Молекулы химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты, которые опосредуют интерференцию рнк

Авторы патента:

МОРРИСИ Дэвид (US)

МакСВИДЖЕН Джеймс (US)

БЕЙДЖЕЛМАН Леонид (US)

C12N15/11 - фрагменты ДНК или РНК; их модифицированные формы (ДНК или РНК, не используемые в рекомбинантном методе C07H 21/00)

A61K31/7088 - соединения, содержащие три или более нуклеозида или нуклеотида

Владельцы патента RU 2418068:

СИРНА ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК. (US)

Настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей смысловую цепь и антисмысловую цепь:

а также к композиции, включающей такую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Представленная молекула нуклеиновой кислоты позволяет опосредовать активность РНК-мишени путем интерференции РНК и обладает повышенной стабильностью и активностью in vivo. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 43 ил., 8 табл.

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США № 11/299254, зарегистрированной 8 декабря 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/234730, зарегистрированной 23 сентября 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/205646, зарегистрированной 17 августа 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 11/098303, зарегистрированной 4 апреля 2005 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/923536, зарегистрированной 20 августа 2004 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/16390, зарегистрированной 24 мая 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/826966, зарегистрированной 16 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/757803, зарегистрированной 14 января 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/720448, зарегистрированной 24 ноября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/693059, зарегистрированной 23 октября 2003 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/444853, зарегистрированной 23 мая 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05346, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, и частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US03/05028, зарегистрированной 20 февраля 2003 года, где в двух последних документах заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/358580, зарегистрированной 20 февраля 2002 года, предварительной заявки на патент США 60/363124, зарегистрированной 11 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/386782, зарегистрированной 6 июня 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/406784, зарегистрированной 29 августа 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/408378, зарегистрированной 5 сентября 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/409293, зарегистрированной 9 сентября 2002 года, и предварительной заявки на патент США № 60/440129, зарегистрированной 15 января 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US04/13456, зарегистрированной 30 апреля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/780447, зарегистрированной 13 февраля 2004 года, которая является частичным продолжением заявки на патент США № 10/427160, зарегистрированной 30 апреля 2003 года, которая является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US02/15876, зарегистрированной 17 мая 2002 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/292217, зарегистрированной 18 мая 2001 года, предварительной заявки на патент США № 60/362016, зарегистрированной 6 марта 2002 года, предварительной заявки на патент США № 60/306883, зарегистрированной 20 июля 2001 года, и предварительной заявки на патент США № 60/311865, зарегистрированной 13 августа 2001 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 10/727780, зарегистрированной 3 декабря 2003 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением Международной патентной заявки № PCT/US05/04270, зарегистрированной 9 февраля 2005 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/543480, зарегистрированной 10 февраля 2004 года. Настоящая заявка также является частичным продолжением заявки на патент США № 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 года, в которой заявляется полезность предварительной заявки на патент США № 60/652787, зарегистрированной 14 февраля 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/678531, зарегистрированной 6 мая 2005 года, предварительной заявки на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 года, и предварительной заявки на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 года. В настоящей заявке утверждается полезность всех перечисленных заявок, которые в этой связи включены в качестве ссылок в материалы настоящей заявки полностью, включая имеющиеся в них чертежи и рисунки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам исследования, диагностики и лечения признаков, заболеваний и состояний, которые являются ответом на модуляцию экспрессии генов и/или их активности. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются ответом на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в механизмы генной экспрессии или другие клеточные процессы, которые опосредуют поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Конкретно, настоящее изобретение относится к двухцепочечным молекулам нуклеиновой кислоты, включающим малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие интерферирующие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), молекулы короткой интерферирующей РНК (киРНК), молекулы РНК двухцепочечной (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и молекулы короткой шпилечной РНК (кшРНК), которые способны быть посредниками в процессе интерференции РНК (РНКи), направленной против генной экспрессии, включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидные наночастичные композиции (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК и другие, которые способны ингибировать функцию молекул эндогенной РНК, таких как эндогенная микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенная короткая интерферирующая РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC), с достижением модуляции генной экспрессии за счет создания препятствий осуществлению регуляторной функции в случае таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC), включая коктейли таких малых молекул нуклеиновой кислоты и липидных наночастичных композиций (ЛНЧ) на основе таких малых молекул нуклеиновой кислоты. Указанные малые молекулы нуклеиновой кислоты используются, например, при создании композиций, действующих в направлении предупреждения, ингибирования или снижения выраженности различных заболеваний, признаков и состояний, которые ассоциированы с экспрессией или активностью гена у субъекта или в организме.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ниже приводится обсуждение информации, относящейся к РНКи. Данное обсуждение приводится лишь для пояснения рассматриваемого изобретения. Соответственно, нижеследующее описание не является прямым указанием на то, что приведенная в нем информация отражает достигнутый уровень техники, предшествующий заявленному изобретению.

Интерференция РНК относится к процессу специфичного по последовательности посттранскрипционного молчания гена у животных, который сопряжен с участием в нем коротких интерферирующих молекул РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13:139-141; и Strauss, 1999, Science, 286, 886). Соответствующий процесс в растениях (Heifetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/61631) известен как посттранскрипционное молчание гена, или молчание РНК, а также как процесс подавления гена, применительно к грибам. Процесс посттранскрипционного молчания гена, как считается, представляет собой эволюционно законсервативный механизм клеточной защиты, используемый организмом для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и представляет собой общий механизм для различных представителей растительного и животного миров (Fire et al., 1999, Trend genet., 15, 358). Такой путь защиты от экспрессии чужеродного гена мог возникнуть в ответ на продукцию двухцепочечных РНК (дцРНК), в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозоновых элементов в геном организма-хозяина, по механизму клеточного ответа, направленного на специфическое разрушение гомологичной одноцепочечной РНК или вирусной геномной РНК. Наличие дцРНК в клетках запускает ответный процесс РНКи по механизму, который до сих пор полностью не изучен. Указанный механизм, по всей видимости, отличается от других известных механизмов, которые вовлекают рибонуклеазы, специфичные для двухцепочечной РНК, таких как реакция интерферона, которая является результатом дцРНК-опосредованной активации протеинкиназы PKR и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, приводящей к неспецифическому расщеплению мРНК рибонуклеазой L (см., например, патенты США №№ 6107094; 5898031; Clemens et al., 1997, J. Interferon & Сytokine Res., 17, 503-524; Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189).

Наличие длинных дцРНК в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, известного как дайсер (Dicer) (Bass, 2000, Cell, 101, 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Дайсер вовлекается в механизм процессинга дцРНК с образованием коротких участков дцРНК, известных как короткие интерферирующие РНК (киРНК) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Короткие интерферирующие РНК, возникающие в результате активности фермента дайсер, содержат в типичном случае от примерно от 21 до примерно 23 нуклеотидов в длину и включают дуплекс из примерно 19 пар оснований (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Дайсер также вовлекается в процесс удаления малых временных РНК длиной 21 и 22 нуклеотида (мвРНК) из молекулы РНК-предшественника с консервативной структурой, которая вовлекается в контроль трансляции (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). Реакция по типу РНКи также приводит к образованию эндонуклеазного комплекса, известного как РНК-индуцированный молчащий комплекс (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечных РНК, содержащих последовательность, комплементарную к антисмысловой цепи дуплекса киРНК. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного к антисмысловой цепи дуплекса киРНК (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).

Процесс РНКи исследовали на множестве различных систем. Файр с соавт. (Fire et al., 1998, Nature, 391, 806) первыми обнаружили РНКи в C. elegans. Бахрамиан и Зарби, а также Вианни и Гетц (Bahramian and Zarbi, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 и Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70) описали функционирующие в системах млекопитающих РНКи, опосредованные дцРНК. Хаммонд с соавт. (Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293) описали РНКи в клетках Drosophila, трансфицированных дцРНК. Элбашир с соавт. и Тушл с соавт. (Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описали РНКи, индуцированную введением дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культуры клеток млекопитающих, включающих эмбриональные клетки почки человека и клетки HeLa. Последние работы, проведенные на лизатах эмбриональных клеток Drosophila (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164), позволили выявить ряд требований к длине киРНК, ее структуре, химическому составу и последовательности, которые являются обязательными для эффективного проявления активности РНКи. Данные исследования показали, что 21-нуклеотидные дуплексы киРНК в основном являются активными в том случае, когда они содержат 3'-концевые динуклеотидные выступающие фрагменты. Кроме того, полное замещение одной или обеих цепей киРНК 2'-дезокси- (2'-H) или 2'-О-метилнуклеотидами удаляет активность РНКи, тогда как, по результатам проведенных исследований, замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих фрагментов киРНК 2'-дезоксинуклеотидами (2'-H) не устраняет активность. Кроме того, было показано, что единичные ошибочные спаривания в последовательностях, расположенных в центре дуплекса киРНК, также удаляют активность РНКи. Дополнительно, проведенные исследования также показали, что положение сайта расщепления в целевой РНК определяется 5'-концом ведущей последовательности киРНК, а не 3'-концом указанной ведущей последовательности (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877). Результаты других исследований показали, что 5'-фосфат в комплементарной цепи-мишени дуплекса киРНК необходим для осуществления активности киРНК, а также продемонстрировали, что АТФ используется для поддержания 5'-фосфатного фрагмента в киРНК (Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309).

Проведенные исследования показали, что замещение 3'-концевых нуклеотидных выступающих сегментов 21-нуклеотидного дуплекса киРНК, содержащего динуклеотидные выступающие 3'-фрагменты с дезоксирибонуклеотидами, не оказывает неблагоприятного эффекта на активность РНКи. Было также показано, что замещение вплоть до четырех нуклеотидов на каждом конце киРНК дезоксирибонуклеотидами хорошо переносится, тогда как полное замещение дезоксирибонуклеотидами приводит к устранению активности РНКи (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877 и Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164). Кроме того, Элбашир с соавт. (Elbashir, et al., выше) также сообщили, что замещение киРНК 2'-O-метилнуклеотидами полностью подавляет активность РНКи. Ли с соавт. и Бич с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914 и Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) ранее предположили, что киРНК может включать модификации либо фосфатно-сахарного скелета, либо нуклеозида, которые включают по меньшей мере один гетероатом азота или серы, однако ни в одной из заявок не было установлено, в какой мере такие модификации могут быть толерантными для молекул киРНК, а также не было приведено каких-либо указаний или соответствующих примеров относительно таких модифицированных киРНК. Кройтцер с соавт. (Kreutzer et al., публикация на патент Канады № 2359180) также описали некоторые химические возможные для использования в конструкциях дцРНК модификации, которые могут противодействовать активации зависимой от двухцепочечной РНК протеинкиназы PKR, конкретно, за счет наличия 2'-амино- или 2'-О-метилнуклеотидов и нуклеотидов, содержащих 2'-О- или 4'-С-метиленовый мостик. Однако Крейцер с соавт. (Kreutzer et al.) также не привели какие-либо примеры или соответствующие руководства, позволяющие определить, до какой степени такие модификации будут толерантными для молекул дцРНК.

Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) проанализировали некоторые химические модификации, введенные в unc-22 ген из C. elegans с использованием длинных (>25 нуклеотидов) транскриптов киРНК. Авторы описали введение тиофосфатных остатков в такие транскрипты киРНК путем встраивания тиофосфатных аналогов нуклеотидов с использованием Т7 и Т3 РНК-полимеразы и показали, что РНК с двумя модифицированными фосфоротиоатом основаниями характеризуются значительным снижением эффективности РНКи. Кроме того, Парриш с соавт. (Parrish et al.) сообщили, что фосфоротиоатная модификация более чем двух остатков очень сильно дестабилизирует РНК in vitro, так что при этом интерферирующая активность не может быть даже оценена (Id. at 1081). Авторы также проанализировали некоторые модификации в 2'-положении нуклеотидного сахара в длинных транскриптах киРНК и обнаружили, что замещение рибонуклеотидов дезоксинуклеотидами приводит к значительному снижению интерферирующей активности, особенно в случае замены уридина на тимидин и/или цитидина на дезоксицитидин. Кроме того, авторы проанализировали некоторые модификации оснований, включая замещения в смысловых и антисмысловых киРНК, урацила на 4-тиоурацил, 5-бромурацил, 5-йодурацил и 3-(аминоаллил)урацил и гуанозина на инозин. В то время как замещения 4-тиоурацилом и 5-бромурацилом были, по всей видимости, толерантными для исследованных молекул, Парриш (Parrish) сообщил, что введение инозина приводит к значительному снижению интерферирующей активности при его включении в любую цепь. Кроме того, Парриш (Parrish) сообщил также, что включение 5-йодурацила и 3'-(аминоаллил)урацила в антисмысловую цепь также приводит к значительному снижению активности РНКи.

Было описано использование более длинных фрагментов дцРНК. Так, например, Бич с соавт. (Beach et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают специфические методы снижения генной экспрессии с использованием дцРНК эндогенного происхождения. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/75164) описывают систему РНКи в клетках Drosophila in vitro и использование специфических молекул киРНК для некоторых функциональных геномных и некоторых терапевтических направлений использования; хотя Тушл (Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245) высказывает сомнение относительно того, что РНКи может использоваться для лечения генетически обусловленных заболеваний или вирусных инфекций в связи с опасностью активации интерферонового ответа. Ли с соавт. (Li et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/44914) описывают использование специфических длинных (141 п.о.-488 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора, для снижения экспрессии некоторых целевых генов. Зерницка-Гетц с соавт. (Zernicka-Goetz et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/36646) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии определенных генов в клетках млекопитающих с использованием ряда длинных (550 п.о.-714 п.о.) молекул дцРНК, синтезированных энзиматически или экспрессированных на основе вектора. Файр с соавт. (Fire et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/32619) описывают некоторые способы введения ряда длинных молекул дцРНК в клетки с целью применения их для ингибирования экспрессии генов в нематодах. Плетинк с соавт. (Plaetinck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/01846) описывают некоторые способы идентификации специфических генов, ответственных за определенный фенотип клетки, с использованием специфических длинных молекул дцРНК. Мелло с соавт. (Mello et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/29058) описывают идентификацию специфических генов, вовлекаемых в дцРНК-опосредованную РНКи. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) описывают некоторые длинные (по меньшей мере содержащие 200 нуклеотидов) конструкции дцРНК. Дешам Дэпайет с соавт. (Deschamps Depaillette et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/07409) описывают специфические композиции, состоящие из некоторых молекул дцРНК, объединенных с некоторыми антивирусными агентами. Ватерхаус с соавт. (Waterhouse et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 99/53050 и 1998, PNAS, 95, 13959-13964) описывают некоторые способы снижения фенотипической экспрессии нуклеиновой кислоты в растительных клетках с использованием некоторых дцРНК. Дрисколл с соавт. (Driscoll et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/49844) описывают специфические конструкции экспрессии ДНК, которые при их использовании способствуют молчанию генов в целевых организмах.

В литературе имеются также другие публикации по различным системам РНКи и молчащим генам. Например, Парриш с соавт. (Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1077-1087) описывают специфические химически модифицированные конструкции дцРНК, действие которых направлено на unc-22 ген из C. elegans. Гроссниклаус (Grossniklaus, публикация по Международной заявке PCT № WO 01/38551) описывает некоторые способы регуляции экспрессии генов polycomb с использованием некоторых дцРНК. Чуриков с соавт. (Churikov et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/42443) описывают некоторые способы модификации генетических характеристик организмов с использованием некоторых дцРНК. Когони с соавт. (Cogoni et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/53475) описывают некоторые способы выделения молчащего гена из Neurospora и их использование. Рид с соавт. (Reed et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/68836) описывают некоторые способы достижения молчания генов в растениях. Хонер с соавт. (Honer et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/70944) описывают некоторые способы скрининга лекарственных препаратов с использованием трансгенных нематод на моделях болезни Паркинсона с использованием некоторых дцРНК. Дик с соавт. (Deak et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/72774) описывают некоторые генные продукты из клеток Drosophila, которые могут иметь отношение к РНКи в Drosophila. Арндт с соавт. (Arndt et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/92513) описывают некоторые способы воздействия на супрессию гена с использованием факторов, усиливающих РНКи. Тушл с соавт. (Tuschl et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/44321) описывают некоторые синтетические конструкции киРНК. Пачук с соавт. (Pachuck et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 00/63364) и Сатишчандран с соавт. (Satishchandran et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 01/04313) описывают некоторые способы и композиции, используемые для ингибирования функций некоторых полинуклеотидных последовательностей, с использованием некоторых длинных (содержащих свыше 250 п.о.) дцРНК, экспрессированных на основе вектора. Эчевери с соавт. (Echeverri et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 02/38805) описывают некоторые гены из C. elegans, идентифицированные с помощью систем РНКи. Крейцер с соавт. (Kreutzer et al., публикации по Международным заявкам PCT № WO 02/055692, WO 02/055693 и EP 1144623 B1) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена с использованием дцРНК. Грахам с соавт. (Graham et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 99/49029 и WO 01/70949 и AU 4037501) описывают некоторые молекулы киРНК, экспрессированные на основе векторов. Фиэр с соавт. (Fire et al., US 6506559) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена in vitro с использованием некоторых длинных конструкций дцРНК (299 п.о.-1033 п.о.), которые опосредуют функцию РНКи. Мартини с соавт. (Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574) описывают некоторые одноцепочечные конструкции киРНК, включающие некоторые 5'-фосфорилированные одноцепочечные киРНК, которые опосредуют интерферирующую активность РНК в клетках Hela. Харборт с соавт. (Harborth et al., 2003, Antisense & Nicleic Acid Drug Development, 13, 83-105) описывают некоторые химически и структурно модифицированные молекулы киРНК. (Chiu и Rana, 2003, RNA, 1034-1048) описывают некоторые химические и структурные модифицированные молекулы киРНК. Вулф с соавт. (Woolf et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 03/064626 и WO 03/064625) описывают некоторые химически модифицированные конструкции дцРНК. Хорнунг с соавт. (Hornuhg et al., 2005, Nature Medicine, 11, 263-270) описывают мощную, специфичную по последовательности индукцию IFN-альфа короткими интерферирующими РНК в плазмацитоидных дендритных клетках через TLR7. Дяджь с соавт. (Judge et al., 2005, Nature Biotechnology, Published online: 20 March 2005) описывают зависимую от последовательности стимуляцию врожденного и иммунного ответа у млекопитающих синтетическими киРНК. Йюки с соавт. (Yuki et al., публикации по Международным заявкам PCT №№ WO 05/049821 и WO 04/048566) описывают некоторые способы создания коротких последовательностей, интерферирующих РНК, и некоторые короткие последовательности РНК с оптимизированной активностью. Саиго с соавт. (Saigo et al., публикация по Международной заявке US 20040539332) описывают некоторые способы создания олиго- или полинуклеотидных последовательностей, включающих короткие последовательности интерферирующих РНК, для достижения интерференции РНК. Теи с соавт. (Tei et al., публикация по Международной заявке PCT № WO 03/044188) описывают некоторые способы ингибирования экспрессии гена-мишени, которые включают трансфекцию клетки, ткани или отдельного организма двухцепочечных полинуклеотидов, включающих ДНК и РНК, содержащих по существу идентичную нуклеотидную последовательность с наличием по меньшей мере частичной нуклеотидной последовательности гена-мишени.

Все авторы приведенных ниже патентных и научных публикаций (Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverue, 2005, Science, 309, 1529-1550; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; и Czech, 2006, MEJM, 354, 11:1194-1195; Hutvagner et al., US 20050227256 и Tuschl et al., US 20050182005) описывают антисмысловые молекулы, которые могут ингибировать функцию миРНК через пространственное блокирование, и все указанные работы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии генов, таких как гены, ассоциированные с развитием или поддержанием состояния болезни, признаков и состояний, имеющих отношение к экспрессии или активности генов, за счет интерференции РНК (РНКи) с использованием коротких молекул интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК). Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, используемым для модуляции экспрессии и активности одного или нескольких генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности, по механизму интерференции РНК (РНКи) с использованием малых молекул нуклеиновой кислоты. В частности, настоящее изобретение охватывает малые молекулы нуклеиновой кислоты, такие как короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), короткие молекулы интерферирующей РНК (киРНК), двухцепочечные молекулы РНК (дцРНК), молекулы микроРНК (миРНК) и короткие шпилечные молекулы РНК (кшРНК), и способы использования для модуляции экспрессии генов и/или других генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии и/или активности.

Настоящее изобретение также относится к малым молекулам нуклеиновой кислоты, таким как киНК, киРНК, и к другим молекулам, которые могут ингибировать функции эндогенных молекул РНК, таких как эндогенные молекулы микроРНК (миРНК) (например, ингибиторы миРНК) или эндогенные короткие молекулы интерферирующих РНК (киРНК) (например, ингибиторы киРНК), или которые могут ингибировать функцию RISC (например, ингибиторы RISC) с целью модуляции генной экспрессии путем интерференции регуляторной функции таких эндогенных РНК или белков, ассоциированных с такими эндогенными РНК (например, RISC). Такие молекулы в целом в тексте настоящего описания обозначаются как ингибиторы РНКи.

КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может представлять немодифицированную или химически модифицированную молекулу. КиНК или ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может быть синтезирован химически, может быть экспрессирован на основе вектора или может быть синтезирован энзиматически. Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать экспрессию или активность гена-мишени в клетках за счет интерференции РНК (РНКи). Настоящее изобретение также охватывает различные химически модифицированные синтетические короткие молекулы нуклеиновой кислоты (киНК), способные модулировать активность РНКи в клетках путем взаимодействия миРНК, киРНК или RISC и в этой связи регуляцию или ингибирование интерференции РНК (РНКи), ингибирование трансляции или трансляционного молчания в клетке или организме. Использование химически модифицированных киНК и/или РНКи улучшает различные свойства нативных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи за счет повышения их резистентности к деградации нуклеазами in vivo и/или в результате повышенного поглощения клетками. В отличие от полученных ранее результатов молекулы киНК согласно настоящему изобретению, содержащие множественные химические модификации, включая полностью модифицированные киНК, сохраняют свою РНКи активность. В этой связи авторы изобретения предлагают химически модифицированные киРНК (в целом обозначаемые в тексте как киНК), которые сохраняют или повышают активность нативных киРНК. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению обеспечивают наличие полезных реагентов и способов для множества терапевтических, профилактических, ветеринарных, диагностических применений, для целевой валидации, для геномных исследований, генетической инженерии и для фармакогеномных вариантов использования.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются одна или несколько молекул киНК и/или ингибиторов РНКи и способы, которые независимо или в сочетании модулируют экспрессию генов-мишеней, кодирующих белки, такие как белки, которые ассоциированы с подержанием и/или развитием заболевания, признаков, расстройств и/или состояний, приведенных в настоящем описании или известных в данной области, таких как гены, кодирующие последовательности, включающие последовательности, имеющиеся в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в предварительных заявках на патенты США №№ 60/363124, USSN 10/923536 и PСТ/US03/05028, которые включены в настоящее описание в качестве «целевых» последовательностей/последовательностей мишеней. Приведенное ниже описание различных аспектов и вариантов настоящего изобретения дано в сочетании со ссылкой на репрезентативные целевые гены, обозначаемые в тексте описания как гены-мишени. Настоящее изобретение также относится к соединениям, композициям и способам, относящимся к признакам, заболеваниям и состояниям, которые являются реакцией на модуляцию экспрессии и/или активности генов, вовлекаемых в пути генной экспрессии или другие клеточные процессы, опосредующие поддержание или развитие таких признаков, заболеваний и состояний. Однако такая ссылка является лишь репрезентативной, и различные аспекты и варианты настоящего изобретения также имеют отношение к другим генам, которые экспрессируют альтернативные целевые гены, такие как мутантные целевые гены, сплайсинг-варианты целевых генов, варианты целевого гена, определяемые видовой спецификой или варьирующие от субъекта к субъекту, и другие целевые генные пути, приведенные в описании или известные в данной области. Дополнительные гены могут быть проанализированы применительно к их целевым сайтам с использованием способов согласно настоящему изобретению, приведенных для репрезентативных целевых генов и описанных последовательностей. Таким образом, модуляция и эффекты такой модуляции других генов могут быть осуществлены по приведенным способам. Иными словами, термины «мишень» и «ген-мишень» в контексте приведенного описания и применительно к цитированным материалам охватывает гены, ассоциированные с развитием и/или поддержанием заболевания, признаков и состояний, таких как гены, кодирующие полипептиды, регуляторные полинуклеотиды (например, миРНК и киРНК), мутантные гены и сплайсинг варианты генов, а также другие гены, вовлекаемые в пути генной экспрессии и/или активности. Таким образом, каждый из вариантов, приведенных в настоящем описании, со ссылкой на термин «мишень» применим во всех молекулах белков, пептидов, полипептидов и/или полинуклеотидов, для которых применим термин «мишень» в контексте, соответствующем настоящему описанию. В целом такие гены-мишени также в тексте настоящего описания могут обозначаться как «целевые» последовательности.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей две или более разных молекул киНК и/или ингибиторов РНКи согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК или их любое сочетание), воздействующих направленно на разные полинуклеотидные мишени, такие как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени, такие как приведенные в настоящем описании или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и некодирующие мишени. Такое объединение молекул киНК может обеспечить повышенный терапевтический эффект.

В одном варианте настоящее изобретение относится к совокупности композиций, включающей две или более разных молекул киНК согласно настоящему изобретению (например, киНК, дуплекс, формирующий киНК, или многофункциональная киНК, или их любое сочетание), которые обладают специфичностью для разных полинуклеотидных мишеней, таких как разные участки целевой РНК или ДНК (например, два разных сайта-мишени согласно настоящему изобретению или любое сочетание мишеней или целевых путей), или как кодирующие, так и не кодирующие мишени, где указанное объединение включает молекулы киНК, воздействующие направлено на 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более разных мишеней.

В связи с тем, что у разных организмов или разных субъектов имеется определенный потенциал вариабельности генома по последовательности, выбор молекул киНК для широкого спектра терапевтических применений будет вовлекать, в высокой степени, консервативные участки гена. В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваются молекулы киНК и/или ингибиторы РНКи, которые направленно воздействуют на консервативные участки генома или участки, которые законсервированы применительно к разным мишеням. Молекулы киНК или ингибиторы РНКи разработаны таким образом, что воздействуют направленно на консервативные участки разных мишеней, позволяют достичь эффективного ингибирования экспрессии целевого гена в разных группах пациентов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной молекуле нуклеиновой кислоты, такой как молекула киНК, где одна из цепей включает нуклеотидную последовательность, являющуюся комплементарной заданной нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части. Заданная нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную целевую последовательность, такую как последовательность, описанная в настоящем тексте или известная в данной области. В другом варианте осуществления настоящего изобретения заданная нуклеотидная последовательность представляет собой целевую последовательность или путь к целевой последовательности, известный в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии гена-мишени или которая направляет процесс расщепления целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 28 пар оснований.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи. В одном конкретном варианте, например, каждая цепь молекулы киНК содержит от примерно 18 до примерно 27 нуклеотидов в длину.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где указанная двухцепочечная молекула киНК включает первую цепь и вторую цепь, где каждая из цепей молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 23 нуклеотидов (например, приблизительно 18, 19, 20, 21, 22 или 23), где первая цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, и где вторая цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к первой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически синтезированной двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где каждая цепь молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов и где одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически синтезированной двухцепочечной короткой молекуле интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК (РНКи), где каждая цепь молекулы киНК содержит в длину от примерно 18 до примерно 23 нуклеотидов и где одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной комплементарностью к целевой РНК, с тем чтобы указанная молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, например, где указанный целевой ген РНК включает последовательность, кодирующую белок. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, например, где целевой ген или РНК включает некодирующую последовательность или регуляторные элементы, вовлекаемые в экспрессию целевого гена (например, некодирующей РНК, миРНК, мвРНК и т.п.).

В одном варианте киНК согласно настоящему изобретению используют для ингибирования экспрессии целевых генов или семейства целевых генов, где указанные гены или последовательности генного семейства обладают гомологией по последовательности. Такие гомологичные последовательности могут быть идентифицированы согласно известным в данной области методам, например с использованием выравнивания последовательностей. Молекулы киНК могут быть разработаны таким образом, чтобы они направленно воздействовали на такие гомологичные последовательности, например, с использованием полностью комплементарных последовательностей или путем включения неканонических пар оснований, например ошибок в паре оснований и/или с использованием пар оснований, соответствующих гипотезе «качелей», которые могут обеспечивать дополнительные целевые последовательности. В тех случаях, когда идентифицировано ошибочное спаривание, неканонические пары оснований (например, ошибочные спаривания и/или пары оснований, соответствующие гипотезе «качелей») могут быть использованы для создания молекул киНК, которые направленно воздействуют на более чем одну генную последовательность. В не ограничивающем примере используют неканонические пары оснований, такие как UU и CC пары оснований, для создания молекул киНК, которые способны направленно воздействовать на последовательности разных полинуклеотидных мишеней, обладающих гомологией по последовательности. В таком случае одним из преимуществ использования киНК согласно настоящему изобретению является тот факт, что может быть разработана одна киНК, которая включает последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную к нуклеотидной последовательности, которая является консервативной для гомологичных генов. В рамках такого подхода одна киНК может использовать для ингибирования экспрессии более чем один ген и может заменить использование более чем одной молекулы киНК для направленного воздействия на разные гены.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, обладающей активностью РНКи против целевой РНК (например, кодирующей или некодирующей РНК), где указанная молекула киНК включает последовательность, комплементарную к любой последовательности РНК, такой как последовательности, депонированные в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в PCT/US03/05028, предварительных заявках на патент США № 60/363124 и/или USSN 10/923536, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, обладающей активностью РНКи против целевой РНК, где указанная молекула киНК включает последовательность, комплементарную РНК, содержащей вариант кодирующей последовательности, например содержащей другие мутантные гены, известные в данной области как ассоциированные с поддержанием и/или развитием заболеваний, признаков, расстройств и/или состояний согласно настоящему изобретению или иных, известных в данной области. Применительно к любой конструкции киНК согласно настоящему изобретению могут быть использованы химические модификации, показанные в таблице I или иным образом приведенные в настоящем тексте. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность, которая может взаимодействовать с нуклеотидной последовательностью целевого гена и тем самым вовлекаться в процесс молчания экспрессии целевого гена, например, где указанная молекула киНК опосредует регуляцию экспрессии целевого гена в рамках клеточных процессов, которые модулируют структуру хроматина или характер метилирования целевого гена, и тем самым препятствует транскрипции целевого гена.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии белков, возникающих в результате гаптотипических полиморфизмов, ассоциированных с признаком, заболеванием или состоянием у субъекта или организма. Анализ генов или уровней белка или РНК может использоваться для идентификации субъектов такими полиморфизмами или субъектов, которые имеют риск развития описанных в данном тексте признаков, состояний или заболеваний. В случае таких субъектов может быть использовано лечение, например лечение с применением молекул киНК согласно настоящему изобретению или любой другой композиции, используемой при лечении заболеваний, связанных с экспрессией целевого гена. При этом анализ уровней белка или РНК может использоваться для определения типа лечения и режима терапии при лечении субъекта. Мониторинг уровня белка или РНК может использоваться для предсказания результатов лечения и для определения эффективности соединения или композиции, которое модулирует уровень и/или активность некоторых белков, ассоциированных с признаком, расстройством, состоянием или заболеванием.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловую цепь, содержащую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к нуклеотидной последовательности или ее части, кодирующей целевой белок. При этом киНК также включает смысловую цепь, где указанная смысловая цепь включает нуклеотидную последовательность целевого гена или его часть.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок или его часть. Указанная молекула киНК также включает смысловой участок, где указанный смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность целевого гена или его часть.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей нуклеотидную последовательность, например нуклеотидную последовательность в антисмысловом участке молекулы киНК, которая комплементарна нуклеотидной последовательности или части такой последовательности целевого гена. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей участок, например антисмысловой участок конструкции киНК, комплементарный к последовательности, содержащей последовательность целевого гена или его часть.

В одном варианте смысловой участок или смысловая цепь молекулы киНК согласно настоящему изобретению комплементарна части антисмыслового участка или антисмысловой цепи молекулы киНК, которая комплементарна целевой нуклеотидной последовательности.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей последовательность, например антисмысловую последовательность конструкции киНК, комплементарную к последовательности или части последовательности, содержащей последовательность, депонированную в Генбанке (GenBank) с номерами доступа, приведенными в PCT/US03/05028, предварительных заявках на патент США № 60/363124 и/или USSN 10/923536, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Химические модификации, показанные в таблице I и описанные в данном тексте, могут использоваться применительно к любой конструкции киНК согласно настоящему изобретению. LNP, описанные в таблице IV, могут использоваться применительно к любой молекуле киНК или сочетанию молекул киНК согласно настоящему описанию.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК включает антисмысловую цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где антисмысловая цепь комплементарна целевой последовательности РНК или ее части и где указанная киНК также включает смысловую цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, и где указанная смысловая цепь и указанная антисмысловая цепь представляют собой различающиеся нуклеотидные последовательности, при этом по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов в каждой цепи комплементарны нуклеотидам другой цепи.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению (например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты) включает антисмысловую (ведущую) цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где антисмысловая цепь комплементарна целевой последовательности РНК или ее части. В одном варианте осуществления по меньшей мере 15 нуклеотидов (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) последовательности целевой РНК комплементарны последовательностям в антисмысловой (ведущей) цепи молекулы киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению (например, двухцепочечная молекула нуклеиновой кислоты) включает смысловую (цепь-«пассажир») цепь, содержащую от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которая включает последовательность целевой РНК или ее часть. В одном варианте по меньшей мере 15 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) последовательности целевой РНК включают смысловую (цепь-«пассажир») цепь молекулы киНК согласно настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения молекула киНК по изобретению включает антисмысловой участок, содержащий от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный антисмысловой участок комплементарен последовательности целевой ДНК, где указанная киНК также включает смысловой участок, содержащий от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок включаются в длинные молекулы, указанный смысловой участок содержит по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в антисмысловом участке.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению обладает активностью РНКи, которая модулирует экспрессию РНК, кодируемой геном. Поскольку гены могут иметь некоторую степень общности, определяемую гомологией последовательности, молекулы киНК могут быть разработаны таким образом, чтобы они оказывали направленное воздействие на класс определенных генов за счет выбора последовательности, которая либо имеет общность среди разных мишеней, либо, альтернативно, они являются уникальными для конкретных мишеней. В этой связи в одном варианте молекула киНК может быть разработана таким образом, чтобы она оказывала направленное воздействие на консервативные участки целевых полинуклеотидных последовательностей, обладающих гомологией среди нескольких генных вариантов, так что будет оказывать направленное воздействие на класс генов посредством одной молекулы киНК. Соответственно, в одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одного или нескольких целевых генных изоформ или вариантов у субъекта или в организме. В другом варианте молекула киНК может быть разработана таким образом, чтобы она оказывала направленное воздействие на последовательность, которая является уникальной для специфической полинуклеотидной последовательности (например, единственная изоформа целевого гена или единственный полиморфизм нуклеотида (SNP)) в связи с высоким уровнем специфичности, который необходим для молекулы киНК с тем, чтобы вовлекаться в реализацию РНКи активности.

В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, которые функционируют как медиаторы РНК-интерфирирующего ответа, вызывающего молчание гена, представляют собой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению состоят из молекул дуплекса нуклеиновой кислоты, содержащих от примерно 15 до примерно 30 пар оснований между олигонуклеотидами, содержащими примерно от 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают молекулы дуплекса нуклеиновой кислоты выступающими концами, содержащими от примерно 1 до примерно 3 нуклеотидов (в частности, примерно 1, 2 или 3), например, 21-нуклеотидные дуплексы, включающие примерно 19 пар оснований и 3'-концевые мононуклеотидные, динуклеотидные или тринуклеотидные выступающие фрагменты. В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают молекулы дуплекса нуклеиновой кислоты с тупыми концами, где оба конца являются тупыми или, альтернативно, один из концов является тупым.

В еще одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) включает нуклеотидный или не нуклеотидный выступающий фрагмент. Термин «выступающий фрагмент» означает концевую часть нуклеотидной последовательности, в которой две цепи двухцепочечной нуклеотидной молекулы не спарены по основаниям (например, фиг.6). В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может включать нуклеотидные или не нуклеотидные выступающие фрагменты на 3'-конце одной или обеих цепей молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Например, молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может включать нуклеотидные или не нуклеотидные выступающие фрагменты на 3'-конце ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке, на 3'-конце цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка или и на ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке и на цепи-«пассажире» или смысловой цепи/участке молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте нуклеотидный выступающий фрагмент молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает 2'-О-метильный, 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-2'-фторарабино- (FANA), 4'-тио-, 2'-О-трифторметильный, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, универсальное основание, ациклический или 5-С-метильные нуклеотиды. В другом варианте не нуклеотидные выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (кмНК) согласно настоящему изобретению включают глицерильные, безосновные или инвертированные дезоксисоединения без основания не нуклеотидной природы.

В одном варианте нуклеотиды, включающие выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК по изобретению), соответствуют нуклеотидам, включающим целевую полинуклеотидную последовательность в молекуле киНК. Соответственно, в таких вариантах нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент молекулы киНК согласно настоящему изобретению, включают последовательность, основанную на целевой полинуклеотидной последовательности, в которой нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты ведущей цепи или антисмысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут быть комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, и нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут содержать нуклеотиды в целевой полинуклеотидной последовательности. Такие нуклеотидные выступающие фрагменты включают последовательность, которая может быть результатом процессинга ферментом дайсер на основе нативной дцРНК в киРНК.

В одном варианте нуклеотиды, содержащие выступающий фрагмент молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению, комплементарны целевой полинуклеотидной последовательности и необязательно модифицированы химически, как приведено в настоящем описании. В этой связи в одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты ведущей цепи или антисмысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут быть комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, то есть тем нуклеотидным позициям в целевой полинуклеотидной последовательности, которые комплементарны нуклеотидным позициям нуклеотидов выступающего фрагмента в ведущей цепи или антисмысловой цепи/участке молекулы киНК. В другом варианте нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент цепи-«пассажира» или смысловой цепи/участка молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут включать нуклеотиды в целевой полинуклеотидной последовательности, то есть те нуклеотидные позиции в целевой полинуклеотидной последовательности, которые соответствуют тем же нуклеотидным позициям в нуклеотидах выступающего фрагмента в цепи-«пассажире» или смысловой цепи/участке молекулы киНК. В другом варианте выступающий фрагмент включает два нуклеотида (например, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'-GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'-CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'-UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) в выступающем фрагменте, который комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В одном варианте выступающий фрагмент включает два нуклеотида (например, 3'-GA; 3'-GU; 3'-GG; 3'-GC; 3'-CA; 3'-CU; 3'-CG; 3'-CC; 3'-UA; 3'-UU; 3'-UG; 3'-UC; 3'-AA; 3'-AU; 3'-AG; 3'-AC; 3'-TA; 3'-TU; 3'-TG; 3'-TC; 3'-AT; 3'-UT; 3'-GT; 3'-CT) в выступающем фрагменте, который не комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В другом варианте нуклеотиды выступающего фрагмента в молекуле киНК согласно настоящему изобретению представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабино- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В другом варианте нуклеотиды выступающего фрагмента в молекуле киНК согласно настоящему изобретению представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, в том случае, когда нуклеотиды выступающего фрагмента представляют собой пуриновые нуклеотиды и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды или 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, в том случае, когда нуклеотиды выступающего фрагмента представляют собой пиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте осуществления пуриновый нуклеотид (в случае его наличия) в выступающем фрагменте молекулы киНК согласно настоящему изобретению представляет собой 2'-О-метилнуклеотиды. В другом варианте пиримидиновый нуклеотид (в случае его наличия) в выступающем фрагменте молекулы киНК согласно настоящему изобретению представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор- или 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды.

