Способ консервирования донорской крови

Изобретение относится к медицине, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для консервирования донорской крови. Способ консервирования донорской крови включает смешивание донорской крови с гемоконсервантом глюгицир, при этом дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат из расчета 0,25 мг на 1 мл, разделение полученной консервированной донорской крови на плазму и эритроцитную массу с последующим хранением эритроцитной массы. Изобретение позволяет пролонгировать сроки хранения морфо-функционально полноценных эритроцитов в донорской эритроцитной массе до 30 суток. 2 ил., 10 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и трансфузиологии, и может быть использовано для консервирования донорской крови.

При консервировании донорской крови укрепление клеточной мембраны эритроцитов достигается с помощью включения в состав гемоконсервантов не проникающих в клетку веществ, вызывающих уплотнение мембраны и частично обезвоживающих ее (сахароза, маннит, сорбит), коллоидных препаратов (растворы желатина, поливинилпирролидона), которые, обволакивая эритроцитную мембрану, повышают ее стабильность при консервировании (Шевченко Ю.Л., Шабалин В.Н., Заривчатский М.Ф., Селиванов Е. А. Руководство по общей и клинической трансфузиологии. - СПб.: ООО «Фолиант», 2003. - С.127-128).

Недостатками существующих гемоконсервантов являются отсутствие влияния на процессы перекисного окисления липидов и образование свободных радикалов при хранении донорских эритроцитов, что неизбежно приводит к ускоренному старению клеток.

Технический результат заключается в пролонгировании сроков хранения морфо-функционально полноценных эритроцитов в донорской эритроцитной массе до 30 суток.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе консервирования донорской крови, включающем смешивание донорской крови с гемоконсервантом глюгицир, разделение полученной консервированной донорской крови на плазму и эритроцитную массу с последующим хранением эритроцитной массы, дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат из расчета 0,25 мг на 1 мл.

3-Окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат (мексидол) широко применяется в различных областях медицины. Благодаря своему механизму действия и широкому спектру фармокологических эффектов 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат оказывает коррегирующее влияние на основные процессы структурно-функциональной дезорганизации клеточных мембран эритроцитов и повреждения функций мембранносвязанных ферментов, связанные с усилением перекисного окисления липидов и свободно-радикального окисления при хранении компонентов донорской крови.

Способ осуществляют следующим образом.

Предложенные свойства 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1

Исследование влияния 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината проводилось в образцах эритроцитной массы (ЭМ), заготовленной на гемоконсерванте глюгицир, который содержал 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината. Контролем служила ЭМ, заготовленная на глюгицире без добавок. Исследования биохимических показателей эритроцитов проводили в образцах ЭМ сразу после заготовки, затем в процессе хранения при t=+4°C через 6 часов, 3 суток, 7 суток, 14 суток, 21 суток и 30 суток.

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по концентрации малонового диальдегида (МДА), который определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой по методике Л.И. Андреевой. Интенсивность свободно-радикального окисления (СРО) и суммарную общую антиоксидантную активность (ОАА) изучали на хемилюминомере Emilite-1105 (Латвия), совмещенном с персональным компьютером. Уровень каталазы определяли по методике М.А.Королюк и соавт.

Интенсификация СРО наблюдалась с первых часов хранения ЭМ. Усиление продукции свободных радикалов к 6 часам хранения было максимально выражено в образцах ЭМ с 0,25 мг 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината /мл - на 168% (р<0,0001), в то время как при хранении ее при больших концентрациях 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината (0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл) СРО снижалось на 16% и 4% соответственно.

К концу первой недели хранения активность СРО во всех опытных образцах была существенно ниже, чем в контрольных. Отмечена активизация СРО в группе с максимальной концентрацией (1,0 мг/мл) 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцината на 37% (р<0,001) и 48% (р<0,001) относительно образцов с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в гемостабилизаторе в 0,25 мг/мл и 0,5 мг/мл соответственно (табл.1).

Через 14 суток хранения уровень СРО в ЭМ, хранимой в глюгицире с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл, выравнился, но был достоверно на 171% (р<0,0001) и 135% (р<0,0001) соответственно выше, чем в образцах с содержанием 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 0,25 мг/мл. В группе с минимальной концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината активность СРО постепенно снижалась, достигнув минимума на 14 сутки (1,41±0,07 усл. ед., р<0,0001), и затем на протяжении всего срока хранения была достоверно минимальной (фиг.1).

