Средство, повышающее активность суммарной триптофанил-тphk-синтетазы

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии, касается применения трекрезана в качестве активатора суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы). Создано средство, повышающее устойчивость сосудистой системы к холестерину, с повышенной активностью. 2 ил.

 

Изобретение относится к медицине, фармакологии и биологии и конкретно может быть использовано, например, для повышения устойчивости сосудистой системы к холестерину, в частности - при ожирении.

В последние годы выявлен ряд дополнительных неканонических функций у ферментов класса аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаз) - ключевых для обмена веществ. В частности - тирозил-тРНК-синтетаза (ТирРСаза), будучи расщепленной, обладает цитокинной активностью и стимулирует ангиогенез, способствуя, тем самым, атерогенезу [Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M. et al., 2003; Wakasugi К., Slike B.M., Hood J. et al., 2002]. Гомолог ТирРСазы-триптофанил-тРНК синтетаза (ТРСаза) в клетках существует в двух формах: 1) основной полноразмерной; 2) частично усеченной (миниТРСаза), лишенной N-концевого фрагмента в процессе альтернативного сплайсинга (или эндогенного регулируемого протеолиза) при созревании пре-мРНК [Liu J., Shue E., Ewalt K.L. and Schimmel P., 2004]. Образование обеих форм фермента может быть резко ускорено у всех млекопитающих при воздействии ряда факторов, например γ-интерферона. При этом ТРСаза, особенно в виде миниТРСазы, в отличие от ТирРСазы, обладает выраженным антиангиогенным и антиатерогенным действием [Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M. et al., 2003; Wakasugi К., Slike B.M., Hood J. et al., 2002]. Известна также взаимосвязь между АРСазами и белокстимулирующим действием аппарата клетки [Нурбеков М.К. и др., 2002].

В литературе имеются сведения о возможности активации ТРСазы различными химическими соединениями [Kisselev L.L., Favorova O.O., Nurbekov M.K. et al., 1981; Liu J., Shue E., Karla L., Ewalt K.L., Schimmel P., 2004].

В качестве ближайшего аналога может быть указан источник: Нурбеков М.К., Фаворова О.О., Дмитренко С.Г., Болотина И.А., Киселев Л.Л. Роль ионов цинка в функционировании бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы. // Молекулярная биология, 1981, т.15, №5, стр.1000-1010 [8].

Однако существует потребность в поиске и внедрении в практику новых диагностических и лекарственных средств, обладающих указанной активностью.

Задачей изобретения является разработка нового средства, повышающего цитокинную активность суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы).

Поставленная задача решается тем, что в качестве активатора суммарной ТРСазы применяют новый отечественный препарат трекрезан, что позволяет расширить область фармакологического применения.

Трекрезан обладает широким спектром терапевтического действия и отвечает формуле:

2MeC₆H₄OCH₂COON+H(CH₂CH₂OH)₃

Известно применение трекрезана как препарата, повышающего иммунитет и адаптивные свойства организма [Воронков М.Г., Расулов М.М., 2007; Воронков М.Г., Мирскова А.Н., Расулов М.М., 2007].

Применение трекрезана по новому назначению стало возможным благодаря выявленным авторами его новым свойствам. Впервые показано, что введение трекрезана стимулирует суммарную активность ТРСаз. Свойства трекрезана стимулировать суммарную активность ТРСаз в литературе не описаны.

Возможность осуществления изобретения может быть проиллюстрирована следующими ниже представленными данными.

Пример 1.