В одном варианте указанные нуклеотиды, содержащие выступающие фрагменты молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению, не комплементарны целевой полинуклеотидной последовательности и необязательно модифицированы химически, как приведено в настоящем описании. В одном варианте выступающий фрагмент включает 3'-UU выступающий фрагмент, который не комплементарен части целевой полинуклеотидной последовательности. В другом варианте указанные нуклеотиды, включающие выступающий фрагмент молекулы киНК согласно настоящему изобретению, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает два или три нуклеотида в выступающем фрагменте, где указанные нуклеотиды в выступающем фрагменте могут быть одинаковыми или разыми. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает два или три нуклеотида в выступающем фрагменте, где указанные нуклеотиды в выступающем фрагменте могут быть одинаковыми или разными и где один или несколько нуклеотидов в выступающем фрагменте модифицированы по основанию, сахару и/или фосфатному скелету.

В одном варианте настоящее изобретение относится к одной или нескольким химически модифицированным конструкциям киНК, обладающим специфичностью для целевых молекул нуклеиновой кислоты, таких как ДНК или РНК, кодирующих белок или не кодирующих РНК, ассоциированных с экспрессией целевых генов. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК на основе РНК (например, киНК, включающая 2'-ОН-нуклеотиды), обладающей специфичностью для молекул нуклеиновой кислоты, которые включают одну или несколько химических модификаций, определенных в настоящем описании. Не ограничивающие примеры таких химических модификаций включают фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды (см., например, USSN 10/981966, зарегистрированный 5 ноября 2004 года, включенный в настоящее описание в качестве ссылки), нуклеотиды с «универсальным основанием», «ациклические» нуклеотиды, 5-С-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды (FANA, см., например, Dоwler et al., 2006, Nucleic Acids Research, 34, 1669-1675) и концевые глицерильные и/или инвертированные дезокси остатки безосновные, включенные в молекулу. Указанные химические модификации, в случае их использования в конструкциях киНК (например, конструкциях киНК на основе РНК), как было показано, сохраняют активность РНКи в клетках, тогда как в то же самое время резко повышают стабильность этих соединений в сыворотке.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает химические модификации, приведенные в настоящем описании (например, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, LNA), во внутренних положениях молекулы киНК. Термин «внутреннее положение» используется для обозначения положения спаренных оснований в дуплексе киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды, которые позволяют поддерживать способность опосредовать процесс РНКи. Модифицированные нуклеотиды могут использоваться для улучшения характеристик in vitro или in vivo, таких как стабильность, активность, токсичность, иммунный ответ и/или биодоступность. Например, молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать модифицированные нуклеотиды в виде некоторого процента от общего числа нуклеотидов, имеющихся в молекуле киНК. При этом молекула киНК согласно настоящему изобретению может в основном включать от примерно 5% до примерно 100% модифицированных нуклеотидов (в частности, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов). Например, в одном варианте осуществления изобретения от примерно 5% до примерно 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию сахарного остатка в нуклеиновой кислоте, такую как модификация 2'-сахара, например 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтритформетоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтиксинуклеотиды или 2'-дезоксинуклеотиды. В другом варианте от примерно 5% до примерно 100% (например, примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию основания в молекуле нуклеиновой кислоты, такую как модификация, включающая инозин, пурин, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галогенуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины, или 6-алкилпиримидины (например, 6-метилуридин) или пропин. В другом варианте от примерно 5% до 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию скелета нуклеиновой кислоты, такую как модификация скелета в приведенной формуле I в настоящем тексте. В другом варианте от примерно 5% до 100% (например, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов) в нуклеотидных позициях в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включают модификацию сахара, основания или скелета в молекуле нуклеиновой кислоты или любое их сочетание (например, любое сочетание модификаций сахара, основания, скелета в молекуле нуклеиновой кислоты или не нуклеотидные модификации). В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% модифицированных нуклеотидов. Фактически процент модифицированных нуклеотидов, имеющихся в данной молекуле киНК, зависит от общего числа нуклеотидов в молекуле киНК. Если молекула киНК является одноцепочечной, то процент модификации может определяться общим числом нуклеотидов, имеющихся в одноцепочечных молекулах киНК. Аналогично, если молекула киНК является двухцепочечной, то процент модификации может определяться общим числом нуклеотидов, имеющихся в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих из них: в смысловой и антисмысловой цепях.

Молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в разных положениях на молекуле киНК. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды во внутренних положениях спаренных оснований в составе дуплекса киНК. Так, например, внутренние положения могут включать позиции от примерно 3 до примерно 19 нуклеотидов от 5'-конца любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или любого участка: смыслового или антисмыслового 21 нуклеотидного дуплекса киНК, содержащего 19 пар оснований и 3'-фрагменты с двумя нуклеотидами. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в неспаренном участке или в выступающих участках молекулы киНК. Термин «не спаренный по основанию» означает, что нуклеотиды не спарены между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК. Нуклеотиды выступающего фрагмента могут быть комплементарны или могут быть спарены по основаниям в соответствующие полинуклеотидные целевые последовательности (см., например, фиг. 6С). Так, например, позиции выступающего фрагмента могут включать позиции от примерно 20 до примерно 21 нуклеотида от 5'-конца любой цепи или участка: смыслового или антисмыслового в 21 нуклеотидном дуплексе киНК, содержащем 19 пар оснований и два нуклеотида 3'-выступающих фрагментов. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в концевых позициях молекулы киНК. Например, такие концевые участки включают 3'-положения, 5'-положения применительно к 3'-положению и к 5'-положению смысловой и/или антисмысловой цепи или участка молекулы киНК. В другом варианте двухцепочечная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает модифицированные нуклеотиды в положениях, спаренных по основанию, или во внутренних положениях, в не спаренных по основанию или в выступающих участках и/или в концевых участках, или может включать любые их сочетания.

Один аспект настоящего изобретения относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК включает одну или несколько химических модификаций, и каждая цепь двухцепочечной киНК содержит примерно 21 нуклеотид в длину. В одном варианте молекула двухцепочечной киНК не содержит рибонуклеотидов. В другом варианте молекула двухцепочечной киНК включает один или несколько рибонуклеотидов. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 30 (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, где каждая цепь содержит от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам на другой цепи. В одном варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и смысловой участок, где указанный смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части. В одном варианте антисмысловой участок и смысловой участок независимо включают от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), где указанный антисмысловой участок включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), который комплементарен нуклеотидам в смысловом участке.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает тупые концы, то есть концы, которые не включают каких-либо выступающих нуклеотидов. Например, молекула киНК, включающая приведенные в настоящем описании модификации (например, включающая нуклеотиды формулы I-VII или конструкции киНК, включающие «Stab 00»-«Stab 36» или «Stab 3F»-«Stab 36F» (таблица I) или любое их сочетание) и/или имеющая любую длину согласно настоящему описанию, может включать тупые концы или концы без выступающих нуклеотидов.

В одном варианте любая молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько тупых концов, то есть где указанный тупой конец не содержит каких-либо выступающих нуклеотидов. В одном варианте молекула киНК с тупым концом характеризуется числом пар оснований, равных числу нуклеотидов, присутствующих в каждой цепи молекулы киНК. В другом варианте молекула киНК включает один тупой конец, например, в котором 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В другом варианте молекула киНК включает один тупой конец, например, в котором 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. В другом варианте молекула киНК включает два тупых конца, например, где 3'-конец антисмысловой цепи и 5'-конец смысловой цепи, а также 5'-конец антисмысловой цепи и 3'-конец смысловой цепи не содержат выступающих нуклеотидов. Молекула киНК с тупыми концами может включать, например, от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). Другие нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК с тупыми концами, могут включать, например, ошибочные спаривания, вздутия, петли или пары оснований, соответствующих гипотезе «качелей», которые модулируют активность молекулы киНК, вовлекаемую в процесс интерференции РНК.

Термин «тупые концы» означает симметричные концы или концы двухцепочечной молекулы киНК, не содержащей выступающих нуклеотидов. Две цепи молекулы двухцепочечной киНК выравнивают друг с другом так, чтобы на концах не было выступающих нуклеотидов. Например, конструкция киНК с тупым концом включает концевые нуклеотиды, которые комплементарны для участков и смысловой, и антисмысловой цепей молекулы киНК.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает рибонуклеотиды в позициях, которые поддерживают или повышают активность РНК. В одном варианте рибонуклеотиды присутствуют в смысловой цепи или в смысловом участке молекулы киНК и могут обеспечивать активность РНКи за счет расщепления смысловой цепи или смыслового участка фермента в составе RISC (например, рибонуклеотиды, присутствующие в определенном положении цепи-«пассажира», смысловой цепи и/или смыслового участка расщепляют, например, положение 9 цепи-«пассажира» дуплекса из 19 пар оснований, который расщепляется RISC ферментом АGO2 (см., например, Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 и Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629). В другом варианте один или несколько (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов на 5'-конце ведущей цепи или ведущего участка (также известного как антисмысловая цепь или антисмысловой участок) молекулы нуклеиновой кислоты киНК представляют собой рибонуклеотиды.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению включает один или несколько рибонуклеотидов в тех положениях в составе цепи-«пассажира» или соответствующего ей участка (также известного как смысловая цепь или смысловой участок), которая способствует расщеплению цепи-«пассажира» или соответствующего ей участка ферментом в комплексе RISC (например, рибонуклеотиды, присутствующие в определенном положении цепи-«пассажира», таком как положение 9 цепи-«пассажира» дуплекса из 19 пар оснований, которая расщепляется в RISC, см., например, Matranga et al., 2005, Cell, 123:1-114 и Rand et al., 2005, Cell, 123:621-629).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более химических модификаций, которые могут быть одинаковыми или разными. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более разных химических модификаций.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где одно или несколько положений нуклеотидов (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) в каждой цепи молекулы киНК включает химическую модификацию. В другом варианте киНК содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или более различных химических модификаций.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК включает от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где каждая цепь молекулы киНК включает одну или несколько химических модификаций. В одном варианте каждая цепь двухцепочечной молекулы киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различных химических модификаций, например различные модификации нуклеотидного сахара, основания или скелета. В другом варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существа аналогична нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене. В другом варианте одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и вторая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности или ее части в целевом гене. В другом варианте каждая цепь молекулы киНК включает от примерно 15 до примерно 30 (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов и каждая цепь включает по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи. Указанный целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем описании или приведенные в работах, включенных в описание в качестве ссылок. Указанный ген может включать, например, последовательности, депонированные в ГенБАнк (GenBank) с указанными номерами доступа.

В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению характеризуется разной картиной химических модификаций, таких как «Stab 00»-«Stab 36» или «Stab 3F»-«Stab 36F» (таблица I), модификаций, приведенных в настоящем описании, или их любое сочетание. Не ограничивающие примеры смысловой и антисмысловой цепей таких молекул киНК, характеризующихся различными картинами модификаций, показаны в таблице II и на фиг. 4 и 5.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению не включает рибонуклеотиды. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько рибонуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более рибонуклеотидов).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению не включает антисмысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и киНК также включает смысловой участок, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности целевого гена или его части. В другом варианте антисмысловой участок и смысловой участок, каждый, включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), и антисмысловой участок включает по меньшей мере от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны нуклеотидам в смысловом участке. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахара в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. Целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем тексте или указанные в цитированных в данном описании работах. В другом варианте киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая из двух цепей молекулы киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов (например, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) и где одна из цепей молекулы киНК включает по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 или более), которые комплементарны последовательности нуклеиновой кислоты целевого гена или его части.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают смысловой участок и антисмысловой, где антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном или его частью, и где смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку. В одном варианте молекула киНК собирается из двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок, а второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК. В другом варианте смысловой участок соединен с антисмысловым участком через линкерную молекулу. В другом варианте смысловой участок соединен с антисмысловым участком через линкерную молекулу, такую как нуклеотидный или не нуклеотидный линкер. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахарного фрагмента в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. Целевой ген может включать, например, последовательности, приведенные в настоящем описании или указанные в ссылках.

В одном варианте молекула киНК по изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновых модификаций (например, где один, или несколько, или все пиримидины (например, U или C) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезокси-2'-фторпиримидином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-О-метилпуриновых модификаций (например, где один, или несколько, или все пурины (то есть A или G) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-О-метилнуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-О-метилпурином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более) 2'-дезоксипуриновых модификаций (то есть, когда один, или несколько, или все пурины (то есть A или G) в соответствующих положениях киНК модифицированы 2'-дезоксинуклеотидами). В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют в смысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют в антисмысловой цепи. В одном варианте модификации 2'-дезоксипурином присутствуют и в смысловой цепи, и в антисмысловой цепи молекулы киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, включающей смысловой участок и антисмысловой участок, где антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности РНК, кодируемой целевым геном или его частью, и где смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна антисмысловому участку, где молекула киНК содержит по меньшей мере один или несколько модифицированных пиримидиновых и/или пуриновых нуклеотидов. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает по меньшей мере две (например, 2, 3, 4, 5 или более) различные химические модификации, например различные модификации сахарного фрагмента в нуклеотиде, основания или нуклеотидного скелета. В одном варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют 2'-О-метилпиримидиновые нуклеотиды или 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды присутствующие в этом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В одном варианте пиримидиновые нуклеотиды в антисмысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил- или 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте в любой из описанных выше молекул киНК любой из нуклеотидов, присутствующих в некомплементарном участке смысловой цепи (например, в выступающем участке), представляет собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид, 2'-дезокси-2'-фторарабино, 2'-О-тритформетилнуклеотид, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотид или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотид или любой другой модифицированный нуклеотид/нуклеозид, приведенный в настоящем описании и в USSN 10/981966, зарегистрированной 5 ноября 2004 года, включенной в настоящее описание в качестве ссылки. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей по меньшей мере два модифицированных нуклеотида (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), где указанный модифицированный нуклеотид выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси-2'-фторнуклеотида, 2'-дезокси-2'-фторарабино-, 2'-О-тритформетилнуклеотида, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотида или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотида или любого другого модифицированного нуклеотида/нуклеозида, приведенного в настоящем описании и в USSN 10/981966, зарегистрированной 5 ноября 2004 года и включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Указанные модифицированные нуклеотид/нуклеозид могут быть одинаковыми или разными. киНК может включать в длину, например, от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды или 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, 4'-тиопиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый или 2'-дезокси-2'-фтоуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторуридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтораденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторгуанозиновые нуклеотиды. Молекула киНК может также включать по меньшей мере модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатную связь. В одном варианте 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, такие как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы киНК против расщепления рибонуклеазами, включающему встраивание по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида в молекулу киНК, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторцитидиновый нуклеотид или 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНк включают по меньшей мере один 2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-уридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтораденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторгуанозиновые нуклеотиды. При этом киНК могут также включать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатную связь. В одном варианте указанные 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, такие как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы киНК против расщепления рибонуклеазами, включающему встраивание по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида в молекулу киНК, где указанный модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотид. В одном варианте все пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабинопиримидиновые нуклеотиды. В одном варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторарабиноцитидиновый нуклеотид или 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновый нуклеотид. В другом варианте модифицированные нуклеотиды в молекуле киНК включают по меньшей мере один 2'-фторцитидиновый нуклеотид и по меньшей мере один 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновый нуклеотид. В одном варианте все уридиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноуридиновые нуклеотиды. В одном варианте все цитидиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноцитидиновые нуклеотиды. В одном варианте все аденозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиноаденозиновые нуклеотиды. В одном варианте все гуанозиновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторарабиногуанозиновые нуклеотиды. При этом молекулы киНК могут также включать по меньшей мере одну модифицированную межнуклеотидную связь, такую как фосфоротиоатная связь. В одном варианте указанные 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды присутствуют в специфически выбранных положениях в молекуле киНК, которые чувствительны к расщеплению рибонуклеазами, таких как положения, содержащие пиримидиновые нуклеотиды.

В одном варианте антисмысловой участок молекулы киНК согласно настоящему изобретению включает последовательность, комплементарную части эндогенного транскрипта, содержащего последовательность, уникальную для аллели, имеющей отношение к конкретному заболеванию или признаку у субъекта или организма, и такая последовательность, включающая отдельный нуклеотидный полиморфизм (SNP), ассоциирована с аллелью, специфичной для определенного заболевания или определенного признака. При этом антисмысловой участок молекулы киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, комплементарную тем последовательностям, которые уникальны для конкретной аллели, что обеспечивает специфичность в осуществлении селективного процесса РНКи против аллели, связанной с конкретными заболеванием, состоянием или признаком.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая осуществляет отрицательную регуляцию экспрессии целевого гена или которая направляет расщепление целевой РНК, где указанная молекула киНК собирается из двух отдельных олигонуклеотидных фрагментов, где один фрагмент включает смысловой участок, а второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы киНК. В одном варианте каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК содержит в длину примерно 21 нуклеотид и примерно 19 нуклеотидов на каждом фрагменте молекулы киНК связаны по основанию с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждом фрагменте молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая цепь содержит в длину примерно 19 нуклеотидов и где нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с соответствующими нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК с образованием по меньшей мере примерно 15 пар оснований (например, 15, 16, 17, 18 или 19), где один или оба конца молекулы киНК представляют собой тупые концы. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-О-метилпиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-О-метил-уридин, -цитидин или -тимидин. В другом варианте все нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В одном варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащую от примерно 19 до примерно 25 пар оснований, содержащую смысловой участок и антисмысловой участок, где примерно 19 нуклеотидов в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью или частью молекулы РНК, кодируемой целевым геном. В другом варианте примерно 21 нуклеотид в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью или ее частью молекулы РНК, кодируемой целевым геном. В любом из указанных выше вариантов 5'-конец фрагмента, включающего указанный антисмысловой участок, может необязательно содержать фосфатную группу.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевой последовательности РНК, где указанная молекула киНК не содержит рибонуклеотидов, где каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов. В одном варианте указанная молекула киНК содержит в длину 21 нуклеотид. Примеры конструкций киНК не рибонуклеотидной природы включают сочетания стабилизирующих химических структур, показанных в таблице I, в любом сочетании смысловой/антисмысловой структурной организации, такие как Stab7/8, Stab7/11, Stab8/8, Stab18/8, Stab18/11, Stab12/13, Stab7/13, Stab18/13, Stab7/19, Stab8/19, Stab18/19, Stab7/20, Stab8/20, Stab18/20, Stab7/32, Stab8/32 или Stab18/32 (например, любые киНК, содержащие Stab 7, 8, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20 или 32 в смысловой или антисмысловой цепях или их сочетания). В контексте настоящего описания различные химические структуры Stab могут включать и 2'-фтор-, и 2'-OCF3 варианты химических структур, приведенных в таблице I. При этом, например, термин «Stab7/8» относится и к Stab7/8, и к Stab7F/8F и т.п. В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной РНК, которая направляет расщепление целевой РНК через интерференцию РНК, где каждая цепь указанной молекулы РНК содержит в длину от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов и где одна цепь молекулы РНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к целевой РНК, с тем чтобы молекула РНК была способна направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и где по меньшей мере одна цепь молекулы РНК необязательно включает один или несколько химически модифицированных нуклеотидов согласно настоящему описанию, таких как, без ограничения, дезоксинуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторарабинонуклеотиды, 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды, 4'-тионуклеотиды, 2'-О-тритформетилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды и т.п., или их сочетание.

В одном варианте целевая РНК согласно настоящему изобретению включает последовательность, кодирующую белок.

В одном варианте целевая РНК согласно настоящему изобретению включает некодирующую последовательность РНК (например, миРНК, мяРНК, киРНК и т.п.) (см., например, Mattik, 2005, Science, 309, 1527-1528; Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530; Sethupathy et al., 2006, RNA, 12, 192-197; и Czech, 2006 NEJM, 354, 11: 1194-1195).

В одном варианте настоящее изобретение относится к лекарственному средству, включающему молекулу киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к активному ингредиенту, включающему молекулу киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию молекулы двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) для достижения ингибирования, отрицательной регуляции или снижения экспрессии целевого гена, где указанная молекула киНК включает одну или несколько химических модификаций и каждая цепь двухцепочечной киНКнезависимо включает в длину от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более). В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждый из двух фрагментов молекулы киНК независимо включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40) и где одна из цепей включает по меньшей мере 15 нуклеотидов, которые комплементарны целевой нуклеотидной последовательности, кодирующей РНК, или ее части. В не ограничивающем примере каждый из двух фрагментов молекулы киНК включает примерно 21 нуклеотид. В другом варианте молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждая цепь включает в длину примерно 21 нуклеотид и где примерно 19 нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждом фрагменте молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте указанная молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей одну или несколько химических модификаций, где каждая цепь включает в длину примерно 19 нуклеотидов и где нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК с образованием по меньшей мере примерно 15 пар оснований (например, 15, 16, 17, 18 или 19), где один или оба конца молекулы киНК представляют собой тупые концы. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждый из двух 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-О-метилпиримидиновый нуклеотид, такой как 2'-О-метил-уридин, -цитидин или -тимидин. В другом варианте все нуклеотиды в каждом фрагменте молекулы киНК спарены по основанию с комлементарными нуклеотидами другого фрагмента молекулы киНК. В другом варианте указанная молекула киНК представляет собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающей от примерно 19 до примерно 25 пар оснований, которая содержит смысловой участок и антисмысловой участок и включает одну или несколько химических модификаций, где примерно 19 нуклеотидов в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью РНК или ее частью, кодируемой целевым геном. В другом варианте примерно 21 нуклеотид в антисмысловом участке спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью РНК или ее частью, кодируемой целевым геном. В любом из указанных выше вариантов 5'-конец фрагмента, включающего антисмысловой участок, может необязательно содержать фосфатную группу.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая способна ингибировать, осуществлять отрицательную регуляцию или снижать экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и где другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. В одном варианте каждая цепь содержит по меньшей мере две химические модификации (например, 2, 3, 4, 5 или более), которые могут быть одинаковыми или разными, такие как модификации сахарного фрагмента нуклеотида, основания нуклеотида или нуклеотидного скелета. В одном варианте большинство пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте большинство пуриновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию молекулы двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая способна ингибировать, осуществлять отрицательную регуляцию или снижать экспрессию целевого гена, где одна из цепей указанной молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК, которая кодирует белок, или ее части, а другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте каждая цепь молекулы киНК включает от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более), где каждая цепь включает по меньшей мере примерно 15 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи. В одном варианте молекула киНК собирается из двух олигонуклеотидных фрагментов, где один включает нуклеотидную последовательность антисмысловой цепи молекулы киНК и второй фрагмент включает нуклеотидную последовательность смыслового участка молекулы киНК. В одном варианте смысловая цепь соединена с антисмысловой цепью через линкерную молекулу, такую как полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-пуриновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте антисмысловая цепь включает один или несколько 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновых нуклеотидов и один или несколько 2'-О-метилпуриновых нуклеотидов. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды, и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В другом варианте указанная смысловая цепь включает 3'-конец и 5'-конец, где терминальный кэп-фрагмент (например, инвертированный дезоксибезосновный фрагмент или инвертированный дезоксинуклеотидный фрагмент, такой как инвертированный тимидин) присутствует на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах смысловой цепи. В другом варианте антисмысловая цепь включает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце антисмысловой цепи. В другом варианте антисмысловая цепь включает глицерильную модификацию на 3'-конце. В другом варианте 5'-конец антисмысловой цепи необязательно включает фосфатную группу.

В рамках любого из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения молекула двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, каждая из двух цепей молекулы киНК может включать от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более). В одном варианте осуществления настоящего изобретения от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в каждой цепи молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК. В одном варианте от примерно 15 до примерно 30 или более нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в каждой цепи молекулы киНК спарены по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК, где по меньшей мере два 3'-концевых нуклеотида в каждой цепи молекулы киНК не спарены по основанию с нуклеотидами в другой цепи молекулы киНК. В другом варианте каждый из 3'-концевых нуклеотидов в каждом фрагменте молекулы киНК представляет собой 2'-дезоксипиримидин, такой как 2'-дезокситимидин. В одном варианте каждая цепь молекулы киНК спарена по основанию с комплементарными нуклеотидами из другой цепи молекулы киНК. В другом варианте от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) в антисмысловой цепи спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью целевой РНК или ее частью. В одном варианте от примерно 18 до примерно 25 нуклеотидов (в частности, примерно 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) в антисмысловой цепи спарены по основанию с нуклеотидной последовательностью целевой РНК или ее частью.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи. В одном варианте каждая цепь содержит по меньшей мере две (например, 2, 3, 4 или 5 или более) различных химических модификаций, таких как модификации сахарного фрагмента нуклеотида, основания нуклеотида или нуклеотидного скелета. В одном варианте большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В другом варианте большая часть пуриновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента. В одном варианте 5'-конец антисмысловой цепи необязательно содержит фосфатную группу.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, и другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, и где указанная нуклеотидная последовательность или ее часть антисмысловой цепи комплементарна нуклеотидной последовательности нетранслируемого участка или его части в молекуле целевой РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая ингибирует экспрессию целевого гена, где одна из цепей молекулы двухцепочечной киНК представляет собой антисмысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, где другая цепь представляет собой смысловую цепь, которая включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности антисмысловой цепи, и где большая часть пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в молекуле двухцепочечной киНК, включает модификацию сахарного фрагмента, и где указанная нуклеотидная последовательность антисмысловой цепи комплементарна нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части, которая присутствует в целевой РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В другом варианте настоящее изобретение относится к двум или более различающимся молекулам киНК согласно настоящему изобретению (например, к молекулам киНК, действие которых направлено на различные участки целевой РНК, или молекулам киНК, которые направленно воздействуют на SREBP1 путь РНК) и фармацевтически приемлемому носителю или разбавителю.

В не ограничивающем примере осуществления настоящего изобретения встраивание химически модифицированных нуклеотидов в молекулы нуклеиновой кислоты представляет собой мощный инструмент, позволяющий преодолеть возможные ограничения по стабильности и биодоступности in vivo, характерные нативным молекулам РНК, которые подлежат экзогенной доставке. Так, например, использование молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты может позволить снизить дозу конкретной вводимой молекулы нуклеиновой кислоты для достижения заданного терапевтического эффекта, поскольку молекулы химически модифицированной нуклеиновой кислоты имеют более длительный период полувыведения из сыворотки. Кроме того, некоторые химические модификации могут повышать биодоступность молекул нуклеиновой кислоты за счет их прямого воздействия на конкретные клетки или ткани и/или за счет повышения уровня захвата молекул нуклеиновой кислоты клетками. В этой связи даже если активность молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты снижена в сравнении с молекулой нативной нуклеиновой кислоты, например в сравнении с молекулами нуклеиновой кислоты, применительно к суммарной РНК, то общая активность молекул модифицированной нуклеиновой кислоты может быть выше, чем нативной молекулы, в связи с повышенной стабильностью и/или благодаря повышенному уровню доставки молекулы. В отличие от нативных немодифицированных киНК химически модифицированные киНК также позволяют минимизировать возможность активации активности интерферона или возможность иммуностимуляции у людей. В этой связи указанные свойства являются преимуществом относительно нативных киРНК или минимально модифицированных киРНК, в свете их способности опосредовать РНКи, в контексте различных применений in vivo или in vitro, включая использование в исследовательских целях и в терапевтических стратегиях. Автор настоящего изобретения описывает молекулы химически модифицированных киНК с повышенной РНКи активностью в сравнении с соответствующими немодифицированными или минимально модифицированными молекулами киРНК. Химически модифицированные мотивы киНК, приведенные в настоящем описании, обеспечивают возможность поддерживать активность РНКи, которая по существу аналогична таковой для немодифицированных или минимально модифицированных активных киРНК (см., например, Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20:6877-6888), но обеспечивая в то же время устойчивость к действию нуклеаз и фармакокинетические свойства, приемлемые для использования в терапевтических вариантах применения.

В молекулах киНК, согласно любому варианту осуществления изобретения, антисмысловой участок рассматриваемой молекулы киНК может включать фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце указанного антисмыслового участка. В любых вариантах молекулы киНК согласно настоящему изобретению, приведенные в настоящем описании, характеризуются наличием антисмыслового участка, который может включать от примерно одной до примерно пяти фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 5'-конце указанного антисмыслового участка. В любых вариантах осуществления настоящего изобретения в рассматриваемых молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, которые химически модифицированы по сахарному фрагменту, основанию или скелету нуклеиновой кислоты. В любом из вариантов осуществления настоящего изобретения в рассматриваемых молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты могут включать, в качестве универсального основания один или несколько рибонуклеотидов. В любом из вариантов осуществления настоящего изобретения в молекулах киНК 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты могут включать один или несколько ациклических нуклеотидов.

Один вариант осуществления настоящего изобретения относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует по меньшей мере одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, таким образом, что допускается экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к клетке млекопитающего, включающей такой вектор экспрессии. Указанная клетка млекопитающего может представлять собой человеческую клетку. Молекула киНК в векторе экспрессии может включать смысловой участок и антисмысловой участок. Антисмысловой участок может включать последовательность, комплементарную последовательности РНК или ДНК, кодирующей мишень, а смысловой участок может включать последовательность, комплементарную антисмысловому участку. Молекула киНК может включать две различающихся цепи, содержащие комплементарные смысловой и антисмысловой участки. Молекула киНК может включать одну цепь, содержащую комплементарные смысловой и антисмысловой участки.

где каждый R1 и R2 независимо обозначает нуклеотид, фрагмент, отличный от нуклеотида, или полинуклеотид, который может быть природным или может быть химически модифицирован и который может быть включен в структуру молекулы киНК или может выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК, каждый X и Y независимо обозначает O, S, N, алкил или замещенный алкил, каждый Z и W независимо обозначают O, S, N, алкил, замещенный алкил, О-алкил, S-алкил, алкарил, аралкил или ацетил, и где W, X, Y и Z необязательно, но не все, обозначают O. В другом варианте модификация скелета согласно настоящему изобретению включает фосфоротиоатные и/или тиофосфоноацетатные межнуклеотидные связи (см., например, Sheehan et al., 2003, Nucleic Acids Research, 31, 4109-4118).

Химически модифицированные межнуклеотидные связи, имеющиеся в структуре формулы I, например, где любой из Z, W, X и/или Y необязательно включает атом серы, могут присутствовать в одной или обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) химически модифицированных межнуклеотидных связей, согласно формуле I, на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных межнуклеотидных связей, согласно формуле I, на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пиримидиновых нуклеотидов с химически модифицированными межнуклеотидными связями, согласно формуле I, в смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. В еще одном не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пуриновых нуклеотидов с химически модифицированными межнуклеотидными связями, согласно формуле I, в смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению, содержащая одну или несколько межнуклеотидных связей, согласно формуле I, также включает химически модифицированный нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы и описывается формулами I-VII.

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 или R12 обозначает независимо H, OH, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, O-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-OH, O-алкил-OH, O-алкил-SH, S-алкил-OH, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-O-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, O-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу формулы I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где любая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или служить точкой присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает O, S, CH2, S=O, CHF или CF2, и B обозначает нуклеозидное основание, такое как аденин, гуанин, урацил, цитозин, тимин, 2-аминоаденозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин или любое другое неприродное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК, или ненуклеозидное основание, такое как фенил, нафтил, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол, небуларин, пиридон, пиридинон или любое другое неприродное универсальное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированные фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, согласно настоящему описанию, или иной, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие белковую локализацию, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет 2'-дезокси-2'-фторнуклеотид. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет собой 2'-О-метилнуклеотид. В одном варианте нуклеотид согласно настоящему изобретению, описываемый формулой II, представляет 2'-дезоксинуклеотид.

Химически модифицированные нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы формулы II может присутствовать в одной или обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в его смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или в обеих цепях. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы II на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей.

где каждый из R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11 или R12 обозначает независимо H, OH, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, O-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-OH, O-алкил-OH, O-алкил-SH, S-алкил-OH, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-O-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, O-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу формулы I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где любая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или служить точкой присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает O, S, CH2, S=O, CHF или CF2, и B обозначает нуклеозидное основание, такое как аденин, гуанин, урацил, цитозин, тимин, 2-аминоаденозин, 5-метилцитозин, 2,6-диаминопурин или любое другое неприродное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК, или ненуклеозидное основание, такое как фенил, нафтил, 3-нитропиррол, 5-нитроиндол, небуларин, пиридон, пиридинон или любое другое неприродное универсальное основание, которое может быть комплементарным или может быть некомплементарным к целевой РНК. В одном варианте R3 и/или R7 включает/ют конъюгированные фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие белковую локализацию, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

Химически модифицированные нуклеотид или фрагмент ненуклеотидной природы формулы III может присутствовать в одной или в обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в его смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 3'-конце и 5'-конце или на обоих: 3'-конце и 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) химически модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы формулы III на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает нуклеотид формулы II или III, где указанный нуклеотид формулы II или III имеет инвертированную конфигурацию. Так, например, нуклеотид формулы II или III соединен с конструкцией киНК в конфигурации 3'-3', 3'-2', 2'-3' или 5'-5', например, на 3'-конце, на 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или обеих цепей киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает 5'-концевую фосфатную группу формулы IV:

где каждый X и Y независимо обозначает O, S, N, алкил, замещенный алкил или алкилгалоген; каждый Z и W независимо обозначает O, S, N, алкил, замещенный алкил, О-алкил, S-алкил, алкарил, аралкил, алкилгалоген или ацетил; и где W, X, Y и Z необязательно, но не все, обозначают O и Y, служит в качестве точки присоединения к молекуле киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, содержащей 5'-концевую фосфатную группу формулы IV в составе цепи, комплементарной к мишени, например в цепи, комплементарной к целевой РНК, где молекула киНК включает молекулу киНК суммарной РНК. В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, содержащей 5'-концевую фосфатную группу формулы IV в составе цепи, комплементарной к мишени, где указанная молекула киНК также включает от примерно 1 до примерно 3 (например, примерно 1, 2 или 3) нуклеотида в 3'-концевом выступающем нуклеотидном фрагменте, содержащем от примерно 1 до примерно 4 (в частности, примерно 1, 2, 3 или 4) дезоксирибонуклеотидов на 3'-конце одной или обеих цепей. В другом варианте 5'-концевая фосфатная группа формулы IV присутствует в составе цепи, комплементарной к мишени, в молекуле киНК согласно настоящему изобретению, например, молекуле киНК, содержащей химические модификации согласно формулам I-VII.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) внутри клетки или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей. Например, в не ограничивающем примере настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в одной цепи киНК. В еще одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в обеих цепях киНК. Указанные фосфоротиоатные межнуклеотидные связи могут присутствовать в одной или в обеих олигонуклеотидных цепях дуплекса киНК, например в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. Указанные молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут включать одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: на 3'-конце и на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепей. Например, репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать от примерно 1 до примерно 5 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) последовательных фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих цепях. В другом не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пиримидиновых фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях. В еще одном не ограничивающем примере репрезентативная молекула киНК согласно настоящему изобретению может включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) пуриновых фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в смысловой цепи, в антисмысловой цепи или в обеих цепях.

Каждая цепь молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению может содержать одну или несколько химических модификаций, так что каждая цепь характеризуется определенной картиной химических модификаций. Несколько не ограничивающих примеров разных схем модификаций, которые могут привести к созданию разных картин модификации, описаны ниже.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где смысловая цепь включает одну или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильных, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильных, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, и/или примерно один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 10 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильных, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильных, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или более (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно концевой кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие одной или нескольких, в частности примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей и/или терминального кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной или на разных цепях.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где указанная смысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5, конкретно примерно 1, 2, 3, 4 или 5, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио-, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или в антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие от примерно 1 до примерно 5 или более, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же цепи или на разных цепях.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где указанная антисмысловая цепь включает одну или несколько, конкретно примерно, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или примерно один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 10 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или в антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие одной или нескольких, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же или на разных цепях.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, где антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1,2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи; и где указанная антисмысловая цепь включает от примерно 1 до примерно 5 или более, конкретно примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тионуклеотидов, и/или один или несколько (в частности, примерно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) модифицированных нуклеотидов с универсальным основанием, и необязательно терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи. В другом варианте один или несколько, в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, пиримидиновых нуклеотидов в смысловой и/или антисмысловой цепи киНК химически модифицированы до 2'-дезокси-, 2'-О-метильного, 2'-О-трифторметильного, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси-, 4'-тио- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов, при наличии или в отсутствие от примерно 1 до примерно 5, в частности примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более, фосфоротиоатных межнуклеотидных связей, и/или концевого кэп-фрагмента на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах, которые могут присутствовать на одной и той же цепи или на разных цепях.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащей от 1 до примерно 5 или более (конкретно, примерно 1, 2, 3, 4, 5 или более) фосфоротиоатных межнуклеотидных связей в каждой цепи молекулы киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к молекуле киНК, включающей 2'-5'-межнуклеотидные связи. Одна или несколько 2'-5'-межнуклеотидных связей могут находиться на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или нескольких цепей последовательности киНК. Кроме того, одна или несколько 2'-5'-межнуклеотидных связей может присутствовать в различных других положениях на одной или обеих цепях последовательности киНК, в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пиримидинового нуклеотида в одной или обеих цепях молекулы киНК, которая может включать 2'-5'-межнуклеотидную связь, или примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более, включая каждую межнуклеотидную связь пуринового нуклеотида в одной или обеих цепях молекулы киНК, которая может включать 2'-5'-межнуклеотидную связь.

В другом варианте молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает дуплекс, содержащий две цепи, где одна или обе указанные цепи могут быть химически модифицированы, где каждая цепь независимо включает от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в длину, где указанный дуплекс содержит от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований и где указанная химическая модификация включает структуру, соответствующую любой из формул I-VII. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает дуплекс, содержащий две цепи, где одна или обе указанные цепи могут быть химически модифицированы посредством химической модификации, включающей структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где каждая цепь состоит примерно из 21 нуклеотида и каждая из них содержит двухнуклеотидный 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент и где указанный дуплекс содержит примерно 19 пар оснований. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одноцепочечную шпилечную структуру, где указанная киНК содержит от примерно 36 до примерно 70 (в частности, примерно 36, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 42 до примерно 50 (в частности, примерно 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством химической модификации, включающей структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует шпилечную структуру, содержащую от примерно 19 до примерно 21 (в частности, примерно 19, 20 или 21) пар оснований и двухнуклеотидный 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент. В другом варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает мотив стволовой части петли, где часть петли в молекуле киНК является биодеградируемой. Например, молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению конструируется таким образом, чтобы при разложении петлевой части молекулы киНК in vivo могла образовываться молекула двухцепочечной киНК с 3'-концевым выступающим фрагментом, таким как 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, содержащий примерно 2 нуклеотида.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает шпилечную структуру, где указанная молекула киНК содержит от примерно 25 до примерно 50 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 25 до примерно 35 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством одной или нескольких химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует шпилечную структуру, содержащую от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV). В другом варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению содержит мотив стволовой части петли, где указанная петлевая часть молекулы киНК является биодеградируемой. В одном варианте молекула линейной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает петлевую часть, содержащую ненуклеотидный линкер.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную шпилечную структуру, где указанная молекула киНК содержит от примерно 25 до примерно 50 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) нуклеотидов в длину и содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает линейный олигонуклеотид, содержащий от примерно 25 до примерно 35 (в частности, примерно 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35) нуклеотидов, которые химически модифицированы посредством одной или нескольких химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию, где указанный линейный олигонуклеотид формирует асимметричную шпилечную структуру, содержащую от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований и 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV). В одном варианте молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению содержит мотив стволовой части петли, где указанная петлевая часть молекулы киНК является биодеградируемой. В другом варианте молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению включает петлевую часть, содержащую ненуклеотидный линкер.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную двухцепочечную структуру, содержащую отдельные полинуклеотидные цепи, которые включают смысловой и антисмысловой участки, где антисмысловой участок имеет от примерно 15 до примерно 30 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок содержит от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок содержат по меньшей мере 3 комплементарных нуклеотида, и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная химически модифицированная молекула киНК согласно настоящему изобретению включает асимметричную двухцепочечную структуру, содержащую отдельные полинуклеотидные цепи, которые включают смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный антисмысловой участок содержит от примерно 18 до примерно 23 (в частности, примерно 18, 19, 20, 21, 22 или 23) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок содержит от примерно 3 до примерно 15 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) нуклеотидов в длину, и где указанный смысловой участок и указанный антисмысловой участок содержат по меньшей мере 3 комплементарных нуклеотида, и где указанная молекула киНК может включать одну или несколько химических модификаций, включающих структуру, соответствующую любой из формул I-VII или любому их сочетанию. В другом варианте молекула асимметричной двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению может также содержать 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована согласно настоящему описанию (например, по 5'-концевой фосфатной группе формулы IV).

