Способ получения плазмидной днк из бактериальных клеток

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения плазмидной ДНК из бактериальных клеток. Способ включает щелочной лизис бактериальных клеток и осаждение клеточных стенок центрифугированием. После чего проводят фильтрацию супернатанта и удаление из полученного фильтрата примеси РНК путем обработки фильтрата РНК-азой. Затем осуществляют осаждение плазмидной ДНК изопропиловым спиртом. Далее проводят дробное фракционирование плазмидной ДНК этиловым спиртом, при этом к раствору плазмидной ДНК сначала добавляют этиловый спирт до концентрации 45-53%, затем добавляют этиловый спирт до концентрации 55-58% и в конце добавляют этиловый спирт до концентрации 60-67%. После чего осуществляют удаление остатков липополисахаридов при помощи обращенно-фазового сорбента с гидрофобизованной поверхностью. Предложенное изобретение позволяет повысить чистоту и выход плазмидной ДНК. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, а именно к технологии наработки и выделения препаративных количеств апирогенной ДНК, и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности.

В последнее десятилетие геноиммунизация завоевала признание как метод, позволяющий получать устойчивый иммунный ответ против искомых антигенов. ДНК-вакцины используются в настоящее время не только для иммунизации животных; интенсивно разрабатываются ДНК вакцины, предназначенные для индукции гуморального и клеточного ответа у людей [1, 2]. Такие вакцины основаны, как правило, на использовании плазмидной ДНК, и, хотя они менее эффективны, чем вакцины на основе вирусных векторов, их применение одобрено ВОЗ, поскольку не имеет очевидных отдаленных последствий, связанных с интеграцией вирусной ДНК в геном. Для повышения эффективности трансфекции клеток плазмидной ДНК используют специальные доставляющие конструкции, однако для получения позитивного эффекта от иммунизации необходимо использовать достаточно высокие дозы ДНК. Это факт требует использования для иммунизации «чистой» ДНК, т.е. ДНК, свободной от примесей, уменьшающих эффективность трансфекции (таких как бактериальная ДНК и РНК), а также иммуногенных (таких как бактериальные белки, протеогликаны, гликопротеины и т.д.) и токсичных примесей (таких как бактериальный липополисахарид (ЛПС)).

Одним из требований, предъявляемых к фармацевтическим препаратам ДНК, является отсутствие в них эндотоксинов (в частности, бактериального ЛПС). Способы, используемые для выделения апирогенной ДНК, можно условно разделить на три типа: основанные на специфическом осаждении ДНК из растворов, основанные на экстракции ЛПС из очищаемого раствора ДНК, а также специфическом связывании иммобилизованных лигандов с ЛПС.

Известен способ получения плазмидной ДНК, основанный на селективной экстракции ЛПС из раствора ДНК [3]. Способ заключается в том, что к раствору плазмидной ДНК, полученной методом щелочного лизиса, добавляют тритон Х-114 до 1% и, перемешивая, охлаждают на ледяной бане, пока раствор не станет гомогенным. Затем полученный раствор нагревают до 25°С и разделяют на две фазы при помощи центрифугирования (38000 g, 37°C, 30 мин) и последующей инкубации при 37°С в течение 30 мин. Трехкратное повторение данной экстракции позволяет удалить до 99% ЛПС (до 64 ЕЭ/мг). Последующая анионобменная хроматография позволяет снизить содержание ЛПС до 2,5 ЕЭ/мг плазмидной ДНК, а также удалить остатки тритона Х-114, РНК и белков.

Недостатками данного способа являются сложность удаления остатков тритона из раствора ДНК и высокие потери плазмидной ДНК на стадии экстракции ЛПС тритоном Х-114, которые составляют 50-60%.

Известен способ получения плазмидной ДНК [4], включающий предварительную очистку плазмидной ДНК экстракцией фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1) с последующим осаждением этиловым спиртом до экстракции ЛПС тритоном Х-114, что позволяет получить более чистый препарат ДНК (по данным LAL-теста содержание ЛПС составило 1 ЕЭ/мг ДНК). Экстракция липополисахарида при помощи тритона Х-114 действительно является удобным методом удаления бактериального липополисахарида, однако недостатками способа являются низкий выход ДНК после экстракции (теряется не менее 50% ДНК) и сложность количественного удаления остатков детергента из раствора ДНК. Для удаления тритона Х-114 используют органические растворители, однако их использование в технологии получения препарата для внутреннего введения, так же как и наличие следовых количеств детергента в таком препарате, нежелательно.

