Гемостимулирующее средство и способ стимуляции гемопоэза
Владельцы патента RU 2414926:
Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент") (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и гематологии. Средство для стимуляции гемопоэза представляет собой гиалуронидазу, иммобилизированную на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с молекулярной массой от 400 до 4000 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5 МэВ, с поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/час. Для стимуляции гемопоэза иммобилизированную вышеуказанным образом гиалуронидазу вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000 ЕД/кг. Использование иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы позволяет повысить безопасность и эффективность стимуляции гемопоэза. 2 н.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.
Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови и гематологических осложнений, в том числе ятрогенного характера, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых гемостимуляторов.
Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].
Наиболее близким по природе происхождения к предлагаемому средству является препарат нативной гиалуронидазы, конъюгированной с полиоксидонием путем химического синтеза [3].
Существует иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидаза, введение которой приводит к увеличению содержания прогениторных клеток в организме [4].
Авторами изобретения впервые выявлена выраженная гемостимулирующая активность иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата нативной гиалуронидазы, который вводят парентерально в дозе 1000 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2 дней [5].
Недостатком данного способа является его эффективность только в случае применения препарата гиалуронидазы в указанной высокой/токсичной дозе [5]. При этом использование данного средства даже в терапевтическом режиме зачастую приводит к развитию целого ряда побочных эффектов и осложнений [6, 7], связанных, в первую очередь, с его иммуногенностью.
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной гиалуронидазы и повышение безопасности и эффективности способа.
Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства. Препарат назначают парентерально либо перорально в дозе 10-1000 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 1-5 дней.
Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства.
Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронидазы [4] было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск). Иммобилизация гиалуронидазы осуществлялась на низкомолекулярном полиэтиленгликоле (400 до 4000 Да) направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.
На сегодняшний день показана возможность стимуляции миелопоэза с помощью высоких доз препарата нативной гиалуронидазы [5]. Кроме того, известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, что делает эффективным его применение в качестве средства, увеличивающего популяцию родоначальных клеток различных классов (в том числе гемопоэтических предшественников) в костном мозге, в низких дозах [4]. При этом согласно литературным сведениям пегилированные (конъюгированные с полиэтиленгликолем) белковые средства являются более безопасными, чем их неконъюгированные аналоги [8].
Тем не менее способность кроветворных стволовых клеток к реализации своего ростового потенциала, проявляющегося увеличением образования зрелых клеток крови за счет стимуляции процессов их дифференцировки под влиянием модифицированной (иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы, остается неизученной. В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [8, 9], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться непредсказуемыми изменениями не только стереохимической структуры исходных веществ, но и их функциональными характеристиками.
Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции гемопоэза на фоне снижения риска развития осложнений и побочных эффектов за счет уменьшения лекарственной нагрузки на организм, для специалиста является неочевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом:
Лабораторному животному 1 раз в сутки в течение 1-5 дней парентерально либо перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 10-1000 ЕД/кг.
Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 543 штук, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).
Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [10] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов [11].
Пример 1
Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили внутрибрюшинно (парентерально) 1 раз в сутки в течение 2-х дней препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) в дозах 1000 и 50 ЕД/кг (способ прототип) и препарат иммобилизированной гиалуронидазы внутрибрюшинно (парентарально) в дозе 50 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 2-х дней) и перорально в дозах 50 и 10 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 1 и 5 дней соответственно). При этом доза «Лидазы» в 1000 ЕД/кг в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная у препарата нативной гиалуронидазы.
Введение препарата нативной гиалуронидазы на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения, но только при использовании дозы 1000 ЕД/кг. В данном случае отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2). При этом указанные изменения сопровождались закономерным увеличением количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).
Вместе с тем эффективность применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) наблюдалась при ее использовании во всех режимах и способах введения (табл.1, 2, 3). При этом парентеральное введение 50 ЕД/кг имГД приводило к значительно более выраженному увеличению показателей активности кроветворения, чем при использовании в качестве гемостимулятора препарата нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг. Так, отмечалось более существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров, эритроидных клеток, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Аналогичные изменения имели место в периферической крови. Количество нейтрофилов, ретикулоцитов и эритроцитов значительно превосходило значения соответствующих показателей у животных, которым вводили «Лидазу» (табл.3). Кроме того, в отличие от стандартного препарата фермента использование имГД сопровождалось значительным увеличением числа тромбоцитов в периферической крови.
Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза оказывала выраженный стимулирующий эффект в отношении эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного (тромбоцитарного) ростков кроветворения. Причем, данное вещество приводило к максимально быстрому восстановлению показателей костного мозга и периферической крови при цитостатической миелосупрессии как при парентеральном, так и пероральном его использовании в низких дозах.