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает кольцевую молекулу нуклеиновой кислоты, где указанная молекула киНК включает в длину от примерно 38 до примерно 70 нуклеотидов (в частности, примерно 38, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70) и содержит от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30) и где указанная молекула киНК может содержать химическую модификацию, которая включает структуру, соответствующую формулам I-VII или любому их сочетанию. Например, репрезентативная молекула химически модифицированной киНК согласно настоящему изобретению включает кольцевой олигонуклеотид, содержащий от примерно 42 до примерно 50 нуклеотидов (в частности, примерно 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50), которые химически модифицированы посредством химической модификации, которая включает структуру, соответствующую формулам I-VII или любому их сочетанию, где указанный кольцевой олигонуклеотид формирует структуру в форме гантели, содержащую примерно 19 пар оснований и 2 петли.

В другом варианте кольцевая молекула киНК согласно настоящему изобретению содержит два петлевых мотива, где одна или обе петлевых части в молекуле киНК являются биодеградируемыми. Например, кольцевая молекула киНК согласно настоящему изобретению сконструирована таким образом, что разложение петлевых частей молекулы киНК in vivo может приводить к образованию молекулы двухцепочечной киНК с 3'-концевыми выступающими фрагментами, такими как 3'-концевые нуклеотидные выступающие фрагменты, содержащие примерно 2 нуклеотида.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один (например, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) безосновный фрагмент, например соединение формулы V:

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 и R13 независимо обозначает Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждый из указанных фрагментов может быть включен в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает О, S, CH2, S=O, CHF или СF2. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один инвертированный безосновный фрагмент (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более фрагментов), например соединение формулы VI:

где каждый R3, R4, R5, R6, R7, R8, R10, R11, R12 и R13 обозначает независимо Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК; R9 обозначает О, S, CH2, S=О, CHF или СF2 и любой из R2, R3, R8 или R13 служит в качестве точек присоединения к молекуле киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте R3 и/или R7 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела, аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает по меньшей мере один замещенный полиалкильный фрагмент (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), например соединение формулы VII:

где n независимо равен целому числу от 1 до 12, каждый R1, R2 и R3 обозначает независимо Н, ОН, алкил, замещенный алкил, алкарил или аралкил, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCH3, OCN, O-алкил, S-алкил, N-алкил, О-алкенил, S-алкенил, N-алкенил, SO-алкил, алкил-OSH, алкил-ОН, О-алкил-ОН, О-алкил-SH, S-алкил-ОН, S-алкил-SH, алкил-S-алкил, алкил-О-алкил, ONO2, NO2, N3, NH2, аминоалкил, аминокислоту, аминоацил, ONH2, О-аминоалкил, О-аминокислоту, О-аминоацил, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил или группу, описываемую любой из формул I, II, III, IV, V, VI и/или VII, где каждая из указанных групп может быть включена в структуру молекулы киНК или выполнять функцию точки присоединения к молекуле киНК. В одном варианте R3 и/или R1 включает конъюгированный фрагмент и линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, приведенный в настоящем описании, или иной линкер, известный в данной области). Не ограничивающие примеры конъюгированных фрагментов включают лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин.

Термин «ZIP-кодовые» последовательности обозначает любую пептидную или белковую последовательность, которая вовлекается в клеточный топогенный транспорт, опосредованный сигнальным событием (см., например, Ray et al., 2004, Science, 306(1501): 1505).

Каждый нуклеотид в составе молекулы двухцепочечной киНК может независимо содержать химическую модификацию, включающую структуру, соответствующую любой из формул I-VIII. Таким образом, в одном варианте одно или несколько нуклеотидных положений в молекуле киНК согласно настоящему изобретению включает химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию. В одном варианте каждое нуклеотидное положение в составе молекулы киНК согласно настоящему изобретению содержит химическую модификацию, соответствующую любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию.

В одном варианте одно или несколько нуклеотидных положений в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает химическую модификацию, соответствующую структуре любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию. В одном варианте каждое нуклеотидное положение в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению содержит химическую модификацию, соответствующую любой из формул I-VII, или любую другую модификацию согласно настоящему описанию.

В другом варианте настоящее изобретение относится к соединению формулы VII, где R1 и R2 обозначают гидроксильные (ОН) группы, n=1, и R3 обозначает О и является точкой присоединения к 3'-концу, 5'-концу или к обоим: 3'- и 5'-концам на одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению или к одноцепочечной молекуле киНК согласно настоящему изобретению. Данная модификация обозначается в настоящем описании как «глицерильная» модификация (например, модификация 6, показанная на фиг. 10).

В другом варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий любой из формул V, VI или VII) согласно настоящему изобретению находятся на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах молекулы киНК согласно настоящему изобретению. Например, химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий формуле V, VI или VII) может присутствовать на 3'-конце, на 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой цепи, смысловой цепи или в обеих: антисмысловой и смысловой цепях молекулы киНК. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует в терминальном положении на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент, соответствующий формулам V, VI или VII) присутствует в двух терминальных положениях на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. В одном варианте химически модифицированный нуклеозидный или ненуклеозидный фрагмент (например, фрагмент формулы V, VI или VII) присутствует в предпоследнем положении на 5'-конце и 3'-конце смысловой цепи и на 3'-конце антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению. Дополнительно, фрагмент формулы VII может присутствовать на 3'-конце или 5'-конце молекулы шпилечной киНК согласно настоящему описанию.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает безосновный остаток формулы V или VI, где указанный безосновный остаток, соответствующий формуле V или VI, соединен с конструкцией киНК в 3'-3', 3'-2', 2'-3' или 5'-5' конфигурации, например, может находиться на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах одной или обеих цепей киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов в закрытой нуклеиновой кислоте (LNA), например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) 4'-тионуклеотидов, например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) ациклических нуклеотидов, например, на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах или согласно любому их сочетанию, в молекуле киНК.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает антисмысловую цепь или антисмысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок и антисмысловую цепь или антисмысловой участок, содержащий одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) модификаций: 2'-О-алкильную (например, 2'-О-метильную), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси-, FANA или безосновную химическую модификацию, или любое их сочетание.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтокси пиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей смысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтокси пуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и где любые нуклеотиды, включающие 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, присутствующий в указанном антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, включающей антисмысловой участок, где любые пиримидиновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды (например, один, или несколько, или все), присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (т.е. более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды).

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению, способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, включающей смысловой участок, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) из пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) из пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды), и антисмысловой участок, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пиримидиновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды), и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Смысловой участок и/или антисмысловой участок могут содержать модификацию в виде концевого кэппинга, такую как модификация, приведенная в настоящем описании или проиллюстрированная на фиг.10, которая необязательно может присутствовать на 3'-конце, 5'-конце или на обоих из них: и 3'-, и 5'-концах смысловой и/или антисмысловой последовательности. Смысловой участок и/или антисмысловой участок необязательно могут также содержать 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, включающий от примерно 1 до примерно 4 (например, 1, 2, 3 или 4) 2'-дезоксиинуклеотидов. Нуклеотиды на выступающем фрагменте могут также включать одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) фосфоротиоатных, фосфоноацетатных и/или тиофосфоноацетатных межнуклеотидных связей. Не ограничивающие примеры указанных химически модифицированных киНК проиллюстрированы на фиг. 4 и 5 и приведены в Таблице II в настоящем описании. В рамках любого из описанных здесь вариантов пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, альтернативно представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляет собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды) и один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Кроме того, в соответствии с любым описанным здесь вариантом один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом участке, альтернативно представляют собой пуриновые рибонуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой пуриновые рибонуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой пуриновые рибонуклеотиды) и любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды). Дополнительно, согласно любому из указанных вариантов один или несколько пуриновых нуклеотидов, присутствующих в смысловом и/или антисмысловом участке, альтернативно выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов (например, где все пуриновые нуклеотиды выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов или, альтернативно, множество (то есть более чем один) пуриновых нуклеотидов выбирают из группы, состоящей из 2'-дезоксинуклеотидов, нуклеотидов закрытых нуклеиновых кислот (LNA), 2'-метоксиэтилнуклеотидов, 4'-тионуклеотидов, 2'-О-трифторметилнуклеотидов, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотидов, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов).

В другом варианте любые модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно в антисмысловой цепи молекул киНК согласно настоящему изобретению, но также, необязательно, и в смысловой и/или в обеих: антисмысловой и смысловой, цепях, включают модифицированные нуклеотиды, обладающие свойствами или характеристиками, которые аналогичны природным рибонуклеотидам. Так, например, настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим модифицированные нуклеотиды, имеющие нозерн-конформацию (например, конформацию согласно циклу псевдоротации, см., например, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984), иначе известную как «рибо-подобная» конфигурация или «А-спираль». Соответственно, химически модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно в антисмысловой цепи молекул киНК согласно настоящему изобретению, но также, необязательно, и в смысловой и/или в обеих: антисмысловой и смысловой, цепях, устойчивы к нуклеазной деградации, но сохраняют при этом способность опосредовать РНКи. Не ограничивающие примеры нуклеотидов, имеющих нозерн-конформацию, включают нуклеотиды закрытых нуклеиновых кислот (LNA) (например, 2'-О, 4'-С-метилен-(D-рибофуранозил)нуклеотиды); 2'-метоксиэтокси нуклеотиды (МОЕ); 2'-метилтиоэтил-, 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, 2'-дезокси-2'-хлорнуклеотиды, 2'-азидонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды, 4'-тионуклеотиды и 2'-О-метилнуклеотиды.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваемая в нем смысловая цепь молекулы двухцепочечной киНК включает концевой кэппинг-фрагмент (см., например, фиг.10), такой как инвертированный дезоксибезосновный фрагмент, на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к химически модифицированной молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, где указанная химическая модификация включает конъюгат, ковалентно присоединенный к химически модифицированной молекуле киНК. Не ограничивающие примеры конъюгатов согласно настоящему изобретению включают конъюгаты, описанные в документе: Vargeese et al., USSN 10/427160, зарегистрированном 30 апреля 2003 г., который включен в настоящее описание полностью, включая имеющиеся в нем чертежи. В другом варианте указанный конъюгат ковалентно присоединен к химически модифицированной молекуле киНК через биодеградируемый линкер. В одном варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют к 3'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК. В другом варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют к 5'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК. В еще одном варианте указанную молекулу конъюгата присоединяют и к 3'-, и к 5'-концу любой из цепей: смысловой или антисмысловой, или к обеим цепям химически модифицированной молекулы киНК, или к их сочетанию. В одном варианте молекула конъюгата согласно настоящему изобретению включает молекулу, которая облегчает доставку химически модифицированной молекулы киНК в биологическую систему, такую как клетка. В другом варианте молекула конъюгата, присоединенная к химически модифицированной молекуле киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой лиганд для клеточного рецептора, такой как пептиды, получаемые из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включающие клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; стероиды и полиамины, такие как ПЭИ, спермин или спермидин. Примеры конкретных молекул конъюгатов согласно настоящему изобретению, которые могут быть присоединены к химически модифицированным молекулам киНК, описаны в документе: Vargeese et al., U.S. Serial № 10/201394, зарегистрированном 22 июля 2002, который включен в настоящее изобретение в качестве ссылки. Тип используемых конъюгатов и уровень конъюгированности молекул киНК согласно настоящему изобретению могут быть оценены с точки зрения улучшения фармакокинетических профилей, биодоступности и/или стабильности конструкций киНК, при сохранении в то же время способности киНК опосредовать активность РНКи. Соответственно, любой специалист со средним уровнем знаний в данной области в состоянии провести скрининг конструкций киНК, которые были модифицированы различными конъюгатами, с тем чтобы определить, обладает ли данный конъюгат киНК улучшенными свойствами, при сохранении способности вовлекаться в процесс РНКи, например, на моделях животных, известных в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к рассматриваемой в нем молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), где указанная молекула киНК включает также нуклеотидный, ненуклеотидный или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер, который соединяет смысловой участок молекулы киНК с антисмысловым участком молекулы киНК. В одном варианте нуклеотидный, ненуклеотидный или смешанный нуклеотидный/ненуклеотидный линкер используется, например, для присоединения конъюгатного фрагмента к киНК. В одном варианте нуклеотидный линкер согласно настоящему изобретению может представлять собой линкер, включающий в длину ≥2 нуклеотидов, в частности примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. В другом варианте указанный нуклеотидный линкер может представлять собой аптамер нуклеиновой кислоты. Термин «аптамер» или «аптамер нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая включает последовательность, распознаваемую молекулой-мишенью в естественной среде. Альтернативно, аптамер может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула-мишень не связывается в естественных условиях с нуклеиновой кислотой. Молекула-мишень может представлять собой любую интересующую молекулу. Так, например, аптамер может использоваться для связывания с лиганд-связывающим доменом белка, препятствуя тем самым имеющему место в естественных условиях взаимодействию лиганда с белком. Приведенный пример не ограничивает настоящее изобретение и для специалистов в данной области очевидно, что с использованием известных методик могут быть реализованы также другие варианты (См., например, Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brody and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Curr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotechnol., 74, 27; Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820; и Jayasena, 1999, Clinical Chemistry, 45, 1628).

В еще одном варианте ненуклеотидный линкер согласно настоящему изобретению включает безосновный нуклеотид, полиэфир, полиамин, полиамид, пептид, углевод, липид, полиуглеводород или другие полимерные соединения (например, полиэтиленгликоли, такие как полиэтиленгликоли, включающие от 2 до 100 этиленгликольных единиц). Конкретные примеры включают соответствующие примеры, описанные в литературе (Seela and Kaiser, Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353 и Nucleic Acids Res. 1987, 15:3113; Cload and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:6324; Richardson and Schepartz, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:5109; Ma et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21:2585 и Biochemistry 1993, 32:1751; Durand et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18:6353; McCurdy et al., Nucleosides & Nucleotides 1991, 10:287; Jschke et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34:301; Ono et al., Biochemistry 1991, 30:9914; Arnold et al., публикация по международному патенту № WO 89/02439; Usman et al., публикация по международному патенту № WO 95/06731; Dudycz et al., публикация по международному патенту № WO 95/11910, и Ferentz and Verdine, J. Am. Chem. Soc. 1991, 113:4000, все указанные работы включены в настоящее описание в качестве ссылок). Термин «ненуклеотидный» также охватывает любую группу или любое соединение, которые могут быть введены в состав цепи нуклеиновой кислоты вместо одной или нескольких нуклеотидных единиц, включая замещения сахарами и/или фосфатными группами, и которые позволяют оставшимся основаниям проявлять свойственную им энзиматическую активность. Указанные группа или соединение могут быть безосновными, в том смысле, что они не содержат обычно распознаваемое нуклеотидное основание, такое как аденозин, гуанин, цитозин, урацил или тимин, например, в С1 положении сахара.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), способной опосредовать интерференцию РНК (РНКи) в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, где одна или обе цепи молекулы киНК, которые были собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, не включают рибонуклеотидов. Например, молекула киНК может быть собрана на основе одного олигонуклеотида, где смысловой и антисмысловой участки киНК включают отдельные олигонуклеотиды, которые не содержат никаких рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-ОН группу) в составе олигонуклеотидов. В другом примере молекула киНК может быть собрана на основе одного олигонуклеотида, где смысловой и антисмысловой участки киНК соединены или циклизованы нуклеотидным или ненуклеотидным линкером согласно настоящему описанию, где указанный олигонуклеотид не содержит никаких рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-ОН группу) в составе олигонуклеотида. Автор настоящей заявки неожиданно обнаружил, что присутствие рибонуклеотидов (например, нуклеотидов, содержащих 2'-гидроксильную группу) в составе молекулы киНК не требуется или не является обязательным для проявления активности РНКи. Соответственно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения все положения в составе киНК могут включать химически модифицированные нуклеотиды или отличные от нуклеотидов фрагменты, такие как нуклеотиды или отличные от нуклеотидов фрагменты, описываемые формулами I, II, II, IV, V, VI или VII, или любое их сочетание, на том уровне, который позволяет сохранить способность молекулы киНК поддерживать активность РНКи.

В еще одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной киНК, которая опосредует активность РНКи в клетке или в составе восстановленной in vitro системы, включающей одноцепочечный полинуклеотид, обладающий комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает 5'-концевую фосфатную группу. В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает 5'-концевую фосфатную группу и 3'-концевую фосфатную группу (например, 2',3'-циклический фосфат). В другом варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В еще одном варианте молекула одноцепочечной киНК согласно настоящему изобретению включает один или несколько химически модифицированных нуклеотидов или отличных от нуклеотидов фрагментов согласно настоящему описанию. Например, все положения в молекуле киНК могут включать химически модифицированные нуклеотиды, такие как нуклеотиды, описываемые любой из формул I-VII, или любое их сочетание, на том уровне, который позволяет сохранить способность молекулы киНК поддерживать активность РНКи.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу одноцепочечной киНК, которая опосредует активность РНКи или которая, в альтернативном варианте, моделирует активность РНКи в клетке или в восстановленной in vitro системе, включающей одноцепочечный полинуклеотид, характеризующийся комплементарностью к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, где один или несколько пиримидиновых нуклеотидов, присутствующих в киНК, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды (например, где все пиримидиновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пиримидиновых нуклеотидов представляет собой 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипиримидиновые нуклеотиды) и где любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-О-метил-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси- или 2'-О-дифторметоксиэтоксипуриновые нуклеотиды), и включает концевую кэп-модификацию, такую как любая модификация, приведенная в настоящем описании или проиллюстрированная на фиг. 10, которая необязательно может присутствовать на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах антисмысловой последовательности. Указанная молекула киНК необязательно включает также от примерно 1 до примерно 4 или более (в частности, примерно 1, 2, 3, 4 или более) концевых 2'-дезоксинуклеотидов на 3'-конце молекулы киНК, где указанные концевые нуклеотиды могут также включать одну или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4 или более) фосфоротиоатных, фосфоноацетатных и/или тиофосфоноацетатных межнуклеотидных связей и где указанная молекула киНК необязательно также включает концевую фосфатную группу, такую как 5'-концевая фосфатная группа. В любом из указанных вариантов любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловом участке, представляют собой, альтернативно, 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды). Кроме того, в любом из указанных вариантов осуществления настоящего изобретения любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК (например, пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке и/или антисмысловом участке), могут, альтернативно, представлять собой нуклеотиды закрытой нуклеиновой кислоты (LNA) (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой нуклеотиды LNA или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой нуклеотиды LNA). Кроме того, в любом из указанных вариантов осуществления настоящего изобретения любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в молекуле киНК, представляют собой, альтернативно, 2'-метоксиэтилпуриновые нуклеотиды (например, где все пуриновые нуклеотиды представляют собой 2'- метоксиэтилпуриновые нуклеотиды или, альтернативно, множество пуриновых нуклеотидов представляют собой 2'-метоксиэтилпуриновые нуклеотиды). В другом варианте осуществления настоящего изобретения любые модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах одноцепочечных киНК согласно настоящему изобретению, включают модифицированные нуклеотиды, обладающие свойствами или характеристиками, аналогичными таковым природных рибонуклеотидов. Например, настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим модифицированные нуклеотиды, характеризующиеся нозерн-конформацией (например, конформация согласно циклу нозерн-псевдоротации, см. например, Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag ed., 1984). Соответственно, химически модифицированные нуклеотиды, присутствующие в молекулах одноцепочечных киНК согласно настоящему изобретению, предпочтительно устойчивы к нуклеазной деградации, но в то же время они сохраняют способность опосредовать процесс РНКи.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок, который содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных) модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в смысловой цепи или в смысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает антисмысловую цепь или антисмысловой участок, который содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных) модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в антисмысловой цепи или в антисмысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула химически модифицированной короткой интерферирующей кислоты (киНК) согласно настоящему изобретению включает смысловую цепь или смысловой участок и антисмысловую цепь или антисмысловой участок, каждый из которых содержит две или более (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более) 2'-О-алкильных (например, 2'-О-метильных), 2'-дезокси-2'-фтор-, 2'-дезокси- или безосновных химических модификаций или любое их сочетание. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в смысловой цепи или в смысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п. В другом варианте 2'-О-алкильная модификация находится в чередующихся положениях в антисмысловой цепи или в антисмысловом участке киНК, таких как положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 и т.п. или положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 и т.п.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает химически модифицированные нуклеотиды или фрагменты ненуклеотидной природы (например, описываемые любой из формул I-VII, такие как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды) в чередующихся положениях в пределах одной или нескольких цепей или участков молекулы киНК. Так, например, такие химические модификации могут быть встроены в положение через один на молекуле киНК, созданной на основе РНК, начиная от первого или второго нуклеотида с 3'-конца или 5'-конца молекулы киНК. В не ограничивающем примере молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению, в которой каждая цепь в киНК составляет 21 нуклеотид в длину, характеризуется тем, что положения 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21 в каждой цепи химически модифицированы (например, представляет соединение, описываемое любой из формул I-VII, такое как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды). В другом не ограничивающем примере молекула двухцепочечной киНК согласно настоящему изобретению, в которой каждая цепь в киНК составляет 21 нуклеотид в длину, характеризуется тем, что положения 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 в каждой цепи химически модифицированы (например, представляет соединение, описываемое любой из формул I-VII, такое как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси- или 2'-О-метилнуклеотиды). В одном варианте одна цепь молекулы двухцепочечной киНК включает химические модификации в положениях 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 и химические модификации в положениях 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 и 21. Такие молекулы киНК также могут включать концевые кэп-фрагменты и/или скелетные модификации согласно настоящему описанию.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пуриновые нуклеозиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из положений концевых нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или участка антисмысловой цепи (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пуриновые нуклеотиды являются рибонуклеотидами. В другом варианте пуриновые рибонуклеотиды, при их наличии, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-«пассажир») молекулы киНК. Такие пуриновые рибонуклеотиды могут присутствовать в стабилизационном мотиве киНК, который в ином случае включает модифицированные нуклеотиды.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пиримидиновые нуклеотиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из положений концевых нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или антисмыслового участка (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пиримидиновые нуклеозиды являются рибонуклеотидами. В другом варианте пиримидиновые рибонуклеотиды, в случае их наличия, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-»пассажир») молекулы киНК. Такие пиримидиновые рибонуклеотиды могут присутствовать в стабилизационном мотиве киНК, который в ином случае включает модифицированные нуклеотиды.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется следующими особенностями: если пиримидиновые нуклеотиды присутствуют на 5'-конце (например, по любому из концевых положений нуклеотидов 1, 2, 3, 4, 5 или 6 от 5'-конца) антисмысловой цепи или антисмыслового участка (иначе называемой как ведущая последовательность или ведущая цепь) молекулы киНК, то такие пиримидиновые нуклеозиды являются модифицированными нуклеотидами. В другом варианте модифицированные пиримидиновые нуклеотиды, в случае их наличия, спарены по основаниям с нуклеотидами смысловой цепи или смыслового участка (иначе называемой как цепь-«пассажир») молекулы киНК. Не ограничивающие примеры модифицированных пиримидиновых нуклеотидов включают такие нуклеотиды, которые описываются любой из формул I-VII, такие как 2'-дезокси-, 2'-дезокси-2'-фтор-, 4'-тио-, 2'-О-трифторметил-, 2'-О-этилтрифторметокси-, 2'-О-дифторметоксиэтокси или 2'-О-метилнуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SI:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их наличия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой независимо 2'-О-метилнуклеотиды, 2'-дезоксирибонуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов; и

(с) любые (N) нуклеотиды представляют собой необязательно 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой рибонуклеотиды; и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, в которых любые пуриновые нуклеотиды, в случае их присутствия, представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

(а) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в антисмысловой цепи (нижняя цепь), отличающиеся от пуриновых нуклеотидов в [N] нуклеотидных положениях, представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды;

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой нуклеотиды, имеющие рибоподобную конфигурацию (например, нозерн-конфигурацию или А-спираль); любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-О-метилнуклеотиды; и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVI:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает спаренные по основанию или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, включающие последовательность, которая придает 5'-концу антисмысловой цепи (нижняя цепь) меньшую термостабильность, чем 5'-конец в смысловой цепи (верхняя цепь); Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; NX3 комплементарен NX4 и NX5, и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 30; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30; NX3 комплементарен NX4; и любые (N) нуклеотиды представляют собой 2'-О-метил- и/или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SVIII:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть немодифицированными или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, включающие последовательность, которая придает 5'-концу антисмысловой цепи (нижняя цепь) меньшую термостабильность, чем 5'-конец в смысловой цепи (верхняя цепь); [ N ] обозначает положения, в которых нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; Х6 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 4; Х7 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; NX7, NX6 и NX3 комплементарны NX4 и NX5, и

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, отличные от [N] нуклеотидов; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов, отличных от [ N ] нуклеотидов; и

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SIX:

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SX:

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXI:

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXII:

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXIII:

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющей структуру SXIV:

где каждый N независимо обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или может отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть не модифицированы или которые могут быть химически модифицированы; [N] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; [ N ] обозначает положения, в которых нуклеотиды являются рибонуклеотидами; Х1 и Х2 обозначают независимо целые числа от примерно 0 до примерно 4; Х3 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; Х4 обозначает целое число от примерно 11 до примерно 30, при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет от 17 до 36; Х5 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 6; Х6 обозначает целое число от примерно 1 до примерно 4; Х7 обозначает целое число от примерно 9 до примерно 15; NX7, NX6 и NX3 комплементарны NX4 и NX5, и

(b) любые пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, отличающиеся от [ N ] нуклеотидов; любые пуриновые нуклеотиды, присутствующие в смысловой цепи (верхняя цепь), представляют собой независимо 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилнуклеотиды или сочетание 2'-дезоксирибонуклеотидов и 2'-О-метилнуклеотидов, отличающиеся от [ N ] нуклеотидов; и

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает концевую фосфатную группу на 5'-конце антисмысловой цепи или антисмыслового участка молекулы нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=1, 2 или 3; каждый Х1 и Х2=1 или 2; Х3=12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, и Х4=5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=1; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=18.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=2; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=17.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает Х5=3; каждый Х1 и Х2=2; Х3=19 и Х4=16.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает В на 3'- и 5'-концах смысловой цепи или смыслового участка.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает В на 3'-конце антисмысловой цепи или антисмыслового участка.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, также включает одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей по первому концевому (N) на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или на обеих: смысловой цепи и антисмысловой цепи молекулы нуклеиновой кислоты. Например, молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты может включать Х1 и/или Х2=2, содержащие нуклеотиды в выступающих положениях с фосфоротиоатной межнуклеотидной связью, например, (NsN), где «s» обозначает фосфоротиоат.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды в антисмысловой цепи (нижняя цепь), которые комплементарны нуклеотидам в целевой полинуклеотидной последовательности, обладающей комплементарностью к N и [N] нуклеотидам антисмысловой (нижней) цепи.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает (N) нуклеотиды в смысловой цепи (верхняя цепь), которые содержат нуклеотидную последовательность, соответствующую целевой полинуклеотидной последовательности, комплементарной к антисмысловой (нижней) цепи, так что непрерывная (N) и N нуклеотидная последовательность смысловой цепи включает нуклеотидную последовательность из последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает В только на 5'-конце смысловой (верхней) цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SI, SII, SIII, SIV, SV, SVI, SVII, SVIII, SIX, SX, SXII, SXIII или SXIV, включает также неспаренный концевой нуклеотид на 5'-конце антисмысловой (нижней) цепи. Неспаренный нуклеотид не комплементарен смысловой (верхней) цепи. В одном варианте неспаренный концевой нуклеотид комплементарен целевой полинуклеотидной последовательности, которая комплементарна N и [N] нуклеотидам в антисмысловой (нижней) цепи. В другом варианте неспаренный концевой нуклеотид не комплементарен последовательности целевого полинуклеотида, характеризующейся комплементарностью к N и [N] нуклеотидам в антисмысловой (нижней) цепи.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает Х6=1 и Х3=10.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, имеющая любую из структур SVIII или SXIV, включает Х6=2 и Х3=9.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, или ингибитор РНКи, изготовленный в виде любой из композиций LNP-051; LNP-053; LNP-054; LNP-069; LNP-073; LNP-077; LNP-080; LNP-082; LNP-083; LNP-060; LNP-061; LNP-086; LNP-097; LNP-098; LNP-099; LNP-100; LNP-101; LNP-102; LNP-103 или LNP-104 (см. таблица IV).

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей первую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты и вторую молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, где каждая из молекул имеет первую цепь и вторую цепь, которые комплементарны друг другу, где указанная вторая цепь первой молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную первой целевой последовательности, и вторая цепь второй молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность, комплементарную второй мишени или целевой последовательности определенного пути. В одном варианте указанная композиция также включает катионный липид, нейтральный липид и полиэтиленгликолевый конъюгат. В одном варианте композиция также включает катионный липид, нейтральный липид, полиэтиленгликолевый конъюгат и холестерин. В одном варианте композиция также включает полиэтиленгликолевый конъюгат, холестерин и поверхностно-активное вещество. В одном варианте указанный катионный липид выбирают из группы, состоящей из CLinDMA, pCLinDMA, eCLinDMA, DMOBA и DMLBA. В одном варианте указанный нейтральный липид выбирают из группы, состоящей из DSPC, DOBA и холестерина. В одном варианте указанный полиэтиленгликолевый конъюгат выбирают из группы, состоящей из ПЭГ-димиристоилглицерола и ПЭГ-холестерина. В одном варианте указанный ПЭГ представляет собой 2К-ПЭГ. В одном варианте указанное поверхностно-активное вещество выбирают из группы, состоящей из пальмитилового спирта, стеарилового спирта, олеилового спирта и линолеилового спирта. В одном варианте указанный катионный липид представляет собой CLinDMA, нейтральный липид представляет собой DSPC, полиэтиленгликолевый конъюгат представляет собой 2К-ПЭГ-DMG, холестерин представляет собой холестерин и поверхностно-активное вещество представляет собой линолеиловый спирт. В одном варианте указанные CLinDMA, DSPC, 2К-ПЭГ-DMG, холестерин и линолеиловый спирт присутствуют в молярном соотношении 43:38:10:2:7 соответственно.

В любом из приведенных в описании вариантов молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней через процесс интерференции РНК или посредством ингибирования интерференции РНК. В одном варианте интерференция РНК представляет собой RISC-опосредованные расщепления мишени (например, киРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне трансляции (например, миРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне транскрипции (например, киРНК-опосредованное молчание на уровне транскрипции). В одном варианте интерференция РНК происходит в цитоплазме. В одном варианте интерференция РНК происходит в ядре.

В любом из приведенных в описании вариантов молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней посредством ингибирования эндогенной целевой РНК, такой как эндогенная мРНК, киРНК, миРНК, или, альтернативно, через ингибирование RISC.

В одном варианте настоящее изобретение относится к одному или нескольким ингибиторам РНКи, которые модулируют экспрессию одного или нескольких генов-мишеней посредством ингибирования миРНК, ингибирования киРНК или ингибирования RISC.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой молекулу киНК, приведенную в настоящем описании, которая содержит одну или несколько цепей, комплементарных одной или нескольким целевым молекулам миРНК или киРНК.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой антисмысловую молекулу, которая комплементарна целевой молекуле миРНК или киРНК или их части. Антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать в длину от примерно 10 до примерно 40 нуклеотидов (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов в длину). Антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы, приведенных в настоящем описании (см., например, молекулы, описываемые любой из формул I-VII согласно настоящему описанию или их любым сочетанием). В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метилнуклеотиды. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды (также известные, как 2'-метоксиэтокси- или МОЕ). В одном варианте антисмысловой ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать одну, или несколько, или все фосфоротиоатные межнуклеотидные связи. В одном варианте антисмысловой ингибитор РНК согласно настоящему изобретению может включать терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, антисмыслового ингибитора РНК.

В одном варианте ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению представляет собой аптамер нуклеиновой кислоты, имеющий связывающую аффинность к RISC, такой как регулируемый аптамер (см., например, An et al., 2006, RNA, 12:710-716). Аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать в длину от примерно 10 до примерно 50 нуклеотидов (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 нуклеотидов в длину). Аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько модифицированных нуклеотидов или фрагментов ненуклеотидной природы, приведенных в настоящем описании (см., например, молекулы, описываемые любой из формул I-VII согласно настоящему описанию или их любым сочетанием). В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один, или несколько, или все 2'-О-метилнуклеотиды. В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько, или все 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды. В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать один или несколько или все 2'-О-метоксиэтилнуклеотиды (также известные как 2'-метоксиэтокси- или МОЕ). В одном варианте аптамер-ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может включать одну, или несколько, или все фосфоротиоатные межнуклеотидные связи. В одном варианте аптамер-ингибитор РНК согласно настоящему изобретению может включать терминальный кэп-фрагмент на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, аптамера-ингибитора РНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии целевого гена в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК целевого гена; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательности целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными или могут быть немодифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающему: (а) синтез одной или нескольких молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными или могут быть немодифицированными, где цепи киНК включают последовательности, комплементарные РНК генов-мишеней, и где указанные последовательности смысловой цепи киНК включают последовательности, идентичные или по существу аналогичные последовательностям целевых РНК; и (b) введение молекул киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна или несколько цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишеней, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательностям целевых РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной или может быть немодифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где указанная последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательностям целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используются в качестве реагента в вариантах применения ex vivo. Например, киНК реагенты вводят в ткань или в клетки, которые затем трансплантируют в организм субъекта для достижения терапевтического эффекта. Указанные клетки и/или ткань могут быть получены из организма или от субъекта, которому позже будет введен эксплантат, или могут быть получены из другого организма или от другого субъекта перед трансплантацией. Молекулы киНК могут использоваться для модуляции экспрессии одного или нескольких генов в клетках или ткани, так что указанные клетки или ткань получают желательный фенотип или становятся способными осуществлять соответствующую функцию при трансплантации in vivo. В одном варианте выделяют определенные клетки-мишени от пациента. Указанные выделенные клетки подвергают контакту с киНК, направленными на специфическую нуклеотидную последовательность внутри клетки, в условиях, подходящих для захвата киНК указанными клетками (например, с использованием реагентов для доставки, таких как катионные липиды, липосомы и т.п., или с использованием других методик, таких как электропорация, для облегчения доставки киНК в клетки). Далее клетки снова вводят в организм того же пациента или другим пациентам.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна или несколько цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени, и где последовательность смысловой цепи киНК включает последовательность, идентичную или по существу аналогичную последовательности целевой РНК; и (b) введение молекулы киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в тканевом эксплантате, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного из определенного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в тканевом эксплантате. В другом варианте данный способ также включает введение тканевого эксплантата снова в организм, из которого была получена ткань, или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-миши; и (b) введение молекулы киНК субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме. Уровень целевого белка или РНК может быть определен с использованием различных методик, известных в данной области.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного целевого гена у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК генов-мишеней; и (b) введение молекул киНК субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней у субъекта или в организме. Уровень целевого белка или РНК может быть определен с использованием различных методик, известных в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК в клетку в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в клетке.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в клетке, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) контактирование клетки in vitro или in vivo с молекулой киНК в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в клетке.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате (например, в любом органе, ткани или клетке, которые могут быть трансплантированы из одного организма в другой или возвращены в тот же организм, из которого данный орган, данная ткань или клетка были взяты), включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, обладающую комплементарностью к РНК гена-мишени; и (b) контактирование клетки из тканевого эксплантата, полученного от конкретного субъекта или из конкретного организма, с молекулой киНК в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени в тканевом эксплантате. В другом варианте указанный способ также включает введение тканевого эксплантата снова тому субъекту или в тот организм, от/из которого данная ткань была получена, или другому субъекту или другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у указанного субъекта или в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени в тканевом эксплантате (например, в любом органе, любой ткани или клетке, которые могут быть трансплантированы из одного организма в другой или возвращены в тот же организм, из которого данный орган, данная ткань или клетка были взяты), включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекул киНК в клетку тканевого эксплантата, полученного от конкретного субъекта или из конкретного организма, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней в тканевом эксплантате. В другом варианте указанный способ также включает введение тканевого эксплантата снова тому субъекту или в тот организм, из которого данная ткань была получена, или другому субъекту или в другой организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии генов-мишеней у указанного субъекта или в указанном организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекулы киНК субъекту или в организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени у субъекта или в организме, включающему: (а) синтез молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными, где указанная молекула киНК включает одноцепочечную последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; и (b) введение молекул киНК субъекту или в организм, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, расстройства, признака или состояния, связанных с экспрессией или активностью гена у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме. Снижение экспрессии гена и в этой связи снижение уровня соответствующего белка/РНК облегчает до некоторой степени симптомы заболевания, расстройства, болезненного признака или болезненного состояния.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения рака у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение рака. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как раковые клетки и ткани. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как подкожное или внутривенное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие рака у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения рака у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения пролиферативного заболевания или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или преждупреждение пролиферативного заболевания или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как клетки ткани, вовлекаемые в пролиферативное заболевание. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие пролиферативного заболевания или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения пролиферативных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата). В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в реакцию отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата). В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения реакции отторжения трансплантата и/или ткани (отторжения аллотрансплантата) у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в аутоиммунное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие аутоиммунного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения аутоиммунных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в инфекционное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие инфекционного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения инфекционных заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где адефовир-дипивоксил и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.), которые все включены полностью в настоящее описание в качестве ссылки. Такие композиции киНК в основном называются как «липидные частицы с нуклеиновой кислотой» (LNP).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где ламивудин (3ТС) и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой киНК. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., и в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/70 946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; и (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам в антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химические модификации отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химические модификации отличаются друг от друга; и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие химическую модификацию; и (f) по меньшей мере две химических модификации отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения инфекции вирусом гепатита В (HBV) у субъекта, включающему введение указанному субъекту адефовира-дипивоксила и ламивудина (3ТС) в сочетании с молекулой химически синтезированной двухцепочечной нуклеиновой кислоты; где (а) указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает смысловую цепь и антисмысловую цепь; (b) каждая цепь указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит в длину от 15 до 28 нуклеотидов; (с) по меньшей мере 15 нуклеотидов в смысловой цепи комплементарны нуклеотидам антисмысловой цепи; (d) антисмысловая цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты комплементарна целевой РНК вируса гепатита В (HBV); (е) по меньшей мере 20% внутренних нуклеотидов в каждой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты представляют модифицированные нуклеозиды, включающие сахарную модификацию; и (f) по меньшей мере две модификации сахарного фрагмента отличаются друг от друга; и где адефовир-дипивоксил и ламивудин (3ТС) и молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты вводят в условиях, подходящих для снижения или ингибирования уровня вируса гепатита В (HBV) у субъекта, в сравнении с субъектом, который не подвергается лечению адефовиром-дипивоксилом и ламивудином (3ТС) и молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г. (Vargeese et al.).

