Питательная среда для выращивания легионелл

Изобретение относится к биотехнологии для выращивания легионелл. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат легкого свиньи с содержанием аминного азота 0,10-0,14 мг%, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный, активированный уголь, L-цистеина гидрохлорид, эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов, агар микробиологический и дистиллированную воду. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания легионелл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, именно к получению питательных сред для выращивания легионелл.

Известна питательная среда для выращивания легионелл, основой которой является мясная вода до 1000,0 мл; пептон ферментативный 10,0 г; натрия хлорид 5,0 г; кровь 10, г; агар-агар 15,0-20,0 г рН 7,3±0,2. Среду автоклавируют 30 мин при температуре 121°С (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6. - 2008. - С.64-65.; С. - 269).

Недостатком данной среды является недостаточная эффективность.

Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде является среда, содержащая г/л: экстракт дрожжей 10,0 г; уголь активированный 2,0 г; ACES буфер (амино-2-оксиэтил-аминоэтан сульфоновая кислота) 10,0 г; а-кетоглуторат 1,0 г; L-цистеин 0,4 г; железа пирофосфат 0,25 г; агар-агар 15,0 г; дистиллированная вода до 1 л; рН 6,9±0,2. (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С.268-270).

Недостатком данной среды является дороговизна не производимого в РФ препарата.

Целью настоящего изобретения является конструирование качественной питательной среды животного происхождения, которая обеспечивает ростовые свойства легионелл.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат легкого свиньи; 0,01 М калий фосфатный буфер (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный), а также активированный уголь, L-цистеина гидрохлорид; дистиллированную воду, агар микробиологический с добавлением в среду эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

ферментативный гидролизат легкого свиньи
с содержанием аминного азота 0,10-0,14 мг%	260,0
калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,9
калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	2,2
активированный уголь	2,0
L-цистеина гидрохлорид	0,4
эмбриональный стимулятор роста
микроорганизмов	2,5
агар микробиологический	8,5
дистиллированная вода до	1 л.

Легкое свиньи ТУ-8-5344-113607. Биологическая ценность легкого свиньи, относящейся к субпродуктам II категории, состоит в наличии в среднем 13,6% белка, минеральные вещества легкого, состоящего из солей натрия, калия, кальция, фосфора и высокого содержания железа; общее их количество достигает 1%, 0,5-1,4% золы. Легкое содержит также витамины, микроэлементы, экстрактивные вещества Из белковых веществ в легком свиньи при ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серин, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин (И.В.Петрухин. Корма и кормовые добавки. Москва. Росагропромиздат. 1989. С. - 104-108).

Питательная среда в качестве стимулятора роста содержит эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов («Способ получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов» Патент РФ №2283347 - Опубл. 10.09.2006. - Бюл. №25).

Способ получения эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов заключается в следующем: проводят отбор свежих, неинфицированных куриных яиц, затем их инкубируют в течение 9 суток. Причем на 5, 6, 7 сутки куриные яйца облучают по 30 секунд при частоте модуляции 9 Гц и мощности излучения 9 мВт, затем куриные яйца охлаждают в течение 6-7 суток при температуре 2-4°С, проводят гомогенизацию, центрифугирование при 15000 об/мин, затем полученную массу фильтруют и подвергают тиндализации при температуре 60-65°С в течение 5-6 суток, фасуют и лиофилизируют.

Легионеллы являются факультативными внутриклеточными паразитами, поэтому растут в желточном мешке куриных эмбрионов, в культуре клеток животных и человека (фибробласты легкого) (Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник для студентов медицинских вузов /Под редакцией А.А.Воробьева. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: OOO »Медицинское информационное агентство», 2008. - С.-400).

Включение в состав среды калий фосфатного буфера 0,01 М (состав калий фосфатного буфера: калий фосфорнокислый 1-замещенный; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный) обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М., 1989). (М.С.Поляк; В.И.Сухаревич; М.Э.Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С.37-38).

При приготовлении питательной среды допускается применение только дистиллированной воды без применения растворов, содержащих ионы натрия, ввиду их губительного действия.

Сочетанное применение указанных компонентов обеспечивает получение чистых культур через 48 ч.

В отличие от прототипа, предлагаемая среда экономична, выгодна и обеспечивает оптимальные условия для размножения легионелл за 2-е суток.

