Способ получения "искусственных семян" из культуры корня шлемника байкальского (scutellaria baicalensis georgi)
Владельцы патента RU 2415928:
Учреждение Российской академии наук Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (RU)
Корни шлемника байкальского разрезают на сегменты размером 2-3-мм. Полученные сегменты капсулируют в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран. Концентрация клафорана составляет 300-550 мг/л. Способ позволяет получить оздоровленную культуру, не проявляющую признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющую более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. Полученные «искусственные семена» сохраняют жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур. 1 ил., 2 табл.
Область применения.
Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в промышленном производстве лекарственного сырья корневого происхождения для фармакологической, пищевой и косметологической отраслей.
Уровень техники.
Идея создания так называемых «искусственных семян» (ИС) возникла при культивировании соматических эмбрионов растений, которые заключали в искусственный эндосперм и ограничивали искусственной семенной оболочкой [Murashige Т. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In Frontiers of Plant Tissue Culture, edited by T.Thrope, pp.15-26, Calgary: International Association of Plant Tissue Culture (1978)].
В дальнейшем понятие ИС было расширено, и в настоящее время искусственными семенами называются капсулированные в гелевую оболочку не только соматические эмбрионы, но и пазушные и верхушечные почки, стеблевые и корневые сегменты, предназначенные для последующего культивирования в условиях in vitro или in vivo. В ИС копируется строение растительного семени. ИС состоит из растительной части (соматического эмбриона, почки и т.д.), капсулы (эндосперм) и иногда семенной оболочки. В семени содержатся все питательные вещества, необходимые для развития проростка. Оболочка семени защищает зародыш от высыхания и от заражения микроорганизмами.
В настоящее время техника капсулирования растительного материала используется при изготовлении ИС в основном из соматических эмбрионов и надземных частей растений.
Имеется несколько японских работ по инкапсулированию фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней (называемых также культурой корня) хрена обыкновенного (Armoracia rusticana) [Uozumi N., Nakasbimada Y., Kato Y., Andy Kobayasbi T. Production of artificial seed from horseradish hairy root. J. Ferment. Bioeng., 74: 21-26 (1992)]. А также живучки ползучей (Ajuga reptans) [Uozumi N., Ohtake A., Nakashmada Y., Morikawa Y., Tanaka N., Kobayashi T. Efficient Regeneration from GUS-Transformed Ajuga Hairy Roots. J. Ferment Bioeng. 81: 374-378 (1996)].
Кроме того, проводились исследования возможного применения метода инкапсулирования фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней для подготовки их к криосохранению на примере культуры корня барвинка малого (Vinca minor) [Hirata K., Mukai M., Goda S., Ishio-Kinugasa M., Yoshida K., Sakai A., Miyamoto K. Cryopreservation of hairy root cultures of Vinca minor (L.) by encapsulation-dehydration. Biotechnology Letters 24: 371-376, 2002.].
В вышеуказанных работах решались задачи микроклонального размножения растений и криосохранения растительного материала.
Однако при выращивании культуры корня шлемника байкальского основной задачей является периодическое оздоровление длительно культивируемых корней, элиминирование случайно внесенной или эндогенной бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.
Задача.
Задачей создания нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) является оздоровление культуры корня, элиминирование бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.
Решение задачи.
Поставленная задача решается использованием нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающемся в сегментировании корней на 2-3 мм фрагменты, их капсулировании в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.
Сущность изобретения.
Сущность нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского заключается в иммобилизации при низких положительных температурах фрагментов молодых участков корней в гелевых капсулах, содержащих питательные вещества и антибиотик. Локальное действие антибиотика способствует более точному проникновению в клетки корней и элиминированию эндогенной бактериальной инфекции. Питательные вещества гелевого матрикса поддерживают жизнеспособность корневых фрагментов при их хранении в условиях низких положительных температур, а отсутствие в ИС экзогенных регуляторов роста не изменяет морфологию корней и состав их вторичных метаболитов. Таким образом, при воспроизведении культуры корня шлемника байкальского из ИС можно получить оздоровленную, хорошо растущую и продуктивную массу корней.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Искусственные семена получают из культуры корня шлемника байкальского, культивируемой в условиях in vitro, но содержащую случайно внесенную или эндогенную бактериальную инфекцию.
Периферийные участки корней вручную разрезают на фрагменты длиной 2-3 мм, которые затем смешивают с гелеподобным 3,5% раствором Na-альгината, содержащим питательные вещества культуральных сред без добавления гормональных регуляторов роста. В состав гелевого матрикса также входит антибиотик клафоран (cefotaxime) в концентрации 450 мг/л. Для закрепления геля и образования капсул используют 70 мМ раствор CaCl2 - время выдерживания капсул в растворе CaCl2 составляет 8-10 минут, после чего их промывают дистиллированной водой. Для избежания преждевременного прорастания ИС (см. чертеж) помещают на хранение в стерильные чашки Петри без питательной среды в условия низких положительных температур на 2-6 недель, проводя, таким образом, иммобилизацию корневых фрагментов. Состав питательной среды гелевого матрикса.