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей адефовир-дипивоксил или молекулы одной или нескольких двухцепочечных нуклеиновых кислот или молекул киНК согласно настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей адефовир-дипивоксил, ламивудин (3ТС) и молекулы одной или нескольких двухцепочечных нуклеиновых кислот или молекулы киНК согласно настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в возрастное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие возрастного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения возрастных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в неврологическое или нейродегенеративное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие неврологического или нейродегенеративного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения неврологических или нейродегенеративных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как клетки и ткани, вовлекаемые в респираторное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие респираторного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения респираторных заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие, как ткани и клетки, вовлекаемые в офтальмологическое заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие офтальмологического заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения офтальмологических заболеваний, расстройств, признаков или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения кожного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или профилактика кожного заболевания, расстройства, признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки, вовлекаемые в кожное заболевание, расстройство, признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие, как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие кожного заболевания, расстройства, признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения кожных заболеваний, признаков, расстройств или состояний у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния (например, гепатита, HCV, HBV, диабета, цирроза, гепатоцеллюлярной карциномы и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки печени, вовлекаемые в заболевание печени, расстройство функции печени, соответствующий признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболевания печени, расстройства функции печени, соответствующего признака или состояния у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния (например, поликистоза почки и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки почки, вовлекаемые в заболевание почки, расстройство функции почки, соответствующий признак или состояние. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания почки, расстройства функции почки, соответствующего признака или состояния. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний почки, расстройств функции почки, соответствующих признаков или состояний.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха (например, снижения слуха, глухоты и т.п.) у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани и клетки уха, внутреннего уха или среднего уха, вовлекаемые в заболевание, расстройство, признак или состояние системы органов слуха. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное или подкожное введение киНК) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболевания, расстройства, признака или состояния системы органов слуха у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний, расстройств, признаков или состояний системы органов слуха у субъекта или в организме.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких метаболических заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение одного или нескольких метаболических заболеваний, признаков или состояний. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие метаболического заболевания, признака или состояния у субъекта или в организме (например, в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, жировую ткань или жировые клетки). Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижении направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме (например, на ткани или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, жировую ткань или жировые клетки). Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения метаболических заболеваний, признаков или состояний у субъекта или в организме. В одном варианте метаболическое заболевание выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, дислипидемии, диабета (например, диабета типа I и/или типа II), инсулинрезистентности, ожирения или родственных состояний, включающих, без ограничения, апноэ во сне, хиатальную грыжу, эзофагеальный рефлюкс, остеоартрит, подагру, рак, ассоциированный с повышенным весом, камни желчного пузыря, камни в почках, легочную гипертензию, бесплодие, заболевание сердечно-сосудистой системы, повышенный вес и повышенные относительно нормы уровни липидов, мочевой кислоты или оксалатов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения одного или нескольких заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего могут быть достигнуты лечение или предупреждение одного или нескольких заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, например в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, в жировую ткань или в жировые клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки, такие как ткани или клетки, вовлекаемые в поддержание или развитие заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для лечения или предупреждения заболеваний сердечно-сосудистой системы, соответствующих признаков или состояний у субъекта или в организме. В одном варианте указанное заболевание сердечно-сосудистой системы выбирают из группы, состоящей из гипертензии, тромбоза венечной артерии, сердечного приступа, липидных синдромов, гипергликемии, гипертриглицеридемии, гиперлипидемии, ишемии, застойной сердечной недостаточности и инфаркта миокарда.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу снижения веса у субъекта или организма, включающему контактирование указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме, посредством чего может быть достигнуто снижение веса. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению через локальное введение в соответствующие ткани или клетки, например, в ткань или клетки печени, поджелудочной железы, тонкого кишечника, в жировую ткань или в жировые клетки. В одном варианте настоящее изобретение относится к контактированию указанного субъекта или организма с молекулой киНК согласно настоящему изобретению посредством системного введения (такого как внутривенное, внутримышечное, подкожное введение киНК или введение киНК через ЖКТ) в соответствующие ткани или клетки. Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть введена в состав композиции или может быть конъюгирована согласно настоящему описанию или по иным методикам, известным в данной области, с целью достижения направленного воздействия на соответствующие ткани или клетки у субъекта или в организме. Молекула киНК может быть объединена с другими терапевтическими вариантами и стратегиями, известными в данной области как подходящие для снижения веса у субъекта или организма.

В одном варианте молекулу киНК или молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 г., а также в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 г., и в USSN 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 г. (Vargeese et al.).

В любом из приведенных в настоящем описании способов модуляции экспрессии одного или нескольких генов-мишеней для лечения или предупреждения заболеваний, признаков, состояний или фенотипов в клетке, у субъекта или в организме, молекула киНК согласно настоящему изобретению модулирует экспрессию одной или нескольких мишеней посредством интерференции РНК. В одном варианте интерференция РНК представляет собой RISC-опосредованное расщепление мишени (например, киРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне трансляции (например, миРНК-опосредованную интерференцию РНК). В одном варианте интерференция РНК представляет собой ингибирование мишени на уровне транскрипции (например, киРНК-опосредованное молчание на уровне транскрипции). В одном варианте интерференция РНК происходит в цитоплазме. В одном варианте интерференция РНК происходит в ядре.

В рамках любого из способов лечения согласно настоящему изобретению киНК может быть введена субъекту в ходе лечения, например, при введении с различными интервалами времени, такими как введение один раз в день в течение всего курса лечения, введение каждые два дня в течение всего курса лечения, введение каждые три дня в течение всего курса лечения, введение один раз в четыре дня в течение всего курса лечения, введение один раз в пять дней в течение всего курса лечения, введение один раз в шесть дней в течение всего курса лечения, введение один раз в неделю в течение всего курса лечения, введение через неделю в течение всего курса лечения, введение один раз в месяц в течение всего курса лечения и т.п. В одном варианте курс лечения охватывает введение один раз каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель. В одном варианте курс лечения составляет от примерно одной до примерно 52 недель или дольше (например, может составлять неопределенное по длительности время лечения). В одном варианте курс лечения составляет от примерно одного до примерно 48 месяцев или дольше (например, может составлять неопределенное по длительности время лечения).

В одном варианте курс лечения включает первоначальный курс лечения, такой как введение один раз каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более недель в течение фиксированного интервала времени (например, 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более) с проведением впоследствии поддерживающего курса лечения, такого как введение один раз каждые 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 или более недель в течение дополнительного фиксированного интервала времени (например, 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз или более).

В рамках любого из способов лечения согласно настоящему изобретению киНК может быть введена субъекту в рамках системного режима согласно настоящему описанию или с использованием любого другого, известного в данной области, способа, либо одного в рамках монотерапии, либо в сочетании с дополнительными видами терапии, согласно настоящему описанию или в соответствии с другими известными в данной области процедурами. Системное введение может включать, например, внутрилегочное введение (в виде ингаляции, с использованием небулайзера и т.п.), внутривенное, подкожное, внутримышечное введение, введение с помощью катетера, назофарангеальное введение, трансдермальное введение или пероральное введение/введение через желудочно-кишечный тракт, которые хорошо известны в данной области.

В одном варианте в рамках любого из способов лечения или профилактики согласно настоящему изобретению киНК может вводиться субъекту локально или в локальные ткани, согласно настоящему описанию или как это известно в данной области, либо по отдельности в рамках монотерапии, либо в сочетании с дополнительными видами терапии, известными в данной области. Локальное введение может включать, например, ингаляцию, введение с помощью небулайзера, катетеризацию, прямую инъекцию, кожное/чрескожное введение, стентирование, закапывание ушных/глазных капель или введение в портальную вену, с достижением соответствующих тканей, или любые другие методики, способы или процедуры локального введения, известные в данной области.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу введения молекул и композиций киНК согласно настоящему изобретению во внутреннее ухо, включающему контактирование киНК с клетками, тканями или структурами внутреннего уха, в условиях, подходящих для введения. В одном варианте указанное введение включает способы и устройства, описанные в патентах США № 5421818, 5476446, 5474529, 6045528, 6440102, 6685697, 6120484 и 5572594, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки, а также методики, описанные в следующих работах: Silverstein, 1999, Ear Nose Throat J., 78, 598-8, 600; и Jackson and Silverstein, 2002, Otolaryngol Clin North Am., 35, 639-53, и адаптированные для использования молекул киНК согласно настоящему изобретению.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени у субъекта или в организме, включающему контактирование субъекта или организма с одной или несколькими молекулами киНК согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для модуляции (например, ингибирования) экспрессии гена-мишени у субъекта или в организме.

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут быть сконструированы таким образом, чтобы они осуществляли отрицательную регуляцию или ингибирование экспрессии гена-мишени посредством воздействия на РНКи множества молекул нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения направленного воздействия на различные ДНК, соответствующие гену-мишени, например, посредством достижения гетерохроматического молчания или ингибирования на уровне транскрипции. В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для достижения направленного воздействия на различные РНК, соответствующие гену-мишени, например, посредством расщепления целевой РНК или ингибирования на уровне трансляции. Не ограничивающие примеры таких РНК включают матричную РНК (мРНК), некодирующую РНК (нкРНК) или регуляторные элементы (см., например, Mattick, 2005, Science, 309, 1527-1528; и Claverie, 2005, Science, 309, 1529-1530), которые включают миРНК и другие малые РНК, чередующиеся сплайсинг-варианты РНК генов-мишеней, модифицированные на посттранскрипционной стадии РНК генов-мишеней, пре-мРНК генов-мишеней и/или матричные РНК. Если процесс альтернативного сплайсинга создает семейство транскриптов, которые различаются по использованию соответствующих экзонов, то настоящее изобретение может использоваться для ингибирования генной экспрессии за счет воздействия на соответствующие экзоны для достижения специфического ингибирования или для дискриминирующего различения функций членов генного семейства. Так, например, белок, который содержит трансмембранный домен, полученный в результате альтернативного сплайсинга, может экспрессироваться как в мембран-связанной форме, так и в секретируемой форме. Использование настоящего изобретения для достижения направленного воздействия на экзон, содержащего трансмембранный домен, может позволить выявить функциональные последствия направленного фармацевтического воздействия на мембран-связанную форму в сравнении с воздействием на секретируемую форму белка. Не ограничивающие примеры вариантов применения настоящего изобретения, относящихся к направленному воздействию на указанные молекулы РНК, включают терапевтическое применение фармацевтических композиций, косметический вариант применения, применение в ветеринарии, создание фармацевтических композиций, молекулярную диагностику и применение для исследований генной функции, а также для картирования, например, с использованием картирования на основе полиморфизма по одному нуклеотиду с использованием молекул киНК согласно настоящему изобретению. Такие варианты применения могут быть осуществлены с использованием известных генных последовательностей или на основе частичных последовательностей, известных на основании информации о последовательности экспрессированного фрагмента (EST).

В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению используют для направленного воздействия на консервативные последовательности, соответствующие одному или нескольким генным семействам, таким как генные семейства, характеризующиеся гомологичными последовательностями. Соответственно, молекулы киНК, направленно воздействующие на множество генов-мишеней или целевых РНК, могут обеспечивать повышенный терапевтический эффект. В одном варианте настоящее изобретение относится к направленному воздействию (расщеплению молекулы или ингибированию экспрессии или функции) на последовательности более чем одного гена-мишени, с использованием одной молекулы киНК, за счет целевого воздействия на консервативные последовательности соответствующего гена-мишени.

В одном варианте молекулы киНК могут использоваться для изучения путей функционирования гена в рамках различных вариантов применения. Так, например, настоящее изобретение может использоваться для ингибирования активности одного или нескольких генов-мишеней на определенном метаболическом пути, с целью определения функции неохарактеризованного одного или нескольких генов путем анализа функции гена, анализа функции мРНК или анализа процесса трансляции. Настоящее изобретение может использоваться для определения потенциальных путей функционирования генов-мишеней, вовлекаемых в различные заболевания или состояния, с целью выработки стратегий разработки фармацевтических композиций. Настоящее изобретение может также использоваться для понимания путей генной экспрессии, вовлекаемых, например, в развитие заболеваний, расстройств, признаков или состояний согласно настоящему описанию или иначе известных в данной области.

В одном варианте одна или несколько молекул киНК и/или способы согласно настоящему изобретению используют для достижения отрицательной регуляции экспрессии одного или нескольких генов, которые кодируют РНК, депонированные в Genbank с соответствующими номерами доступа, например гены-мишени, кодирующие одну или несколько последовательностей РНК, депонированные в Genbank с соответствующими номерами доступа, например номерами доступа в Genbank (№), указанными в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и РСТ/US03/05028, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) создание библиотеки конструкций киНК, обладающих заданным уровнем сложности; и (b) тестирование конструкций киНК согласно (а), в условиях, подходящих для определения целевых сайтов РНКи в последовательности целевой РНК. В одном варианте молекулы киНК согласно (а) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В другом варианте молекулы киНК согласно (а) имеют различную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте соответствующий тест может включать восстановленную in vitro систему тестирования киНК согласно настоящему описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой экспрессируется целевая РНК. В другом варианте анализируют фрагменты целевой РНК для выявления уровня расщепления, например, путем гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) создание рандомизированной библиотеки конструкций киНК, обладающих заданной степенью сложности, такой как 4^N, где N обозначает число спаренных по основаниям нуклеотидов в каждой из цепей конструкции киНК (например, для конструкции киНК, содержащей 21 нуклеотид в смысловой и антисмысловой цепях с 19 парами оснований, сложность будет составлять 4¹⁹); и (b) тестирование конструкции киНК согласно (а) в условиях, подходящих для определения целевых сайтов РНКи в последовательности целевой РНК. В другом варианте молекулы киНК согласно (а) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В еще одном варианте молекулы киНК согласно (а) имеют различную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте данный тест может включать тест в рамках восстановленной in vitro системы для анализа киНК, согласно приведенному в примере 6 описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой целевая РНК экспрессируется. В другом варианте проводят анализ фрагментов целевой РНК для выявления уровня расщепления, например, с помощью гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в составе последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу, включающему: (а) анализ последовательности целевой РНК, кодируемой геном-мишенью; (b) синтез одного или множества наборов молекул киНК, обладающих комплементарностью по последовательности к одному или нескольким участкам РНК согласно (а); и (с) тестирование молекул киНК согласно (b) в условиях, подходящих для определения мишеней РНКи в последовательности целевой РНК. В одном варианте указанные молекулы киНК согласно (b) содержат цепи фиксированной длины, например, включающие в длину примерно 23 нуклеотида. В другом варианте молекулы киНК согласно (b) имеют разную длину, например содержат цепи, включающие от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте соответствующий тест может включать восстановленную in vitro систему анализа киНК согласно настоящему описанию. В другом варианте указанный тест может включать систему культивирования клеток, в которой экспрессируется целевая РНК. Фрагменты целевой РНК анализируют для выявления уровня расщепления, например, с помощью гель-электрофореза, нозерн-блоттинга или тестов на защиту от РНКазы, для определения наиболее подходящих одного или нескольких сайтов-мишеней в составе последовательности целевой РНК. Последовательность целевой РНК может быть получена по известным в данной области методам, например путем клонирования и/или транскрипции в системах in vitro и в ходе клеточной экспрессии в системах in vivo.

Термин «сайт-мишень»/»целевой сайт» означает последовательность внутри целевой РНК, на которую происходит/в отношении которой осуществляется «нацеливание»/«направленное воздействие» для достижения расщепления, опосредованного участием конструкции киНК, которая содержит в своем антисмысловом участке последовательности, комплементарные целевой последовательности.

Фраза «выявляемый уровень расщепления» относится к расщеплению целевой РНК (и образованию расщепленных продуктов РНК) до уровня, достаточного для обнаружения продуктов расщепления, который превышает фоновый уровень продуктов РНК, образуемых при случайной деградации целевой РНК. Образование продуктов расщепления на уровне 1-5% от целевой РНК является достаточным количеством, позволяющим выявить в рамках большинства методов детекции превышение получаемых показателей над фоном.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композиции, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными и которые оказывают направленное воздействие на один или несколько генов, в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания, признака или состояния у субъекта, включающему введение указанному субъекту композиции согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для диагностики указанных заболеваний, признака или состояния у субъекта. В другом варианте настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения заболевания, признака или состояния, таких как метаболические и/или сердечно-сосудистые заболевания, признаки, состояния или расстройства у субъекта, включающему введение указанному субъекту композиции согласно настоящему изобретению, в условиях, подходящих для лечения или предупреждения заболевания, признака или состояния у субъекта, в качестве отдельного агента или в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими соединениями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу подтверждения достижения направленного воздействия на ген-мишень, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; (b) введение молекулы киНК в клетку, ткань, субъекту или в организм в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, ткани у субъекта или в организме; и (с) определение функции гена путем тестирования наличия каких-либо фенотипических изменений в клетке, ткани, у субъекта или в организме.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу подтверждения направленного воздействия, включающему: (а) синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, где одна из цепей киНК включает последовательность, комплементарную РНК гена-мишени; (b) введение молекулы киНК в биологическую систему в условиях, подходящих для модуляции экспрессии гена-мишени в биологической системе; и (с) определение функции гена путем тестирования наличия каких-либо фенотипических изменений в биологической системе.

Термин «биологическая система» в контексте настоящего описания используется для обозначения материала, в очищенной или в неочищенной форме, взятого из биологических источников, которые могут включать, без ограничения, организм человека или животного, где указанная система содержит в своем составе компоненты, необходимые для проявления активности РНКи. Термин «биологическая система» включает, например, клетку, ткань, субъекта или организм, или соответствующий экстрагированный из них элемент. Термин «биологическая система» также включает установленные системы РНКи, которые могут использоваться в системах тестирования in vitro.

Термин «фенотипическое изменение» используется для обозначения любого выявляемого изменения в клетке, которое происходит в ответ на контакт с молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (или обработку такой молекулой) (например, киНК). Такие выявляемые изменения включают, без ограничения, изменения по форме, размеру, уровню пролиферации, подвижности, экспрессии белка или экспрессии РНК или по другим физическим или химическим изменениям, которые могут быть оценены с использованием известных методик. Выявляемые изменения могут также включать экспрессию репортерных генов/молекул, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или различные метки-фрагменты, которые используются для идентификации экспрессированного белка или любого другого клеточного компонента, уровень которого можно определить.

В одном варианте настоящее изобретение относится к набору, содержащему молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной и которая может использоваться для модуляции экспрессии гена-мишени в биологической системе, включающей, например, клетку, ткань, субъект или организм. В другом варианте настоящее изобретение относится к набору, содержащему более чем одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными и которые могут использоваться для модуляции экспрессии более чем одного гена-мишени, в биологической системе, включающей, например, клетку, ткань, субъект или организм.

В одном варианте настоящее изобретение относится к клетке, содержащей одну или несколько молекул киНК согласно настоящему изобретению, которые могут быть химически модифицированными. В другом варианте указанная клетка, содержащая молекулу киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой клетку млекопитающего. В еще одном варианте указанная клетка, содержащая молекулу киНК согласно настоящему изобретению, представляет собой человеческую клетку.

В одном варианте синтез молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которая может быть химически модифицированной, включает: (а) синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК; (b) совместный отжиг двух комплементарных цепей в условиях, подходящих для получения молекулы двухцепочечной киНК. В другом варианте синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК проводят в рамках твердофазного синтеза олигонуклеотидов. В еще одном варианте синтез двух комплементарных цепей молекулы киНК проводят в рамках процедуры тандемного синтеза олигонуклеотидов в твердой фазе.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу синтеза молекулы дуплексной киНК, включающему: (а) синтез олигонуклеотидной последовательности первой цепи молекулы киНК, где олигонуклеотидная последовательность первой цепи включает расщепляемую линкерную молекулу, которая может использоваться в качестве скелетной затравки для синтеза олигонуклеотидной последовательности второй цепи киНК; (b) синтез олигонуклеотидной последовательности второй цепи молекулы киНК на скелетной затравке олигонуклеотидной последовательности первой цепи, где олигонуклеотидная последовательность второй цепи также включает химический фрагмент, который может использоваться для очистки дуплекса киНК; (с) расщепление линкерной молекулы согласно (а) в условиях, подходящих для гибридизации двух олигонуклеотидных цепей киНК с образованием стабильного дуплекса; и (d) очистку дуплекса киНК с использованием химического фрагмента олигонуклеотидной последовательности второй цепи. В одном варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) проводят в условиях снятия защиты от олигонуклеотида, например в условиях гидролиза с использованием алкиламинового основания, такого как метиламин. В одном варианте указанный способ синтеза включает твердофазный синтез на твердой подложке, такой как стекло с контролируемым размером пор (CPG) или полистирол, где первую последовательность согласно (а) синтезируют на расщепляемом линкере, таком как сукцинильный линкер, с использованием твердой подложки в качестве скелетной затравки. Расщепляемый линкер согласно (а), используемый в качестве скелетной затравки для синтеза второй цепи, может иметь близкую реакционную способность к дериватизированному линкеру на твердой подложке, так что расщепление дериватизированного линкера на твердой подложке и расщепляемого линкера согласно (а) происходит одновременно. В другом варианте химический фрагмент (b), который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности, включает тритильную группу, например диметокситритильную группу, которая может использоваться в стратегии тритильного синтеза, согласно настоящему описанию. В еще одном варианте в ходе очистки удаляют химический фрагмент, такой как диметокситритильная группа, например, с использованием для этого кислых условий.

В еще одном варианте способ синтеза киНК представляет собой синтез в фазе раствора или синтез в гибридной фазе, где обе цепи дуплекса киНК синтезируют в тандемном варианте с использованием расщепляемого линкера, присоединенного к первой последовательности, который действует как скелетная затравка для синтеза второй последовательности. Расщепление линкера в условиях, подходящих для гибридизации отдельных цепей последовательности киНК, приводит к образованию молекулы двухцепочечной киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу синтеза молекулы дуплексной киНК, включающему: (а) синтез олигонуклеотидной последовательности одной цепи молекулы киНК, где указанная последовательность включает расщепляемую линкерную молекулу, которая может использоваться в качестве скелетной затравки для синтеза другой олигонуклеотидной последовательности; (b) синтез второй олигонуклеотидной последовательности, обладающей комплементарностью к последовательности первой цепи, на основе скелетной затравки согласно (а), где вторая последовательность включает другую цепь молекулы двухцепочечной киНК и где вторая последовательность также включает химический фрагмент, который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности; (с) очистку продукта согласно (b) с использованием химического фрагмента олигонуклеотидной последовательности второй цепи в условиях, подходящих для выделения полноразмерной последовательности, включающей обе олигонуклеотидные цепи киНК, соединенные расщепляемым линкером, в условиях, подходящих для гибридизации двух олигонуклеотидных цепей киНК с образованием стабильного дуплекса. В одном варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) происходит в ходе снятия защиты с олигонуклеотида, например в условиях гидролиза. В другом варианте расщепление линкерной молекулы согласно (с) происходит после снятия защиты с олигонуклеотида. В другом варианте способ синтеза включает твердофазный синтез на твердой подложке, такой как стекло с контролируемым размером пор (CPG) или полистирол, где первую последовательность (а) синтезируют на расщепляемом линкере, таком как сукцинильный линкер, с использованием твердой подложки в качестве скелетной затравки. Расщепляемый линкер согласно (а), используемый в качестве скелетной затравки при синтезе второй цепи, может включать аналогичную реакционную способность или отличающуюся реакционную способность относительно дериватизированного линкера на твердой подложке, так что расщепление дериватизированного линкера на твердой подложке и расщепляемого линкера согласно (а) происходит либо одновременно, либо последовательно. В одном варианте химический фрагмент согласно (b), который может использоваться для выделения присоединенной олигонуклеотидной последовательности, включает тритильную группу, например диметокситритильную группу.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания молекулы двухцепочечной киНК в рамках одностадийной процедуры синтеза, включающему: (а) синтез олигонуклеотида, содержащего первую и вторую последовательности, где первая последовательность комплементарна второй последовательности, и где первую олигонуклеотидную последовательность соединяют со второй олигонуклеотидной последовательностью через расщепляемый линкер, и где концевая 5'-защитная группа, например 5'-О-диметокситритильная группа (5'-О-DMT), остается на олигонуклеотиде, имеющем вторую последовательность; (b) снятие защиты с олигонуклеотида, за счет чего происходит расщепление линкера, соединяющего две олигонуклеотидных последовательности; и (с) очистку продукта согласно (b) в условиях, подходящих для выделения молекулы двухцепочечной киНК, например, с использованием стратегии тритильного синтеза согласно настоящему описанию.

В другом варианте способ синтеза молекул киНК согласно настоящему изобретению включает стратегию, описанную в патентах США (Scaringe et al., патенты США №№ 5889136; 6008400; и 6111086), включенных в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые вовлекаются в процесс РНКи против целевого полинуклеотида (например, целевой РНК или целевой ДНК), где указанная конструкция киНК включает одну или несколько химических модификаций, например одну или несколько химических модификаций, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, которые повышают нуклеазную резистентность конструкции киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые характеризуются повышенной нуклеазной резистентностью, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной резистентностью к нуклеазе.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с улучшенными токсикологическими профилями (например, обладающих ослабленными иммуномодулирующими свойствами или их отсутствием), включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК; и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями (например, обладающих ослабленными иммуномодулирующими свойствами или их отсутствием), включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике; и (b) тестирование композиции с киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, обладающих улучшенными токсикологическими профилями.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют ответ интерферона (например, имеет место отсутствие ответа интерферона или ослабленный ответ интерферона) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют ответа интерферона.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, которые не стимулируют ответ интерферона (например, имеет место отсутствие ответа интерферона или ослабленный ответ интерферона) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа интерферона. В одном варианте указанный интерферон включает интерферон-альфа.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют воспалительный или провоспалительный цитокиновый ответ (например, имеет место отсутствие ответа цитокина или ослабленный ответ цитокина) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют ответа цитокина. В одном варианте указанный цитокин включает интерлейкин, такой как интерлейкин-6 (IL-6) и/или фактор некроза опухолевой ткани-альфа (TNF-α).

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу создания композиций киНК, которые не стимулируют воспалительный или провоспалительный цитокиновый ответ (например, имеет место отсутствие ответа цитокина или ослабленный ответ цитокина) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, включающей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции с киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа цитокина. В одном варианте указанный цитокин включает интерлейкин, такой как интерлейкин-6 (IL-6) и/или фактор некроза опухолевой ткани-альфа (TNF-α).

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, которые не стимулируют ответ Toll-подобного рецептора (NLR) (например, имеет место отсутствие TLR ответа или ослабленный TLR ответ) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) встраивание нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII (например, мотивов киНК, проиллюстрированных в таблице I) или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые не стимулируют TLR ответа. В одном варианте TLR включает TLR3, TLR7, TLR8 и/или TLR9.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения композиций киНК, которые не стимулируют ответ Toll-подобного рецептора (NLR) (например, имеет место отсутствие TLR ответа или ослабленный TLR ответ) в клетке, у субъекта или в организме, включающему (а) получение композиции киНК, содержащей молекулу киНК согласно настоящему изобретению и вектор доставки или частицы, используемые для доставки, согласно настоящему описанию или согласно любой известной в данной области методике, и (b) тестирование композиции киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения композиций киНК, которые не стимулируют ответа TLR. В одном варианте TLR включает TLR3, TLR7, TLR8 и/или TLR9.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая направляет расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК (РНКи), где: (а) каждая цепь указанной молекулы киНК включает от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов в длину; (b) одна цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к указанной целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и (с) где нуклеотидные части в составе указанной молекулы киНК химически модифицированы для снижения иммуностимулирующих свойств молекулы киНК до уровня, который ниже, чем указанные свойства у соответствующей немодифицированной молекулы киНК. Считается, что такие молекулы киНК обладают улучшенным токсикологическим профилем, в сравнении с немодифицированной или минимально модифицированной киНК.

Фраза «улучшенный токсикологический профиль» в контексте настоящего описания означает, что химически модифицированная или изготовленная конструкция киНК демонстрирует сниженную токсичность в клетке, у субъекта или в организме, в сравнении с немодифицированной или неформулированной киНК или с молекулой киНК, имеющей меньший уровень модификации или такие модификации, которые менее эффективны с позиции улучшения токсикологических характеристик. Такие молекулы киНК также рассматриваются как обладающие «повышенной активностью РНКи». В не ограничивающем примере молекулы и композиции киНК с улучшенными токсикологическими профилями ассоциированы со сниженными иммуностимулирующими свойствами, такими как сниженный, уменьшенный или ослабленный иммуностимулирующий ответ в клетке, у субъекта или организме, в сравнении с немодифицированной или неформулированной киНК или с молекулой киНК, имеющей меньшие модификации или модификации, которые менее эффективны с позиции улучшения токсикологических параметров. Такой улучшенный токсикологический профиль характеризуется подавленной или сниженной иммуностимуляцией, такой как снижение или подавление индукции интерферонов (например, интерферона-альфа), воспалительных интерлейкинов (например, интерлейкинов, таких как IL-6 и/или TNF-альфа) и/или toll-подобных рецепторов (таких как TLR-3, TLR-7, TLR-8 и/или TLR-9. В одном варианте молекула или композиция на основе киНК с улучшенным токсикологическим профилем не включает рибонуклеотидов. В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает менее 5 рибонуклеотидов (например, 1, 2, 3 или 4 рибонуклеотида). В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает Stab 7, Stab 8, Stab 11, Stab 12, Stab 13, Stab 16, Stab 17, Stab 18, Stab 19, Stab 20, Stab 23, Stab 24, Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 28, Stab 29, Stab 30, Stab 31, Stab 32, Stab 33, Stab 34, Stab 35, Stab 36 или любое их сочетание (см. таблица I). В тексте настоящего описания все числовые показатели в химических структурах Stab включают и 2'-фтор- и 2'-OCF3 варианты химических структур, показанных в таблице I. Например, «Stab 7/8» относится и к Stab 7/8, и к Stab 7F/8F и т.п. В одном варианте молекула или композиция киНК с улучшенным токсикологическим профилем включает молекулу киНК согласно настоящему изобретению и композицию, описанную в заявке на патент США № 20030077829, включенную в настоящее описание полностью в качестве ссылки вместе с рисунками.

В одном варианте уровень иммуностимулирующего ответа, ассоциированного с данной молекулой киНК, может быть измерен в соответствии с приведенной в описании методикой или в соответствии с другим известным в данной области способом, например путем определения уровня PKR/интерферонового ответа, пролиферации, B-клеточной активации и/или продукции цитокинов в соответствующих тестах, используемых для количественной оценки иммуностимулирующего ответа конкретных молекул киНК (см., например, Leifer et al., 2003, J Immonother. 26, 313-9; и патент США № 5968909, включенный в настоящее описание полностью в качестве ссылки). В одном варианте сниженный иммуностимулирующий ответ определяется значениями в диапазоне от примерно 10% до примерно 100% в сравнении с молекулой немодифицированной или минимально модифицированной киНК, например, выражается снижением иммуностимулирующего ответа примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%. В одном варианте иммуностимулирующий ответ, ассоциированный с молекулой киНК, может модулироваться уровнем химической модификации. Так, например, молекула киНК, включающая модифицированные нуклеотиды на уровне от примерно 10% до примерно 100%, в частности примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% от всех нуклеотидных позиций в молекуле киНК, могут быть отобраны применительно к соответствующей степени иммуностимулирующих свойств согласно настоящему описанию.

В одном варианте степень снижения иммуностимулирующего ответа выбирают для оптимизации активности РНКи. Например, сохранение определенной степени иммуностимуляции может быть предпочтительно для лечения вирусной инфекции, где менее чем 100% снижение иммуностимуляции может быть предпочтительно для достижения максимальной антивирусной активности (в частности, снижение иммуностимуляции примерно на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%), тогда как ингибирование экспрессии эндогенного целевого гена может быть предпочтительно в случае молекул киНК, которые обладают минимальными стимулирующими свойствами, с целью предупреждения неспецифической токсичности или нецелевых эффектов (в частности, снижение иммуностимуляции от примерно 90% до примерно 100%).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле химически синтезированной двухцепочечной киНК, которая направляет расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК (РНКи), где: (а) каждая цепь указанной молекулы киНК составляет в длину от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов; (b) одна цепь указанной молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к указанной целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через интерференцию РНК; и (с) где один или несколько нуклеотидов в указанной молекуле киНК химически модифицированы для снижения иммуностимулирующих свойств молекулы киНК до уровня, который ниже, чем у соответствующей молекулы немодифицированной киНК. В одном варианте каждая цепь включает по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в другой цепи.

В другом варианте молекула киНК, в которую введены модифицированные нуклеотиды с целью снижений иммуностимулирующих свойств указанной молекул киНК, включает антисмысловой участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную к нуклеотидной последовательности целевого гена или его части, и также включает смысловой участок, где указанный смысловой участок имеет нуклеотидную последовательность, которая по существу аналогична нуклеотидной последовательности указанного целевого гена или его части. В другом варианте антисмысловой участок и смысловой участок включают от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов, где указанный антисмысловой участок включает по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, которые комплементарны нуклеотидам в смысловом участке. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пиримидиновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-О-метилпиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте пуриновые нуклеотиды в смысловом участке представляют собой 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом участке, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В другом варианте пиримидиновые нуклеотиды в указанном антисмысловом участке представляют собой 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые нуклеотиды. В еще одном варианте пуриновые нуклеотиды в указанном антисмысловом участке представляют собой 2'-О-метилпуриновые нуклеотиды. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения пуриновые нуклеотиды, присутствующие в указанном антисмысловом участке, включают 2'-дезоксипуриновые нуклеотиды. В другом варианте указанный антисмысловой участок включает фосфоротиоатную межнуклеотидную связь на 3'-конце указанного антисмыслового участка. В другом варианте антисмысловой участок включает глицерильную модификацию на 3'-конце указанного антисмыслового участка.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения молекула киНК, в которую включены модифицированные нуклеотиды с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, может включать любые структурные особенности молекул киНК согласно настоящему описанию. В других вариантах молекула киНК, в которую введены модифицированные нуклеотиды с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, может включать любые химические модификации молекул киНК согласно настоящему описанию.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекулы химически синтезированной двухцепочечной киНК, содержащей химически модифицированные нуклеотиды, которые вводятся с целью снижения иммуностимулирующих свойств указанной молекулы киНК, включающему: (а) введение одного или нескольких модифицированных нуклеотидов в молекулу киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекулы киНК, обладающей сниженными иммуностимулирующими свойствами, в сравнении с соответствующей молекулой киНК, содержащей немодифицированные нуклеотиды. Каждая цепь молекулы киНК включает в длину от примерно 18 до примерно 38 нуклеотидов. Одна цепь молекулы киНК включает нуклеотидную последовательность, обладающую достаточной степенью комплементарности к целевой РНК, с тем чтобы молекула киНК могла направлять расщепление целевой РНК через процесс интерференции РНК. В одном варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию воспалительных или провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-6 (IL-6) или фактор некроза опухолевой ткани (TNF-α), в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм. В другом варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию Toll-подобных рецепторов (TLR), таких как TLR3, TLR7, TLR8 или TLR9, в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм. В другом варианте сниженные иммуностимулирующие свойства включают подавленную или сниженную индукцию интерферонов, таких как интерферон-альфа, в ответ на введение киНК в клетку, ткань или организм.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между смысловой и антисмысловой цепями молекулы киНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между смысловой и антисмысловой цепями молекулы киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой РНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой РНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой ДНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, обладающих повышенной связывающей афинностью между антисмысловой цепью молекулы киНК и комплементарной последовательностью целевой ДНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК, способных опосредовать процесс повышения полимеразной активности клеточной полимеразы, способной генерировать дополнительные эндогенные молекулы киНК, обладающие гомологией по последовательности к молекуле химически модифицированной киНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, способных опосредовать процесс повышения полимеразной активности клеточной полимеразы, способной генерировать дополнительные эндогенные молекулы киНК, обладающие гомологией по последовательности к молекуле химически модифицированной киНК.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям химически модифицированной киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида в клетке, где указанные химические модификации не оказывают существенного влияния на взаимодействие киНК с целевой молекулой РНК, молекулой ДНК и/или белками или другими факторами, которые обязательны для процесса РНКи, в таком варианте, который мог бы снизить эффективность РНКи, опосредованную участием таких конструкций киНК.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной специфичностью РНКи против полинуклеотидных мишеней, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или любым их сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной специфичностью РНКи. В одном варианте повышенная специфичность включает сниженные нецелевые эффекты в сравнении с молекулой немодифицированной киНК. Например, введение концевых кэп-фрагментов на 3'-конце, 5'-конце или на обоих: 3'- и 5'-концах смысловой цепи или участке молекулы киНК согласно настоящему изобретению может придавать киНК повышенную специфичность за счет устранения возможности функционирования смысловой цепи и смыслового участка в качестве матрицы в процессе активной РНКи против соответствующей мишени, комплементарной к смысловой цепи или смысловому участку.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевого полинуклеотида, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой РНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой РНК.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой ДНК, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной активностью РНКи против целевой ДНК.

В еще одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК против целевого полинуклеотида с повышенной способностью к поглощению клетками, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной способностью к клеточному поглощению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкциям киНК, которые опосредуют процесс РНКи против целевого полинуклеотида, где указанная конструкция киНК включают одну или несколько химических модификаций согласно настоящему описанию, которые повышают биодоступность таких конструкций киНК, например, за счет присоединения полимерных конъюгатов, таких как полиэтиленгликоль, или эквивалентных конъюгатов, которые улучшают фармакокинетику конструкции киНК, или за счет присоединения конъюгатов, которые направляют конструкцию в специфические типы тканей или специфические типы клеток in vivo. Не ограничивающие примеры таких конъюгатов описаны в заявке на патент США, серийный номер 10/201394 (Vargееse et al.), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) введение конъюгата в структуру молекулы киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекулы киНК с повышенной биодоступностью. Такие конъюгаты могут включать лиганды для клеточных рецепторов, такие как пептиды, полученные из природных белковых лигандов; последовательности, определяющие локализацию белка, включая клеточные ZIP-кодовые последовательности; антитела; аптамеры нуклеиновых кислот; витамины и другие кофакторы, такие как фолят и N-ацетилгалактозамин; полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ); фосфолипиды; холестерин; производные холестерина; полиамины, такие как спермин или спермидин, и другие.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, комплементарную к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность химически модифицирована таким образом, что она больше не может действовать в качестве ведущей последовательности для эффективного участия в интерференции РНК и/или распознаваться клеточными белками, которые способствуют РНКи. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК химически модифицирована согласно настоящему описанию. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК не модифицирована (например, представляет собой суммарную РНК).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность разработана или модифицирована таким образом, что препятствует ее поступлению в путь РНКи в качестве ведущей последовательности или в качестве последовательности, которая комплементарна к последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, РНК). В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК химически модифицирована согласно настоящему описанию. В одном варианте первая нуклеотидная последовательность киНК не модифицирована (например, полностью представляет РНК). Такая архитектура или такие модификации, как ожидается, будут повышать активность киНК и/или улучшать специфичность молекул киНК согласно настоящему изобретению. Ожидается также, что указанные модификации будут минимизировать любые нецелевые эффекты и/или ассоциированную с ними токсичность.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность включает концевой кэп-фрагмент на 5'-конце указанной второй последовательности. В одном варианте концевой кэп-фрагмент включает безосновный инвертированный фрагмент, инвертированный дезокси безосновный фрагмент, инвертированный нуклеотидный фрагмент, группу, показанную на фиг. 10, алкильную или циклоалкильную группы, гетероцикл или любую другую группу, которая препятствует активности РНКи, где вторая последовательность служит в качестве ведущей последовательности или матрицы для РНКи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), которая включает первую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности целевой РНК или ее части, и вторую последовательность, обладающую комплементарностью к указанной первой последовательности, где указанная вторая последовательность включает концевой кэп-фрагмент на 5'-конце и 3'-конце указанной второй последовательности. В одном варианте каждый концевой кэп-фрагмент включает безосновный инвертированный фрагмент, инвертированный дезокси безосновный фрагмент, инвертированный нуклеотидный фрагмент, группу, показанную на фиг. 10, алкильную или циклоалкильную группы, гетероцикл или любую другую группу, которая препятствует проявлению активности РНКи, где вторая последовательность служит в качестве ведущей последовательности или матрицы для РНКи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной специфичностью для осуществления отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии целевой нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК, такой как ген или ее соответствующая РНК), включающему (а) введение одной или нескольких химических модификаций в структуру молекулы киНК и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с улучшенной специфичностью. В другом варианте химическая модификация, используемая для повышения специфичности, включает концевые кэп-модификации на 5'-конце, 3'-конце или на обоих: 5'- и 3'-концах, молекулы киНК. Концевые кэп-модификации могут включать, например, структуру, показанную на фиг. 10 (например, инвертированные дезокси безосновные фрагменты), или любую другую модификацию, которая придает части молекулы киНК (например, смысловой цепи) неспособность участвовать в интерференции РНК против последовательности нецелевой нуклеиновой икслоты. В не ограничивающем примере молекула киНК сконструирована таким образом, что только антисмысловая последовательность молекулы киНК может служить в качестве ведущей последовательности в RISC-опосредованной деградации соответствующей последовательности целевой РНК. Это сопровождается тем, что смысловая последовательность киНК делается неактивной из-за введения в нее химических модификаций, которые препятствуют распознаванию смысловой цепи в качестве ведущей последовательности механизмом РНКи. В одном варианте такие химические модификации включают любую химическую группу на 5'-конце смысловой цепи киНК или любую другую группу, которая может придать смысловой цепи неактивность в качестве ведущей последовательности в процессе интерференции РНК. Такие модификации, например, могут приводить к образованию молекулы, в которой 5'-конец смысловой цепи уже не содержит свободной 5'-гидроксильной (5'-OH) или свободной 5'-фосфатной группы (например, фосфат, дифосфат, трифосфат, циклический фосфат и т.п.). Не ограничивающие примеры таких конструкций киНК, приведенных в настоящем описании, включают, например, «Stab 9/10», «Stab 7/8», «Stab 7/19», «Stab 17/22», «Stab 23/24», «Stab 24/25» и «Stab 24/26» (например, любую киНК, включающую Stab 7, 9, 17, 23 или 24 в смысловых цепях) и их варианты (см. таблица I), где 5'-конец и 3'-конец смысловой цепи киНК не включают гидроксильную группу или фосфатную группу. Согласно настоящему описанию, символьные знаки в обозначении химических структур Stab включают и 2'-фтор-, и 2'-ОCF3 варианты химических структур, приведенных в таблице I. Например, термин «Stab 7/8» относится и к Stab 7/8, и к Stab 7F/8F.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу скринигга молекул киНК, которые активны в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, включающему (а) получение множества немодифицированных молекул киНК, (b) скрининг молекул киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК, которые демонстрируют активность в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, и (с) введение химических модификаций (например, химических модификаций согласно настоящему описанию или иных известных в данной области) в молекулы активных киНК согласно пункту (b). В одном варианте указанный способ также включает повторный скрининг молекул химически модифицированных киНК согласно стадии (с) в условиях, подходящих для выделения молекул химически модифицированных киНК, которые активно опосредуют интерференцию РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга химически модифицированных молекул киНК, которые активно опосредуют интерференцию РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты, включающему (а) получение множества молекул химически модифицированных молекул киНК (например молекул киНК согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области), и (b) скрининг молекул киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул химически модифицированных киНК, которые активны в опосредовании интерференции РНК против последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

Термин «лиганд» относится к любому соединению или молекуле, таким как лекарственное средство, пептид, гормон или нейротрансмиттер, которые способны взаимодействовать с другим соединением, таким как рецептор, либо непосредственно, либо опосредованно. Рецептор, который взаимодействует с лигандом, может присутствовать на поверхности клетки или, альтернативно, может представлять собой внутриклеточный рецептор. Взаимодействие лиганда с рецептором может приводить к биохимической реакции, или это может быть просто физическое взаимодействие или ассоциация.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) объединение композиции экципиента с молекулой киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной биодоступностью. Такие эксципиенты включают полимеры, такие как циклодекстрины, липиды, катионные липиды, полиамины, фосфолипиды, наночастицы, рецепторы, лиганды и другие.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения молекул киНК согласно настоящему изобретению с повышенной биодоступностью, включающему (а) введение нуклеотидов, описываемых любой из формул I-VII или их любым сочетанием, в молекулу киНК, и (b) тестирование молекулы киНК согласно стадии (а) в условиях, подходящих для выделения молекул киНК с повышенной биодоступностью.

