуногенными у обезьян. Титры Аβ специфических антител были определяемыми после однократной инъекции и далее возрастали после последующих инъекций. Обычно для тестируемых конъюгатов пиковые титры достигались после второй или третьей иммунизации, когда геометрические средние титров варьировались от 25000 до 500000. Полученные результаты подтверждают открытие, что Аβ конъюгаты, описанные в настоящем описании, способны вызывать ответ Аβ-специфических антител.

D. Эффект добавки на иммуногенность конъюгатных вакцин у резус-макак

Проводили дополнительное исследование у нечеловекообразных приматов, т.е. резус-макак, для определения, могут ли конъюгаты Аβ пептида-ОМРС и добавки на основе сапонина, такой как ISCOMATRIX®, обеспечить улучшенный иммунный ответ. Заявители использовали Аβ(1-18) пептид, конъюгированный с ОМРС, в качестве модели антигена. Резус-макак (Macaca mulattа) держали в соответствии с протоколами ухода за животными института Merck Research Laboratories и New Iberia Research Center (The University of Louisiana at Lafayette, New Iberia, LA).

Пяти группам макак, по три в группе, вводили следующие Аβ(1-18)-ОМРС конъюгаты: (1) 5 мкг конъюгата (на основании содержания пептида) в квасцах, (2) 5 мкг конъюгата в квасцах+100 мкг ISCOMATRIX®, (3) 5 мкг конъюгата в квасцах+50 мг ISCOMATRIX®, (4) 30 мкг конъюгата в квасцах, (2) 30 мкг конъюгата в квасцах+100 мкг ISCOMATRIX®. Иммунизацию проводили внутримышечными инъекциями в 0,5 мл аликвотах на 0, 8 и 24 неделях с использованием туберкулиновых шприцев (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Образцы сыворотки собирали с интервалами в четыре недели, начиная с 0 недели (предварительная кровь), и исследовали на титры антител против Аβ₄₀ посредством ELISA, проводимого, как описано в предшествующем примере.

Промежуточный анализ этого текущего исследования продемонстрировал, что на PD1 макаки, получившие 5 мкг конюгатной вакцины в квасцах, не смогли дать какие-либо определяемые титры, тогда как получавшие 30 мкг конъюгатной вакцины в квасцах дали низкие Аβ₄₀ специфические титры. У всех макак, которые получали композицию квасцов плюс ISCOMATRIX®, развились значительные титры антител. На PD2 обе дозы иммуногена только в квасцах давали одинаковые уровни титров, тогда как в группе, получавшей квасцы плюс ISCOMATRIX®, развились титры антител в 10 раз выше, относительно группы только с квасцами. Результаты этого исследования подтверждают, что такой конъюгат Аβ пептида-ОМРС является иммуногенным у нечеловекообразных приматов. Данные, кроме того, предполагают, что эффективность такой конъюгатной вакцины является значительно усиленной добавкой на основании сапонина, такой как ISCOMATRIX®.

ПРИМЕР 4

Иммунореактивность поликлональной сыворотки морских свинок

С целью продемонстрировать, что иммунная сыворотка, полученная от морских свинок выше (пример 3В), после иммунизации конъюгатами 8-меров KLH действует при БА людей, проводили исследование для оценки иммунореактивности поликлональной сыворотки от морских свинок, иммунизированных иммуногеном Аβ(3-10)-KLH. Через четыре недели после второй инъекции этого конструкта получали кровь от соответствующей морской свинки в соответствии со следующей методологией.