Приготовление ферментативного гидролизата

Легкое свиньи в количестве 1 кг режут на кусочки размером 2×2 см, ссыпают в эмалированную кастрюлю, заливают водопроводной водой в количестве 1,5 л, варят в течение 10 мин, остужают до 46°С. Отвар сливают в 3 л стеклянный баллон. Остывшие кусочки легкого пропускают через мясорубку, затем помещают в баллон с отваром. Фермент панкреатин в количестве 9,5 г/л (или поджелудочную железу крупного рогатого скота, дважды пропущенную через мясорубку, в количестве 150 г/кг) помещают в баллон с фаршем легкого и отваром его. Доводят рН до 8,2±0,1 с помощью калия гидроокиси по фенолфталеину. В качестве консерванта добавляют хлороформ в количестве 1% к объему жидкости. Баллон закрывают ватно-марлевой пробкой, тщательно перемешивают и помещают в термокамеру при температуре 37±1°С. Содержимое баллона в течение суток перемешивают, через каждые 20±1 мин по 5 мин, а в последующие сутки через 1,5±0,2 ч по 5 мин. Динамику процесса гидролиза контролируют путем определения аминного азота. Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,5%-0,6% (через 5 суток). После этого подогрев и перемешивание прекращают, гидролизат отстаивают. Отстоявшийся верхний слой гидролизата декантируют с помощью резинового шланга и фильтруют через полотняный фильтр. Сбор фильтрата ведут в стеклянный баллон емкостью 3 л, для консервации добавляют хлороформ в количестве 1% к объему содержимого баллона, закрывают резиновой пробкой и транспортируют в холодовую камеру, где хранят при температуре от +2 до +8°С.

Питательную среду на ферментативной основе легкого свиньи для выращивания легионелл готовят следующим способом. Берут ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% 260,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; агар микробиологический 8,5; дистиллированную воду до 1 л. Смесь доводят до кипения и кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин, рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до 6,8±0,1 в количестве 5 мл. Приготовленную питательную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой Крафт. Стерилизуют при 1 атм. в течение 15 мин. После расплавления в кипящей водяной бане в остуженный до 56°С агар добавляют 0,4 г L-цистеина гидрохлорид и 2,5 мл эмбрионального стимулятора роста микроорганизмов, затем разливают в стерильные чашки Петри. Просушивают в течение 30 минут и используют для посева.

Эффективность полученной питательной среды оценивали в соответствии с методическими указаниями «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легиоиеллеза», (Москва, 2006), с использованием в качестве тест-культур легионелл Legionella pneumophilla АТСС 33155 Bloomington, Legionella pneumophilla ATCC 33152 Philadelphia.

Испытуемые культуры выращивали на пластинках плотного агара рН 6,8 при температуре 37°С 24 ч. Из суточных культур готовили 1 млрд. взвесь м.т. тест-штаммов, равной 10 ед. по оптическому стандарту мутности ОСО ГИСК им. Л.А.Тарасовича, затем серийными десятикратными разведениями в физиологическом растворе в объеме 4,5 мл доводили до содержания в 1 мл 10-⁷ 100 м.к. Из данных разведений взвесей культур высевали по 0,1 мл на 3 чашки Петри разлитого подсушенного агара. Посевы инкубировали при 37°С в течение 5 суток при ежедневном просмотре. Через 24-120 ч учитывали результаты путем подсчетов выросших колоний.

Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,100% 240,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,7; калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный 2,0; активированный уголь 1,0; L-цистеина гидрохлорид 0,2; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 0,5; агар микробиологический 6,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект был меньше, чем 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,12% - 260,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 0,9; калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный 2,2; активированный уголь 2,0; L-цистеина гидрохлорид 0,4; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 2,5; агар микробиологический 8,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект превышает 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде содержащей, г/л: ферментативный гидролизат из легкого свиньи, разбавленного дистиллированной водой до показания аминного азота 0,14% - 280,0 мл; калий фосфорнокислый 1-замещенный 1,1; калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный 2,4; активированный уголь 3,0; L-цистеина гидрохлорид 0,6; эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов 4,0; агар микробиологический 10,5; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов накопительный эффект наблюдался менее 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых колоний диаметром 1,-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Полученные результаты позволили определить оптимальный вариант питательной среды на ферментативной основе легкого свиньи (пример 2).

Предлагаемая среда качественная, в основу берется ферментативный гидролизат легкого свиньи, а в качестве стимулятора эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов.

Питательная среда для культивирования легионелл, содержащая питательную основу, активированный уголь, агар микробиологический и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит L-цистеина гидрохлорид, эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный, а в качестве питательной основы - ферментативный гидролизат легкого свиньи с содержанием аминного азота 0,10-0,14 мг% при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Ферментативный гидролизат легкого свиньи
с содержанием аминного азота 0,10-0,14 мг%	240,0-280,0
Калий фосфорнокислый 1-замещенный	0,7-1,1
Калий фосфорнокислый 2-замещенный
3-водный	2,0-2,4
Активированный уголь	1,0-3,0
L-цистеина гидрохлорид	0,2-0,6
Эмбриональный стимулятор роста
микроорганизмов	0,5-4,0
Агар микробиологический	6,5-10,5
Дистиллированная вода	до 1 л