В другом варианте полиэтиленгликоль (ПЭГ) может быть ковалентно присоединен к соединениям киНК согласно настоящему изобретению. Присоединенные ПЭГ могут иметь любой молекулярный вес, предпочтительно от примерно 100 до примерно 50000 дальтон (Да).

Настоящее изобретение может использоваться либо само по себе, либо как компонент набора, включающего по меньшей мере один из реагентов, необходимых для осуществления процесса введения РНК in vitro или in vivo с целью тестирования образцов и/или субъектов. Например, предпочтительные компоненты указанного набора включают молекулу киНК согласно настоящему изобретению и носитель, который способствует введению киНК в интересующие клетки согласно настоящему описанию (например, с использованием липидов и других способов трансфекции, известных в данной области, см., например, Beigelman et al., US 6395713). Указанный набор также может использоваться для целевой валидации, например для определения генной функции и/или активности гена, или в процессе оптимизации лекарственного препарата, а также при разработке лекарственных препаратов (см., например, Usman et al., USSN 60/402996). Такой набор может также включать инструкцию для пользователей, позволяющую применять на практике набор согласно настоящему изобретению.

Термин «короткая интерферирующая нуклеиновая кислота», «киНК», «короткая интерферирующая РНК», «киРНК», «молекула короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты», «молекула короткого интерферирующего олигонуклеотида» или «молекула химически модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания относится к любой молекуле нуклеиновой кислоты, способной осуществлять ингибирование или отрицательную регуляцию генной экспрессии или вирусной репликации опосредованием интерференции РНК «РНКи» или в процессе молчания гена в специфичном для последовательности режиме. Указанные термины могут относиться как к отдельным молекулам нуклеиновой кислоты, так и к множеству таких молекул нуклеиновой кислоты или к объединению таких молекул нуклеиновой кислоты. Соответственно, киНК может представлять собой молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающую самокоплементарный смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. При этом киНК может быть собрана из двух отдельных олигонуклеотидов, где одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая цепь представляет собой антисмысловую цепь, где антисмысловая и смысловая цепи являются самокомплементарными (то есть каждая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности другой цепи); так что в том случае, когда антисмысловая цепь и смысловая цепь формируют дуплекс или двухцепочечную структуру, например, где участок двухцепочечной молекулы содержит от примерно 15 до примерно 30, в частности примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 пар оснований, антисмысловая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловая цепь включает нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части (в частности, от примерно 15 до примерно 25 или более нуклеотидов молекулы киНК комплементарны целевой нуклеиновой кислоте или ее части). Альтернативно, киНК может быть собрана из одного нуклеотида в том случае, когда самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки молекулы киНК соединяются с помощью одного или нескольких линкеров на основе нуклеиновой кислоты или на основе одного или нескольких линкеров, отличных от нуклеиновой кислоты. Указанная киНК может представлять собой полинуклеотид, имеющий дуплексную структуру, структуру асимметричного дуплекса, шпилечную структуру или асимметричную шпилечную вторичную структуру, содержащий самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле отдельной нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. Указанная киНК может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, содержащий две или более петлевых структур и стебель, включающий самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки, где указанный антисмысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловой участок содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и где указанный кольцевой полинуклеотид может быть подвергнут процессингу in vivo или in vitro с получением активной молекулы киНК, способной участвовать в процессе РНКи. Указанная киНК может также включать одноцепочечный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части (например, когда в случае такой молекулы киНК не требуется наличия в данной молекуле киНК нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части), где указанный одноцепочечный полинуклеотид может также включать концевую фосфатную группу, такую как 5'-фосфат (см., например, Martinez et al., 2002, Cell, 110, 563-574 и Schwatz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568) или 5'-, 3'-дифосфат. В некоторых вариантах молекула киНК согласно настоящему изобретению включает отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или участки, где указанные смысловые и антисмысловые участки ковалентно соединяются с помощью нуклеотидных или ненуклеотидных линкерных молекул, известных в данной области, или, в альтернативном варианте, могут быть нековалентно соединены силами ионного взаимодействия, водородными связями, силами Ван-дер-вальса, по типу гидрофобных взаимодействий и/или путем слипания. В некоторых вариантах молекулы киНК согласно настоящему изобретению включают нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности целевого гена. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению взаимодействует с нуклеотидной последовательностью целевого гена таким образом, что вызывает ингибирование экспрессии целевого гена. В этой связи молекулы киНК необязательно ограничиваются теми молекулами, которые содержат только РНК, но также охватывают химически модифицированные нуклеотиды и фрагменты ненуклеотидной природы. В некоторых вариантах молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению не содержат нуклеотидов, включающих 2'-гидрокси (2'-OH) группу. Заявитель описывает в рамках некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты, в случае которых не требуется наличия нуклеотидов, содержащих 2'-гидроксигруппу, для их участия в процессе РНКи, и в этой связи молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в необязательном варианте, не включают какие-либо рибонуклеотиды (например, нуклеотиды, содержащие 2'-OH группу). Такие молекулы киНК, в случае которых не требуется наличия рибонуклеотидов в молекуле киНК для их участия в РНКи, могут, тем не менее, содержать присоединенные один или несколько линкеров или другие присоединенные или ассоциированные группы, фрагменты или цепи, содержащие один или несколько нуклеотидов с 2'-OH группами. Необязательно, молекулы киНК могут включать рибонуклеотиды примерно в 5, 10, 20, 30, 40 или 50% от всех нуклеотидных позиций. Молекулы модифицированной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут также описываться как короткие модифицированные интерферирующие олигонуклеотиды «siMON». Соответственно, в контексте настоящего описания применение термина киНК эквивалентно другим терминам, используемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны вовлекаться в специфичный по последовательности процесс РНКи, таким как, например, термины короткая интерферирующая РНК (киРНК), двухцепочечная РНК (дцРНК), микроРНК (миРНК), короткая шпилечная РНК (кшРНК), короткий интерферирующий олигонуклеотид, короткая интерферирующая нуклеиновая кислота, короткий интерферирующий модифицированный олигонуклеотид, химически модифицированная киРНК, молчащая РНК на стадии пост-транскрипции гена (ptgsРНК) и другие. Не ограничивающие примеры молекул киНК согласно настоящему изобретению проиллюстрированы на фиг. 4-6 и в таблице II. Такие молекулы отличаются от других молекул нуклеиновой кислоты, полученных по методикам, известным в данной области, которые вовлекаются в ингибирование экспрессии гена, такие как рибозимы, антисмысловые молекулы, триплекс-формирующие молекулы, аптамеры, 2,5-А-химерные молекулы или «ложные» олигонуклеотиды.

Термины «интерференция РНК» или «РНКи» обозначают биологический процесс ингибирования или отрицательной регуляции генной экспрессии в клетке, в соответствии с общими представлениями, имеющимися в данной области, и который опосредован участием в нем молекул короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (см., например, Zamore and Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; и Vaughn and Martienssen, 2005, Science, 309, 1525-1526; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2001, Nature, 411, 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; и Kreutzer et al., Международная РСТ публикация № WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., Международная РСТ публикация № WO 01/36646; Fire, Международная РСТ публикация № WO 99/32619; Plaetnick et al., Международная РСТ публикация № WO 00/01846; Mello and Fire, Международная РСТ публикация № WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, Международная РСТ публикация № WO 99/07409; и Li et al., Международная РСТ публикация № WO 00/44914; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237; Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60; McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850; Reinhart et al., 2002, Gene & Dev, 16, 1616-1626; и Reinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831). Кроме того, в контексте настоящего описания термин РНКи используется эквивалентно с терминами, обычно применяемыми для описания специфичной по последовательности интерференции РНК, такой как пост-транскрипционное молчание гена, ингибирование на уровне трансляции, ингибирование на уровне транскрипции или эпигенез. Так, например, молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться для достижения эпигенетического молчания генов как на посттранскрипционном уровне, так и на претранскрипционном уровне. В рамках не ограничивающего примера эпигенетическая модуляция генной экспрессии молекулами киНК согласно настоящему изобретению может возникать в результате киНК-опосредованной модификации структуры хроматина или характера метилирования, ведущей к изменению генной экспрессии (см., например, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837, Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). В рамках другого не ограничивающего примера модуляция генной экспрессии под действием молекул киНК согласно настоящему изобретению может стать результатом киНК-опосредованного расщепления РНК (кодирующей или некодирующей РНК) через образование комплекса RISC или, альтернативно, в ходе ингибирования на уровне трансляции, известного в данной области. В другом варианте модуляция генной экспрессии под действием молекул киНК согласно настоящему изобретению может стать результатом ингибирования на уровне транскрипции (см., например, Janowski et al., 2005, 1, 216-222).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой олигонуклеотид, формирующий дуплекс «DFO» (см., например, фиг. 14-15 и Vaish et al, USSN 10/727780, зарегистрированный 3 декабря 2003 года, и международную PCT заявку на патент № US04/16390, зарегистрированную 24 мая 2004 года).

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению представляет собой полифункциональную киНК (см., например, фиг. 16-28 и Jadhav et al, USSN 60/543480, зарегистрированный 10 февраля 2004 года, и международную PCT заявку на патент № US04/16390, зарегистрированную 24 мая 2004 года). В одном варианте полифункциональная киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, направленно воздействующую, например, на два или более участка целевой РНК (см., например, целевые последовательности, приведенные в таблицах II и III). В одном варианте полифункциональная киНК согласно настоящему изобретению может включать последовательность, направленно воздействующую на одну или несколько мишеней, включая кодирующие участки и некодирующие участки SREBP1.

Термин «асимметричная шпилечная структура» в контексте настоящего описания обозначает молекулу линейной киНК, включающую антисмысловой участок, петлевой участок, который может включать нуклеотиды или фрагменты ненуклеотидной природы, и смысловой участок, который включает меньшее количество нуклеотидов, чем антисмысловой участок, до такого предела, чтобы смысловой участок имел достаточное количество комплементарных нуклеотидов для спаривания по основаниям с антисмысловым участком и мог образовывать дуплекс с петлевой структурой. Например, молекула асимметричной шпилечной киНК согласно настоящему изобретению может включать антисмысловой участок с длиной, достаточной для опосредования РНКи в клетке или системе in vitro (в частности, от примерно 15 до примерно 30 или примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов), и петлевой участок, включающий от примерно 4 до примерно 12 (в частности, примерно 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, и смысловой участок, содержащий от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов, которые комплементарны антисмысловому участку. Молекула асимметричной шпилечной киНК может включать также 5'-концевую фосфатную группу, которая может быть химически модифицирована. Петлевая часть молекулы асимметричной шпилечной киНК может включать нуклеотиды, фрагменты ненуклеотидной природы, линкерные молекулы или конъюгированные молекулы согласно настоящему изобретению.

Термин «асимметричный дуплекс» в контексте настоящего описания обозначает молекулу киНК, включающую две отдельные цепи, которые содержат смысловой участок и антисмысловой участок, где указанный смысловой участок включает меньшее число нуклеотидов, чем антисмысловой участок, до такого предела, чтобы смысловой участок имел достаточное количество комплементарных нуклеотидов для спаривания по основаниям с антисмысловым участком и мог сформировать дуплекс. Например, молекула асимметричной дуплексной киНК согласно настоящему изобретению может включать антисмысловой участок с длиной, достаточной для участия в РНКи в клетке или системе in vitro (в частности, от примерно 15 до примерно 30 или примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов), и смысловой участок, содержащий от примерно 3 до примерно 25 (в частности, примерно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) нуклеотидов, которые комплементарны антисмысловому участку.

Термин «ингибитор РНКи» в контексте настоящего описания обозначает любую молекулу, которая может осуществлять отрицательную регуляцию, снижать или ингибировать функцию или активность интерференции РНК в клетке или в организме. Ингибитор РНКи может осуществлять отрицательную регуляцию, снижать или ингибировать РНКи (например, РНКи-опосредованное расщепление целевого полинуклеотида, осуществлять ингибирование трансляции или приводить к транскрипционному молчанию) путем взаимодействия с функцией любого компонента на пути РНКи или создания препятствий такой функции, включая белковые компоненты, такие как RISC, или компоненты нуклеиновой кислоты, такие как миРНК или киРНК. Ингибитор РНКи может представлять молекулу киНК, антисмысловую молекулу, аптамер или малую молекулу, которая взаимодействует с функцией или препятствует функции RISC, миРНК или киРНК или любого другого компонента на пути РНКи в клетке или в организме. За счет достижения ингибирования РНКи (например, РНКи-опосредованного расщепления целевого полинуклеотида, ингибирования трансляции или транскрипционного молчания), ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может использоваться для модуляции (например, для позитивной регуляции или отрицательной регуляции) экспрессии целевого гена. В одном варианте ингибитор РНК согласно настоящему изобретению используется для позитивной регуляции генной экспрессии путем создания препятствий, интерферирования (например, за счет снижения или предотвращения) эндогенной отрицательной регуляции или ингибирования генной экспрессии по пути ингибирования трансляции, транскрипционного молчания или RISC-опосредованного расщепления полинуклеотидов (например, мРНК). Соответственно, в рамках пути, создающего препятствия механизму эндогенной репрессии, молчания или ингибирования генной экспрессии, ингибиторы РНКи согласно настоящему изобретению могут применяться для позитивной регуляции генной экспрессии при лечении заболеваний, признаков или состояний, определяемых отсутствием функции. В одном варианте термин «ингибитор РНКи» используется вместо термина «киНК» в различных вариантах настоящего изобретения, например применительно к описанию эффекта повышения генной экспрессии для целей лечения заболеваний, признаков и/или состояний, связанных с отсутствием функции.

Термин «аптамер» или «аптамер нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания обозначает полинуклеотид, который специфически связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула нуклеиновой кислоты имеет последовательность, которая отличается от последовательности, распознаваемой целевой молекулой в ее природном окружении. Альтернативно, аптамер может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая связывается с молекулой-мишенью, где указанная молекула-мишень в естественном состоянии не связывается с нуклеиновой кислотой. Указанная молекула-мишень может представлять собой любую интересующую молекулу. Например, аптамер может использоваться для связывания с лиганд-связывающим доменом белка, что устраняет возможность взаимодействия природного лиганда с белком. Это один из не ограничивающих примеров его использования, тогда как специалисты в данной области хорошо понимают, что имеются другие варианты, которые могут легко быть получены с использованием известных методик (см., например, Gold et al., 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 763; Brode and Gold, 2000, J. Biotechnol., 74, 5; Sun, 2000, Сurr. Opin. Mol. Ther., 2, 100; Kusser, 2000, J. Biotеchnol., 74, 27; Hermann and Patel, 2000, Science, 287, 820; и Jayasena, 1999, Clinicаl Chemistry, 45, 1628). Молекулы аптамера согласно настоящему изобретению могут быть химически модифицированы в соответствии с процедурами, известными в данной области или приведенными в настоящем описании.

Термин «антисмысловая нуклеиновая кислота» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая связывается с целевой РНК посредством взаимодействия по типу РНК-РНК или РНК-ДНК, или РНК-ПНК (протеиновая нуклеиновая кислота; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) и в этой связи изменяет активность целевой РНК (см. обзор Штейна и Ченга (Stein and Cheng, 1993 Science 261, 1004) и патент США № 5849902 (Wolf et al.)) за счет пространственного взаимодействия или посредством РНКаза Н-опосредованного распознавания мишени. В типичном случае антисмысловые молекулы комплементарны к целевой последовательности на протяжении одной непрерывной последовательности антисмысловой молекулы. Однако в некоторых вариантах антисмысловая молекула может связываться с субстратом, так что субстратная молекула формирует петлю, и/или антисмысловая молекула может связываться так, что антисмысловая молекула формирует петлю. Таким образом, антисмысловая молекула может быть комплементарна двум (или даже больше) не непрерывным субстратным последовательностям, или две (или даже больше) не непрерывных части последовательности антисмысловой молекулы могут быть комплементарны целевой последовательности, или имеют место оба варианта. Обзор имеющихся в настоящее время стратегий работы с антисмысловыми молекулами приведен в литературе (см. Schmajuk et al., 1999, J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas et al., 1997, Nature, 15, 751-753, Stein et al., 1997, Antisense N. A. Drug Dev., 7, 151, Crooke, 2000, Methods Enzymol., 313, 3-45; Crooke, 1998, Biotech. Genet. Eng. Rev., 15, 121-157, Сrooke, 1997, Ad. Pharmacol., 40, 1-49). Кроме того, антисмысловая ДНК или антисмысловая ДНК, модифицированная 2'-MOE или с использованием других модификаций, известных в данной области, могут применяться для направленного воздействия на РНК посредством взаимодействия по типу РНК-ДНК, с достижением активации РНКазы Н, которая расщепляет целевую РНК в дуплексе. Антисмысловые олигонуклеотды могут включать один или более участков, активирующих РНКазу Н, которые способны активировать расщепление целевой РНК РНКазой Н. Антисмысловая ДНК может быть синтезирована химически или может быть экспрессирована при использовании вектора экспрессии на основе одноцепочечной ДНК или его эквивалента. Антисмысловые молекулы согласно настоящему изобретению могут быть химически модифицированы в соответствии с известными в данной области процедурами или в соответствии с настоящим описанием.

Термин «модулировать» означает, что экспрессия гена или уровень молекулы РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц, или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, подвергается позитивной или отрицательной регуляции, так что экспрессия, ее уровень или ее активность становятся выше или ниже, чем это наблюдается в отсутствие модулятора. Так, например, термин «модулировать» может означать «ингибировать», но использование слова «модулировать» не ограничено данным определением.

Термины «ингибировать», «осуществлять отрицательную регуляцию» или «снижать» в контексте настоящего описания означают, что экспрессия гена или уровень молекул РНК или эквивалентных молекул РНК, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, снижается до уровня, меньше того, который наблюдается в отсутствие молекул нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение уровня молекул киНК происходит ниже уровня, наблюдаемого в присутствии неактивной или ослабленной молекулы. В другом варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение уровня молекул киНК происходит ниже уровня, наблюдаемого в присутствии, например, молекулы киНК со скрученной последовательностью или с ошибочными спариваниями. В другом варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии молекулой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению выше в присутствии молекулы нуклеиновой кислоты, чем в ее отсутствие. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии ассоциированы с посттранскрипционным молчанием, таким как РНКи-опосредованное расщепление молекулы целевой нуклеиновой кислоты (например, РНК) или ингибирование трансляции. В одном варианте ингибирование, отрицательная регуляция или снижение генной экспрессии ассоциированы с посттранскрипционным молчанием, таким как в случае изменений, связанных с характером метилирования ДНК и структурой хроматина ДНК.

Термин «позитивная регуляция» или «усиление» в контексте настоящего описания означает, что экспрессия гена или уровень молекул РНК или эквивалентных РНК молекул, кодирующих один или несколько белков или белковых субъединиц или определяющих активность одного или нескольких белков или белковых субъединиц, возрастает выше уровня, наблюдаемого в отсутствие молекул нуклеиновой кислоты (например, киНК) согласно настоящему изобретению. В одном варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии под действием молекулы киНК превышает уровень, наблюдаемый в присутствии неактивной или ослабленной молекулы. В другом варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии молекулами киНК превышает тот уровень, который отмечается в присутствии, например, молекулы киНК со скрученной последовательностью или с ошибочными спариваниями. В другом варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии под действием молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению выше в присутствии молекулы нуклеиновой кислоты, чем в ее отсутствие. В одном варианте позитивная регуляция или усиление генной экспрессии ассоциированы с генным молчанием по механизму ингибирования РНК, такому как РНКи-опосредованное расщепление или молчание кодирующей или некодирующей целевой РНК, которая осуществляет отрицательную регуляцию, ингибирует или вызывает молчание на уровне экспрессии интересующего гена, подлежащего позитивной регуляции. Отрицательная регуляция генной экспрессии может быть, например, индуцирована кодирующей РНК или кодируемым ею белком, например, по механизму отрицательной обратной связи или по механизму антагонистических эффектов. Отрицательная регуляция генной экспрессии может быть, например, индуцирована некодирующей РНК, характеризующейся регуляторным контролем над интересующим геном, например, за счет достижения молчания экспрессии гена через ингибирование трансляции, изменение структуры хроматина, характера метилирования, RISC-опосредованное расщепление РНК или ингибирование трансляции. Соответственно, ингибирование или отрицательная регуляция мишеней, которые осуществляют отрицательную регуляцию, супрессию или вызывают молчание интересующего гена, может использоваться для позитивной регуляции или усиления экспрессии интересующего гена применительно к варианту терапевтического использования.

В одном варианте ингибитор РНК согласно настоящему изобретению используется для позитивной регуляции генной экспрессии посредством ингибирования механизма РНКи или генного молчания. Например, ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения заболеваний и состояний, определяемых отсутствием функции, за счет позитивной регуляции генной экспрессии, такой как в случае гаплоидной недостаточности, где одна аллель данного гена несет мутацию (например, рамочный сдвиг, миссенс- или нонсенс-мутацию), что приводит к потере функции белка, кодируемого мутантной аллелью. В таких случаях ингибитор РНКи может использоваться для позитивной регуляции экспрессии белка, кодируемого аллелью дикого типа или функциональной аллелью, что приводит к коррекции гаплоидной недостаточности за счет компенсации мутантной или null-аллели. В другом варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению используется для отрицательной регуляции экспрессии токсического действия функциональной аллели, где одновременно используется ингибитор РНКи согласно настоящему изобретению для целей позитивной регуляции экспрессии аллели дикого типа или функциональной аллели, как это происходит при лечении заболеваний, признаков или состояний согласно настоящему описанию или в рамках других вариантов применения, известных в данной области (см., например, Rhodes et al., 2004, PNAS USA, 101:11147-11152; и Meisler et al., 2005, The Journal of Clinical Investigation, 115: 2010-2017).

Термины «ген», или «целевой ген», или «целевая ДНК» в контексте настоящего описания используются для обозначения нуклеиновой кислоты, которая кодирует РНК, например, для обозначения последовательностей нуклеиновой кислоты, включающих, без ограничения, структурные гены, кодирующие полипептид. Ген или целевой ген может также кодировать функциональную РНК (фРНК) или некодирующую РНК (нкРНК), такую как малая временная РНК (мвРНК), микроРНК (миРНК), малая ядерная РНК (мяРНК), короткая интерферирующая РНК (киРНК), малая ядрышковая РНК (мяРНК), рибосомальная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК) и ее РНК-предшественники. Такие некодирующие РНК могут служить в качестве молекул целевой нуклеиновой кислоты для киНК-опосредованной интерференции РНК при модуляции активности фРНК или мяРНК, вовлекаемых в функциональные или регуляторные клеточные процессы. В этой связи абберантная активность фРНК или мяРНК, ведущая к заболеванию, может модулироваться молекулами киНК согласно настоящему изобретению. Молекулы киНК, направленно воздействующие на фРНК и мяРНК, могут также использоваться для целей манипуляции или для изменения генотипа или фенотипа субъекта, организма или клетки, путем встраивания в клеточные процессы, такие как геномный импринтинг, транскрипция, трансляция или процессинг нуклеиновых кислот (например, трансаминирование, метилирование и т.п.). Целевой ген может представлять собой ген, полученный из клетки, это может быть эндогенный ген, трансген или экзогенные гены, такие как гены патогена, такого как вирус, который имеется в клетке после инфекции. Клетка, содержащая целевой ген, может быть получена из любого организма или может содержаться в любом организме, например из растения/в растении, из животного/в животном, из простейшего/в простейшем, из вируса/в вирусе, из бактерии/в бактерии или из гриба/в грибе. Не ограничивающие примеры растений включают однодольные, двудольные или голосеменные растения. Не ограничивающие примеры животных включают позвоночных или безпозвоночных животных. Не ограничивающие примеры грибов включают плесени или дрожжи. Соответствующий обзор приведен в работе Снайдера и Герштейна (Snyder and Gerstein, 2003, Science, 300, 258-260).

Термин «неканоническая пара оснований» в контексте настоящего описания обозначает любую пару оснований, не соответствующих правилу Уотсона-Крика, такие как ошибочные спаривания и/или пары оснований, соответствующие гипотезе «качелей», включая флип-спаривания, ошибочные спаривания одной водородной связью, ошибочные спаривания транс-типа, взаимодействия трех оснований и взаимодействия четырех оснований. Не ограничивающие примеры таких неканонических пар оснований включают, без ограничения, АС реверсию Hoogsteen, АС спаривание по типу «качелей», AU реверсию Hoogsteen, GU пары, соответствующие гипотезе «качелей», АА N7 амино, СС-2-карбонил-амино(Н1)-N3-амино(Н2), GA сдвиг, UC 4-карбониламино, UU иминокарбонил, AC реверсная пара, соответствующая гипотезе «качелей», AU Hoogsteen, AU реверсное спаривание, соответствующее правилу Уотсона-Крика, CG реверсию, соответствующую правилу Уотсона-Крика, GC N3-амино-амино N3, AA N1-аминосимметрическое спаривание, AA N7-аминосимметрическое спаривание, GA N7-N1-аминокарбонил, GA+ карбониламино N7-N1, GG N1-карбонилсимметрическое спаривание, GG N3-аминосимметрическое спаривание, CC карбониламиносимметрическое спаривание, CC N3 аминосимметрическое спаривание, UU 2-карбонилиминосимметрическое спаривание, UU 4-карбонилиминосимметрическое спаривание, AA амино-N3, AA N1-амино, AC-амино-2-карбонил, AC N3-амино, AC N7-амино, AU амино-4-карбонил, AU N1-имино, AU N3-имино, AU N7-имино, СС карбониламино, GA амино-N1, GA амино-N7, GA-карбониламино, GA N3-амино, GC амино-N3, GC карбониламино, GC N3-амино, GC N7-амино, GG амино-N7, GG карбонилимино, GG N7-амино, GU амино-2-карбонил, GU-карбонилимино, GU имино-2-карбонил, GU N7-имино, psiU имино-2-карбонил, UC 4-карбониламино, UC иминокарбонил, UU имино-4-карбонил, AC C2-H-N3, GA карбонил-C2-Н, UU имино-4-карбонил-2-карбонил-С5-Н, АС амино(А) N3(С)-карбонил, GC иминоаминокарбонил, Gpsi имино-2-карбониламино-2-карбонил и GU иминоамино-2-карбонильные пары оснований.

Термин «целевой»/«мишень» в контексте настоящего описания обозначает любой целевой белок, пептид или полипептид, такие как белок, пептид или полипептид, кодируемые последовательностями, депонированными в Genbank c номерами доступа, приведенными в настоящем описании и/или в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923 536 и/или в PCT/US03/05028, которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Термин «целевой»/«мишень» также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты или к целевым полинуклеотидным последовательностям, кодирующим любой целевой белок, пептид или полипептид, такие как белки, пептиды или полипептиды, кодируемые последовательностями с номерами доступа в Genbank, приведенными в настоящем описании и/или предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или USSN PCT/US03/05028. Интересующая мишень может включать целевые нуклеотидные последовательности, такие как целевая ДНК или целевая РНК. Термин «целевой»/«мишень» также используется для обозначения других последовательностей, таких как различающиеся изоформы, мутантные целевые гены, сплайсинг-варианты целевых полинуклеотидов, целевые полиморфизмы и некодирующие (например, нкРНК, миРНК, мвРНК) или другие регуляторные полинуклеотидные последовательности согласно настоящему описанию. В этой связи в различных вариантах осуществления настоящего изобретения молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно изобретению (например, киНК), обладающая комплементарностью к целевой РНК, может использоваться для ингибирования или отрицательной регуляции активности миРНК или другой нкРНК. В одном варианте ингибирование активности миРНК или нкРНК может использоваться для отрицательной регуляции или ингибирования генной экспрессии (например, генов-мишеней согласно настоящему описанию или других генов-мишеней, известных в данной области), которые зависят от активности миНК или нкРНК. В другом варианте ингибирование активности миРНК или нкРНК молекулами двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, киРНК), обладающими комплементарностью к миРНК или нкРНК, может использоваться для позитивной регуляции или усиления экспрессии целевого гена (например, генов-мишеней согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области), где экспрессия таких генов подвергается отрицательной регуляции, супрессируется, или такие гены становятся молчащими под действием миРНК или нкРНК. Такая позитивная регуляция генной экспрессии может использоваться для лечения заболеваний и состояний, ассоциированных с потерей функций или гаплоидной недостаточностью, известных в данной области (например, в случае мышечных дистрофий, муковисцидоза или неврологических заболеваний и состояний, приведенных в настоящем описании, таких как эпилепсия, включая тяжелую миоклоническую эпилепсию новорожденных или синдром Дравета).

Термин «целевой метаболический путь» в контексте настоящего описания означает любую мишень, вовлекаемую в пути генной экспрессии или активности гена. Так, например, любая данная мишень может иметь родственные целевые пути, которые могут включать путь против хода считывания информации, по ходу считывания информации или гены-модификаторы, локализованные на указанном биологическом пути. Указанные целевые гены биологического пути могут обеспечивать аддитивные или синергические эффекты при лечении заболеваний, состояний или признаков согласно настоящему изобретению.

В одном варианте мишенью является любая целевая РНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая ДНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая мРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая миРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая киРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является любая целевая мвРНК или ее часть.

В одном варианте мишенью является цель или целевой путь или их часть.

В одном варианте мишенью является любая (например, одна или несколько) из целевых последовательностей согласно настоящему описанию и/или приведенная в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028 или их части. В одном варианте мишенью является любая (например, одна или несколько) из целевых последовательностей, проиллюстрированных в таблице II, или их часть. В другом варианте мишенью является киРНК, миРНК или мвРНК, соответствующая любой (например, одной или нескольким) целевой последовательности верхней цепи или нижней цепи, показанным в таблице II, или их части. В другом варианте мишенью является любая киРНК, миРНК или мвРНК, соответствующие любой (например, одной или нескольким) последовательности согласно настоящему описанию или приведенной в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028.

Термин «гомологичная последовательность» обозначает нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с одной или несколькими полинуклеотидными последовательностями, такими как гены, генные транскрипты и/или некодирующие полинуклеотиды. Например, гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с двумя или более генами, кодирующими родственные, но различающиеся белки, такие как различные представители одного генного семейства, различные белковые эпитопы, различные белковые изоформы или полностью дивергентные гены, такие как для цитокина и его соответствующих рецепторов. Гомологичная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, которая имеет общность с двумя или более некодирующими полинуклеотидами, такими как некодирующие ДНК или РНК, регуляторные последовательности, интроны и сайты контроля или регуляции транскрипции. Гомологичные последовательности могут также включать консервативные участки последовательности, общие для более чем одной полинуклеотидной последовательности. Указанная гомология необязательно должна быть полной гомологией (то есть 100%), поскольку частично гомологичные последовательности также входят в область настоящего изобретения (например, последовательности, гомологичные на 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80% и т.п.)

Термин «консервативный участок последовательности» обозначает нуклеотидную последовательность одного или нескольких участков в полинуклеотиде, которые не варьируют по составу в значительной мере между поколениями или от одной биологической системы, одного субъекта или организма к другой биологической системе, другому субъекту или организму. Полинуклеотид может включать как кодирующие, так и некодирующие ДНК и РНК.

Термин «смысловой участок» обозначает нуклеотидную последовательность молекулы киНК, обладающую комплементарностью к антисмысловому участку молекулы киНК. Кроме того, смысловой участок молекулы киНК может включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающей гомологией к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В одном варианте смысловой участок молекулы киНК обозначен как смысловая цепь или цепь-»пассажир».

Термин «антисмысловой участок» обозначает нуклеотидную последовательность молекулы киНК, обладающую комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Кроме того, антисмысловой участок молекулы киНК может необязательно включать последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую комплементарностью к смысловому участку молекулы киНК. В одном варианте антисмысловой участок молекулы киНК обозначен как антисмысловая цепь или ведущая цепь.

Термин «целевая нуклеиновая кислота» или «целевой полинуклеотид» обозначает любую последовательность нуклеиновой кислоты (например, любую мишень и/или любую целую последовательность метаболического пути), экспрессия или активность которой подвергается модуляции. Целевая нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК. В одном варианте целевая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению представляет собой целевую ДНК или целевую РНК.

Термин «комплементарность» означает, что нуклеиновая кислота может образовывать одну или несколько водородных связей с последовательностью другой нуклеиновой кислоты, либо в соответствии с правилом Уотсон-Крика, либо других нетрадиционных типов, приведенных в настоящем описании. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где каждая цепь включает в длину от примерно 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от примерно 10% до примерно 100% (в частности, например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между двумя цепями молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В другом варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая представляет собой антисмысловую цепь, где каждая цепь включает в длину от 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от по меньшей мере примерно 10% до примерно 100% (в частности, по меньшей мере примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между нуклеотидной последовательностью антисмысловой цепи молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и нуклеотидной последовательностью молекулы соответствующей целевой нуклеиновой кислоты, такой как целевая РНК, или целевая мРНК, или вирусная РНК. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, где одна цепь включает нуклеотидную последовательность, которая обозначена как смысловой участок, а другая цепь включает нуклеотидную последовательность, которая обозначена как антисмысловой участок, и где каждая цепь включает в длину от 15 до 30 нуклеотидов, характеризуется уровнем комплементарности на уровне от примерно 10% до примерно 100% (в частности, примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100%) между смысловым участком и антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты. Применительно к молекулам нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению энергия свободной связи между молекулой нуклеиновой кислоты и ее комплементарной последовательностью является достаточной для осуществления соответствующей функции нуклеиновой кислоты, например активности РНКи. Определение энергии свободной связи применительно к молекулам нуклеиновой кислоты известно в данной области (см., например, Turner et al., 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp. 123-133; Frier et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, J. Am. Chem. Soc. 109;3783-3785). Выраженный в процентах уровень комплементарности указывает на процентную долю непрерывающейся цепи остатков в молекуле нуклеиновой кислоты, которые образуют водородные связи (например, при спаривании оснований, в соответствии с правилом Уотсона-Крика) со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, когда 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов из общего числа 10 нуклеотидов в первом олигонуклеотиде спариваются по основаниям со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, включающей 10 нуклеотидов, что соответствует уровню комплементарности 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% соответственно). В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению обладает полной комплементарностью между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению полностью комплементарна молекуле соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Термин «полностью комплементарна/комплементарен» означает, что все непрерывные цепи остатков последовательности нуклеиновой кислоты образуют водородные связи с тем же числом непрерывных цепей остатков во второй последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает от примерно 15 до примерно 30 или более (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или более) нуклеотидов, которые комплементарны молекулам одной или нескольких целевых нуклеиновых кислот или их части. В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению характеризуется частичной комплементарностью (то есть имеет комплементарность ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или не спаренные по основаниям нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов) в структуре молекулы киНК, что может приводить к образованию вздутий, петлевых структур или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы киНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, характеризуется наличием полной комплементарности между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, полностью комплементарна к молекуле соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такая как молекула киНК, характеризуется частичной комплементарностью (то есть комплементарностью ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы нуклеиновой кислоты и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или наличие не спаренных по основаниями нуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов, таких как нуклеотидные вздутия) в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, структура которой приводит к появлению вздутий, петлевых структур или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению представляет собой микроРНК (миРНК). Термин «микроРНК» или «миРНК» обозначает малую двухцепочечную РНК, которая регулирует экспрессию целевых матричных РНК путем либо расщепления мРНК, либо репрессии на уровне трансляции/ингибирования, либо по механизму гетерохроматического молчания (см., например, Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28; и Sethupathy et al., 2006, RNA, 12:192-197). В одном варианте микроРНК согласно настоящему изобретению характеризуется частичной комплементарностью (то есть комплементарностью ниже 100%) между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы миРНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком молекулы миРНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты. Например, частичная комплементарность может включать различные ошибочные спаривания или наличие не спаренных по основаниями нуклеотидов (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более ошибочных спариваний или не спаренных по основаниям нуклеотидов, таких как нуклеотидные вздутия) в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты, структура которой приводит к появлению вздутий, петель или выступающих фрагментов между смысловой цепью или смысловым участком и антисмысловой цепью или антисмысловым участком миРНК или между антисмысловой цепью или антисмысловым участком миРНК и молекулой соответствующей целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению, которые осуществляют отрицательную регуляцию или снижают экспрессию целевого гена, используются для предупреждения или лечения заболеваний, расстройств, состояний или признаков у субъекта или в организме согласно настоящему описанию или других, известных в данной области.