В целом, исходя из полученных данных следует, что средство, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на водорастворимом носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает выраженной гемостимулирующей активностью. При этом эффективность данного средства значительно превышает таковую у стандартных препаратов гиалуронидазы.
Цитируемая литература:
1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.
2. Волкова M.A. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.
3. Дубницкая Л.В., Назаренко Т.А. Возможности применения препарата Лонгидаза® в комплексной терапии патологических изменений эндометрия // Русский медицинский журнал. - 2008. - Т.16 - №19. - С.1248-1251.
4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.
5. Патент (RU) на изобретение №2336899 «Способ стимуляции миелопоэза», 2008 г. Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.
6. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.
7. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa^ JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.
8. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клин. фарм. 2008. Том 71. №1. С.61-69.
9. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биотехнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - №1-2. - С.256-264.
10. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.
| Таблица 1 | |||
| Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 105 неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) | |||
| Сроки исследования, сутки | КОЕ-Э | КОЕ-ГМ | |
| Фон | 6,75±0,73 | 4,50±0,38 | |
| 1 | 9,50±0,50* | 8,38±0,63* | |
| 3-е | 2 | 8,88±0,81 | 8,00±0,87* |
| 3 | 9,13±1,13* | 12,38±0,82*# | |
| 4 | 18,50±0,50*#$ | 17,00±0,53*#$ | |
| 5 | 14,38±1,00*#$ | 14,63±0,51*#$ | |
| 6 | 15,25±0,33*#$ | 16,25±0,86*#$ | |
| 1 | 7,25±0,70 | 6,63±0,73* | |
| 5-е | 2 | 7,50±0,53 | 5,75±0,75 |
| 3 | 10,13±0,44*# | 7,88±0,55* | |
| 4 | 14,88±0,44*#$ | 10,75±0,45*#$ | |
| 5 | 9,38±0,42*# | 8,75±0,49*# | |
| 6 | 12,25±0,65*#$ | 9,5±0,70*# | |
| 1 | 6,38±0,68 | 4,25±0,56 | |
| 10-е | 2 | 5,75±0,37 | 5,50±0,42 |
| 3 | 7,88±0,83 | 7,14±0,70* | |
| 4 | 10,00±0,71*# | 9,2±0,2*#$ | |
| 5 | 7,50±0,53 | 6,50±0,63* | |
| 6 | 12,1±0,33*#$ | 9,88±0,72*#$ | |
| Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, | |||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана. | |||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг |
| Таблица | |||||||
| Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии CBA\CaLac (×106/бедро) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) | |||||||
| Сроки исследования, сутки | Незрелые нейтрофильные гранулоциты | Зрелые нейтрофильные гранулоциты | Эозинофильные гранулоциты | Лимфоидные клетки | Моноциты | Эритроидные клетки | |
| фон | 1,10±0,10 | 3,72±0,31 | 0,47±0,09 | 3,38±0,30 | 0,48±0,06 | 1,77±0,32 | |
| 3-е | 1 | 0,04±0,01* | 0,11±0,04* | 0 | 1,87±0,15* | 0,55±0,04 | 0,18±0,05* |
| 2 | 0,05±0,02* | 0,16±0,03* | 0 | 1,57±0,13* | 0,60±0,11 | 0,13±0,03* | |
| 3 | 0,13±0,03*# | 0,15±0,04* | 0 | 1,36±0,10*# | 0,42±0,09 | 0,31±0,02*# | |
| 4 | 0,14±0,05*# | 0,17±0,04* | 0 | 1,29±0,12*# | 0,61±0,06 | 0,28±0,02*# | |
| 5 | 0,15±0,02*# | 0,11±0,02* | 0,01±0,01* | 1,36±0,07*# | 0,36±0,04# | 0,30±0,01*# | |
| 6 | 0,17±0,11*# | 0,10±0,01* | 0,01±0,01* | 1,35±0,14*# | 0,39±0,11 | 0,45±0,02*# | |
| 5-е | 1 | 4,22±0,26* | 1,45±0,26* | 0,30±0,08 | 2,03±0,21* | 0,86±0,08* | 1,04±0,16 |
| 2 | 4,82±0,46* | 1,69±0,23* | 0,07±0,07* | 2,66±0,26 | 0,98±0,20* | 1,27±0,28 | |