Реактивность поликлональной сыворотки оценивали на сечениях головного мозга при БА человека (BioChail Institute, Inc., Hayward, CA). Сечения головного мозга человека получали инкубацией при 60°С в течение тридцати минут с последующими двумя пятиминутными промывками ксилолом при комнатной температуре. Сечения впоследствии погружали в 100% EtOH дважды на пять минут каждый с последующим пятиминутным погружением в ddH₂O. Сечения погружали на три минуты в 99% муравьиную кислоту с последующей короткой промывкой ddH₂O и пятиминутным погружением в фосфатный буферный раствор (PBS). Затем сечения инкубировали с блокатором пероксидазы в течение десяти минут с последующей пятиминутной промывкой PBS. Сечения блокировали десятиминутным воздействием 10% козьей сыворотки с последующей пятиминутной промывкой PBS. Затем сечения инкубировали с разведенной сывороткой морских свинок при 4°С в течение ночи или в течение одного часа при комнатной температуре. После пятиминутной промывки PBS сечения инкубировали в течение десяти минут с разведенным биотинированным козьим IgG против морских свинок или биотинилированными лошадиными анти-мышиными антителами (1 капля в 5 мл PBS). Сечения пять минут промывали в PBS и затем инкубировали с раствором ABC (набор Vectorstatin ABC; Vector Laboratories, Inc.) в течение тридцати минут. Сечения промывали PBS в течение пяти минут. Затем сечения окрашивали DAB (DakoCytomation) в течение пяти минут и промывали ddH₂O. Затем сечения докрашивали гематоксилином в течение тридцати секунд и дегидрировали в градуированном EtOH и ксиленах (70% EtOH в течение пяти минут, 80% EtOH в течение пяти минут, 100% EtOH в течение пяти минут и ксиленах в течение пяти минут). Затем сечения покрывали стеклом и оценивали с помощью световой микроскопии.

Иммуногенный ответ, вызываемый конъюгатом Аβ(3-10)-KLH, давал ответ антител, которые были направлены против человеческой ткани головного мозга при БА. Как показано на фиг.4, такие сечения головного мозга человека имеют обширные отложения Аβ, в некоторой степени типичные ожидаемые для БА человека. Тогда как сыворотка пре-иммунизированных морских свинок продемонстрировала отсутствие иммунореактивности при воздействии на эту ткань, положительная иммунореактивность сыворотки от той же морской свинки была отмечена после двух инъекций конструкта Аβ(3-10)-KLH. Полученные данные демонстрируют, что иммуногенность, обнаруживаемая ELISA и проиллюстрированная на фиг.3, включает значительный ответ антител, направленный против человеческого Аβ, обнаруживаемого в этой ткани с БА. Следовательно, результаты расширяют неожиданное обнаружение различной иммуногенности некоторых Аβ фрагментов, что далее демонстрирует, что этот ответ направлен, в некоторой степени согласуясь с терапевтическим применением.

ПРИМЕР 5

Идентификация иммуногенных фрагментов, не имеющих Т-клеточных эпитопов

Для идентификации иммуногенных фрагментов, не имеющих Т-клеточного эпитопа для применения в настоящем изобретении, может быть использован следующий иммуноферментный анализ Immunospot (ELISpot) в качестве метода для оценки Т-клеточного ответа на определенный антиген. Иммуногенные фрагменты, обладающие Т-клеточными эпитопами, идентифицировали по присутствию темного пятна на поверхности белой мембраны; каждое пятно показывает присутствие Т-клетки, которая имеет секретируемый интерферон-гамма (IFN-γ) в ответ на антиген (т.е. иммуногенный фрагмент). Специалист в области техники вакцин и иммунологиии знаком с этим анализом, см., например, Larsson et al., AIDS 3: 767-777, 1999 и Mwau et al., AIDS Research and Human Retroviruses 18:611-618, 2002. Недавний обзор можно обнаружить в A.E. Kalyuzhny, Methods Mol. Biol. 302: 15-31, 2005.

Заявители использовали моноциты периферической крови (PBMC) от макак-резус (New Iberia Research Center, The University of Louisiana at Lafayette, New Iberia, LA) для ответа на пептиды Аβ1-40 (American Peptide Co., Sunnyvale, CA) (последовательность аминокислот DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV) (SEQ ID № 78) и Аβ1-20 (Synpep, Dublin, CA) (последовательность аминокислот DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF) (SEQ ID № 79).