Термины «пролиферативное заболевание» или «рак» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся нерегулируемым клеточным ростом или репликацией, в соответствии с известными в настоящее время данными, и включают лейкозы, например острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), СПИД-родственные виды рака, такие как саркома Капоши, рак молочной железы, рак кости, включающий такие формы, как остеосаркома, хондросаркома, саркома Эвинга, фибросаркомы, гигантоклеточные опухоли, адамантиномы и хордомы, опухоли головного мозга, такие как менингиомы, глиобластомы, астроцитомы низкой степени выраженности, олигодендроцитомы, опухоли гипофиза, шванномы и метастазирующий рак головного мозга, рак головы и шеи, включающий различные лимфомы, такие как лимфома клеток мантии, неходжкинская лимфома, аденома, плоскоклеточная карцинома, карцинома гортани, рак желчного пузыря и желчных протоков, рак сетчатки, такой как ретинобластома, рак пищевода, рак желудка, множественная миелома, рак яичника, рак матки, рак щитовидной железы, рак яичка, рак эндометрия, меланому, колоректальный рак, рак легкого, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак легкого (включая немелкоклеточный рак легкого), рак поджелудочной железы, саркомы, опухоль Уилмса, цервикальный рак, рак головы и шеи, рак кожи, назофарингеальную карциному, липосаркому, эпителиальную карциному, карциному клеток почки, аденокарциному желчного пузыря, околоушную аденокарциному, саркому эндометрия, формы рака, характеризующиеся множественной лекарственной резистентностью к применяемым для лечения препаратам; и пролиферативные заболевания и состояния, такие как неоваскуляризация, ассоциированная с опухолевым ангиогенезом, дегенерация желтого пятна (например, сырая/сухая АMD), неоваскуляризация роговицы, диабетическая ретинопатия, неоваскулярная глаукома, миопическия дегенерация и другие пролиферативные заболевания и состояния, такие как рестеноз и поликистоз почки, а также любой другой вид рака или пролиферативного заболевания, состояния, признака, генотипа или фенотипа, которые могут реагировать на модуляцию экспрессии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термины «воспалительное заболевание» или «воспалительное состояние» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся наличием воспалительного или аллергического процесса, в соответствии с известными в настоящее время данными, такие как воспаление, острое воспаление, хроническое воспаление, респираторное заболевание, атеросклероз, псориаз, дерматит, рестеноз, астма, аллергический ринит, атопический дерматит, септический шок, ревматоидный артрит, воспалительная болезнь кишечника, воспалительная болезнь тазовой области, боль, воспалительное заболевание глаза, глютеновая болезнь, синдром Лея, недостаточность глицеролкиназы, семейная эозинофилия (FE), аутосомальная рецессивная спастическая атаксия, воспалительное заболевание гортани, туберкулез, хронический холецистит, бронхэктазия, силикоз и другие пневмокониозы, а также любое другое воспалительное заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут реагировать на модуляцию экспрессии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термины «аутоиммунное заболевание» или «аутоиммунное состояние» в контексте настоящего описания обозначают любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, характеризующиеся аутоиммунитетом, в соответствии с известными в настоящее время данными, такие как рассеянный склероз, сахарный диабет, волчанка, глютеновая болезнь, болезнь Крона, язвенный колит, синдром Гийена-Барре, склеродерма, синдром Гудпасчера, гранулематоз Вегенера, аутоиммунная эпилепсия, энцефалит Расмуссена, первичный билиарный склероз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит, болезнь Аддисона, тиреоидит Хашимото, фибромиалгия, синдром Меньера, реакция отторжения трансплантата (например, предупреждение отторжения аллотрансплантата), злокачественная анемия, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дерматомиозит, синдром Шегрена, волчаночный эритематоз, рассеянный склероз, тяжелая псевдопаралитическая миастения, синдром Рейтера, болезнь Грейвса и любые другие аутоиммунные заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут реагировать на модуляцию экспресии связанного с заболеванием гена в клетке или ткани, применяемую отдельно или в сочетании с другими видами терапии.

Термин «инфекционное заболевание» в контексте настоящего описания обозначает любое заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, ассоциированные с инфекционным агентом, таким как вирус, бактерии, грипп, прион или паразит. Не ограничивающие примеры различных вирусных генов, которые могут быть мишенью для используемых молекул киНК согласно настоящему изобретению, включают вирус гепатита С (HCV, например, депонированный в GenBank с номерами доступа №№ D11168, D50483.1, L38318 и S82227), вирус гепатита B (HBN, например, депонированный в GenBank с номером доступа № AF100308.1), вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1, например, депонированный в Genbank с номером доступа № U51188), вирус иммунодефицита человека типа 2 (ВИЧ-2, например, депонированный в Genbank с номером доступа № Х60667), вирус лихорадки Западного Нила (WNV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001563), цитомегаловирус (CMV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001347), респираторно-синцитиальный вирус (RSV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001781), вирус гриппа (например, депонированный в GenBank с номером доступа № AF037412), риновирус (например, депонированный в GenBank с номерами доступа № D00239, Х02316, X01087, L24917, M16248, K02121, X01087), папилломавирус (например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001353), вирус простого герпеса (HSV, например, депонированный в GenBank с номером доступа № NC_001345) и другие вирусы, такие как HTLV (например, депонированный в GenBank с номером доступа № AJ430458). В связи с высокой вариабельностью по последовательности, свойственной геномам многих вирусов, отбираемые для широкого диапазона терапевтического применения молекулы киНК будут, скорее всего, включать консервативные участки вирусного генома. Не ограничивающие примеры консервативных участков вирусных геномов включают, без ограничения, 5'-некодирующие участки (NCR), 3'-некодирующие участки (NCR) и/или внутренние рибосомальные сайты, определяющие вход вирусных частиц (IRES). Молекулы киНК, разработанные для применения их против консервативных участков различных вирусных геномов, позволяют достичь эффективного ингибирования репликации вирусов у пациентов разных групп и могут обеспечивать эффективность молекул киНК против вирусных квазивидов, которые возникают из-за мутации в неконсервативных участках вирусного генома. Не ограничивающие примеры бактериальных инфекций включают актиномикоз, сибирскую язву, аспергиллез, бактеремию, бактериальные инфекции и микозы, инфекции Bartonella, ботулизм, бруцеллез, инфекции Burkholderia, инфекции Campilobacter, кандидиаз, болезнь кошачьих царапин, хламидийные инфекции, холеру, инфекции Clostridium, кокцидиомикоз, перекрестную инфекцию, криптококкоз, дерматомикозы, дифтерию, эрлихиоз, инфекции Escherechia coli, фасцит, некротизирующие инфекции, инфекции Fusobacterium, газовую гангрену, инфекции грамотрицательными бактериями, инфекции грамположительными бактериями, гистоплазмоз, импетиго, инфекции Klebsiella, легионеллез, лепру, лептоспироз, инфекции Listeria, болезнь Лайма, мадуромикоз, мелиоидоз, инфекции Mycobacterium, микоплазменные инфекции, микозы, инфекции Nocardia, онихомикоз, орнитоз, чуму, пневмококковые инфекции, инфекции Pseudomonas, ку-лихорадку, лихорадку укуса крысы, рецидивирующую лихорадку, ревматическую лихорадку, рикеттиозные инфекции, пятнистую лихорадку Скалистых гор, сальмонеллезные инфекции, скарлатину, цуцугамуши, сепсис, болезни, передающиеся половым путем - бактериальные инфекции, бактериальные кожные заболевания, стафилококковые инфекции, стрептококковые инфекции, столбняк, клещевые протозоозы, туберкулез, туляремию, брюшной тиф, сыпной тиф, эпидемическое заболевание, передающееся вшами, вибриоинфекции, тропическую фрамбезию, иерсиниозы, зоонозы и зигомикоз. Не ограничивающие примеры грибных инфекций включают аспергиллез, бластомикоз, кокцидиомикоз, криптококкоз, грибные инфекции ногтей рук и пальцев стопы, грибковый синусит, гистоплазмоз, мукоромикоз, грибковую инфекцию ногтей, паракокцидиомикоз, споротрихоз, лихорадка долины (кокцидиомикоз) и аллергию на плесневые грибы.

Термин «неврологическое заболевание» обозначает любое заболевание, расстройство или состояние, поражающее центральную или периферическую нервную систему, включающие СДВГ, неврологические осложнения СПИДа, отсутствие прозрачной перегородки, приобретенную эпилептиформную афазию, острый диссеминированный энцефаломиелит, адренолейкодистрофию, агенизию мозолистого тела, агнозию, синдром Аикарди, болезнь Александера, болезнь Альперса, альтернирующую гемиплегию, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, анэнцефалию, аневризму, синдром Ангельмана, ангиоматоз, аноксию, афазию, апраксию, арахноидальные кисты, арахноидит, синдром Арнольда-Киари, артериовенозную мальформацию, аспартам, синдром Аспергера, атаксию-телангиэктазию, атаксию, синдром дефицита внимания с гиперактивностью, аутизм, автономную дисфункцию, боль в спине, синдром Барта, болезнь Баттена, болезнь Бехчета, паралич Белла, доброкачественный эссенциальный блефароспазм, доброкачественную фокальную амиотрофию, доброкачественную интракрониальную гипертензию, синдром Бернхардта-Рота, болезнь Бинсвангера, блефароспазм, синдром Блоха-Сульцбергера, повреждения плечевого сплетения новорожденных, повреждения плечевого сплетения, синдром Брэдбери-Эглстона, аневризма головного мозга, повреждения головного мозга, опухоли головного и спинного мозга, синдром Брауна-Секварда, бульбоспинальную мышечную атрофию, болезнь Канавана, туннельный синдром запястья, каузалгия, каверномы, кавернозную ангиому, кавернозную мальформацию, синдром паралича шейного отдела, синдром центрального паралича, синдром центральной боли, краниальные расстройства, мозжечковую дегенерацию, мозжечковую гипоплазию, церебральную аневризму, аневризму головного мозга, артериосклероз головного мозга, атрофию головного мозга, алиментарный полиневрит, церебральный гигантизм, церебральную гипоксию, церебральный паралич, церебро-окуло-фациоскелетный синдром, болезнь Шарко-Мари-Тутта, порок Киари, хорею, хореоакантоцитоз, хроническую воспалительную демиелинезирущую полинейропатию (CIDP), хроническую ортостатическую неустойчивость, хроническую боль, синдром Кокейна тип II, синдром Коффина-Лоури, кому, включая персистентное вегетативное состояние, синдром комплексной региональной боли, врожденную лицевую диплегию, врожденную миастению, врожденную миопатию, врожденные кавернозные мальформации сосудов, кортикобазальную дегенерацию, краниальный артериит, краниосиностоз, болезнь Кройцфельдта-Якоба, кумулятивные травматические расстройства, синдром Кушинга, инклюзионную болезнь (CIBD), цитомегаловирусную инфекцию, синдром танцующих глаз-танцующих ног, болезнь Денди-Уокера, болезнь Даусона, синдром Д'Морсьера, паралич Дежерине-Клюмпке, мультиинфарктную деменцию, деменцию субкортикальную, деменция, сопровождающуюся наличием тел Леви, дерматомиозит, развивающееся поражение органов, синдром Девикса, диабетическую невропатию, рассеянный склероз, синдром Дравета, семейную вегетативную дисфункцию, дисграфию, дислексию, дисфагию, поражение органа, дистонию, эпилептическую энцефалопатию младенцев, синдром Эмпти Селла, эпидемический летаргический энцефалит, энцефалит и менингит, энцефалоцеле, энцефалопатию, энцефалотригеминальный ангиоматоз, эпилепсию, спастический спинальный паралич, паралич Эрба-Душенна и Дежерине-Клюмпке, болезнь Фабри, синдром Фара, обмороки, семейную вегетативную дистонию, семейную гемангиому, семейную идиопатическую кальцификацию базальных ганглиев, семейный спастический паралич, фибрильные судороги (например, GEFS и GEFS-плюс), синдром Фишера, клапанный синдром младенца, атаксию Фридрейха, болезнь Гоше, синдром Герстманна, болезнь Герстманна-Штраусслера-Шайнкера, гигантоклеточный артериит, гигантоклеточную инклюзионную болезнь, лейкодистрофию глобоидных клеток, глоссофарингеальную невралгию, синдром Гийена-Барра, HTLV-1-ассоциированную миелопатию, болезнь Халлервордена-Шпатца, повреждение головы, головную боль, длительную гемикранию, гемифациальный спазм, альтернирующую гемиплегию, наследственные невропатии, наследственную спастическую параплегию, наследственную атактическую полиневритиформную патологию, ушную инфекцию опоясывающим герпесом, опоясывающий герпес, синдром Хираяма, нарушение дифференцировки переднего мозга в полушариях и долях, болезнь Хантингтона, гидроэнцефалию, гидроцефалию при нормальном давлении, гидроцефалию, гидромиелию, гиперкортизолицизм, гиперсомнию, гипертонию, гипотонию, гипоксию, иммунный энцефаломиелит, миозит с инклюзионными телами, недостаточную пигментацию, гипотонию младенцев, болезнь депонирования фитановой кислоты у младенцев, болезнь Рефума младенцев, спазмы младенцев, воспалительную миопатию, липодистрофию кишечника, интракраниальные цисты, внутричерепную гипертензию, синдром Исаакса, синдром Жубера, синдром Киреса-Сэйра, болезнь Кеннеди, синдром Кинсбурна, синдром Кляйна-Левина, синдром Клиппеля-Фейля, синдром Клиппеля-Тренона (KTS), синдром Клювера-Буси, корсаковский синдром, болезнь Крабе, болезнь Кугельберга-Веландера, маленькое Куру, миастенический синдром Ламберта-Итона, синдром Ландау-Клеффнера, ущемление латерального кожного нерва бедра, латеральный мозговой синдром, неспособность к обучению, болезнь Лея, синдром Линно-Гасто, синдром Лэша-Найхана, лейкодистрофию, синдром Левина-Критчли, деменцию с телами Леви, Лиссэнцефалию, синдром замкнутого пространства, болезнь Лу-Герига, неврологические осложнения при волчанке, болезнь Лайма - неврологические осложнения, болезнь Мачадо-Джозефа, макрэнцефалию, мегалэнцефалию, синдром Мелкерссона-Розенталя, менингит, болезнь Менкеса, болезнь Рото-Бернгардта, метахромную лейкодистрофию, микроцефалию, мигрень, синдром Миллера-Фишера, мини-инсульты, митохондриальную миопатию, синдром Мебиуса, амиотрофию одной конечности, патологии двигательных нейронов, болезнь Мойямойя, муколипидозы, мукополисахаридозы, мультиинфарктную деменцию, мультифокальную двигательную невропатию, рассеянный склероз, множественную системную атрофию с ортостатической гипотензией, множественную системную атрофию, мышечную дистрофию, миастению врожденную, тяжелую псевдопаралитическую миастению, миелокластный рассеянный склероз, миоклоническую энцефалопатию младенцев, миоклонию, миопатию врожденную, миопатию токсическую, миопатию, миотонию врожденную, миотонию, нарколепсию, нейроакантоцитоз, нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге, нейрофиброматоз, нейролептический злокачественный синдром, неврологические осложнения СПИД, неврологические проявления болезни Помпе, нейромиелит зрительного нерва, нейромиотонию, нейрональный восковидный липофусциноз, расстройства нейрональной миграции, невропатию наследственную, нейросаркоидоз, нейротоксичность, кавернозный невус, болезнь Ниманна-Пика, синдром О'Салливана-МакЛауда, затылочную невралгию, последствия скрытой спинальной дизрафии, синдром Охтахара, оливопентоцеребеллярную атрофию, опсонию-миоклонию, ортостатическую гипотензию, синдром Оверуза, боль - хроническую, паранеопластический синдром, перестезию, болезнь Паркинсона, пармиотонию врожденную, пароксизмальный хореоатетоз, пароксизмальную гемикранию, болезнь Парри-Ромберга, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, синдром Пена Шокейра II, периневральные цисты, периодические параличи, периферическую невропатию, перивентрикулярную лейкомаляцию, персистирующее вегетативное состояние, первазивные расстройства развития, болезнь накопления фитановой кислоты, болезнь Пика, пириформный синдром, опухоли щитовидной железы, полимиозит, болезнь Помпе, перэнцефалию, постполимиелитный синдром, постгерпетическую невралгию, постинфекционный энцефаломиелит, постуральную гипотензию, постуральный ортостатический тахикардийный синдром, постуральный тахикардийный синдром, первичный боковой склероз, болезни приона, прогрессирующую гемифациальную атрофию, прогрессирующую двигательную атаксию, прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию, прогрессирующую склерозирующую полиодистрофию, прогрессирующий супрануклеарный паралич, ложную опухоль головного мозга, пиридоксин-зависимые и пиридоксин-отзывчивые судорожные расстройства, синдром Рамсея-Ханта типа I, синдром Рамсея-Ханта типа II, энцефалит Расмуссена и другие аутоиммунные эпилепсии, синдром рефлексной симпатетической дистрофии, болезнь Рефсума, болезнь Рефсума младенцев, повторяющееся двигательное расстройство, повторяющиеся стресс-повреждения, синдром усталых ног, миелопатию, ассоциированную с ретровирусами, синдром Ретта, синдром Рейя, синдром Рили-Дея, головную боль SUNCT, цисты поясничных нервных корешков, танец святого Вита, болезнь слюной железы, болезнь Сандхоффа, болезнь Шилдера, шизэнцефалию, судорожные расстройства, септооптическую дисплазию, тяжелую миоклоническую эпилепсию новорожденных (SMEI), синдром укачивания ребенка, опоясывающий лишай, синдром Шая-Дрегера, синдром Шегрена, приступы апное во сне, расстройство сна, синдром Сото, мышечную спастичность, расщелину позвоночника, инфаркт спинного мозга, повреждение спинного мозга, опухоли спинного мозга, спинальную мышечную атрофию, спиноцеребеллярную атрофию, синдром Стила-Рихардсона-Ольшевского, синдром Стиффа-Персона, дегенерацию полосатого тела, инсульт, синдром Стерджа-Уэбера, подострый склерозирующий панэнцефалит, субкортикальную артериосклеротическую энцефалопатию, расстройства глотания, хорею Сиденгама, обмороки, сифилитический спинальный склероз, сирингогидромиелию, сирингомиелию, системную красную волчанку, сухотку спинного мозга, тардивную дискинезию, цисты Тарлова, болезнь Тау-Сакса, височный артериит, синдром фиксации спинного мозга в области крестца, болезнь Томсена, синдром сдавления плечевого сплетения и подключичной артерии, тиреотоксическую миопатию, тригеминальную невралгию, паралич Тодда, синдром Туретта, преходящее нарушение мозгового кровообращения, трансмессивные спонгиформные энцефалопатии, поперечный миелит, травматическое повреждение головного мозга, тремор, трегиминальную невралгию, тропический спастический парапарез, туберозный склероз, эректильную сосудистую опухоль, васкулит, включая височный артериит, болезнь фон Экономо, болезнь Гиппеля-Линдау (VHL), болезнь фон Реклингхауссена, синдром Валленберга, болезнь Верднига-Хоффмана, синдром Верницке-Корсакова, синдром Веста, болезнь Уипла, синдром Уильямса, болезнь Уилсона, Х-сцепленную спинальную и бульбарную мышечную атрофию и синдром Целлвегера.

Термин «респираторное заболевание» обозначает любое заболевание или состояние, поражающее дыхательный тракт, такое как астма, хроническая обструктивная болезнь легких или «ХОБД», аллергический ринит, синусит, легочная вазоконстрикция, воспаление, аллергии, затрудненное дыхание, респираторный дистресс-синдром, муковисцидоз, легочная гипертензия, легочная вазоконстрикция, эмфизема и любое другое респираторное заболевание, состояние, признак, генотип или фенотип, которые могут отвечать на модуляцию экспрессии гена, связанного с заболеванием, в клетке или ткани, индивидуально или в сочетании с другими видами терапии.

Термин «заболевание органов зрения» в контексте настоящего описания обозначает любое заболевание, состояние, признак генотип или фенотип глаза и родственных структур, известных в данной области, таких как цистоидный отек желтого пятна, звездчатый хиалоз, патологическая миопия и стафилома задней склеры, токсокароз (мигрирующие глазные личинки), окклюзия вены сетчатки, отслоение заднего стекловидного тела, тракционные разрывы сетчатки, эпиретинальная мембрана, диабетическая ретинопатия, дегенерация решетчатой структуры, окклюзия вены сетчатки, окклюзия артерии сетчатки, макулярная дегенерация (например, возрастная дегенерация желтого пятна, такая как сырая AMD или сухая AMD), токсоплазмоз, хороидальная меланома, приобретенный ретиносхизис, бляшки Холенхорста, идиопатическая центральная серозная хореоретинопатия, макулярная перфорация, синдром окулярного гистоплазмоза, макроаневризма сетчатки, пигментированный ретинит, отслоение сетчатки, гипертензивная ретинопатия, отслоение пигментированного эпителия сетчатки (RPE), папиллофлебит, окулярный ишемический синдром, болезнь Коатса, милиарная аневризма Лебера, конъюнктивальная неоплазма, аллергический конъюнктивит, весенний катар, острый бактериальный конъюнктивит, аллергический конъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит, вирусный конъюнктивит, бактериальный конъюнктивит, хламидийный и гонококковый конъюнктивит, конъюнктивальное повреждение, эписклерит, склерит, утолщение конъюнктивы, птеригий, поверхностный лимбический кератоконъюнктивит (SLK Теодора), токсический конъюнктивит, конъюнктивит с псевдомембраной, крупнопапиллярный конъюнктивит, пограничная дегенерация Терьена, акантамебный кератит, грибковый кератит, нитчатый кератит, бактериальный кератит, сухой кератит/синдром сухого глаза, бактериальный кератит, кератит, вызванный простым герпесом, стерильные корнеальные инфильтраты, фликтенулез, корнеальная абразия и рекуррентная корнеальная эрозия, инородное тело в роговице, ожоги роговицы, эпителиальная дистрофия базальной мембраны (EBMD), поверхностная пятнистая кератопатия Тайгсона, раневое поражение роговицы, узелковая дегенерация Сальцманна, эндотелиальная дистрофия Фукса, неполный вывих кристаллических линз, глаукома Цилиари-Блока, первичная открытоугольная глаукома, синдром дисперсии пигмента и пигментированная глаукома, синдром псевдоэксфолиации и псевдоэксфолиативная глаукома, увеит передней камеры, первичная открытоугольная глаукома, увеальная глаукома и глаукомоциклитный кризис, синдром дисперсии пигмента и пигментарная глаукома, острая закрытоугольная глаукома, увеит передней камеры, гифема, глаукома угольной рецессии, глаукома, вызванная линзами, синдром псевдоэксфолиации и псевдоэксфолиативная глаукома, синдром Аксенфильда-Ригера, неоваскулярная глаукома, воспаление сетчатки и pars plana, хороидальный разрыв, синдром ретракции Дуана, токсическая/пищевая невропатия зрительного нерва, аберрантная регенерация краниального нерва III, массивное интракраниальное поражение, фистула сонного-пещеристого синуса, ишемическая невропатия задней части зрительного нерва, отек диска зрительного нерва и папилледема, паралич краниального нерва III, паралич краниального нерва IV, паралич краниального нерва VI, паралич краниального нерва VII (лицевого нерва), синдром Хорнера, межъядерная офтальмоплегия, гипоплазия зрительного нерва головы, врожденные ямки в диске зрительного нерва, зрачок Вестфалле-Пильтца, друзы в зрительном нерве головы, демиелинизирующая невропатия зрительного нерва (неврит зрительного нерва, ретробульбарный оптический неврит), слепота преходящая и преходящее нарушение мозгового кровообращения, ложная опухоль головы, аденома гипофиза, контагиозный моллюск, каналикулит, бородавки и папилломы, педикулез и фтириаз, блефарит, ячмень (на глазу), пресептальный целлюлит, халазион, плоскоклеточная карцинома, поражение Herpes Zoster Ophthalmicus, педикулез и фтириаз, перелом потоком воздуха, хроническая эпифора, дакриоцистит, блефарит, вызванный простым герпесом, орбитальный целлюлит, заворот века в пожилом возрасте и плоскоклеточная карцинома.

Термин «кожное заболевание» используется для обозначения любого заболевания или состояния кожи, дермы или любой входящей в их состав субструктуры, такой как волосы, фолликулы и т.п. Кожные заболевания, расстройства, состояния и признаки могут включать псориаз, эктопический дерматит, различные виды рака кожи, такие как меланома или плоскоклеточная карцинома, облысение, выпадение волос, изменения пигментации и любое другое заболевание, состояние или признак, ассоциированные с кожей, дермой или их структурами.

Термин «заболевание органов слуха» используется для обозначения любого заболевания или состояния системы органов слуха, включающей ухо, такое как внутренней ухо, среднее ухо, наружное ухо, слуховой нерв и любые другие содержащиеся в них субструктуры. Заболевания, расстройства, состояния и признаки, относящиеся к системе органов слуха, могут включать ослабление слуха, глухоту, звон в ушах, болезнь Меньера, вертиго, расстройство баланса и двигательные расстройства, а также любое другое заболевание, состояние или признак, ассоциированные с ухом или его структурами.

Термин «метаболическое заболевание» используется для обозначения любого заболевания или состояния, воздействующего на метаболические пути, согласно известным в настоящее время данным. Метаболическое заболевание может приводить к развитию аномального метаболического процесса, либо врожденного, связанного с наследственной ферментативной аномалией (врожденные ошибки метаболизма), либо приобретенного, связанного с заболеванием эндокринного органа или недостаточностью метаболически важного органа, такого как печень. В одном варианте метаболическое заболевание включает гиперлипидемию, гиперхолестеринемию, сердечно-сосудистое заболевание, атеросклероз, гипертензию, диабет (например, диабет типа I и/или II), инсулинрезистентность и/или ожирение.

Термин «сердечно-сосудистое заболевание» в контексте настоящего описания используется для обозначения заболевания или состояния, поражающих сердце и сосудистую систему, которые включают, без ограничения, ишемическую болезнь сердца (ИБС), органическое поражение сосудов головного мозга (CVD), стеноз аорты, заболевание периферических сосудов, атеросклероз, артериосклероз, инфаркт миокарда (сердечный приступ), цереброваскулярное заболевание (инсульт), преходящее нарушение кровообращения (TIA), стенокардию (стабильную и нестабильную), предсердную фибрилляцию, аритмию, патологию сердечных клапанов, застойную сердечную недостаточность, гиперхолестеринемию, гиперлипопротеинемию типа I, гиперлипопротеинемию типа II, гиперлипопротеинемию типа III, гиперлипопротеинемию типа IV, гиперлипопротеинемию типа V, вторичную гипертриглицеридемию и семейную недостаточность по лецитин-холестерин-ацилтрансферазе.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения каждая последовательность молекул киНК согласно настоящему изобретению включает независимо от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов в длину, в конкретных вариантах от примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в длину. В другом варианте дуплексы киНК согласно настоящему изобретению независимо включают от примерно 15 до примерно 30 пар оснований (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30). В одном варианте одна или несколько цепей молекулы киНК согласно настоящему изобретению независимо включает от примерно 15 до примерно 30 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30), которые комплементарны молекуле целевой нуклеиновой кислоты. В еще одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению содержат шпилечные или кольцевые структуры, содержащие от примерно 35 до примерно 55 (в частности, примерно 35, 40, 45, 50 или 55) нуклеотидов в длину или от примерно 38 до примерно 44 (в частности, примерно 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44) нуклеотидов в длину и включают от примерно 15 до примерно 25 (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25) пар оснований. Репрезентативные примеры молекул киНК согласно настоящему изобретению проиллюстрированы в таблице II и/или на фиг. 4-5.

В контексте настоящего описания термин «клетка» используется в общепринятом биологическом смысле и не относится к целому многоклеточному организму, например, конкретно не относится к человеку. Клетка может находиться в организме, то есть может находиться в организме птиц, растений и млекопитающих, таких как человек, корова, овца, пчелы, обезьяны, свинья, собаки и кошки. Данная клетка может быть прокариотической (например, бактериальной клеткой) или эукариотической (например, может быть клеткой млекопитающего или растительной клеткой). Указанная клетка может иметь соматическое происхождение или представлять собой клетку зародышевой линии, тотипотентной или плюрипотентной, делящейся или неделящейся. Указанная клетка может также быть получена из гаметы или из эмбриона, из стволовой клетки или полностью дифференцированной клетки, или она может их включать. Указанная клетка может представлять собой выделенную клетку, очищенную клетку или по существу очищенную клетку, в соответствии с представлениями, принятыми в данной области.

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению добавляют непосредственно или они могут быть подвергнуты комплексообразованию с катионными липидами, могут быть введены в состав липосом или могут быть любым иным образом доставлены к целевым клеткам или тканям. Нуклеиновая кислота или комплексы на основе нуклеиновой кислоты могут быть введены в локальном режиме в соответствующие ткани ex vivo или in vivo посредством локальной доставки в легкое, при их включении в биополимеры или в отсутствие такого включения. В конкретных вариантах молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают последовательности, показанные в таблице II или на фиг. 4-5. Примеры таких молекул нуклеиновой кислоты состоят по существу из последовательностей, определенных в указанных таблицах и на чертежах. Кроме того, химически модифицированные конструкции, описанные в таблице I, и композиции на основе нанолипидных частиц (LNP), показанные в таблице IV, могут использоваться в любой из последовательностей киНК или в группе последовательностей киНК согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клеткам млекопитающих, содержащих одну или несколько молекул киНК согласно настоящему изобретению. Одна или несколько указанных молекул киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться для независимого направленного воздействия на одни и те же или разные сайты в целевом полинуклеотиде согласно настоящему изобретению.

Термин «РНК» используется для обозначения молекулы, включающей по меньшей мере один рибонуклеотидный остаток. Термин «рибонуклеотид» используется для обозначения нуклеотида, содержащего гидроксильную группу в 2'-положении β-D-рибофуранозного фрагмента. Данные термины включают двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, выделенную РНК, такую как частично очищенная РНК, по существу чистая РНК, синтетическую РНК, полученную рекомбинантными методами РНК, а также измененную РНК, которая отличается от природной РНК за счет внесения в нее добавки, делеции, замещения и/или изменения одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать добавление материала ненуклеотидной природы, такие как добавки, содержащиеся на одном или обоих концах молекулы киНК или введенные внутрь молекулы, например, локализованные в одном или нескольких нуклеотидах в составе РНК. Нуклеотиды в составе молекул киНК согласно настоящему изобретению могут также включать нестандартные нуклеотиды, такие как неприродные нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды, или дезоксинуклеотиды. Указанные измененные РНК могут рассматриваться как аналоги, в частности аналоги природных РНК.

Термин «субъект» используется для обозначения организма, который является донором или реципиентом эксплантируемых клеток или представляет собой сами клетки. Термин «субъект» также относится к организму, в который могут вводиться молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Рассматриваемый в настоящем изобретении «субъект» может представлять собой млекопитающего или клетки млекопитающего, в том числе человека или клетки человека. В одном варианте указанный термин относится к ребенку (например, к субъектам, которые моложе 1 месяца или возраст которых составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 месяцев). В одном варианте указанный термин относится к детям более позднего возраста (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 лет). В одном варианте указанный термин относится к субъекту пожилого возраста (например, к субъектам в возрасте примерно 65 лет).

Термин «химическая модификация» используется для описания любой модификации химической структуры нуклеотидов, которые отличаются от нуклеотидов в нативной киРНК или РНК. Термин «химическая модификация» охватывает такие варианты, как добавление, замещение или модификация нативных нуклеозидов и нуклеотидов в составе киРНК или РНК модифицированными нуклеозидами и модифицированными нуклеотидами, согласно настоящему описанию или согласно известной в данной области информации. Не ограничивающие примеры таких химических модификаций включают, без ограничения, композиции, описываемые любой из формул I, II, III, IV, V, VI или VII согласно настоящему описанию, нуклеотиды, содержащие фосфоротиоатные межнуклеотидные связи, 2'-дезоксирибонуклеотиды, 2'-О-метилрибонуклеотиды, 2'-дезокси-2'-фторрибонуклеотиды, 4'-тиорибонуклеотиды, 2'-О-трифторметилнуклеотиды, 2'-О-этилтрифторметоксинуклеотиды, 2'-О-дифторметоксиэтоксинуклеотиды (см., например, USSN 10/981966, зарегистрированный 5 ноября 2004 года, включенный в настоящее описание в качестве ссылки), FANA, нуклеотиды с «универсальным основанием», «ациклические» нуклеотиды, 5-С-метилнуклеотиды, модификации, включающие введение терминальных глицерильных и/или инвертированных дезокси-безосновных остатков, или модификацию, описываемую любой из формул I-VII согласно настоящему описанию. В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, дцРНК, киНК и т.п.) частично модифицированы посредством химических модификаций (в частности, модифицированы примерно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95%). В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, дцРНК, киНК и т.п.) полностью модифицированы за счет химических модификаций (например, модифицированы почти на 100%).

Термин «фосфоротиоат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z и/или W включают атом серы. Соответственно, термин фосфоротиоат относится как к фосфоротиоатным, так и к фосфородитиоатным межнуклеотидным связям.

Термин «фосфоноацетат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z и/или W включают ацетильную или защищенную ацетильную группу.

Термин «тиофосфоноацетат» в контексте настоящего описания относится к межнуклеотидной связи в соединении формулы I, где Z включает ацетильную или защищенную ацетильную группу и W включает атом серы, или, альтернативно, W включает ацетильную или защищенную ацетильную группу и Z включает атом серы.

Термин «универсальное основание» в контексте настоящего описания относится к аналогам нуклеотидного основания, которые могут образовывать пары оснований с каждым из природных оснований ДНК/РНК, при наличии небольшой дискриминации между ними. Не ограничивающие примеры универсальных оснований включают С-фенильные, С-нафтильные и другие ароматические производные, инозин, азолкарбоксамиды и нитроазоловые производные, такие как 3-нитропиррол, 4-нитроиндол, 5-нитроиндол и 6-нитроиндол, известные в данной области (см., например, Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447).

Термин «ациклический нуклеотид» в контексте настоящего описания относится к любому нуклеотиду, содержащему ациклический рибозный сахар, например, где любой из рибозных атомов углерода (С1, C2, C3, C4 или С5) независимо или в сочетании удалены из нуклеотида.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, по отдельности или в сочетании с другими лекарственными препаратами, могут использоваться для предупреждения или лечения заболеваний, расстройств, состояний или признаков согласно настоящему описанию или иных, известных в данной области, у субъекта или в организме.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут вводиться субъекту или могут вводиться в любые соответствующие клетки, которые, как это известно специалистам в данной области, подходят для такой цели, по отдельности или в сочетании с одним или несколькими лекарственными препаратами, в условиях, подходящих для лечения.

В другом варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с другими известными режимами лечения, применяемыми для профилактики или лечения заболеваний, расстройств или состояний у субъекта или в организме. Так, например, описанные молекулы могут использоваться в сочетании с одним или несколькими известными соединениями, режимами лечения или процедурами, применяемыми для лечения заболеваний, расстройств, состояний и признаков согласно настоящему описанию у субъекта или в организме, в соответствии с известными в данной области подходами.

В одном варианте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению, в рамках способа, который позволяет экспрессию молекулы киНК. Например, указанный вектор может содержать одну или несколько последовательностей, кодирующих обе цепи молекулы киНК, включающей дуплекс. Указанный вектор может также содержать одну или несколько последовательностей, кодирующих одну молекулу нуклеиновой кислоты, которая является самокомплементарной и в этой связи формирует молекулу киНК. Не ограничивающие примеры таких векторов экспрессии описаны в литературе (Paul et al., 2002, Nature Biotechnology 19, 505; Miyagashi and Taira, 2002, Nature Biotechnology 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; и Novina et al., Nature Medicine, обновленная публикация он-лайн doi:10.1038/nm725.

В другом варианте настоящее изобретение относится к клетке млекопитающего, например к клетке человека, включающей вектор экспрессии согласно настоящему изобретению.

В еще одном варианте вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает последовательность молекулы киНК, характеризующейся комплементарностью к молекуле РНК, депонированной в Genbank с номерами доступа, приведенными в предварительной заявке на патент США № 60/363124, USSN 10/923536 и/или PCT/US03/05028.

В одном варианте вектор экспрессии согласно настоящему изобретению включает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую две или более молекул киНК, которые могут быть одинаковыми или могут различаться.

В другом аспекте настоящего изобретения молекулы киНК, которые взаимодействуют с молекулами целевой РНК и осуществляют отрицательную регуляцию гена, кодирующего молекулы целевой РНК (например, молекулы целевой РНК, депонированные в Genbank с номерами доступа, приведенными в настоящем описании), экспрессируются на основе единиц транскрипций, встроенных в векторы на основе ДНК или РНК. Указанные рекомбинантные векторы могут представлять собой плазмиды на основе ДНК или вирусные векторы. Вирусные векторы, экспрессирующие киНК, могут быть сконструированы на основе приведенных выше векторов, включающих, без ограничения, аденоассоциированный вирус, ретровирус, аденовирус или альфавирус. Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул киНК, могут быть получены согласно настоящему описанию и могут персистировать в целевых клетках. Альтернативно, могут использоваться вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул киНК. Такие векторы могут вводиться повторно, при необходимости. После экспрессии молекулы киНК связываются и осуществляют отрицательную регуляцию функции или экспрессии гена через интерференцию РНК (РНКи). Доставка векторов, экспрессирующих киНК, может быть системной, например, проводимой путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от субъекта с последующим введением вновь в организм субъекта, или с помощью других способов, которые способствуют встраиванию вектора в желательную целевую клетку.

Термин «векторы» используется для обозначения любой методики, основанной на нуклеиновой кислоте и/или на вирусах, применяемой для доставки желательной нуклеиновой кислоты.

Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалистам на основе приведенного описания предпочтительных вариантов его осуществления и из прилагаемой формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг. 1 дана иллюстрация не ограничивающего примера схемы синтеза молекул киНК. Комплементарные последовательности цепей киНК, цепи 1 и цепи 2, синтезируют в тандеме и соединяют с помощью расщепляемой связи, такой как нуклеотидный сукцинат или безосновный сукцинат, которые могут быть одинаковыми или могут отличаться от расщепляемого линкера, используемого для твердофазного синтеза на твердой подложке. Указанный синтез может проводиться либо в твердой фазе, либо в фазе раствора, в приведенном примере синтез проводится в твердой фазе. Указанный синтез проводится таким образом, что защитная группа, такая как диметокситритильная группа, остается интактной на концевом нуклеотиде тандемного олигонуклеотида. При расщеплении и снятии защиты с олигонуклеотида, две цепи киНК спонтанно гибридизуются с образованием дуплекса киНК, что позволяет осуществлять очистку дуплекса за счет использования свойств концевой защитной группы, например с использованием тритила в методе очистки, где выделяют только дуплексы/олигонуклеотиды с концевой защитной группой.

На фиг. 2 показан масс-спектр MALDI-TOF очищенного дуплекса киНК, синтезированного по способу согласно настоящему изобретению. Два приведенных пика соответствуют расчетной массе отдельных цепей последовательности киНК. Этот результат показывает, что дуплекс киНК, полученный в ходе тандемного синтеза, может быть очищен в виде одной единицы с использованием простой методики тритильной очистки.

На фиг. 3 дана иллюстрация не ограничивающего примера деградации целевой РНК, участвующей в РНКи. Двухцепочечная РНК (дцРНК), которая генерируется РНК-зависимой РНК-полимеразой (RdRP) из чужеродной одноцепочечной РНК, например, вирусной РНК, транспозона или другой экзогенной РНК, активирует фермент DICER, который, в свою очередь, генерирует дуплексы киНК. Альтернативно, синтезированная или экспрессированная киНК может быть введена непосредственно в клетку с использованием соответствующих способов. При этом образуется активный комплекс киНК, который распознает целевую РНК, что приводит к деградации целевой РНК эндонуклеазным комплексом RISC или в ходе синтеза дополнительной РНК по механизму РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), которая может активировать DICER, приводя к образованию дополнительных молекул киНК, что усиливает ответ по механизму РНКи.

На фиг. 4A-F проиллюстрированы не ограничивающие примеры конструкций химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению. На приведенных чертежах N обозначает любой нуклеотид (аденозин, гуанозин, цитозин, уридин или необязательно тимидин, где тимидин, например, может быть замещен в пределах выступающих участков, обозначенных (N N). Приведены различные модификации смысловой и антисмысловой цепей в конструкции киНК. Указанные (N N) нуклеотидные положения могут быть химически модифицированы в соответствии с приведенным описанием (например, с использованием 2'-О-метил-, 2'-дезокси-2'-фтормодификаций и т.п.) и могут быть получены из соответствующей целевой последовательности нуклеиновой кислоты либо иным способом (см., например, фиг. 6С). Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 4, могут необязательно включать рибонуклеотид в 9-м положении, считая от 5'-конца в смысловой цепи, или в 11-м нуклеотидном положении от 5'-конца ведущей цепи, при отсчете 11 нуклеотидного положения от 5'-конца ведущей цепи (см. фиг. 6С).