| 3 | 6,31±0,52*# | 2,2±0,11*# | 0,12±0,08 | 2,28±0,36 | 1,29±0,15* | 1,98±0,30# | |
| 4 | 8,49±0,50*# | 3,98±0,33# | 0,17±0,10 | 2,62±0,23 | 2,14±0,22*#$ | 2,78±0,19#$ | |
| 5 | 5,77±0,44*# | 3,26±0,29# | 0,31±0,08 | 2,88±0,09 | 0,90±0,12* | 1,74±0,08# | |
| 6 | 6,01±0,46*# | 2,26±0,26# | 0,15±0,08* | 2,15±0,18 | 1,07±0,15* | 2,09±0,29# | |
| 10-е | 1 | 1,00±0,18 | 6,65±0,45* | 0,76±0,45 | 1,82±0,25* | 0,60±0,09 | 0,35±0,06* |
| 2 | 0,80±0,11 | 6,57±0,53* | 0,51±0,10 | 1,87±0,17* | 0,66±0,14 | 0,39±0,03* | |
| 3 | 0,99±0,06 | 6,11±0,57* | 0,33±0,10 | 2,39±0,50 | 0,94±0,21 | 1,29±0,19# | |
| 4 | 0,97±0,13 | 6,32±0,48* | 0,53±0,12 | 3,35±0,65# | 1,00±0,09*# | 3,71±0,02*#$ | |
| 5 | 0,74±0,05 | 6,13±0,68* | 0,29±0,10 | 2,49±0,56 | 1,39±0,26*# | 2,63±0,22*#$ | |
| 6 | 0,86±0,13 | 5,78±0,34* | 0,21±0,06 | 2,45±0,32 | 1,49±0,16*# | 3,1±0,15*#$ | |
| Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, | |||||||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана | |||||||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалупонидазы в дозе 1000 ЕД/кг |
| Таблица 3 | ||||||
| Показатели периферической крови у мышей линии CBA\CaLac после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) | ||||||
| Сроки исследования, сутки | Эритроциты, Т/л | Ретикулоциты, в промиллях | Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л | Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л | Тромбоциты, Т/л | |
| Фон | 8,61±0,18 | 14,1±0,3 | 0,40±0,06 | 2,26±0,02 | 796,57±77,49 | |
| 1 | 7,89±0,28* | 10,7±0,24* | 0,01±0,01* | 0,12±0,03* | 503,80±25,97* | |
| 3-е | 2 | 7,19±0,21* | 9,89±0,37* | 0,01±0,01* | 0,13±0,03* | 557,83±46,69* |
| 3 | 7,84±0,25* | 12,8±0,6*# | 0,02±0,01* | 0,17±0,02* | 505,67±24,25 * | |
| 4 | 7,69±0,14* | 14,7±0,52#$ | 0,02±0,01* | 0,15±0,01* | 568,17±22,60* | |
| 5 | 7,59±0,18* | 12,3±0,41*# | 0,04±0,02* | 0,14±0,06* | 560,67±36,33* | |
| 6 | 7,54±0,45* | 12,7±0,38*# | 0,02±0,01* | 0,15±0,01* | 509,83±58,60* | |
| 1 | 7,53±0,15* | 28,4±1,3* | 0,16±0,04* | 0,75±0,23* | 349,40±36,84* | |
| 5-е | 2 | 7,85±0,27* | 27,6±2,4* | 0,13±0,05* | 0,65±0,10* | 393,33±33,96* |
| 3 | 8,59±0,12# | 37,5±1,89*# | 0,41±0,08# | 1,7±0,16# | 321,60±23,22* | |
| 4 | 9,53±0,35*#$ | 41,2±1,3*# | 0,83±0,25*#$ | 2,47±0,16#$ | 672,83±22,69#$ | |
| 5 | 8,06±0,30 | 34,5±0,96*# | 0,99±0,31*#$ | 1,69±1,12# | 450,83±11,12*# | |
| 6 | 9,13±0,08*# | 32,7±2,3*# | 1,03±0,21*#$ | 1,79±0,14# | 727,67±74,10# | |
| 1 | 7,29±0,18* | 15,6±1,4 | 1,31±0,32* | 5,13±0,63* | 977,33±27,66 | |
| 10-е | 2 | 7,18±0,15* | 16,7±0,78* | 1,71±0,42* | 5,36±1,15* | 843,33±100,51 |
| 3 | 7,33±0,15* | 16,4±0,97* | 1,17±0,23* | 7,42±0,18*# | 884,17±33,78 | |
| 4 | 8,14±0,17$ | 24,3±1,7*#$ | 1,25±0,14* | 8,50±0,37*#$ | 1143,17±38,51*#$ | |
| 5 | 7,36±0,29* | 19,4±0,45*#$ | 1,18±0,24* | 7,93±0,65*# | 1367,80±101,30*# | |
| 6 | 8,53±0,18 | 26,7±1,84*#$ | 1,48±0,26* | 8,67±0,42*#$ | 803,83±98,77 | |
| Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, | ||||||
| # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана, | ||||||
| $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг |
1. Средство для стимуляции гемопоэза, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с молекулярной массой от 400 до 4000 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5МэВ с поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч.
2. Способ стимуляции гемопоэза, включающий введение препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют иммобилизированную гиалуронидазу по п.1, которую вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000ЕД/кг.