| Среда Гамборга (В-5) | мг/л |
| сахароза | 20000 |
| NaH2PO4·2H2O | 169 |
| KNO3 | 250 |
| (NH4)2SO4 | 134 |
| MgSO4·7H2O | 250 |
| CaCl2 | 150 |
| MnSO4·4H2O | 13,6 |
| Н3ВО3 | 3 |
| ZnSO4·7H2O | 2 |
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 |
| CoCl2·6H2O | 0,025 |
| CuSO4·5H2O | 0,025 |
| KI | 0,75 |
| тиамин | 10 |
| пиридоксин | 1 |
| никотиновая кислота | 1 |
| мезоинозит | 100 |
| клафоран | 450 |
При переносе ИС после хранения при пониженных положительных температурах на питательную среду в условия +26°С активизируются корневые меристемы инкапсулированных фрагментов, что на 3-4-й день приводит к прорастанию корней через альгинатную оболочку и образованию хорошо растущей массы ветвящихся корней.
Разный состав питательных веществ гелевого матрикса ИС приводит к различной всхожести ИС после хранения при низких положительных температурах. Корневые фрагменты шлемника байкальского лучше сохраняются в оболочке со средой Гамборга (В-5), чем с другими питательными средами.
Проросшие молодые корневые кончики отделяют и помещают в жидкую питательную среду того же состава и культивируют в условиях качания (90 об/мин) в темноте до образования хорошо растущей массы корней (3-4 недели). Для контроля стерильности полученных таким образом из ИС корневых культур берут пробы культуральной среды на контаминацию. Установлено, что даже после 2-недельной иммобилизации инфицированных корневых фрагментов в оболочке, содержащей антибиотик, ИС дают начало обновленной корневой культуре шлемника байкальского, сохраняющей стерильность в течение последующих пассажей.
Ростовая активность и масса обновленной культуры корня шлемника байкальского, полученной из ИС, в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корней того же возраста, а общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы становится почти в 3 раза выше. Таким образом, общая продуктивность культуры корня существенно возрастает.
Результаты примера 1 представлены в таблицах 1 и 2.
Пример 2.
Аналогично примеру 1, за исключением уменьшенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 300 мг/л.
При концентрации антибиотика клафоран ниже 300 мг/л элиминирования бактериальной инфекции не происходит.
Результаты примера 2 представлены в таблицах 1 и 2.
Пример 3.
Аналогично примеру 1, за исключением увеличенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 550 мг/л.
При концентрациях более высоких, чем 550 мг/л, всхожесть ИС снижается вследствие ингибирования прорастания корневых сегментов, что уменьшает выход оздоровленного растительного материала.
Результаты примера 3 представлены в таблицах 1 и 2.
Результаты изобретения.
Как видно из таблицы 1, повышение концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе ИС приводит к снижению всхожести ИС при хранении в условиях низких положительных температур. Понижение же содержания антибиотика ведет к риску недостаточного элиминирования бактериальной инфекции в культуре корня шлемника байкальского.
В таблице 2 приведены основные показатели продуктивности культуры корня шлемника байкальского. Как можно видеть, обновленная культура корня, полученная из ИС, по ростовой активности и массе корней в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корня того же возраста, которая была ослаблена внезапно проявившейся бактериальной инфекцией. Кроме того, общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы в обновленной культуре корня шлемника байкальского становится почти в 3 раза выше, и соответствует содержанию флавонов в стабильно растущей исходной неинфицированной культуре.
С помощью способа получения ИС из длительно растущей культуры корня шлемника байкальского получена оздоровленная культура, не проявляющая признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющая более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. В ИС сохраняется стерильность и жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур.
| Таблица 1. | |||
| Жизнеспособность ИС в зависимости от концентрации антибиотика в гелевом матриксе и сроков хранения при низких положительных температурах. | |||
| Концентрация антибиотика клафоран в оболочке ИС, мг/л | Всхожесть ИС после разных сроков хранения, % | ||
| 2 недели | 4 недели | 6 недель | |
| 300 | 90 | 85 | 85 |
| 450 | 90 | 82 | 80 |
| 550 | 80 | 75 | 70 |
| Таблица 2. | |||
| Сравнительная оценка продуктивности 6-недельной культуры корня шлемника байкальского, выращиваемой в колбах, до и после применения нового способа получения ИС. | |||
| Основные показатели | Исходная неинфицированная корневая культура | Инфицированная корневая культура до обновления | Корневая культура, полученная из ИС |
| Сырой вес корней, г | 18,5±1,3 | 11,4±1,3 | 19,3±1,5 |
| Доля сухого вещества, % | 6,3±0,2 | 9,9±0,2 | 6,4±0,2 |
| Содержание основных флавонов, мг/г сух.в. | 22,4±0,2 | 8,2±0,1 | 21,4±0,4 |
| Содержание флавонов в 6-недельной культуре, мг/колба | 26,1±0,3 | 9,3±0,2 | 26,4±0,4 |
Способ получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающийся в сегментировании корней на 2-3-мм фрагменты, капсулировании их в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.