Методика. Эксперименты проводились на кроликах массой 2,5-3 кг. Гиперхолестеринемию как разновидность жировой дистрофии моделировали по Н.Н.Аничкову и С.С.Халатову ежедневным скармливанием животным с пищей холестерина в дозе 0,25 г/кг. Через месяц после начала кормления в крови животных определялся уровень холестерина, общих липидов, триглицеридов и β-липопротеидов. Согласно полученным при этом результатам были сформированы контрольная и пять опытных групп. Все животные продолжали получать холестерин. Кроликам опытных групп вводили трекрезан, а контрольным животным - физиологический раствор. Кроликам первой опытной группы ежедневно вводили внутримышечно свежеприготовленный водный раствор трекрезана в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Второй группе животных трекрезан вводился так же, как и первой, но в дозе 25 мг/кг. Третьей группе кроликов трекрезан добавляли в пищевой рацион из расчета 50 мг/кг в сутки в течение 2 мес. Животные четвертой группы получали по той же схеме с пищей трекрезан в дозе 150 мг/кг в сутки. Пятой группе кроликов раствор трекрезана в дозе 5 мг/кг вводили внутримышечно с первого дня эксперимента вместе с холестерином. Эксперименты продолжались в течение 3 мес. После этого животные забивались путем воздушной эмболии.

Активность ТРСазы измеряли в частично очищенных экстрактах. Образцы аорты (от 5 до 8 г) измельчали при 5°С и растирали в жидком азоте до порошкового состояния. Смесь экстрагировали в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1 мМ β-меркаптоэтатол; 5 мМ ЭДТА; 1 мМ PMSF; 0,1 М KCl. После перемешивания при 5°С в течение 30 мин клеточный дебрис осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 20000 g. К супернатанту добавляли, перемешивая, мелко измельченный сульфат аммония до 40% насыщения. После формирования осадка в течение 1 - 2 часов при 5°С его удаляли центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Осадок удаляли. К супернатанту добавляли тем же путем сульфат аммония до 60% насыщения. Осадок оставляли на ночь при 5°С. Перед опытом осадок центрифугировали при 20000 g в течение 20 мин. Осадок для удаления соли диализовали против указанного выше буфера без KCl. В реакционную смесь объемом 60 мкл, содержащую 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 5 мМ MgCl₂; 0,05 мг/мл БСА; 0,1 мМ [С¹⁴]; L-триптофан (54 mCi/моль, Amersham); 50 мМ KCl; 1,0 мМ ЭДТА; 2,5 мМ АТФ; 7 мг/мл суммарной дрожжевой тРНК [Seshaiah P., Andrew D.J., 1999]. При использовании частично очищенных препаратов тРНК^Трп их концентрация в смеси составляла 0,2 мкМ. К смеси добавляли 20 мкг частично очищенного препарата, нормализованного по белку. Смесь инкубировали при 25°С и отбирали по 9 мкл аликвот, помещали на Whatman GFC диски и промывали 5% ТХУ. Связанную радиоактивность определяли с помощью сцинтилляционного счетчика β-радиации. В контроле использовали соответствующие количества суммарного белка плазмы. Для измерения специфического эффекта трекрезана использовали время инкубации на линейном участке зависимости радиоактивности от продолжительности инкубации и от концентрации экстракта.

Результаты. В первой серии опытов трекрезан вводили внутримышечно в дозе 5 мг/кг в течение 2 мес. Определение активности трекрезана на препарате синтетазы из тканей аорты показало, что уровень ТРСазы у кроликов этой группы под влиянием трекрезана повысился, но не существенно.

В следующих опытах, при увеличении дозы трекрезана до 25 мг/кг (внутримышечно) уровень ТРСазы заметно повышался (фиг.1). При введении трекрезана в рацион животных его эффективность значительно снижалась. Активность синтетазы в ткани аорты проявляла тенденцию к увеличению только в группе животных, получавших трекрезан в дозе 150 мг/кг в сутки (фиг.1).

Наконец, при трехмесячном введении трекрезана в дозе 5 мг/кг с первого дня эксперимента, т.е. в определенной мере профилактически, установлено, что у кроликов этой группы проявляется выраженный эффект - повышение уровня ТРСазы (фиг.1).

Таким образом, установлено, что при введении трекрезана происходит активация ТРСазы.