При традиционном хранении МДА в ЭМ прогрессивно нарастал к 30 суткам в 4,8 раза. В опытных образцах на 3 сутки хранения регистрировали максимальное снижение МДА, причем наиболее максимальным (на 75%, р<0,001) оно было в образцах с содержанием 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в гемостабилизаторе 0,5 мг/мл. Показательным является значительное снижение уровня МДА в ЭМ начиная с 14 суток хранения в присутствии 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в минимальной концентрации (табл.2).

Проведя анализ динамики ПОЛ при хранении ЭМ, нами показана эффективность 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в качестве компонента гемоконсерванта с целью уменьшения активности ПОЛ. При этом выявлена оптимальная доза 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в глюгицире - 0,25 мг/мл.

В ответ на развитие деструктивных процессов в эритроцитах при хранении мгновенно реагирует ферментативное звено антиоксидантной защиты. В контрольных образцах ЭМ ОАА снижалась на 57% (р<0,001) к 30 суткам хранения от исходной величины (табл.3). В ЭМ с добавлением 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в дозе 0,25 мг/мл ОАА на 3 сутки остается на исходном уровне. В конце первой недели она постепенно начинала снижаться и достигала на 30 сутки семисуточного уровня контрольных образцов ЭМ. Образцы ЭМ с содержанием 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 0,5 мг/мл на протяжении всего срока хранения сохраняли уровень ОАА выше контрольного. К 30 суткам хранения этот уровень был на 166% (р<0,0001) выше, чем в образцах с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 0,25 мг/мл. В максимальной концентрации - 1,0 мг/мл - 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат способен активировать АОА в течение всего периода хранения ЭМ, в то время как в дозе 0,25 мг/мл снижает эффективность антиоксидантного воздействия к 14 суткам хранения (фиг.2).

Усиление антирадикальной защиты эритроцитов в процессе хранения проявлялось активацией антиперекисного фермента каталазы во всех образцах ЭМ. Пик каталазной активности регистрировался в образцах ЭМ 14 суток хранения, что позволяет предположить нарастание образования перекиси водорода в результате усиления ПОЛ на протяжении первых двух недель хранения (табл.4). Повышенный уровень активности каталазы в контрольной серии следует рассматривать как компенсаторное явление в ответ на более выраженное усиление продукции свободных радикалов и интенсификацию ПОЛ относительно опытной серии. При традиционном хранении ЭМ прогрессирование ПОЛ на поздних сроках хранения, вероятно, связано с дефицитом антиоксидантных ферментов. В образцах ЭМ 21 и 30 суток хранения отмечено достоверное снижение активности каталазы относительно образцов опытной серии, что приводит к срыву систем детоксикации в эритроцитах. Нормализующее влияние 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината предупреждает развитие аналогичных изменений в опытной серии образцов.

Таким образом, при хранении эритроцитной массы происходит интенсивное снижение АОА-защиты с активацией ПОЛ. Применение экзогенного антиоксиданта 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината позволяет снизить активность ПОЛ и уменьшить «нагрузку» на антиоксидантные системы эритроцитов. Введение 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в гемоконсервант оказывает выраженное мембранопротектерное действие и позволяет адаптировать форменные элементы крови к их жизни в условиях гипоксии. Минимальный уровень активации ПОЛ определялся в эритромассе при хранении ее с 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинатом в концентрации 0,25 мг/мл глюгицира, однако АОА была ниже, чем в других опытных образцах. Возможно, активация ПОЛ в группах с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 0,5 и 1,0 мг/мл глюгицира связана с ингибированием эндогенных антиоксидантов эритроцитов при введении больших доз экзогенных антиоксидантов по принципу «обратной связи». Исходя из изложенного мы рекомендуем заготовку эритроцитной массы на глюгицире, содержащем 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат в минимальной концентрации - 0,25 мг/мл глюгицира.