Очищенные моноклональные мышиные анти-обезьяньи IFN-γ (клон MD-1, Кат.№ СТ 525, U-CyTech biosciences, Utrecht, The Netherlands) разводили в фосфатном буферном растворе (PBS) с 1% пенициллином и сульфатом стрептомицина (GIBCO® Penicillin-Streptomycin, Кат.№ 15140-122, Invitrogen, Carlsbad, CА), затем добавляли в 96-луночные стерильные планшеты HTS IP (Кат.№ MSIPS4W10, Millipore, Billerica, MA) и инкубировали в течение более чем двенадцать часов при 4°С. Планшеты промывали и добавляли R10 [среда RPMI 1640 (GIBCO® Кат.№ 11875-093), 10% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone SH 30090.03, Logan, UT), 0,1% 50 мМ 2-меркаптоэтанола (GIBCO® Кат.№ 21985-023), 1% 1М буфер HEPES (GIBCO® 15630-080), 1% 200 мМ L-глютамина (GIBCO® Кат.№ 25030-081), 1% 100 мМ раствора пирувата натрия МЕМ (GIBCO® Кат.№ 11360-070), 1% раствора пенициллина-стрептомицина (GIBCO® Кат.№ 15140-122) перед инкубацией в течение, по меньшей мере, двух часов при 37°С. PBMC центрифугировали и ресуспендировали в R10. PBMC подсчитывали на счетчике Z2 Coulter (Beckman Coulter, Fullerton, CA]. В каждую ячейку аспирированного планшета вносили или 0,4 мкг Аβ 1-40, Аβ 1-20, РНА (фитогемагглютинин, Кат.№ L-8902, Sigma, St.Louis, MO, положительный контроль), или разведенный ДМСО (Sigma, отрицательный контроль); затем к каждой лунке добавляли 400000 PBMC. Планшеты инкубировали в течение 18-24 часов при 37°С во влажном инкубаторе с СО₂. Планшеты промывали в PBS с 5% FBS и 0,005% Tween; биотин-конъюгированные анти-обезьяньи IFN-γ поликлональные антитела (U-CyTech biosciences, Utrecht, The Netherlands) разводили в той же среде и добавляли к каждой ячейке; затем планшеты инкубировали при 4°С в течение 18-24 часов. Стрептавидин-АР (Кат.№ 13043E, BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) разводили в той же среде и добавляли к промытым планшетам; планшеты инкубировали при комнатной температуре и в темноте в течение двух часов. Фильтрованный субстрат 1-Step NBT/BCIP (Pierce, Rockford, IL, Кат.№ 34042) добавляли и проводили дополнительную инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение десяти минут. После промывки планшетам позволяли высохнуть до получения изображения с помощью CCD камеры и пятна в каждой ячейке автоматически обсчитывали с помощью компьютера.

Заявители установили, что пятно образования клеток на миллион PBMC (SFC/10⁶ PBMC) должно превосходить 55 и должно в 4 раза превышать отрицательный контроль для определения как положительный результат; несоответствие обоим этим критериям определяет отрицательный результат. Макак-резус вакцинировали или МАР конструктом, включающим Аβ (3-10)/(21-28) (Конструкт № 12, фиг.6А), конъюгированным с ОМРС, или с двумя или оба из двух мономерных конструктов, Аβ (3-10) (SEQ ID № 69) и Аβ (21-28) (SEQ ID № 73), конъюгированных с ОМРС. Каждую макаку оценивали во время схемы вакцинации с месячными интервалами в течение трех или четырех месяцев, наибольший ответ, когда-либо записанный против или Аβ 1-40 или Аβ 1-20, составил только 18 SFC/10⁶ PBMC, существенно ниже критерия 55 SFC/10⁶ PBMC. Следовательно, все привело к отрицательной оценке, обеспечивая достаточное доказательство того, что вакцины не вызывают Т-клеточного ответа и, следовательно, не включают Т-клеточного эпитопа.