Известен способ получения плазмидной ДНК путем удаления примесей бактериального ЛПС из растворов ДНК с помощью ионно-обменной хроматографии [5]. Суть способа заключается в использовании колонки, заполненной целлюлозными шариками с иммобилизованным на поверхности полиэтиленимином или диэтиламиноэтилом. Данные адсорбенты имеют высокую способность связывать эндотоксины.

К недостаткам данного способа можно отнести лишь однократную возможность использования колонки, невысокую эффективность удаления примесей эндотоксина из раствора и высокие потери ДНК.

Известен способ получения и очистки плазмидной ДНК, включающий три стадии хроматографии [6]. Исходный бактериальный лизат наносили на колонку Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences), затем собранный элюат наносили на колонку Sepharose 6 Fast Flow, в которой сорбент содержал иммобилизованные серосодержащие ароматические остатки (2-меркаптопиридин, 2-пиридин этантиол). Две стадии хроматографии позволили снизить содержание эндотоксина в полученном элюате в 319 раз по сравнению с исходным лизатом (по данным LAL-теста 470 и 150000 ЕЭ/мг плазмиды, соответственно). Конечным этапом данного способа является очистка полученного элюата на колонке SOURCE 30Q (Amersham Biosciences), что позволяет снизить содержание эндотоксина до 9 ЕЭ/мг плазмидной ДНК.

Недостатками данного способа являются длительность, трудоемкость, ресурсозатратность в силу высокой стоимости и разового использования хроматографических сорбентов и получение небольших количеств очищенной плазмидной ДНК.

Известен способ получения плазмидной ДНК фармацевтического качества [7], включающий получение клеток, содержащих плазмидную ДНК, получение лизата, содержащего плазмидную ДНК, путем разрушения клеток способом непрерывного щелочного лизиса, концентрирование лизата путем осаждения подходящим агентом, анионообменную хроматографию, хроматографию с образованием тройной спирали, гидрофобную хроматографию и конечную стадию диафильтрации и/или буферного обмена. При этом стадия диафильтрации включает следующие стадии: сбор раствора с последней хроматографической стадии; осуществление первой стадии диафильтрации против буфера Трис/NaCl; осуществление второй стадии диафильтрации против солевого раствора в условиях, подходящих для контролирования конечной концентрации буфера и для стабилизации рН конечного препарата плазмидной ДНК.

Недостатками известного способа являются длительность и трудоемкость, а также большие потери целевого продукта на множественных стадиях хроматографии.

Известен способ, в котором для удаления примесей эндотоксина из препарата плазмидной ДНК используют коммерчески доступные носители, в частности агарозные частицы с иммобилизованным полимиксином В (Pierce Detoxi-Gel beads) [8]. Полимиксин В является циклическим пептидом, продуцируемым Bacillus polymyxa, и способен с высокой аффинностью связывать ЛПС. Данный способ включает следующие стадии: выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli любым стандартным методом; осаждение плазмидной ДНК 96% этанолом с последующим разведением ДНК в апирогенном ТЕ-Буфере (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0) до концентрации 1 мг/мл; приготовление 50% суспензии агарозных частицы с иммобилизованным полимиксином В; хромотаграфию с соотношением компонентов 2:1:1 (суспензия агарозных частиц с полимиксином В/Буфер-TNE (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 0.25 М NaCl, 1 мМ ЭДТА) / плДНК в ТЕ-Буфере).

К недостаткам данного способа можно отнести сложность регенерации использованной колонки и высокое содержание ЛПС в очищенном препарате плазмидной ДНК (от 10 до 50 ЕЭ/мг ДНК). Кроме того, поскольку полимиксин В активирует в крови стимуляцию нефротоксина и неуротоксина, примеси полимиксина В в препарате плазмидной ДНК, предназначенном для введения в человека, недопустимы.

Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом, является способ получения плазмидной ДНК фармацевтического качества, включающий селективное осаждение плазмидной ДНК из бактериального лизата при помощи катионного детергента СТАВ (цетилтриметиламмониум бромид, СН₃(СН₂)₁₅N(СН₃)₃Br), с последующей очисткой полученной плазмидной ДНК при помощи анионообменной хроматографии [9]. В данном способе первым этапом является щелочной лизис бактериальных клеток, в процессе которого проводят удаление примесей РНК добавлением РНКазы А до концентрации 100 мкг/мл. Полученный лизат очищают от клеточных стенок при помощи центрифугирования с последующей фильтрацией через 22-25 мкм фильтр. Вторым этапом является селективное осаждение плазмидной ДНК при помощи добавления к фильтрату СТАВ до конечной концентрации 2 г/л. Осадок ДНК растворяют в буфере (0.60 М NaCl, 25 mM Tris-HCl, mM ЭДТА, рН 7.4) в течение ночи. Дополнительную очистку препаратов плазмидной ДНК проводят при помощи анионообменной хромотографии с использованием слабых анионообменных мембранных картриджей (МА 75 D, Sartorius). На последнем этапе фракции, содержащие ДНК, объединяют и переводят в физиологический раствор при помощи гель-фильтрации (Sephadex G-25). Данный способ позволяет получить препараты плазмидной ДНК, содержащие до 5 ЕЭ эндотоксина на миллиграмм плазмидной ДНК.

Недостатком данного способа является то, что он приводит только к частичной очистке ДНК (концентрация белка в среднем 100 мкг/мг плазмидной ДНК). Кроме того, потери плазмидной ДНК только на стадии осаждения СТАВ-ом составляют не менее 50%, а использование ионообменной хроматографии увеличивает трудоемкость и ресурсоемкость способа.

Технической задачей изобретения является повышение чистоты и выхода целевого продукта.

Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в следующем.

Биомассу бактериальных клеток, полученную в результате культивирования продуцентов рекомбинантных плазмид, лизируют при помощи щелочного лизиса. Полученный лизат очищают от клеточных стенок при помощи центрифугирования с последующей фильтрацией через складчатый фильтр (2 слоя фильтровальной бумаги или Ватман 3ММ).

Для удаления примеси РНК к фильтрату добавляют раствор РНК-азы А до концентрации 50 мкг/мл и инкубируют на водяной бане при комнатной температуре в течение 1 ч. Для удаления фермента к раствору добавляют 1/600 объема 10% SDS, 1/1000 объема β-меркаптоэтанола, перемешивают, добавляют 1/60 объема 3 М ацетата калия, рН 5.5 и инкубируют во льду в течение 30 минут с последующим центрифугированием при 24000 g в течение 25 минут при 4°С. Полученный супернатант фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Плазмидную ДНК осаждают из полученного фильтрата добавлением 0.7 объема изопропанола с последующим центрифугированием. Осадок ДНК промывают 70% этанолом и растворяют в Буфере 1 (25 мМ Трис-HCl, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0; из расчета 1 мл буфера на 1 г исходной биомассы).

Липополисахарид и ДНК отличаются по растворимости, поэтому препарат плазмидной ДНК, полученный в результате осаждения изпропанолом, фракционируют последовательным осаждением этиловым спиртом. Для этого к раствору плазмидной ДНК добавляют этиловый спирт до концентрации 45-53% с последующей инкубацией во льду в течение 30 мин. После центрифугирования при 27000 g в течение 20 минут при 4°С отбирают супернатант и добавляют 3 М ацетат аммония до концентрации 60 мМ и этиловый спирт до концентрации 55-58% с последующей инкубацией во льду в течение 15 мин. После центрифугирования при 27000 g в течение 20 минут при 4°С отбирают супернатант и добавляют этиловый спирт до концентрации 60-67% с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин. После центрифугирования 27000 g в течение 20 минут при комнатной температуре супернатант удаляют, осадок растворяют в 3-5 мл Буфера 1.

Для более глубокой очистки препарата плазмидной ДНК от примеси ЛПС используют суспензию коммерчески доступного обращенно-фазового сорбента с гидрофобизованной поверхностью, преимущественно фенил-сефарозы/октил-агарозы/бутил-агарозы, в количестве, необходимом для очистки одного образца плазмидной ДНК (из расчета 25-35 мкл фенилсефарозы/октил-агарозы/бутил-агарозы на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК). Суспензию отмывают 3 раза 5-кратным избытком апирогенной воды посредством центрифугирования при 17000 g. К осадку фенил-сефарозы/октил-агарозы добавляют плазмидную ДНК и инкубируют при комнатной температуре на роторном миксере барабанного типа (скорость вращения 10 об/мин) в течение 4 часов. Центрифугируют при 17000g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант (раствор плазмидной ДНК) переносят в новые пробирки. Плазмидную ДНК фильтруют в стерильных условиях через мембранный фильтр с порами диаметром 0.22 микрона.

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

1) Препарат плазмидной ДНК, полученный в результате осаждения изопропанолом, дробно фракционируют последовательным трехкратным осаждением этиловым спиртом, взятым в оптимальной возрастающей концентрации от 45 до 67%, что позволяет освободить препарат плазмидной ДНК от примеси ЛПС и белков.