Фиг. 4А: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям и где все присутствующие нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК и где все присутствующие нуклеотиды представляют собой рибонуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная как «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепях.

Фиг. 4B: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтормодифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксиринуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная как «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепях.

Фиг. 4С: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащая 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил- или 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь, включающая 21 нуклеотид, необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в смысловой и антисмысловой цепях.

Фиг 4D: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид, которые необязательно содержат 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», в необязательном варианте соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи.

Фиг 4Е: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или любые химические модификации согласно настоящему описанию. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-О-метил-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», необязательно соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи.

Фиг. 4F: Смысловая цепь включает 21 нуклеотид, содержащие 5'- и 3'-концевые кэп-фрагменты, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно спарены по основаниям, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды. Антисмысловая цепь включает 21 нуклеотид и необязательно содержит 3'-концевой глицерильный фрагмент, где два концевых 3'-нуклеотида необязательно комплементарны последовательности целевой РНК, а также содержит одну 3'-концевую фосфоротиоатную межнуклеотидную связь, и где все пиримидиновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированные нуклеотиды, и где все пуриновые нуклеотиды, которые могут присутствовать, представляют собой 2'-дезоксинуклеотиды, за исключением (N N) нуклеотидов, которые могут включать рибонуклеотиды, дезоксинуклеотиды, универсальные основания или другие химические модификации согласно настоящему описанию. Модифицированная межнуклеотидная связь, такая как фосфоротиоатная, фосфородитиоатная или другая модифицированная межнуклеотидная связь согласно настоящему описанию, показанная в виде «s», необязательно соединяет (N N) нуклеотиды в антисмысловой цепи. Антисмысловая цепь конструкций A-F включает последовательность, комплементарную любой последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Кроме того, в том случае, когда глицерильный фрагмент (L) присутствует на 3'-конце антисмысловой цепи в любой конструкции, показанной на фиг. 4A-F, модифицированная межнуклеотидная связь является необязательной.

На фиг. 5A-F проиллюстрированы не ограничивающие примеры конкретных последовательностей химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению. Варианты A-F относятся к химическим модификациям, приведенным на фиг. 4А-F, применительно к репрезентативной последовательности киНК. Такие химические модификации могут быть использованы в любой последовательности киНК применительно к любой мишени. Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 5, могут необязательно включать рибонуклеотид в 9-м положении от 5'-конца смысловой цепи или в 11-м положении от 5'-конца ведущей цепи, при отсчете 11 нуклеотидного положения от 5'-конца ведущей цепи (фиг. 6С). Кроме того, последовательности, показанные на фиг. 5, могут необязательно включать концевые рибонуклеотиды примерно до 4 положения на 5'-конце антисмысловой цепи (например, в положении примерно 1, 2, 3 или 4 концевого рибонуклеотида на 5'-конце антисмысловой цепи).

На фиг. 6А-С приведены не ограничивающие примеры различных конструкций киНК согласно настоящему изобретению.

Примеры, проиллюстрированные на фиг. 6А (конструкции 1, 2 и 3), характеризуются наличием 19 репрезентативных пар оснований; однако различные варианты осуществления настоящего изобретения могут включать любое число пар оснований согласно настоящему описанию. Выделенные скобками участки соответствуют положению нуклеотидов в выступающих фрагментах, которые включают, например, примерно 1, 2, 3 или 4 нуклеотида в длину, предпочтительно примерно 2 нуклеотида. Конструкции 1 и 2 могут использоваться независимо для достижения активности РНКи. Конструкция 2 может включать полинуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который, в необязательном варианте, может быть сконструирован в виде биодеградируемого линкера. В одном варианте петлевая структура, показанная в конструкции 2, может включать биодергадируемый линкер, который приводит к образованию конструкции 1 in vivo и/или in vitro. В другом примере конструкция 3 может использоваться для создания конструкции 2, на основе тех же принципов, что и в случае линкера, используемого для создания активной конструкции 2 киНК in vivo и/или in vitro, где необязательно может использоваться другой биодеградируемый линкер для создания активной конструкции 1 киНК in vivo и/или in vitro. Соответственно, стабильность и/или активность конструкций киНК может модулироваться при разработке конструкции киНК, используемой in vivo и/или in vitro и/или in vitro.

Примеры, проиллюстрированные на фиг. 6B, отражают различные вариации в молекуле двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, такой как микроРНК, которая может включать выступающие фрагменты, вздутия, петли и стеблевые петли, возникающие в результате частичной комплементарности. Такие мотивы, содержащие вздутия, петли и стеблевые петли, рассматриваются в основном как характеристики миРНК. Указанные вздутия, петли и стеблевые петли возникают в результате наличия любой степени частичной комплементарности, такой как при наличии ошибочных спариваний или вздутий, которые включают примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более нуклеотидов в одной или обеих цепях молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.

В примере, проиллюстрированном на фиг. 6С, показана модель молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, включающей дуплекс из 19 пар оснований, на основе двух последовательностей из 21 нуклеотида, содержащих динуклеотидные 3'-выступающие фрагменты. Верхняя цепь (1) отображает смысловую цепь (цепь-«пассажир»), средняя цепь (2) отображает антисмысловую цепь (ведущая цепь), и нижняя цепь (3) представляет собой целевую полинуклеотидную последовательность. Выступающие динуклеотидные фрагменты (NN) могут включать последовательность, полученную из целевого полинуклеотида. Так, например, 3'-(NN) последовательность в ведущей цепи может быть комплементарна 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида. Кроме того, 5'-(NN) последовательность цепи-«пассажира» может включать такую же последовательность, что и 5'-[NN] последовательность целевого полинуклеотида. В других вариантах выступающие фрагменты (NN) не были получены из целевой полинуклеотидной последовательности, например, в том случае, когда 3'-(NN) последовательность ведущей цепи не комплементарна 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида, и 5'-(NN) последовательность цепи-«пассажира» может включать последовательность, отличную от 5'-[NN] последовательности целевого полинуклеотида. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения любые (NN) нуклеотиды химически модифицированы, например, включают модификации 2'-О-метилом, 2'-дезокси-2'-фтором и/или имеют другие модификации согласно настоящему описанию. Кроме того, цепь-«пассажир» может включать рибонуклеотидную позицию N в цепи-«пассажире». Применительно к показанным на чертеже 19 репрезентативных пар оснований в 21-мерном дуплексе, локализация N может быть удалена от 3'-конца цепи-«пассажира» на 9 нуклеотидов. Однако, в случае дуплексов варьирующейся длины, положение N определяется относительно 5'-конца ведущей цепи путем отсчета 11 нуклеотидов от 5'-конца ведущей цепи и выбора соответствующих спаренных по основаниям нуклеотидов в цепи-«пассажире». Расщепление Ago2 происходит между положениями 10 и 11, как указано на чертеже стрелкой. В дополнительных вариантах имеются два рибонуклеотида, NN, в положениях 10 и 11 относительно 5'-конца ведущей цепи, определяемых путем отсчета 10 и 11 нуклеотидных положений от 5'-конца ведущей цепи и выбора соответствующих спаренных по основанию нуклеотидов в цепи-«пассажире».

На фиг. 7А-С показана диаграмма, иллюстрирующая схему, которая была использована при создании кассет экспрессии для целей получения шпилечных конструкций киНК.

Фиг. 7А: Олигомер ДНК синтезируют с использованием последовательности сайта 5'-рестрикции (R1), за которой следует участок, имеющий последовательность, идентичную заданной целевой последовательности (смысловой участок киНК), где указанный смысловой участок включает, например, примерно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида (N) в длину, и за указанной последовательностью следует петлевая последовательность с определенной последовательностью (X), включающая, например, от примерно 3 до примерно 10 нуклеотидов.

Фиг. 7B: Затем полученную синтетическую конструкцию подвергают расширению с помощью ДНК-полимеразы с образованием шпилечной структуры, имеющей самокомплементарную последовательность, на основе которой получают транскрипт киНК, который специфичен для целевой последовательности и содержит самокомплементарные смысловой и антисмысловой участки.

Фиг. 7С: Указанную конструкцию нагревают (например, приблизительно до 95°С) для линеаризации последовательности, что позволяет достичь расширения комплементарной второй цепи ДНК с использованием праймера к последовательности 3'-рестрикции первой цепи. Далее двухцепочечную ДНК встраивают в соответствующий вектор для экспрессии в клетках. Указанная конструкция может быть получена таким образом, что при транскрипции образуется 3'-концевой нуклеотидный выступающий фрагмент, например, путем создания методами генной инженерии сайтов рестрикции и/или за счет использования поли-U участков терминации, как описано в работе Пола с соавт. (Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505-508).

Фиг. 8А-С представляет собой диаграмму, иллюстрирующую схему, которая была использована при создании кассеты экспрессии для получения конструкций двухцепочечных киНК.

Фиг. 8А: Олигомер ДНК синтезируют с использованием последовательности сайта 5'-рестрикции (R1), за которой следует участок, имеющий последовательность, идентичную заданной целевой последовательности (смысловой участок киНК), где указанный смысловой участок включает, например, примерно 19, 20, 21 или 22 нуклеотида (N) в длину, и за указанной последовательностью следует сайт 3'-рестрикции (R2), который соседствует с петлевой последовательностью определенной последовательности (X).

Фиг 8B: Затем полученную синтетическую конструкцию подвергают расширению с помощью ДНК-полимеразы с образованием шпилечной структуры, имеющей самокомплементарную последовательность.

Фиг 8С: Далее указанную конструкцию процессируют с использованием ферментов рестрикции, специфичных к R1 и R2, с получением двухцепочечной ДНК, которую затем встраивают в соответствующий вектор для экспрессии в клетках. Кассету транскрипции разрабатывают таким образом, чтобы каждая сторона дцДНК была фланкирована U6 промоторным участком, что позволяет создать по отдельности смысловую и антисмысловую цепи киНК. К указанным конструкциям могут быть добавлены поли-Т-терминирующие последовательности для создания U-выступающих фрагментов в полученном транскрипте.

Фиг. 9А-Е представляет собой диаграмму, иллюстрирующую способ, который был использован для определения сайтов-мишеней для киНК-опосредованного процесса РНКи, в составе конкретной целевой последовательности нуклеиновой кислоты, такой как матричная РНК.

Фиг. 9А: Синтезируют совокупность олигонуклеотидов киНК, где антисмысловой участок конструкции киНК комплементарен к сайтам-мишеням вдоль всей последовательности целевой нуклеиновой кислоты и где смысловой участок включает последовательность, комплементарную антисмысловому участку киНК.

Фиг. 9B и C: (фиг. 9B) Последовательности объединяют и встраивают в векторы, так что (фиг. 9С) трансфекция вектора в клетки приводит к экспрессии киНК.

Фиг. 9D: Клетки сортируют на основе наличия фенотипических изменений, которые ассоциированы с модуляцией последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

Фиг. 9Е: киНК выделяют из отсортированных клеток и секвенируют для идентификации эффективных сайтов-мишеней в последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

На фиг. 10 проиллюстрированы не ограничивающие примеры различных химических стабилизирующих структур (1-10), которые могут использоваться, например, для стабилизации 3'-конца в последовательностях киНК согласно настоящему изобретению и которые включают: (1) [3-3']-инвертированную дезоксирибозу; (2) дезоксирибонуклеотид; (3) [5'-3']-3'-дезоксирибонуклеотид; (4) [5'-3']-рибонуклеотид; (5) [5'-3']-3'-О-метилрибонуклеотид; (6) 3'-глицерил; (7) [5'-3']-3'-дезоксирибонуклеотид; (8) [3'-3']-дезоксирибонуклеотид; (9) [5'-2']-дезоксирибонуклеотид; и (10) [5-3']-дидезоксирибонуклеотид. Кроме модифицированных и немодифицированных химических структур скелета, приведенных на чертеже, указанные химические структуры могут быть объединены с различными другими скелетными модификациями согласно настоящему описанию, например, со скелетными модификациями формулы I. Кроме того, 2'-дезоксинуклеотид, показанный в виде 5'-концевых модификаций, может быть представлен иначе модифицированным или вовсе не модифицированным нуклеотидом или фрагментом ненуклеотидной природы согласно настоящему описанию, например, может включать модификации, соответствующие любой из формул I-VII или любому их сочетанию.

На фиг. 11 показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий стратегию, которая была использована для идентификации конструкций химически модифицированных киНК согласно настоящему изобретению, которые обладают резистентностью к нуклеазе, при одновременном сохранении способности опосредовать активность РНКи. Химические модификации вводят в конструкцию киНК с учетом выявленных параметров сборки (например, при встраивании 2'-модификаций, модификаций основания, скелетных модификаций, концевых кэп-модификаций и т.п.). Модифицированную конструкцию подвергают тестированию в соответствующей системе (например, в сыворотке крови человека для оценки нуклеазной резистентности, как это показано на чертеже, или на модели животных для оценки ФК параметров /характеристик доставки). Параллельно, конструкцию киНК тестируют на наличие РНКи активности, например, в системе культуры клеток, такой как тест на люциферазный репортер. Затем идентифицируют конструкции лидерных киНК, которые обладают конкретными характеристиками, при одновременном сохранении РНКи активности, и которые могут быть далее подвергнуты соответствующей модификации, и вновь проводят количественный анализ. Такого же рода подход может быть использован для идентификации киНК-конъюгированных молекул с улучшенными фармакокинетическими профилями, способностью к доставке и РНКи активностью.

На фиг. 12 приведены не ограничивающие примеры молекул фосфорилированных киНК согласно настоящему изобретению, включающих линейные и дуплексные конструкции, а также их асимметрические производные.

На фиг. 13 приведены не ограничивающие примеры химически модифицированных концевых фосфатных групп согласно настоящему изобретению.

На фиг. 14А приведены не ограничивающие примеры технологии, используемой для создания самокомплементарных конструкций DFO на основе палиндромных и/или повторяющихся последовательностей нуклеиновой кислоты, которые идентифицированы в целевой последовательности нуклеиновой кислоты. (i) В целевой последовательности нуклеиновой кислоты идентифицируют палиндромную или повторяющуюся последовательность. (ii) Создают последовательность, которая комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты и палиндромной последовательности. (iii) Инвертированную повторяющуюся последовательность непалиндромной/повторяющейся части комплементарной последовательности присоединяют к 3'-концу комплементарной последовательности для получения самокомплементарной молекулы DFO, включающей последовательность, комплементарную целевой нуклеиновой кислоте. (iv) Молекула DFO может подвергаться самосборке с образованием двухцепочечного олигонуклеотида. На фиг. 14B приведен не ограничивающий репрезентативный пример олигонуклеотидной последовательности, образующей дуплекс. На фиг. 14С приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий схему самосборки репрезентативной олигонуклеотидной последовательности, формирующей дуплекс. На фиг. 14D показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий схему самосборки репрезентативной олигонуклеотидной последовательности, формирующей дуплекс, с последующим взаимодействием с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты, приводящим к модуляции генной экспрессии.

На фиг. 15 приведен не ограничивающий пример архитектуры самокомплементарных конструкций DFO на основе палиндромных и/или повторяющихся последовательностей нуклеиновых кислот, которые включены в конструкции DFO и которые содержат последовательность, комплементарную к любой целевой последовательности нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Встраивание указанных палиндромных/повторяющихся последовательностей позволяет создать конструкции DFO определенной архитектуры, формирующие дуплекс, в которых каждая цепь способна опосредовать экспрессию целевого гена, например, в процессе РНКи. Вначале идентифицируют целевую последовательность. Далее создают комплементарную последовательность, при этом в данную комплементарную последовательность вводят нуклеотидные или ненуклеотидные модификации (показанные как X или Y), которые генерируют образование искусственного палиндрома (показанного на чертеже в виде XYXYXY). Указанный инвертированный повтор непалиндромной/повторяющейся комплементарной последовательности присоединяют к 3'-концу комплементарной последовательности с получением самокомплементарной DFO, включающей последовательность, комплементарную к целевой нуклеиновой кислоте. Указанный DFO может подвергаться самосборке с образованием двухцепочечного олигонуклеотида.

На фиг. 16 проиллюстрированы не ограничивающие примеры полифункциональных молекул киНК согласно настоящему изобретению, включающих две отдельные полинуклеотидные последовательности, каждая из которых способна опосредовать РНКи, направляющий расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 16А приведен не ограничивающий пример полифункциональной молекулы киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 3'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Указанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью применительно к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к последовательностям целевой нуклеиновой кислоты. На фиг. 16B приведен не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 5'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью применительно к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к последовательностям целевой нуклеиновой кислоты.

На фиг. 17 приведены не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих одну полинуклеотидную последовательность, которая содержит различные участки, каждый из которых способен вовлекаться в РНКи, направляющую расщепление различных последовательностей целевой нуклеиновой кислоты. На фиг. 17А приведен не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где второй комплементарный участок расположен на 3'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 17B показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый комплементарный участок расположен на 5'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. В одном варианте, указанные конструкции полифункциональной киНК подвергаются процессингу in vivo или in vitro с образованием конструкций полифункциональных киНК, как показано на фиг. 16.

На фиг. 18 показаны не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих две отдельные полинуклеотидные последовательности, каждая их которых способна опосредовать РНКи, направляющую расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты, где конструкция полифункциональной киНК также включает самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок, что позволяет создать более короткие конструкции бифункциональных киНК, которые могут опосредовать интерференцию РНК против различных целевой последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 18А показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 3'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональных киНК, и где первый и второй комплементарные участки включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 18В показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый и второй комплементарные участки расположены на 5'-концах каждой полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК, и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны целевым последовательностям нуклеиновой кислоты.

На фиг. 19 показаны не ограничивающие примеры молекул полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению, включающих одну полинуклеотидную последовательность, которая содержит различные участки, каждый из которых способен опосредовать РНКи, направляющую расщепление различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты, и где конструкция полифункциональной киНК также включает самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок, что позволяет создать более короткие конструкции бифункциональных киНК, которые могут опосредовать интерференцию РНК против различных целевых последовательностей нуклеиновой кислоты. На фиг. 19А показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где второй комплементарный участок расположен на 3'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК, и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. На фиг. 19B показан не ограничивающий пример молекулы полифункциональной киНК, содержащей первый участок, который комплементарен к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и второй участок, который комплементарен второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 2), где первый комплементарный участок расположен на 5'-конце полинуклеотидной последовательности в полифункциональной киНК и где первый и второй комплементарные участки также включают самокомплементарный, палиндромный или повторяющийся участок. Показанные пунктиром части каждой полинуклеотидной последовательности в конструкции полифункциональной киНК обладают комплементарностью к соответствующим частям дуплекса киНК, но не комплементарны к целевой последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте указанные конструкции полифункциональной киНК подвергаются процессингу in vivo или in vitro с образованием конструкции полифункциональной киНК, как показано на фиг. 18.

На фиг. 20 показан не ограничивающий пример, иллюстрирующий, как молекулы полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению могут направленно воздействовать на две отдельные молекулы целевой нуклеиновой кислоты, такие как отдельные молекулы РНК, кодирующие различные белки (например, любые мишени согласно настоящему изобретению), например, на цитокин и его соответствующий рецептор, на различные вирусные штаммы, на вирусный и клеточный белок, вовлекаемый в вирусную инфекцию или репликацию, или различные белки, вовлекаемые в общий или дивергентный биологический путь, связанный с поддержанием прогрессирования болезни. Каждая цепь конструкции полифункциональной киНК включает участок, комплементарный к отдельным молекулам целевой нуклеиновой кислоты. Указанную молекулу полифункциональной киНК разрабатывают таким образом, что каждая цепь киНК может быть использована в составе комплекса RISС для инициации процесса интерференции РНК, вовлекаемого в расщепление соответствующей мишени. Параметры указанной архитектуры могут включать дестабилизацию каждого конца конструкции киНК (см,. например, Schwarz et al., 2003, Cell, 115, 199-208). Такая дестабилизация может быть достигнута, например, при использовании гуанозин-цитидиновых пар оснований, чередующихся пар оснований (например, неканонических пар, соответствующих модели «качелей») или дестабилизирующих химически модифицированных нуклеотидов в концевых нуклеотидных положениях, в соответствии с известными в настоящее время данными.

На фиг. 21 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий, как молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению могут направленно воздействовать на две отдельные целевые последовательности нуклеиновой кислоты в составе одной молекулы целевой нуклеиновой кислоты, таких как чередующиеся кодирующие участки РНК, кодирующие и некодирующие участки РНК или чередующиеся участки сплайсинг-вариантов РНК. Каждая цепь конструкции полифункциональной киНК включает участок, комплементарный к отдельным участкам молекулы целевой нуклеиновой кислоты. Указанная молекула полифункциональной киНК разработана таким образом, что каждая цепь киНК может использоваться в составе комплекса RISС для инициации процесса интерференции РНК, опосредующего расщепление соответствующего целевого участка. Параметры указанной архитектуры могут включать дестабилизацию каждого конца конструкции киНК (см., например, Schwarz et al., 2003, Cell, 115, 199-208). Такая дестабилизация может быть достигнута, например, при использовании гуанозин-цитидиновых пар оснований, чередующихся пар оснований (например, неканонических пар, соответствующих модели «качелей») или дестабилизирующих химически модифицированных нуклеотидов в концевых нуклеотидных положениях, в соответствии с известными в настоящее время данными.

На фиг. 22(А-Н) приведены не ограничивающие примеры присоединенных конструкций полифункциональных киНК согласно настоящему изобретению. В приведенных примерах линкер (например, нуклеотидный или ненуклеотидный линкер) соединяет два участка киНК (например, соединяет вместе два смысловых, два антисмысловых или, альтернативно, смысловой и антисмысловой участки). Отдельные смысловые (или смысловые и антисмысловые) последовательности, соответствующие первой целевой последовательности и второй целевой последовательности, гибридизируют с соответствующей смысловой и/или антисмысловой последовательностями в полифункциональной киНК. Дополнительно, различные конъюгаты, лиганды, аптамеры, полимеры или репортерные молекулы могут быть присоединены к линкерному участку для достижения селективного или улучшенного характера доставки и/или с целью создания улучшенных фармакокинетических свойств.

На фиг. 23 показан не ограничивающий пример различных дендримерных архитектур полифункциональных киНК.

На фиг. 24 показан не ограничивающий пример различных супрамолекулярных архитектур полифункциональных киНК.

На фиг. 25 приведен не ограничивающий пример дайсера (dicer), позволяющего достичь соответствующей структуры полифункциональной киНК, с использованием 30-нуклеотидной конструкции-предшественника киНК. Далее дуплекс из 30 пар оснований расщепляют дайсером с получением продуктов с 22 и 8 парами оснований на любом конце (фрагменты из 8 пар оснований не показаны). Для простоты описания, выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но эти данные могут быть предоставлены. Показаны три целевые последовательности. Требуемое перекрывание последовательности по идентичности выделено на череже в виде серых прямоугольников. N-положения родительских киНК из 30 пар оснований представляют собой предполагаемые сайты 2'-OH-положений, делающих возможным расщепление дайсером, в случае тестирования в условиях стабилизированных химических структур. Следует отметить, что процессинг 30-мерного дуплекса дайсерной РНКазой III не создает точного расщепления по механизму 22+8, но, скорее, позволяет получить серию родственных продуктов (где продукт 22+8 относится к основныму сайту). Таким образом, процессинг дайсером приводит к получению серии активных киНК.

На фиг. 26 показан не ограничивающий пример архитектуры многофункциональных киНК, полученных с помощью дайсера на основе 40-нуклеотидной конструкции-предшественника киНК. Дуплекс из 40 пар оснований расщепляют дайсером на продукты по 20 пар оснований с любого конца. Для простоты описания, выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но эти данные могут быть предоставлены. Показаны четыре целевые последовательности. Целевые последовательности, обладающие гомологией, обведены прямоугольником. Указанный формат конструкций может быть использован для получения более крупных РНК. Если химически стабилизированные киНК связываются дайсером, то стратегически расположенные рибонуклеотидные связи можно использовать для создания продуктов расщепления, которые позволяют получить более широкий репертуар полифункциональных структур по их архитектуре. Например, продукты расщепления не будут ограничены стандартом дайсера примерно в 22 нуклеотида, но можно создать конструкции полифункциональных киНК с перекрывающейся идентичностью к целевой последовательности, варьирующей в диапазоне от примерно 3 до примерно 15 нуклеотидов.

На фиг. 27 показан не ограничивающий пример дополнительных вариантов конструкции полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению. В одном примере конъюгат, лиганд, аптамер, метку или другой фрагмент присоединяют к участку полифункциональной киНК, что позволяет достичь улучшенного характера доставки или улучшенного фармакокинетического профиля.

На фиг. 28 показан не ограничивающий пример дополнительных вариантов конструкции полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению. В одном примере конъюгат, лиганд, аптамер, метку или другой фрагмент присоединяют к участку полифункциональной киНК, с достижением улучшенного характера доставки или улучшенного фармакокинетического профиля.

На фиг. 29 приведен не ограничивающий пример холестерин-связанного фосфорамидита, который может использоваться для синтеза холестериновых конъюгатов с молекулами киНК согласно настоящему изобретению. Показан пример, включающий холестериновый фрагмент, присоединенный к 5'-концу смысловой цепи молекулы киНК.

На фиг. 30 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 262.

На фиг. 31 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 263.

На фиг. 32 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 33 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием двух разных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 34 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием двух разных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайт 1583.

На фиг. 35 показан не ограничивающий пример ингибирования S антигена HBV (HBsAg) in vitro с использованием различных конструкций киНК, имеющих выбранный характер модификации, который включает присутствие рибонуклеотидов в определенных положениях, где имеет место направленное воздействие на РНК HBV, сайты 262 и 263.

На фиг. 36 показан не ограничивающий пример зависимого от дозы ингибирования экспрессии РНК HСV in vitro с использованием Stab 25 и Stab 29 конструкций киНК, направленно воздействующих на сайты 327, 282 и 304 в РНК.

На фиг. 37 показан не ограничивающий пример ингибирования in vivo ДНК HBV у мышей с использованием композиций на основе молекул киНК согласно настоящему изобретению LNP-086 и LNP-061 с различными структурами выступающих фрагментов. Активные конструкции киНК LNP-086 и LNP-061 оценивают в сравнении с контрольными группами введения ФБР и ивертированных контрольных композиций. Как показано на чертеже, конструкции киНК с 2'-O-метильными выступающими фрагментами обеспечивают мощную анти-HBV активность в рамках данной модели.

На фиг. 38 показан не ограничивающий пример опосредованного HBV263M-LNP-086 снижения уровней ДНК HBV в сыворотке in vivo у HBV-реплицирующих мышей, которым вводят дозы 0,3, 1 или 3 мг/кг/день в течение трех дней, в сравнении с животными в группах введения контрольной киНК или ФБР. Уровни сывороточных ДНК HBV были эквивалентны в группах введения контрольной киНК и ФБР, что указывает на специфичность по последовательности анти-HBV активности и отсутствие неспецифических липидных эффектов.

На фиг. 39 показан не ограничивающий пример опосредованного HBV263M-LNP-086 снижения уровней HBV HBsAg в сыворотке in vivo у HBV-реплицирующих мышей, которым вводят дозы 0,3, 1 или 3 мг/кг/день в течение трех дней, в сравнении с животными в группах введения контрольной киНК или ФБР. Уровни сывороточного HBV HBsAg были эквивалентны в группах введения контрольной киНК и ФБР, что указывает на специфичность по последовательности анти-HBV активности и отсутствие неспецифических липидных эффектов.

На фиг. 40 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий длительность киНК-опосредованного снижения уровней HBV на модели мышей с HBV инфекцией. HBV-реплицирующим мышам вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Minv-LNP-086 в дозах 3 мг/кг/день в течение трех дней, с последующим анализом сывороточных титров HBV в дни 3, 7 и 14 после введения последней дозы. Как показано на чертеже, анти-HBV активность является длительной, так что значительная активность все еще наблюдается в 7 день (снижение 2,0 log 10) и день 14 (снижение 1,5 log 10).

На фиг. 41 приведен не ограничивающий пример специфичного расщепления РНК HBV в печени, опосредованного введением активной композиции HBV263M-LNP-086 на модели мышей с HBV инфекцией. Мышам, реплицирующим HBV, вводят дозы HBV263M-LNP-086, равные 0,3, 1, 3, 10 мг/кг/день, или, в качестве контроля, HBV263invM-LNP в дозе 10 мг/кг/день в течение трех дней, и через три дня после введения последней дозы определяют уровни РНК HBV в печени. Наблюдается зависимое от дозы снижение уровня РНК HBV в печени, которое достигает снижения до 90%, 66,5%, 18% и 4%, отмечаемое в группах введения 10, 3, 1 и 0,3 мг/кг HBV263M-LNP, соответственно, в сравнении с введением контрольной композиции HBV263invM-LNP-086 в дозе 10 мг/кг.

На фиг. 42 приведен не ограничивающий пример, демонстрирующий, что снижение уровня РНК HBV в печени связано с РНКи-опосредованным расщеплением РНК HBV. Используют анализ быстрой амплификации по 5'-концам кДНК (RACE) для выявления расщепления РНК HBV в предполагаемом сайте. HBV-реплицирующим мышам вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Мinv-LNP-086 в дозе 3 мг/кг/день в течение 3 дней. Животных умерщвляют через 3, 7 и 14 дней после введения последней дозы и выделяют суммарную печеночную РНК. Ожидалось, что лигирование адапторной последовательности со свободными 5'-концами популяции РНК и проведение далее реакции по процедуре ОТ-ПЦР с адапторными и HBV-специфическими праймерами должно привести к образованию ПЦР продукта с 145 парами оснований, если РНК HBV была расщеплена в заданном сайте-мишени. Как показано на чертеже, ожидаемый продукт амплификации выявляется в образцах, обработанных активной HBV263 киНК, в каждой анализируемой точке, но не в контрольных образцах HBV263. Далее продукты ПЦР подвергают субклонированию и секвенируют, и в результате проведенного анализа было подтверждено корректное соединение между адапторной последовательностью и предполагаемым сайтом расщепления HBV263 киНК. Данный результат показывает, что снижение уровня РНК HBV, наблюдаемое в печени, связано со специфическим РНКи-опосредованным расщеплением РНК HBV в печени. Кроме того, выявление продуктов специфического расщепления РНК HBV в анализируемых точках 7 и 14 дни, указывает на то, что длительная активность киНК против HBV связана с продолжающимся расщеплением РНК HBV.

На фиг. 43 приведен не ограничивающий пример, иллюстрирующий фармакокинетические свойства HBV263M-LNP-086, определенные у мышей после введения однократной дозы 3 мг/кг. Был использован метод гибридизации для выявления HBV263М киНК в плазме и в печени с течением времени. HBV263М быстро элиминируется из плазмы с периодом элиминации T_1/2, равным примерно 1,7 часа. Однако HBV263М выявлялся в печени в течение 14-дневного периода отбора и анализа образцов и имел период элиминации Т_1/2, равный 4 дням. Максимальная концентрация, равная 31,3±17,8 нг/мг (среднее значение ± стандартное отклонение), наблюдается в печени через 1 час и соответствует 65±32% от дозы киНК. На 14 день в печени остается в интактном виде 1,4±0,7% от дозы. Длительная опосредованная киНК анти-HBV активность, наблюдаемая на модели мышей, хорошо коррелирует с указанным временем пребывания киНК в печени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Механизм действия молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению

В приведенном ниже тексте дается обсуждение предполагаемого механизма интерференции РНК, опосредованного участием короткой интерферирующей РНК, в соответствии с известными в настоящее время данными, при этом следует отметить, что приведенное обсуждение не является ограничивающим и его не следует рассматривать как указание на достигнутый уровень техники в данной области. В настоящем изобретении заявитель демонстрирует, что химически модифицированные короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты обладают аналогичной или улучшенной способностью опосредовать РНКи, относительно молекул киНК, и, как ожидается, будут обладать повышенной стабильностью и активностью in vivo; в этой связи, данное изобретение не следует рассматривать как ограниченное только лишь киРНК, поскольку оно может быть применено ко всем киНК в целом. Фразы «улучшенная способность опосредовать РНКи» или «повышенная РНКи активность» в контексте настоящего описания включают активность РНКи, определенную in vitro и/или in vivo, где активность РНКи представляет собой отражение как способности киНК опосредовать РНКи, так и стабильности таких киНК согласно настоящему изобретению. В рамках настоящего изобретения, образование продукта, определяемого данной активностью, может быть повышено in vitro и/или in vivo, в сравнении со всеми РНК, киРНК или киНК, содержащими множество рибонуклеотидов. В некоторых случаях, активность или стабильность молекулы киНК может быть снижена (например, снижена менее чем в 10 раз), тогда как общая активность молекулы киНК повышена in vitro и/или in vivo.

Интерференция РНК относится к процессу специфичного по последовательности посттранскрипционного молчания гена у животных, который сопряжен с участием в нем коротких интерферирующих молекул РНК (киРНК) (Fire et al., 1998, Nature, 391, 806). Соответствующий процесс в растениях известен как посттранскрипционное молчание гена или молчание РНК, а также как процесс подавления гена, применительно к грибам. Процесс посттранскрипционного молчания гена, как считается, представляет собой эволюционно законсервативный механизм клеточной защиты, используемый организмом для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и представляет собой общий механизм для различных представителей растительного и животного мира (Fire et al., 1999, Trend genet., 15, 358). Такой путь защиты от экспрессии чужеродного гена мог возникнуть в ответ на продукцию двухцепочечных РНК (дцРНК), в результате вирусной инфекции или в результате случайной интеграции транспозоновых элементов в геном организма-хозяина, по механизму клеточного ответа, направленного на специфическое разрушение гомологичной одноцепочечной РНК или вирусной геномной РНК. Наличие дцРНК в клетках запускает ответный процесс РНКи по механизму, который до сих пор полностью не изучен. Указанный механизм, по всей видимости, отличается ответом интерферона, который является результатом дцРНК-опосредованной активации протеинкиназы PKR и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы, приводящей к неспецифическому расщеплению мРНК рибонуклеазой L.

Наличие длинных дцРНК в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеазы III, известного как дайсер (Dicer). Дайсер вовлекается в механизм процессинга дцРНК с образованием коротких участков дцРНК, известных как короткие интерферирующие РНК (киРНК) (Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). Короткие интерферирующие РНК, возникающие в результате активности фермента дайсер, содержат в типичном случае от примерно от 21 до примерно 23 нуклеотидов в длину и включают дуплекс из примерно 19 пар оснований. Дайсер также вовлекается в процесс удаления малых временных РНК длиной 21 и 22 нуклеотида (мвРНК) из молекулы РНК-предшественника с консервативной структурой, которая вовлекается в контроль трансляции (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). Реакция по типу РНКи также приводит к образованию эндонуклеазного комплекса, содержащего киРНК, известного как РНК-индуцированный молчащий комплекс (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей последовательность, гомологичную киРНК. Расщепление целевой РНК происходит в середине участка, комплементарного к ведущей последовательности дуплекса киРНК (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Дополнительно, интерференция РНК может также вовлекать молчание гена, опосредованное малой РНК (например, микроРНК или миРНК), преимущественно по механизму, который осуществляет регуляцию структуры хроматина и, в этой связи, препятствует транскрипции целевых генных последовательностей (см., например, Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237). Как таковые, молекулы киНК по настоящему изобретению могут быть использованы для опосредования подавления гена, путем взаимодействия с транскриптами РНК или, альтернативно, путем взаимодействия с определенными генными последовательностями, где такое взаимодействие приводит к подавлению гена либо на транскрипционном уровне, либо на пост-транскрипционном уровне.

Процесс РНКи исследовали на множестве различных систем. Файр с соавт. (Fire et al., 1998, Nature, 391, 806) первыми обнаружили РНКи в C. elegans. Вианни и Гетц (Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70) описали функционирующие в системах млекопитающих РНКи, опосредованные дцРНК. Хаммонд с соавт. (Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293) описали РНКи в клетках Drosophila, трансфицированных дцРНК. Элбашир с соавт. (Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494) описали РНКи, индуцированную введением дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культуры клеток млекопитающих, включающих эмбриональные клетки почки человека и клетки HeLa. Последние работы, проведенные на лизатах эмбриональных клеток Drosophila, позволили выявить ряд требований к длине киРНК, ее структуре, химическому составу и последовательности, которые являются обязательными для эффективного проявления активности РНКи. Данные исследования показали, что 21-нуклеотидные дуплексы киРНК в основном являются активными в том случае, когда они содержат два 2-нуклеотидных 3'-концевых выступающих фрагмента. Кроме того, замещение одной или обеих цепей киРНК 2'-дезокси- или 2'-О-метилнуклеотидами удаляет активность РНКи, тогда как, по результатам проведенных исследований, замещение 3'-концевых нуклеотидов киРНК 2'-дезоксинуклеотидами не устраняет активность. Далее, было показано, что ошибочные спаривания в последовательностях, расположенных в центре дуплекса киРНК, также удаляют активность РНКи. Дополнительно, проведенные исследования также показали, что положение сайта расщепления в целевой РНК определяется 5'-концом ведущей последовательности киРНК, а не 3'-концом указанной ведущей последовательности (Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877). Результаты других исследований показали, что 5'-фосфат в комплементарной цепи-мишени дуплекса киРНК необходим для осуществления активности киРНК, а также продемонстрировали, что АТФ используется для поддержания 5'-фосфатного фрагмента в киРНК (Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309); однако молекулы киРНК, не содержащие 5'-фосфат, активны при их экзогенном введении, что позволяет предположить, что 5'-фосфорилирование конструкций киРНК может происходить in vivo.

Олигонуклеотиды, образующие дуплекс (DFO) согласно настоящему изобретению

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим олигонуклеотиды, образующие дуплекс (DFO), которые могут подвергаться самосборке с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды, образующие дуплекс, согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы химически или путем экспрессии на основе единиц транскрипции и/или векторов. Молекулы DFO согласно настоящему изобретению обеспечивают наличие полезных реагентов и способов, применимых во множестве терапевтических, диагностических, сельскохозяйственных, ветеринарных направлений, для целевой валидации, при исследовании генома, в генно-инженерных манипуляциях и в варианте фармакогеномного приложения.

Автор настоящего изобретения показал, что некоторые олигонуклеотиды, обозначенные в настоящем тексте, для простоты описания, но не с целью ограничения, как олигонуклеотиды, образующие дуплекс, или молекулы DFO, являются мощными медиаторами специфичной по последовательности регуляции генной экспрессии. Олигонуклеотиды, образующие дуплекс, согласно настоящему изобретению отличаются от других известных в данной области последовательностей нуклеиновых кислот (например, киРНК, миРНК, мвРНК, кшРНК, антисмысловые олигонуклеотиды и т.п.) тем, что они представляют собой класс линейных полинуклеотидных последовательностей, сконструированных таким образом, что они становятся способны к самосборке с образованием двухцепочечных олигонуклеотидов, где каждая цепь в таких двухцепочечных олигонуклеотидах включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна молекуле целевой нуклеиновой кислоты. В этой связи, молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению способны подвергаться самосборке с образованием функциональных дуплексов, где каждая цепь указанного дуплекса включает одну и ту же полинуклеотидную последовательность и каждая цепь содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна молекуле целевой нуклеиновой кислоты.

В основном, двухцепочечные олигонуклеотиды образуются путем сборки двух различающихся олигонуклеотидных последовательностей, где олигонуклеотидная последовательность одной цепи комплементарна олигонуклеотидной последовательности второй цепи; такие двухцепочечные олигонуклеотиды собираются из двух отдельных олигонуклеотидов или на основе одной молекулы, которая складывается сама с собой с образованием двухцепочечной структуры, часто называемой как шпилечная структура со стеблевым петлевым участком (например, кшРНК или короткая шпилечная РНК). Все указанные двухцепочечные олигонуклеотиды, известные в данной области, характеризуются одной общей для них особенностью, которая заключается в том, что каждая цепь дуплекса имеет свою, отличную от других нуклеотидную последовательность.