ПРИМЕР 6

Повышение Аβ плазмы

Нечеловекообразных приматов макак-резус (N=3) иммунизировали 5 мкг конъюгата МАР Аβ (3-10)/(21-28) (Конструкт № 12, фиг.6А) или его мономерным составляющим конъюгатом, Аβ (3-10) (SEQ ID № 69) и Аβ (21-28) (SEQ ID № 73), связанными с ОМРС в качестве носителя, и рецептировали в МАА плюс 100 мкг ISCOMATRIX®. Резус приматы получали вакцинации каждые четыре недели с забором крови и анализами через четыре недели после каждой инъекции. Определяли титры анти-Аβ₄₀ и общие уровни Аβ_1-40.

Уровень Аβ_1-40 плазмы определяли у этих иммунизированных животных с использованием 6E10/G210 ELISA. Этот анализ измеряет Аβ_1-40 с использованием сандвич-ELISA, включающего N-концевое захватывающее антитело 6Е10 (Аβ 1-8) (Signet Laboratories, Dedham, MA) и С-концевое Аβ₄₀ нео-эпитоп антитело (G210) (The Genetics Company, Inc., Zurichm Switzerland), конъюгированные с щелочной фосфатазой. Антитело 6Е10 покрывали на планшеты в концентрации 5 мкг/мл. Разведенные образцы плазмы (1:3) использовали по 50 мкл/ячейку в трех экземплярах. Стандарты Аβ_1-40 получали из 400 пМ-3 пМ в 6Е10 иммуно-истощенной матрице резус. Этот анализ имеет соотношение сигнал-шум около 5-20. CDP-звездный субстрат щелочной фосфатазы получали от Applied Biosystems, Foster City, CA. SuperBlock®, заранее полученный блокирующий буфер получали от Pierce Biotechnology, Rockfold, IL (Кат.№ 37515). Баллы отдельных образцов, запущенных в трех экземплярах, преобразовывали в точные аналитические концентрации с использованием кривой третьего порядка, соответствующей стандартам. QC образцы запускали для оценки вариабельности сигнала между планшетами.

Как изображено на фиг.8А, результаты этого анализа демонстрируют более чем 3-кратное увеличение Аβ₄₀ плазмы на PD3 после иммунизации с использованием конструкта МАР Аβ (3-10)/(21-28) (Конструкт № 12, фиг.6А). Такое увеличение Аβ₄₀ плазмы не наблюдали у животных, иммунизированных мономерными вакцинными конструктами Аβ конъюгата/ОМРС. В частности, иммунизация с использованием или Аβ (3-10) (SEQ ID № 69), или Аβ (21-28) (SEQ ID № 73) давала отсутствие или, по существу, низкие ответы по этой мерке. Было отмечено, что такие различия были независимыми от уровня титров, как изображено на фиг.8В.

В целом, полученные данные демонстрируют, что некоторые конструкты имеют преимущество относительно других иммуногенных конструктов в отношении их способности повышать уровень Аβ плазмы. Специалист в области техники понимает, что такая селективность иммуногенных фрагментов, т.е. способность повышать уровень Аβ плазмы, не была показана до настоящего изобретения и не была предсказуема из предшествующей области техники. По существу, идентификация иммуногенов, или 8-меров, или МАР, с отсутствием Т-клеточного эпитопа, которые повышают Аβ плазмы после иммунизации, обеспечивает метод для выбора указанных 8-меров или МАР для применения в вакцинных конструктах. Как результат настоящего изобретения, специалист в области техники в настоящее время может охарактеризовать указанные конструкты вакцин и количественно (т.е. иммуногенность), и качественно (т.е. природу ответа поликлональных антител - способность повышать уровень АВ плазмы). Кроме того, специалисту в области техники будет понятно, что настоящее изобретение не ограничено фрагментами Аβ из 8 аминокислот, но включает любой антиген, способный вызывать ответ поликлональных антител в организме-хозяине, который реагирует на Аβ.

1. Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ, включающая иммуногенный фрагмент Аβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способный вызывать иммунный ответ в форме антител к Аβ, где указанный иммуногенный фрагмент содержит один или более линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров) Aβ, при этом указанный один или более 8-меров включают Аβ(21-28) (AEDVGSNK).

2. Фармацевтическая композиция по п.1, где указанный иммуногенный фрагмент выбран из группы, состоящей из линейного пептида из 8 аминокислот (8-мера) Аβ, поливалентного линейного пептида с вставленным, по меньшей мере, одним линкером, и поливалентного разветвленного множественного антигенного пептида (MAP).

3. Фармацевтическая композиция по п.2, где указанный иммуногенный фрагмент представляет собой поливалентный разветвленный MAP или поливалентный линейный пептид с полиэтиленгликолевым (PEG) линкером.

4. Фармацевтическая композиция по п.2, где указанный иммуногенный фрагмент представляет собой поливалентный разветвленный MAP.

5. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, включающая молекулу носитель, связанную с указанным иммуногенным фрагментом для получения конъюгата, где носитель улучшает иммунный ответ, включающий антитела к фрагменту Aβ.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, где молекула носитель выбрана из группы, состоящей из альбуминов сыворотки, гемоцианина фиссуреллы (KLH), молекул иммуноглобулина, альбумина, белка столбнячного токсина и белкового комплекса наружной мембраны Neisseria meningitidis (OMPC).

7. Фармацевтическая композиция по п.6, где молекулой носителем является OMPC.

8. Фармацевтическая композиция по п.7, где мультивалентный конъюгат МАР-ОМРС получен с использованием лизиновой основы.

9. Фармацевтическая композиция по п.6, где конъюгат содержит KLH, связанный с пептидом формулы:
Ac-AEDVGSNK-(Aha)-C-NH₂;
или OMPC, связанный с пептидом формулы:
Ac-AEDVGSNK-(Aha)-K(BrAc)NH₂;
где Aha представляет собой 6-аминогексановую кислоту, а ВrАс представляет собой бромацетил.

10. Фармацевтическая композиция по п.7, где конъюгат содержит OMPC, связанный с пептидом, выбранным из:
BrAc-Aha-(PEG)-AEDVGSNK-(PEG)-EFRHDSGY-NH₂,
BrAc-Aha-(PEG)-AEDVGSNK-(PEG)-DAEFRHDS-NH₂,
BrAc-Aha-(PEG)-AEDVGSNK-(PEG)-DSGYEVHH-(PEG)-EFRHDSGY-NH₂,
BrAc-Aha-(PEG)-AEDVGSNK-(PEG)-AEFRHDSG-(PEG)-EFRHDSGY-(PEG)-DAEFRHDS-NH₂,
,
,

и

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где конъюгат содержит ОМРС, связанный с:

12. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый адъювант.

13. Фармацевтическая композиция по п.12, где фармацевтически приемлемый адъювант представляет собой гидроксид алюминия или адъювант на основе сапонина.

14. Фармацевтическая композиция по п.9, где фармацевтически приемлемым адъювантом является адъювант на основе сапонина.

15. Фармацевтическая композиция по любому из предыдущих пунктов для использования в профилактике или лечении заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента.

16. Фармацевтическая композиция по п.15, где заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.

17. Способ для предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Аβ в головном мозге пациента, нуждающегося в такой профилактике или лечении, включающий введение эффективной дозы иммуногенного фрагмента Аβ с отсутствием Т-клеточного эпитопа, способного вызывать иммунный ответ в форме антител к указанному фрагменту Аβ, где иммуногенный фрагмент содержит один или более линейных пептидов из 8 аминокислот (8-меров) Аβ, при этом указанный один или более 8-меров включают Аβ(21-28) (AEDVGSNK).

18. Способ по п.17, где иммуногенный фрагмент способен повышать уровень Аβ плазмы.