2) После дробного фракционирования спиртом препарат плазмидной ДНК дополнительно очищают с помощью обращенно-фазового сорбента с гидрофобизованной поверхностью, преимущественно фенил-сефарозы, октил-агарозы или бутил-агарозы, взятого в количестве 25-35 мкл суспензии на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК, что позволяет осуществить более глубокую очистку препарата плазмидной ДНК от примеси ЛПС.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение плазмидной ДНК из биомассы, дробное фракционирование плДНК этиловым спиртом и очистка при помощи октил-агарозы.

Клетки E.coli DH5αF', трансформированные рекомбинантной плазмидой pcDNA-TCI, наращивали до ОД₆₀₀=1.5 в ферментере LKB. Суспензию клеток центрифугировали при 5500 g в течение 10 минут при 4°С, супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в предварительно охлажденном во льду Буфере 1 (25 мМ Трис-HCl, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0) из расчета 200 мл буфера на 25 г клеток. Суспензию клеток снова центрифугировали при 5500 g в течение 10 минут при 4°С, осадок клеток ресуспендировали в предварительно охлажденном Буфере 1 (для 25 г клеток суммарный объем суспензии должен составлять 200 мл) и инкубировали во льду на орбитальной качалке 10 мин (150 об/мин, амплитуда 5). Затем к клеткам добавляли 240 мл Буфера 2 (1% SDS, 0.2 М NaOH) и инкубировали во льду на орбитальной качалке не более 5 минут (150 об/мин, амплитуда 5). Далее добавляли 240 мл Буфера 3 (3 М ацетат калия, рН 5.5), затем 45 мл насыщенного раствора перхлората калия и инкубировали во льду на орбитальной качалке 15 мин (150 об/мин, амплитуда 5) с последующим центрифугированием при 24000 g в течение 25 минут при 4°С.

Супернатант фильтровали через складчатый фильтр (2 слоя фильтровальной бумаги или Ватман 3ММ).

К фильтрату добавляли раствор РНК-азы А до концентрации 50 мкг/мл и инкубировали на водяной бане при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации к раствору добавляли 1/600 объема 10% SDS, 1/1000 объема β-меркаптоэтанола, перемешивали, добавляли 1/60 объема Буфера 3 и инкубировали во льду в течение 30 минут с последующим центрифугированием при 24000 g в течение 25 минут при 4°С. Супернатант фильтровали через складчатый фильтр (2 слоя фильтровальной бумаги).

К фильтрату добавляли 0.7 объема изопропанола (до конечной концентрации 40%), перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием при 24000 g в течение 20 мин при 4°С. Супернатант декантировали, к осадку ДНК добавляли 50 мл 70% этанола и перемешивали. Доводили объем этанола до 200 мл, центрифугировали при 24000 g в течение 10 минут при 4°С и тщательно удаляли супернатант. Осадок растворяли в Буфере 1 (из расчета 1 мл буфера на 1 г исходной биомассы), для этого к осадку ДНК добавляли 0.7 объема от необходимого количества буфера и оставляли ночь на орбитальной качалке во льду (150 об/мин, амплитуда 5). Затем доводили объем раствора до объема, численно равного весу исходной биомассы.

Затем проводили дробное фракционирование плазмидной ДНК этанолом. Для этого к раствору плазмидной ДНК добавляли 1.2 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 52.4%) и инкубировали на льду в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 0.02 объема 3 М ацетата аммония и 0.14 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 56.7%) и инкубировали на льду в течение 15 мин.

Центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли к супернатанту 0.11 объема 96% (до конечной концентрации 60.7%) этилового спирта, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант удаляли, осадок растворяли в 3 мл Буфера 1. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически.

Затем проводили очистку плДНК при помощи октил-агарозы. Для этого суспензию октил-агарозы в количестве, необходимом для очистки одного образца плазмидной ДНК (из расчета 35 мкл октил-агарозы на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК), отмывали 3 раза 5-кратным избытком апирогенной воды (дважды дистиллированная вода, проверенная на отсутствие примесей эндотоксина) посредством центрифугирования при 17000 g. К осадку октилагарозы добавляли плазмидную ДНК и инкубировали при комнатной температуре на роторном миксере барабанного типа (скорость вращения 10 об/мин) в течение 4 часов с последующим центрифугированием при 17000 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Супернатант (раствор плазмидной ДНК) фильтровали в стерильных условиях через мембранный фильтр с порами диаметром 0.22 микрона.