Пример 2

Влияние 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината на морфо-функциональную полноценность донорских эритроцитов исследовали путем определения содержания свободного гемоглобина бензидиновым методом, доли осмотически неустойчивых эритроцитов (по содержанию свободного гемоглобина после помещения эритроцитов в 0,6% раствор натрия хлорида), количества микросгустков (подсчет под микроскопом), среднего содержания гемоглобина в эритроците (МСН), среднего объема эритроцита (MCV) и ширины распределения эритроцитов (анизоцитоз) на гематологическом анализаторе МЕК-6410К (Япония). Хранение донорской эритроцитной массы сопровождается увеличением проницаемости клеточной мембраны, ростом осмотической неустойчивости эритроцитов и увеличением содержания свободного гемоглобина, что, вероятно, является следствием аккумулирования в клетках скрытых структурных повреждений, индуцированных активными формами кислорода и продуктами их реакций. При включении в состав гемоконсерванта «глюгицир» 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината происходит стабилизация этого процесса (табл.5). В первые 6 часов хранения число осмотически неустойчивых эритроцитов в контрольных образцах ЭМ превышает на 91% (р<0,0001), 90,1% (р<0,0001) и 87% (р<0,0001) их значения в соответствующих образцах с 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинатом в концентрациях 0,25 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. Аналогичные изменения прослеживаются в течение всего срока хранения ЭМ, что, вероятно, связано с повышением осмотической резистентности эритоцитов в присутствии 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината.

Содержание свободного гемоглобина к концу срока хранения в ЭМ увеличивалось в контроле в 20 раз (р<0,0001), а в образцах с 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинатом в концентрациях 0,25 мг/мл в 4 раза, 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл в 9 раз (р<0,0001) от исходного соответственно (табл.6). На 21 сутки хранения в ЭМ с добавлением 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в концентрации 0,25 мг/мл выявлялись минимальные значения свободного гемоглобина, которые составляли 62% (р<0,0001) и 70% (р<0,0001) от контрольного значения соответственно. На 30 сутки в контроле наблюдалась интенсификация выхода гемоглобина из эритроцитов, превышающая критически допустимые значения для гемотрансфузионных сред, тогда как в группах с добавлением 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината к концу срока хранения ЭМ соответствовала международным стандартам качества гемокомпонентов.

Значительное преимущество 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в концентрации 0,25 мг/мл, видимо, обусловлено его антигемолитическим и мембраностабилизирующим действием.

На всем этапе хранения средний объем эритроцитов (MCV) в ЭМ не превышал нормальных значений. К 30 суткам хранения в контрольных образцах MCV увеличился на 14% (р<0,05) от исходного. Наиболее выраженные изменения MCV зарегистрированы на 3-4 неделе хранения, достигая к 30 суткам верхней границы нормы. В опытных образцах ЭМ 2-3 недели хранения MCV различался в зависимости от концентрации 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината. К 30 суткам хранения MCV во всех опытных образцах соответствовал этому показателю третьей недели хранения контрольной серии (табл.7). В контрольных образцах ЭМ анизоцитоз эритроцитов до 21 суток сохранялся в пределах нормальных значений, но к 30 суткам он составил 157% (р<0,0001) от исходного. В опытных сериях этот показатель увеличивался лишь на 37% (р<0,001), 38% (р<0,001), 48% (р<0,001) при увеличении концентрации 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината с 0,25 мг/мл до 1,0 мг/мл от исходных соответственно и не превышал нормы к концу срока хранения. Минимальная выраженность анизоцитоза относительно контрольной серии и других опытных серий выявлена в образцах с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 0,25 мг/мл. На 30 сутки хранения ширина распределения эритроцитов данной группы соответствовала второй неделе хранения в контрольной серии и третьей неделе в серии с концентрацией 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината 1,0 мг/мл (табл.8).

Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН) на протяжении всего срока хранения во всех образцах ЭМ соответствовало нормальным значениям (табл.9).

Минимальное содержание микросгустков определялось в образцах с добавлением 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в концентрации 0,25 мг/мл. Динамические изменения гематологических показателей эритроцитов свидетельствуют о целесообразности применения 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината при консервировании ЭМ (табл.10).

Дополнительное применение 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцината в составе гемоконсерванта «глюгицир» позволяет пролонгировать сроки хранения донорских эритроцитов и снизить уровень деструктивных процессов в хранящейся до восстребования эритроцитной массе, повышается антиоксидантный статус эритроцитов, что позволяет защитить клеточные мембраны от повреждающего действия токсичных свободнорадикальных продуктов, препятствует образованию новых радикалов в процессе хранения гемокомпонента, превращает наиболее реакционно-способные радикалы в менее активные.

Способ консервирования донорской крови, включающий смешивание донорской крови с гемоконсервантом глюгицир, разделение полученной консервированной донорской крови на плазму и эритроцитную массу с последующим хранением эритроцитной массы, отличающийся тем, что дополнительно в состав гемоконсерванта глюгицир вводят 3-окси-6-метил-2-этил-пиридина сукцинат из расчета 0,25 мг на 1 мл.