Учитывая сложность механизма действия трекрезана, была исследована динамика процесса активации ТРСазы. Для этого, с использованием частично очищенных препаратов дрожжевой тРНК^Трп, изучены линейные участки зависимостей накопления продуктов специфического ацилирования ТРСазой. Выявленная кинетика с локальным максимумом (фиг.2) подтверждает стимулирующее действие трекрезана и отражает соотношение разных форм ТРСазы, возникающих при действии трекрезана.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами:

Фиг.1. Активность ТРСазы в частично очищенных препаратах аорты при воздействии препарата трекрезан в различных дозах и путях введения в условиях развития экспериментальной гиперхолестеринемии (жировой дистрофии сосудов). Обозначения:

- контроль (А);

- трекрезан в дозе 150 мг/кг перорально (Б);

- трекрезан в дозе 25 мг/кг внутримышечно (В);

- трекрезан в дозе 5 мг/кг вместе с холестерином (Г).

Фиг.2. Кинетика активности ТРСазы в частично очищенных препаратах аорты кроликов при развитии гиперхолестеринемии (жировой дистрофии сосудов) и применении трекрезана в дозе 25 мг/кг.

1 - контроль (сразу после введения трекрезана);

2 - 2 недели введения трекрезана;

3 - 1 месяц введения трекрезана;

4 - 1,5 месяца введения трекрезана;

5 - 2 месяца введения трекрезана;

6 - 2,5 месяца введения трекрезана.

ЛИТЕРАТУРА

1. Tzima E., Reader J.S., Irani-Tehrani M., Ewalt K.L., Schwartz M.A., Schimmel P. Biologically active fragment of a human tRNA synthetase inhibits fluid shear stress-activated responses of endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA // Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100(25): 14903-7.

2. Wakasugi К., Slike B.M., Hood J., Otani A., Ewalt K.L., Friedlander M., Cheresh D.A., Schimmel P. A human aminoacyl-tRNA synthetase as a regulator of angiogenesis // Proc Natl Acad Sci USA. 2002, (I): 173-7.

3. Liu J., Shue E., Ewalt K.L. and Schimmel P. A new γ-interferon-inducible promoter and splice variants of an anti-angiogenic human tRNA synthetase. NAR, 2004, 32 (2): 719-727 // Nucleic Acids Res., 2004, 32(2): 719-727.

4. Воронков М.Г., Расулов М.М. Трекрезан - родоначальник нового класса адаптогенов и иммуномодуляторов // Хим. - фарм. ж., 2007, №1, с.3-9.

5. Воронков М.Г., Мирскова А.Н., Расулов М.М. Иммуномодуляторная эффективность трекрезана // Химико-фармацевтический журнал, 2007, №5, с.7-11.

6. Seshaiah P., Andrew D.J. WRS-85D: A tryptophanyl-tRNA synthetase expressed to high levels in the developing Drosophila salivary gland // Mol. Biol. Cell., 1999, May; 10(5): 1595-608.

7. Kisselev L.L., Favorova O.O., Nurbekov M.K., Dmitriyenko S.G., Engel-hardt W.A. Bovine tryptophanyl-tRNA synthetase. A zinc metalloenzyme. // Eur. J. Biochem. 1981. Dec;120(3):511-517.

8. Нурбеков M.K., Фаворова О.О., Дмитренко С.Г., Болотина И.А., Киселев Л.Л. Роль ионов цинка в функционировании бычьей триптофанил-тРНК-синтетазы. // Молекулярная биология, 1981, т.15, №5, стр.1000-1010.

9. Нурбеков M.K и др. Возможные механизмы гепатопротекторного действия изопропоксигерматрана и 1-этоксисилатрана // Бюлл. эксперим. биол. Мед., 2002, т. 134, №10, с.397-401.

Применение трекрезана в качестве активатора суммарной триптофанил-тРНК синтетазы (ТРСазы).