В целевом препарате плазмидной ДНК, а также в полученных в ходе дробного осаждения осадках, растворенных в Буфере 1, определяли концентрацию плазмидной и геномной ДНК, белков и ЛПС. Для определения содержания примеси белка в препаратах плазмидной ДНК был использован флуоресцентный метод, основанный на использовании специфического флуоресцентного красителя на белок - NanoOrange Protein Quantitation Kit (Molecular Probe, США). Измерение концентрации плазмидной ДНК и оценки примеси геномной ДНК E.coli проводили при помощи количественной ПЦР в реальном времени. Для определения содержания эндотоксина в образцах плазмидной ДНК был использован ЛАЛ-тест (Associate of Cape Cod Incorporated, США).

Показатели качества целевого продукта представлены в таблице.

Таблица
Стадия	Количество pcDNA-TCI, полученное из 25 г клеток E.coli по данным количественного ПЦР, мг	Содержание геномной ДНК, мг	Содержание ЛПС, ЕЭ	Содержание белка, мкг
Раствор плазмидной ДНК после осаждения изопропанолом	19	4	≥125000	-
Осадок ДНК после осаждения 52.4% этанолом	0.95	3.6	≥112500	-
Осадок ДНК после осаждения 56.7% этанолом	1.8	0.46	-	-
Осадок ДНК после осаждения 60.7% этанолом	16.2	0.00013	≤625	<160
Раствор плазмидной ДНК после очистки при помощи октил-агарозы	12.5	0.0001	<62.5	<120

Из полученных данных следует, что последовательное осаждение раствора плазмидной ДНК 52.4 и 56.7% этанолом приводит к практически полному удалению примесей геномной ДНК и белков и удалению более 99% ЛПС. Очистка плазмидной ДНК с использованием октил-агарозы позволила значительно снизить примеси ЛПС и 1 мг плазмидной ДНК содержал не более 5 ЕЭ ЛПС, не более 10 нанограмм геномной ДНК и менее 10 микрограмм белков. Потери плазмидной ДНК после фракционирования спиртом и очистки при помощи октил-агарозы составили приблизительно 35%.

Пример 2. Выделение плазмидной ДНК из биомассы, дробное фракционирование плДНК этиловым спиртом и очистка при помощи фенил-сефарозы.

Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coli DH5αF' аналогично примеру 1 до стадии дробного фракционирования этанолом.

Затем к раствору плазмидной ДНК добавляли 0.882 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 45%) и инкубировали на льду в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 0.02 объема 3 М ацетата аммония и 0.272 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 55%) и инкубировали на льду в течение 15 мин.

Центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли к супернатанту 0.14 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 60%), инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант удаляли, осадок растворяли в 4 мл Буфера 1. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически.

Затем проводили дополнительную очистку плазмидной ДНК аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве сорбента использовали фенил-сефарозу и добавляли ее из расчета 30 мкл суспензии фенил-сефарозу на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК.

После очистки плДНК с использованием фенил-сефарозы, 1 мг плазмидной ДНК содержал менее 10 нанограмм геномной ДНК, менее 2,5 ЕЭ ЛПС и менее 10 микрограмм белков. Потери плазмидной ДНК после фракционирования спиртом и очистки при помощи фенил-сефарозы составили приблизительно 30%.

Пример 3. Выделение плазмидной ДНК из биомассы, дробное фракционирование плДНК этиловым спиртом и очистка при помощи фенил-сефарозы.

Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coli DH5αF' аналогично примеру 1 до стадии дробного фракционирования этанолом.

Затем к раствору плазмидной ДНК добавляли 1.233 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 53%) и инкубировали на льду в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 0.02 объема 3 М ацетата аммония и 0.162 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 58%) и инкубировали на льду в течение 15 мин.

Центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли к супернатанту 0.31 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 67%), инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант удаляли, осадок растворяли в 5 мл Буфере 1. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически.

Затем проводили дополнительную очистку плазмидной ДНК аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве сорбента использовали фенил-сефарозу и добавляли ее из расчета 25 мкл суспензии фенил-сефарозу на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК.

После очистки плазмидной ДНК с использованием фенил-сефарозы, 1 мг плазмидной ДНК содержал менее 10 нанограмм геномной ДНК, менее 5 ЕЭ ЛПС и менее 10 микрограмм белков. Потери плазмидной ДНК после фракционирования спиртом и очистки при помощи фенил-сефарозы составили приблизительно 30%.

Пример 4. Выделение плазмидной ДНК из биомассы, дробное фракционирование плДНК этиловым спиртом и очистка при помощи бутил-агарозы.

Плазмидную ДНК выделяли из клеток E.coli DH5αF' аналогично примеру 1 до стадии дробного фракционирования этанолом.

Затем к раствору плазмидной ДНК добавляли 1.1 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 50.3%) и инкубировали на льду в течение 30 мин с последующим центрифугированием при 27000g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли 0.02 объема 3 М ацетата аммония и 0.17 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 56%) и инкубировали на льду в течение 15 мин.

Центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант переносили в новые пробирки, добавляли к супернатанту 0.3 объема 96% этилового спирта (до конечной концентрации 65.2%), инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 27000 g в течение 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант удаляли, осадок растворяли в 4 мл Буфера 1. Концентрацию ДНК измеряли спектрофотометрически.

Затем проводили дополнительную очистку плазмидной ДНК аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве сорбента использовали бутил-агарозу и добавляли ее из расчета 30 мкл суспензии бутил-агарозы на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК.

После очистки плДНК с использованием бутил-агарозы, 1 мг плазмидной ДНК содержал менее 10 нанограмм геномной ДНК, менее 2,5 ЕЭ ЛПС и менее 10 микрограмм белков. Потери плазмидной ДНК после фракционирования спиртом и очистки при помощи бутил-агарозы составили приблизительно 30%.

Использование способа позволит получать апирогенную плазмидную ДНК в препаративных количествах с высоким выходом.

Источники информации

1. Donnelly, J.J, Ulmer, J.B., Shiver, J.W., Liu, M.A., DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol. - 1997. - V.15. P.617-648.

2. Gurunathan, S., Klinman, D.M., Seder, R.A., DNA vaccines: immunology, application, and optimization. Ann. Rev. Immunol. - 2000. - V.18. P.927-974.

3. Rozkov, A., Larsson, В., Gillström, S., Björnestedt, R., Schmidt, S.R., Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol Bioeng. 2008. - V.99. - P.557-566.

4. Yasuda, K., Kawano, H., Yamane, I., et all, Restricted cytokine production from mouse peritoneal macrophages in culture in spite of extensive uptake of plasmid DNA. Immunology. - 2004. - V.111. - P.282-290.

5. Mitzner, S., Schneidewind, J., Falkenhagen, D., Loth, F., Klinkmann, H., Extracorporeal endotoxin removal by immobilized polyethylenimine. Artif. Organs. 1993. - V.17. - P.775-781.

6. Lemmens, R., Olsson, U., Nyhammar, Т., Stadler, J., Supercoiled plasmid DNA: selective purification by thiophilic/aromatic adsorption. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 2003. - V.784. - P.291-300.

7. Заявка RU №200600579 «Способ получения плазмидной ДНК фармацевтического качества», С 12 N 15/10, on. 27.10.2006.

8. Montbriand, P.M., Malone, R.W., Improved method for the removal of endotoxin from DNA. J. Biotechnol. 1996. - V.44. - P.43-46.

9. Syren P.O., Rozkov A., Schmidt S.R., Stromberg P., Milligram scale parallel purification of plasmid DNA using anion-exchange membrane capsules and a multi-channel peristaltic pump. J. of Chromatography. 2007. - V.856. - P.68-74.

1. Способ получения плазмидной ДНК из бактериальных клеток, включающий щелочной лизис последних, осаждение клеточных стенок центрифугированием, фильтрацию супернатанта, удаление из полученного фильтрата примеси РНК путем обработки фильтрата РНК-азой, осаждение и очистку плазмидной ДНК, отличающийся тем, что осаждение плазмидной ДНК проводят изопропиловым спиртом, затем осуществляют дробное фракционирование плазмидной ДНК этиловым спиртом, при этом к раствору плазмидной ДНК сначала добавляют этиловый спирт до концентрации 45-53%, затем добавляют этиловый спирт до концентрации 55-58% и в конце добавляют этиловый спирт до концентрации 60-67% с последующим удалением остатков липополисахаридов при помощи обращено-фазового сорбента с гидрофобизованной поверхностью.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для осаждения плазмидной ДНК используют изопропиловый спирт до конечной концентрации 40%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют октил-агарозу из расчета 35 мкл суспензии на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК, фенил-сефарозу из расчета 25-30 мкл суспензии на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК или бутил-агарозу из расчета 30 мкл суспензии на 100 о.е. (ОД₂₆₀) плазмидной ДНК.