В отличие от соответствующих методик, известных в данной области, которые используются для получения молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты, авторы изобретения разработали новый, недорогой и упрощенный способ получения молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты из одноцепочечного или линейного нуклеотида. Две цепи двухцепочечного олигонуклеотида, образованного согласно настоящему изобретению, имеют одинаковую нуклеотидную последовательность и не соединены ковалентно друг с другом. Такие молекулы двухцепочечных олигонуклеотидов могут быть легко соединены после синтеза, с использованием для этого методов и реагентов, известных в данной области и доступных любому специалисту со средним уровнем знаний для их практического применения. В одном варианте одноцепочечный олигонуклеотид согласно настоящему изобретению (олигонуклеотид, образующий дуплекс), который может образовывать двухцепочечный олигонуклеотид, включает первый участок и второй участок, где второй участок включает нуклеотидную последовательность, которая является инвертированным повтором нуклеотидной последовательности первого участка или его части, так что одноцепочечный олигонуклеотид подвергается самосборке с образованием дуплексного олигонуклеотида, где нуклеотидная последовательность одной цепи указанного дуплекса не отличается от нуклеотидной последовательности второй цепи. Не ограничивающие примеры таких олигонуклеотидов, образующих дуплекс, проиллюстрированы на фиг. 14 и 15. Указанные олигонуклеотиды, образующие дуплекс (DFO), могут необязательно включать некоторые палиндромные или повторяющиеся последовательности, где такие палиндромные или повторяющиеся последовательности присутствуют между первым участком и вторым участком DFO.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле олигонуклеотида, образующего дуплекс (DFO), где указанная молекула DFO включает самокомплементарную последовательность нуклеиновой кислоты, образуя дуплекс, где указанная нуклеотидная последовательность комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Молекула DFO может включать одну самокомплементарную последовательность или дуплекс, возникающий при сборке таких самокомплементарных последовательностей.

В одном варианте олигонуклеотид, образующий дуплекс (DFO) согласно настоящему изобретению, включает первый участок и второй участок, где второй участок включает нуклеотидную последовательность, содержащую инвертированный повтор нуклеотидной последовательности первого участка, так что молекула DFO может собираться с образованием двухцепочечного олигонуклеотида. Такие двухцепочечные олигонуклеотиды могут функционировать как короткая интерферирующая нуклеиновая кислота (киНК) в направлении модуляции экспрессии гена. Каждая цепь двухцепочечного олигонуклеотидного дуплекса, сформированного под действием молекул DFO согласно настоящему изобретению, может включать участок нуклеотидной последовательности, комплементарный той же нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле одноцепочечной DFO, которая может собираться с образованием двухцепочечного олигонуклеотида. Автор изобретения неожиданно обнаружил, что одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий нуклеотидные участки, обладающие самокомплементарностью, может легко собираться с образованием дуплексных олигонуклеотидных конструкций. Такие DFO могут подвергаться сборке с образованием дуплексов, которые способны ингибировать генную экспрессию в специфичном по последовательности режиме. Молекулы DFO согласно настоящему изобретению включают первый участок с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности второго участка, где последовательность первого участка комплементарна целевой нуклеиновой кислоте (например, РНК). Соответственно, DFO может формировать двухцепочечный олигонуклеотид, где часть каждой цепи указанного двухцепочечного олигонуклеотида включает последовательность, комплементарную последовательности целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к двухцепочечному олигонуклеотиду, где две цепи двухцепочечного олигонуклеотида не соединены ковалентно друг с другом, и где каждая цепь двухцепочечного олигонуклеотида включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна такой же нуклеотидной последовательности в молекуле целевой нуклеиновой кислоты или в ее части (например, целевой РНК). В другом варианте две цепи двухцепочечного олигонуклеотида имеют общую для них, идентичную нуклеотидную последовательность, включающую по меньшей мере примерно 15, предпочтительно по меньшей мере примерно 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид.

В одном варианте молекула DFO согласно настоящему изобретению включает структуру формулы DFO-I:

где Z включает палиндромную или повторяющуюся последовательность нуклеиновой кислоты, необязательно при наличии одного или нескольких модифицированных нуклеотидов (например, нуклеотида с модифицированным основанием, таким как 2-аминопурин, 2-амино-1,6-дигидропурин или универсальное основание), например, с длиной от примерно 2 до примерно 24 нуклеотидов с четным числом (в частности, примерно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22, или 24 нуклеотида), Х обозначает последовательность нуклеиновой кислоты с длиной, например, от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), Х' включает последовательность нуклеиновой кислоты, например, с длиной от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности Х или ее части, p включает концевую фосфатную группу, которая может присутствовать или может отсутствовать, и где последовательности X и Z, либо независимо, либо вместе, включают нуклеотидную последовательность, которая комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части и которая имеет длину, достаточную для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты или ее частью (например, целевой РНК). Так, например, Х независимо может включать последовательность, включающую в длину от примерно 12 до примерно 21 или более (например, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более) нуклеотидов, которая комплементарна нуклеотидной последовательности целевой РНК или ее части. В другом не ограничивающем примере длина нуклеотидной последовательности X и Z вместе, когда Х присутствует в ней и когда она комплементарна мишени или ее части (например, целевой РНК), составляет от примерно 12 до примерно 21 и более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более). В еще одном не ограничивающем примере, когда Х отсутствует, длина нуклеотидной последовательности Z, которая комплементарна мишени или ее части, составляет от примерно 12 до примерно 24 и более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24 или более). В одном варианте X, Z и Х' обозначают независимо олигонуклеотиды, где Х и/или Z включают нуклеотидную последовательность с длиной, достаточной для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с нуклеотидной последовательностью мишени или ее частью (например, целевой РНК). В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и Z или Z и X', или X, Z и X' либо идентичны, либо различаются.

В том случае, когда последовательность, приведенная в настоящем описании, рассматривается как имеющая «достаточную» длину для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с другой последовательностью, это означает, что ее длина такова, что числа связей (например, водородных связей), образованных между двумя последовательностями, достаточно для того, чтобы две последовательности могли сформировать дуплекс в нужных условиях. Такие условия могут представлять собой условия in vitro (например, для диагностики или для тестирования) или условия in vivo (например, для терапевтических целей). Определение такой длины представляет собой простую и стандартную процедуру.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкции двухцепочечного олигонуклеотида, имеющего формулу DFO-I(a):

где Z включает палиндромную или повторяющуюся последовательность нуклеиновой кислоты или последовательность, подобную палиндромной или повторяющейся последовательности нуклеиновой кислоты, при наличии одного или нескольких модифицированных нуклеотидов (например, нуклеотидов с модифицированным основанием, таким как 2-аминопурин, 2-амино-1,6-дигидропурин или универсальное основание), например, с длиной от примерно 2 до примерно 24 нуклеотидов с четным числом (в частности, примерно 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 22 или 24 нуклеотида), Х обозначает последовательность нуклеиновой кислоты с длиной, например, от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), Х' включает последовательность нуклеиновой кислоты, например, с длиной от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности Х или ее части, p включает концевую фосфатную группу, которая может присутствовать или может отсутствовать, и где каждый X и Z независимо включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части (например, целевой РНК) и имеет длину, достаточную для взаимодействия с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты или ее частью (например, направленного воздействия на целевую РНК). Так, например, последовательность Х независимо может включать последовательность, включающую в длину от примерно 12 до примерно 21 или более (в частности, примерно, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более) нуклеотидов в длину, которые комплементарны нуклеотидной последовательности в мишени или ее части (например, целевой РНК). В другом не ограничивающем примере длина нуклеотидной последовательности X и Z вместе (когда Х присутствует), которая комплементарна мишени или ее части, составляет от примерно 12 до примерно 21 и более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или более). В еще одном не ограничивающем примере, когда Х отсутствует, длина нуклеотидной последовательности Z, которая комплементарна мишени или ее части, составляет от примерно 12 до примерно 24 и более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 или более). В одном варианте X, Z и Х' обозначают независимо олигонуклеотиды, где Х и/или Z включают нуклеотидную последовательность с длиной, достаточной для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с нуклеотидной последовательностью мишени или ее части (например, направленного воздействия на целевую РНК). В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и Z или Z и X', или X, Z и X' либо идентичны, либо различаются. В одном варианте конструкция двухцепочечного олигонуклеотида формулы I(а) включает одно или несколько, конкретно 1, 2, 3 или 4 ошибочных спариваний, но до определенного уровня, с тем, чтобы такие ошибочные спаривания существенно не снижали способность двухцепочечного олигонуклеотида ингибировать экспрессию целевого гена.

В одном варианте молекула DFO согласно настоящему изобретению включает структуру формула DFO-II:

где каждый X и X' обозначает независимо олигонуклеотиды с длиной от примерно 12 до примерно 21 нуклеотида, где Х включает, например, последовательность нуклеиновой кислоты с длиной от примерно 12 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), Х' включает последовательность нуклеиновой кислоты, с длиной, например, от примерно 12 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности Х или ее части, p включает концевую фосфатную группу, которая может присутствовать или может отсутствовать, и где X включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК) или ее части и имеет длину, достаточную для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты или ее частью. В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' достаточны для образования относительно стабильного двухцепочечного олигонуклеотида.

В одном варианте настоящее изобретение относится к конструкции двухцепочечного олигонуклеотида, имеющего формулу DFO-II(а):

где каждый X и X' обозначает независимо олигонуклеотиды с длиной от примерно 12 нуклеотидов до примерно 21 нуклеотида, где Х включает последовательность нуклеиновой кислоты, например, с длиной от примерно 12 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), Х' включает последовательность нуклеиновой кислоты, например, с длиной от примерно 12 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную к последовательности Х или ее части, p включает концевую фосфатную группу, которая может присутствовать или может отсутствовать, и где X включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна к последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК) или ее части и имеет длину, достаточную для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с последовательностью целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК) или ее частью. В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' достаточны для образования относительно стабильного двухцепочечного олигонуклеотида. В одном варианте конструкция двухцепочечного олигонуклеотида формулы II(а) включает одно или несколько, конкретно 1, 2, 3 или 4 ошибочных спаривания, но до определенного уровня, с тем, чтобы такие ошибочные спаривания существенно не снижали способность двухцепочечного олигонуклеотида ингибировать экспрессию целевого гена.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле DFO, имеющей формулу DFO-I(b):

где Z включает палиндромную или повторяющуюся последовательность нуклеиновой кислоты, которая необязательно включает один или несколько нестандартных или модифицированных нуклеотидов (например, нуклеотид с модифицированным основанием, таким как 2-аминопурин или универсальное основание), которые могут облегчать спаривание по основаниям с другими нуклеотидами. Z может иметь длину, например, достаточную для взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с молекулой целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК), которая предпочтительно имеет длину, равную по меньшей мере 12 нуклеотидам, конкретно от примерно 12 до примерно до примерно 24 нуклеотидов (в частности, примерно 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 24 нуклеотида). Параметр p представляет концевую фосфатную группу, которая может присутствовать или может отсутствовать.

В одном варианте молекула DFO, описываемая любой из формул DFO-I, DFO-I(a), DFO-I(b), DFO-II(a) или DFO-II, может включать химические модификации согласно настоящему описанию, такие как, например, нуклеотиды, описываемые любой из формул I-VII, стабилизационные химические структуры, приведенные в таблице I, или любое другое сочетание модифицированных нуклеотидов и фрагментов ненуклеотидной природы, описанных в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.

В одном варианте палиндромная или повторяющаяся последовательность или модифицированный нуклеотид (например, нуклеотид с модифицированным основанием, таким как 2-аминопурин или универсальное основание), в Z в составе конструкции DFO, описываемой формулами DFO-I, DFO-I(a) и DFO-I(b), включает химически модифицированные нуклеотиды, которые способны взаимодействовать с частью последовательности целевой нуклеиновой кислоты (например, включает модифицированные аналоги оснований, которые могут образовывать пары оснований, соответствующие или не соответствующие правилу Уотсона-Крика).

В одном варианте молекула DFO согласно настоящему изобретению, например DFO, описываемая формулами DFO-I или DFO-II, включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов в длину (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40). В одном варианте молекула DFO согласно настоящему изобретению включает одну или несколько химических модификаций. В рамках не ограничивающего примера, введение химически модифицированных нуклеотидов и/или фрагментов ненуклеотидной природы в молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению обеспечивают мощный инструмент, позволяющий преодолеть потенциальное ограничение по стабильности и биодоступности in vivo, характерное для молекул немодифицированных РНК, доставляемых экзогенно. Так, например, использование молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты может позволить снизить дозу конкретных молекул нуклеиновой кислоты для достижения нужного терапевтического эффекта, поскольку молекулы химически модифицированной нуклеиновой кислоты имеют в основном более продолжительный период пребывания в сыворотке или в клетках, или в тканях организма. Кроме того, некоторые химические модификации могут улучшать биодоступность и/или активность молекул нуклеиновой кислоты не только за счет повышения периода полувыведения, но также за счет того, что они способствуют более точному воздействию молекул нуклеиновой кислоты на конкретные органы, клетки или ткани и/или за счет повышения поступления молекул нуклеиновой кислоты в клетки. В этой связи, даже если активность молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты in vitro ниже, чем у молекулы нативной/немодифицированной нуклеиновой кислоты, например, при сравнении ее с молекулой немодифицированной РНК, то общая активность молекулы модифицированной нуклеиновой кислоты нуклеиновой будет выше, чем активность молекулы нативной или немодифицированной нуклеиновой кислоты за счет ее повышенной стабильности, а также эффективности действия, длительности эффекта, биодоступности и/или точности доставки молекулы.

Полифункциональные или многоцелевые молекулы киНК согласно настоящему изобретению

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекулам киНК, включающим молекулы полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК), которые модулируют экспрессию одного или нескольких целевых генов в биологической системе, такой как клетка, ткань или организм. Молекулы полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК) согласно настоящему изобретению могут направленно воздействовать более чем на один участок в последовательности целевой нуклеиновой кислоты или могут направленно воздействовать на последовательности более чем одной отдельной нуклеиновой кислоты (например, могут воздействовать на целевые последовательности и/или последовательности целевой РНК метаболического пути, и/или последовательности ДНК). Молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению могут быть химически синтезированы или экспрессированы на основе единиц транскрипции и/или векторов. Молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению обеспечивают наличие полезных реагентов и способов для множества приложений, имеющих отношение к лечению и диагностике человека, в сельском хозяйстве, ветеринарии, для целевой валидации, для исследования генома, в генетических манипуляциях и в фармакогеномных исследованиях.

Заявитель продемонстрировал в данном изобретении, что некоторые олигонуклеотиды, называемые в настоящем тексте для удобства, но не с целью ограничения, как молекулы полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты или молекулы полифункциональной киНК, являются мощными медиаторами специфичной по последовательности регуляции генной экспрессии. Молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению отличаются от других, известных в данной области последовательностей нуклеиновой кислоты (например, киРНК, миРНК, мвРНК, кшРНК, антисмысловых олигонуклеотидов и т.п.) тем, что они представляют собой класс полинуклеотидных молекул, сконструированных таким образом, что каждая цепь в конструкции полифункциональной киНК включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна другой последовательности нуклеиновой кислоты в одной или нескольких молекулах целевой нуклеиновой кислоты. Таким образом, молекула одной полифункциональной киНК (в основном, двухцепочечная молекула) согласно настоящему изобретению может оказывать направленное воздействие на молекулы более чем одной (например, 2, 3, 4, 5 или более) различающихся целевых нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут также оказывать направленное воздействие более чем на один (2, 3, 4, 5 или более) участок одной и той же последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, такие молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению будут полезны при осуществлении отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии молекул одной или нескольких целевых нуклеиновых кислот. В связи со способностью конструкций полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению вызывать снижение или ингибирование экспрессии молекул более чем одной целевой нуклеиновой кислоты, указанные молекулы полифункциональной киНК могут рассматриваться как класс мощных терапевтических агентов, которые могут обеспечить одновременное ингибирование множества мишеней на пути, связанном с развитием заболевания (например, ингибирование ангиогенного механизма). Такое одновременное ингибирование может обеспечивать синергический терапевтический эффект, где будет отсутствовать необходимость разделять доклинические и клинические испытания или усложненный процесс регистрационных исследований.

Как ожидается, использование молекул полифункциональной киНК, которые воздействуют более чем на один участок молекулы целевой нуклеиновой кислоты (например, на целевую РНК или ДНК), будет обеспечивать мощное ингибирование генной экспрессии. Например, конструкция на основе одной полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению может воздействовать и на консервативные, и на вариабельные участки молекулы целевой нуклеиновой кислоты (например, на целевые РНК или ДНК), позволяя тем самым осуществлять отрицательную регуляцию или ингибирование, например, разных целевых изоформ или вариантов для оптимизации терапевтической эффективности и минимизации токсичности, или для достижения целевого воздействия и на кодирующий, и на некодирующий участки молекулы целевой нуклеиновой кислоты.

В основном, двухцепочечные олигонуклеотиды получают путем сборки двух разных олигонуклеотидов, где олигонуклеотидная последовательность одной цепи комплементарна олигонуклеотидной последовательности второй цепи; такие двухцепочечные олигонуклеотиды в основном собираются из двух отдельных олигонуклеотидов (например, киРНК). Альтернативно, дуплекс может быть сформирован на основе одной молекулы, которая складывается сама с собой (например, кшРНК - короткая шпилечная РНК). В данной области известно, что указанные двухцепочечные олигонуклеотиды опосредуют интерференцию РНК и имеют общее свойство, заключающееся в том, что только один участок нуклеотидной последовательности (ведущая последовательность или антисмысловая последовательность) обладает комплементарностью к последовательности целевой нуклеиновой кислоты, а другая цепь (смысловая последовательность) включает нуклеотидную последовательность, которая гомологична последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В основном, антисмысловая последовательность содержится в активном комплексе RISC и направляет RISC на целевую нуклеотидную последовательность за счет комплементарного спаривания по основаниям антисмысловой последовательности с целевой последовательностью, участвуя, таким образом, в специфичной по последовательности интерференции РНК. В данной области известно, что в некоторых клеточных культурах некоторые типы немодифицированных киРНК могут демонстрировать так называемые «нецелевые» эффекты. Имеется гипотеза, согласно которой такой нецелевой эффект вовлекает участие в комплексе RISC смысловой последовательности вместо антисмысловой последовательности киРНК (см., например, Schwarz et al., 2003, 115, 199-208). В этом случае считается, что смысловая последовательность направляет комплекс RISC на последовательность (нецелевая последовательность), которая отличается от требуемой целевой последовательности, что приводит к ингибированию нецелевой последовательности. В случае таких молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты, каждая цепь комплементарна последовательности другой целевой нуклеиновой кислоты. Однако нецелевые мишени, которые подвергаются воздействию таких дцРНК, невозможно полностью предсказать, и они неспецифичны.

В отличие от известного в данной области подхода на основе молекул двухцепочечных нуклеиновых кислот, авторы разработали новый, потенциально рентабельный и упрощенный способ отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии более чем одной целевой последовательности нуклеиновой кислоты с использованием одной конструкции полифункциональной киНК. Указанные молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению разработаны как двухцепочечные или частично двухцепочечные молекулы, таким образом, что каждая часть цепи или участок полифункциональной киНК комплементарны выбранной последовательности целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению не ограничены целевыми последовательностями, которые комплементарны друг другу, но, скорее, относятся к любым двум различным целевым последовательностям нуклеиновой кислоты. Молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению разработаны таким образом, что каждая цепь или участок молекулы полифункциональной киНК, которая комплементарна данной последовательности целевой нуклеиновой кислоты, имеет определенную длину (в частности, от примерно 16 до примерно 28 нуклеотидов в длину, предпочтительно от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов в длину), с тем, чтобы она могла участвовать в интерференции РНК против целевой последовательности нуклеиновой кислоты. Комплементарность между целевой последовательностью нуклеиновой кислоты и цепью или участком полифункциональной киНК должна быть достаточной (включать по меньшей мере 8 пар оснований) для расщепления целевой последовательности нуклеиновой кислоты в процессе интерференции РНК. Как ожидается, полифункциональная киРНК согласно настоящему изобретению будет действовать в направлении минимизации нецелевых эффектов, наблюдаемых в случае некоторых последовательностей киРНК, таких как эффекты, описанные в работе Шварца с соавт. (Schwarz et al., выше).

Ранее сообщалось, что дцРНК с длиной от 29 пар оснований до 36 пар оснований (Tuschl et al., Международная PCT публикация № WO 02/44321) не вовлекаются в процесс РНКи. Одной из причин, объясняющих, почему указанные дцРНК не активны, может быть метаболическая недостаточность или диссоциация цепи, которая должна взаимодействовать с целевой последовательностью РНК, так что RISC комплекс уже становится неспособным эффективно взаимодействовать с множеством копий целевой РНК, что приводит к значительному снижению потенциала и эффективности процесса РНКи. Заявитель неожиданно обнаружил, что полифункциональные киНК согласно настоящему изобретению могут позволить преодолеть эту сложную проблему и, соответственно, повысить эффективность и потенциал процесса РНКи. Так, в рамках некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения, могут быть сконструированы полифункциональные киНК с длиной от примерно 29 до примерно 36 пар оснований, таким образом, что часть каждой цепи молекулы полифункциональной киНК включает участок нуклеотидной последовательности, который комплементарен последовательности целевой нуклеиновой кислоты, имеющей длину, достаточную для эффективного участия в РНКи (например, содержит от примерно 15 до примерно 23 пар оснований), и включающей участок нуклеотидной последовательности, который не комплементарен целевой нуклеиновой кислоте. В связи с наличием и комплементарного, и некомплементарного участков в каждой цепи полифункциональной киНК, указанная полифункциональная киНК может опосредовать интерференцию РНК против целевой последовательности нуклеиновой кислоты, независимо от соответствия требованиям относительного уровня метаболической активности или наличия диссоциации (например, в том случае, когда длина каждой цепи слишком велика для участия в РНКи против целевой последовательности соответствующей нуклеиновой кислоты). Кроме того, архитектура молекул полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению, включающая внутренние перекрывающиеся участки, позволяет молекулам полифункциональной киНК иметь размер, благоприятный (то есть сниженный) для участия в интерференции РНК и для использования в качестве терапевтического агента (например, в том случае, когда каждая цепь включает независимо от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов в длину). Не ограничивающие примеры проиллюстрированы на фиг. 16-28.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает первый участок и второй участок, где первый участок полифункциональной киНК включает нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты молекулы первой целевой нуклеиновой кислоты, и второй участок полифункциональной киНК включает последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты молекулы второй целевой нуклеиновой кислоты. В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает первый участок и второй участок, где первый участок полифункциональной киНК включает нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты первого участка молекулы целевой нуклеиновой кислоты, и второй участок полифункциональной киНК включает нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности нуклеиновой кислоты второго участка молекулы целевой нуклеиновой кислоты. В другом варианте первый участок и второй участок полифункциональной киНК может включать последовательности отдельных нуклеиновых кислот, которые имеют некоторую степень комплементарности (например, от примерно 1 до примерно 10 комплементарных нуклеотидов). В некоторых вариантах конструкции полифункциональной киНК, включающие последовательности отдельных нуклеиновых кислот, могут быть легко объединены после синтеза с использованием методов или агентов, известных в данной области, и такие объединенные конструкции также входят в область настоящего изобретения. Альтернативно, первый участок и второй участок полифункциональной киНК могут включать последовательность одной нуклеиновой кислоты, обладающую некоторой степенью самокомплементарности, например, в случае шпилечной структуры или структуры стеблевой петли. Не ограничивающие примеры таких двухцепочечных и шпилечных полифункциональных коротких интерферирующих нуклеиновых кислот приведены на фиг. 16 и 17, соответственно. Указанные полифункциональные короткие интерферирующие нуклеиновые кислоты (полифункциональные киНК) могут необязательно включать некоторое перекрытие по нуклеотидной последовательности, где такие перекрывающиеся нуклеотидные последовательности присутствуют между первым участком и вторым участком полифункциональной киНК (см., например, фиг. 18 и 19).

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК), где каждая цепь указанной полифункциональной киНК независимо включает первый участок последовательности нуклеиновой кислоты, который комплементарен целевой последовательности отдельной нуклеиновой кислоты, и второй участок нуклеотидной последовательности, который не комплементарен целевой последовательности. Целевая последовательность каждой цепи нуклеиновой кислоты находится в молекуле одной и той же целевой нуклеиновой кислоты или в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот.

В другом варианте полифункциональная киНК включает две цепи, где: (а) первая цепь включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к целевой последовательности нуклеиновой кислоты (комплементарный участок 1), и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности (некомплементарный участок 1); (b) вторая цепь полифункциональной киНК включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, который отличается от целевой нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности первой цепи (комплементарный участок 2), и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности комплементарного участка 2 (некомплементарный участок 2); (с) комплементарный участок 1 первой цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 2 второй цепи, и комплементарный участок 2 второй цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 1 первой цепи. Целевая последовательность нуклеиновой кислоты в комплементарном участке 1 и в комплементарном участке 2 находится в молекуле одной той же целевой нуклеиновой кислоты или в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот.

В другом варианте полифункциональная киНК включает две цепи, где: (а) первая цепь включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, полученной из гена (например, первого гена) (комплементарный участок 1), и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности комплементарного участка 1 (некомплементарный участок 1); (b) вторая цепь полифункциональной киНК включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, полученной из гена (например, второго гена), который отличается от гена для комплементарного участка 1 (комплементарный участок 2), и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности комплементарного участка 2 (некомплементарный участок 2); (с) комплементарный участок 1 первой цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 2 второй цепи, и комплементарный участок 2 второй цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 1 первой цепи.

В другом варианте полифункциональная киНК включает две цепи, где: (а) первая цепь включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к последовательности целевой нуклеиновой кислоты, полученной из гена (например, первого гена) (комплементарный участок 1), и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности комплементарного участка 1 (некомплементарный участок 1); (b) вторая цепь полифункциональной киНК включает участок, обладающий комплементарностью по последовательности к целевой последовательности нуклеиновой кислоты, которая отличается от последовательности целевой нуклеиновой кислоты комплементарного участка 1 (комплементарный участок 2), при условии, однако, что и целевая последовательность нуклеиновой кислоты для комплементарного участка 1, и целевая последовательность нуклеиновой кислоты для комплементарного участка 2 были получены из одного и того же гена, и участок, не обладающий комплементарностью по последовательности к целевой нуклеотидной последовательности комплементарного участка 2 (некомплементарный участок 2); (с) комплементарный участок 1 первой цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 2 второй цепи, и комплементарный участок 2 второй цепи включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности в некомплементарном участке 1 первой цепи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК), где указанная полифункциональная киНК включает две комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты, где первая последовательность включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в молекуле первой целевой нуклеиновой кислоты, и где вторая последовательность включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную к другой нуклеотидной последовательности в молекуле той же целевой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, первый участок первой последовательности также комплементарен к нуклеотидной последовательности второго участка второй последовательности, и где первый участок второй последовательности комплементарен нуклеотидной последовательности второго участка первой последовательности.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК), где указанная полифункциональная киНК включает две комплементарные последовательности нуклеиновой кислоты, где первая последовательность включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную к нуклеотидной последовательности в молекуле первой целевой нуклеиновой кислоты, и где вторая последовательность включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную другой нуклеотидной последовательности в молекуле второй целевой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, первый участок первой последовательности также комплементарен к нуклеотидной последовательности второго участка второй последовательности, и где первый участок второй последовательности комплементарен нуклеотидной последовательности второго участка первой последовательности.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле полифункциональной киНК, включающей первый участок и второй участок, где первый участок включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов, комплементарную к последовательности нуклеиновой кислоты в молекуле первой целевой нуклеиновой кислоты, и где второй участок включает нуклеотидную последовательность, содержащую от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов, комплементарную к другой последовательности нуклеиновой кислоты в молекуле второй целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле полифункциональной киНК, включающей первый участок и второй участок, где первый участок включает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов, комплементарную к последовательности нуклеиновой кислоты в молекуле целевой нуклеиновой кислоты, и где второй участок включает нуклеотидную последовательность, содержащую от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов, комплементарную к другой последовательности нуклеиновой кислоты в молекуле той же целевой нуклеиновой кислоты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекуле двухцепочечной полифункциональной короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (полифункциональной киНК), где одна цепь полифункциональной киНК включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты, и где вторая цепь включает первый участок, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты. При этом первая и вторая последовательности целевой нуклеиновой кислоты могут присутствовать в молекулах отдельных целевых нуклеиновых кислот или могут представлять собой разные участки в молекуле одной и той же целевой нуклеиновой кислоты. Соответственно, молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться для направленного воздействия на экспрессию разных генов, сплайсинг-вариантов одного и того же гена, мутантных и консервативных участков одного или нескольких генных транскриптов или как кодирующих, так и некодирующих последовательностей одинаковых или разных генов или генных транскриптов.

В одном варианте молекула целевой нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению кодирует один белок. В другом варианте молекула целевой нуклеиновой кислоты кодирует более чем один белок (например, 1, 2, 3, 4, 5 или более белков). Соответственно, конструкция полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению может использоваться для отрицательной регуляции или ингибирования экспрессии нескольких белков. Так, например, молекула полифункциональной киНК, включающая участок в одной цепи, который имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную к первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты, полученной из мишени, и вторая цепь которой включает участок с нуклеотидной последовательностью, комплементарной ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующей в молекулах целевой нуклеиновой кислоты для генов, кодирующих два белка (например, два разных белка), может использоваться для отрицательной регуляции, ингибирования или закрытия конкретного биологического пути путем направленного воздействия на множественные гены целевого пути.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения используется преимущество консервативных нуклеотидных последовательностей, присутствующих в разных генных вариантах. При конструировании полифункциональных киНК таким образом, что одна цепь включает последовательность, которая комплементарна одной или нескольким целевым последовательностям нуклеиновой кислоты, которые сохранены среди разных представителей целевого генного семейства, а другая цепь необязательно включает последовательность, которая комплементарна последовательности целевой нуклеиновой кислоты в рамках некоторого метаболического пути, становится возможным, с использованием одной полифункциональной киНК, селективно и эффективно ингибировать целевой ген, который связан с заболеванием, протекающим через определенный биологический путь.

В одном варианте полифункциональная короткая интерферирующая нуклеиновая кислота (полифункциональная киНК) согласно настоящему изобретению включает первый участок и второй участок, где первый участок включает нуклеотидную последовательность, комплементарную первой целевой РНК первой мишени, и второй участок включает нуклеотидную последовательность, комплементарную второй целевой РНК второй мишени. В одном варианте первый и второй участки могут включать нуклеотидную последовательность, комплементарную общим или консервативным последовательностям РНК или разных целевых сайтов в одной целевой последовательности или в общем участке для разных целевых последовательностей.

В одном варианте молекула двухцепочечной полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает структуру формулы MF-1:

где каждый 5'-p-XZX'-3 и 5'-р-YZY'-3' независимо обозначает олигонуклеотид с длиной от примерно 20 нуклеотидов до примерно 300 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 20 до примерно 200 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 40 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 40 нуклеотидов, от примерно 24 до примерно 38 нуклеотидов или от примерно 26 до примерно 38 нуклеотидов; XZ включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты; YZ обозначает олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты; Z включает нуклеотидную последовательность с длиной от примерно 1 до примерно 24 нуклеотидов (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотида), которая является самокомплементарной; Х включает нуклеотидную последовательность с длиной от примерно 1 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно, от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y'; Y включает нуклеотидную последовательность с длиной от примерно 1 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Х'; каждый p включает концевую фосфатную группу, которая может независимо присутствовать или может отсутствовать; каждый ХZ и YZ имеет независимо длину, достаточную для стабильного взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с первой и второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, соответственно, или с их частью. Так, например, каждая последовательность Х и Y может независимо включать последовательность, содержащую от примерно 12 до примерно 21 или более нуклеотидов в длину (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 нуклеотид или более), которая комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в молекулах других целевых нуклеиновых кислот, таких как целевые РНК или их части. В другом не ограничивающем примере совместная длина нуклеотидной последовательности X и Z, которая комплементарна первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты или ее части, составляет от примерно 12 до примерно 21 или более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 нуклеотид или более). В другом не ограничивающем примере совместная длина нуклеотидной последовательности Y и Z, которая комплементарна второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты или ее части, составляет от примерно 12 до примерно 21 или более нуклеотидов (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 нуклеотид или более). В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекуле одной целевой нуклеиновой кислоты (например, в целевой РНК или в РНК целевого биологического пути). В другом варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот (например, в целевой РНК или в РНК целевого биологического пути). В одном варианте Z включает палиндромную или повторяющуюся последовательность. В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В одном варианте длины олигонуклеотидов Y и Y' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов Y и Y' не идентичны. В одном варианте конструкция двухцепочечного олигонуклеотида формулы I(а) включает одно или несколько, конкретно 1, 2, 3 или 4 ошибочных спаривания, до такого уровня, когда имеющиеся ошибочные спаривания существенно не снижают способность двухцепочечного олигонуклеотида ингибировать экспрессию целевого гена.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает структуру формулы MF-II:

где каждый 5'-p-XX'-3 и 5'-р-YY'-3' независимо обозначает олигонуклеотид с длиной от примерно 20 нуклеотидов до примерно 300 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 20 до примерно 200 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 100 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 40 нуклеотидов, от примерно 20 до примерно 40 нуклеотидов, от примерно 24 до примерно 38 нуклеотидов или от примерно 26 до примерно 38 нуклеотидов; X включает последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна первой целевой последовательности нуклеиновой кислоты; Y обозначает олигонуклеотид, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, которая комплементарна ко второй целевой последовательности нуклеиновой кислоты; Х включает нуклеотидную последовательность с длиной от примерно 1 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), которая комплементарна к нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y'; Y включает нуклеотидную последовательность с длиной от примерно 1 до примерно 100 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 1 до примерно 21 нуклеотида (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотид), которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Х'; каждый p включает концевую фосфатную группу, которая может независимо присутствовать или может отсутствовать; каждый Х и Y имеет независимо длину, достаточную для стабильного взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с первой и второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, соответственно, или с их частью. Так, например, каждая последовательность Х и Y может независимо включать последовательность, содержащую от примерно 12 до примерно 21 или более нуклеотидов в длину (в частности, примерно 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 нуклеотид или более), которая комплементарна целевой нуклеотидной последовательности в молекулах других целевых нуклеиновых кислот, таких как целевые РНК или их часть. В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекуле одной целевой нуклеиновой кислоты (например, в целевой РНК или в РНК целевого биологического пути). В другом варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот (например, в целевой РНК или в РНК целевого биологического пути). В одном варианте Z включает палиндромную или повторяющуюся последовательность. В одном варианте длины олигонуклеотидов X и X' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов X и X' не идентичны. В одном варианте длины олигонуклеотидов Y и Y' идентичны. В другом варианте длины олигонуклеотидов Y и Y' не идентичны. В одном варианте конструкция двухцепочечного олигонуклеотида формулы I(а) включает одно или несколько, конкретно 1, 2, 3 или 4 ошибочных спаривания, до такого уровня, когда имеющиеся ошибочные спаривания существенно не снижают способность двухцепочечного олигонуклеотида ингибировать экспрессию целевого гена.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает структуру формулы MF-III:

где каждый X, X', Y и Y' независимо обозначает олигонуклеотид с длиной от примерно 15 нуклеотидов до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 18 до примерно 40 нуклеотидов или от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов; X включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y'; Х' включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y; каждый X и Х' имеет независимо длину, достаточную для стабильного взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с первой и второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, соответственно, или их частью; W обозначает нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который соединяет последовательности Y' и Y; и полифункциональная киНК направляет расщепление первой и второй целевой последовательности через интерференцию РНК. В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекуле одной и той же целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК или РНК целевого метаболического пути). В другом варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот (например, целевой РНК или РНК целевого метаболического пути). В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х'. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y'. В одном варианте участок W соединяет последовательности Y и Y' через биодеградируемый линкер. В одном варианте W также включает конъюгат, метку, аптамер, лиганд, липид или полимер.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает структуру формулы MF-IV:

где каждый X, X', Y и Y' независимо обозначает олигонуклеотид с длиной от примерно 15 нуклеотидов до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 18 до примерно 40 нуклеотидов или от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов; X включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y'; Х' включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y; каждый Y и Y' имеет независимо длину, достаточную для стабильного взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с первой и второй целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, соответственно, или их частью; W обозначает нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который соединяет последовательность Y' и Y; и полифункциональная киНК направляет расщепление первой и второй целевой последовательности через интерференцию РНК. В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекуле одной и той же целевой нуклеиновой кислоты. В другом варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты присутствуют в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот. В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х'. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y'. В одном варианте участок W соединяет последовательности Y и Y' через биодеградируемый линкер. В одном варианте W также включает конъюгат, метку, аптамер, лиганд, липид или полимер.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает структуру формулы MF-V:

где каждый X, X', Y и Y' независимо обозначает олигонуклеотид с длиной от примерно 15 нуклеотидов до примерно 50 нуклеотидов, предпочтительно от примерно 18 до примерно 40 нуклеотидов или от примерно 19 до примерно 23 нуклеотидов; X включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y'; Х' включает нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности, присутствующей на участке Y; каждый Х, Х', Y и Y' имеет независимо длину, достаточную для стабильного взаимодействия (например, для спаривания по основаниям) с первой, второй, третьей или четвертой целевой последовательностью нуклеиновой кислоты, соответственно, или их частью; W обозначает нуклеотидный или ненуклеотидный линкер, который соединяет последовательности Y' и Y; и полифункциональная киНК направляет расщепление первой, второй, третьей и/или четвертой целевой последовательности нуклеиновой кислоты через интерференцию РНК. В одном варианте все целевые последовательности нуклеиновой кислоты: первая, вторая, третья и четвертая, присутствуют в молекуле одной и той же целевой нуклеиновой кислоты (например, целевой РНК или участок метаболического пути целевой РНК). В другом варианте первая, вторая, третья и четвертая целевые последовательности нуклеиновой кислоты независимо присутствуют в молекулах разных целевых нуклеиновых кислот (например, целевой РНК или РНК целевого метаболического пути). В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 3'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 5'-концом последовательности Y. В одном варианте участок W соединяет 5'-конец последовательности Y' с 3'-концом последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Х'. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y. В одном варианте концевая фосфатная группа присутствует на 5'-конце последовательности Y'. В одном варианте участок W соединяет последовательности Y и Y' через биодеградируемый линкер. В одном варианте W также включает конъюгат, метку, аптамер, лиганд, липид или полимер.

В одном варианте участки X и Y молекулы полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению (то есть имеющие любую из формул MF-I-MF-V) комплементарны разным целевым последовательностям нуклеиновой кислоты, которые представляют собой части одной и той же молекулы целевой нуклеиновой кислоты. В одном варианте указанные целевые последовательности нуклеиновой кислоты находятся в разных положениях в составе кодирующего участка транскрипта РНК. В одном варианте такие целевые последовательности нуклеиновой кислоты включают кодирующие и некодирующие участки одного транскрипта РНК. В одном варианте такие целевые последовательности нуклеиновой кислоты включают участки транскриптов, полученных при альтернативном сплайсинге, или предшественников таких транскриптов, полученных в результате альтернативного сплайсинга.

В одном варианте молекула полифункциональной киНК, описываемая любой из формул MF-I-MF-V, может включать химические модификации согласно настоящему описанию, которые охватывают, без ограничения, такие модификации, как, например, нуклеотиды, описываемые любой из приведенных формул I-VII, стабилизирующие химические структуры, приведенные в таблице I, или любые другие сочетания модифицированных нуклеотидов и фрагментов ненуклеотидной природы, описанные в разных вариантах настоящей заявки.

В одном варианте палиндромная или повторяющаяся последовательность или модифицированный нуклеотид (например, нуклеотид с модифицированным основанием, таким как 2-аминопурин или универсальное основание) во фрагменте Z в конструкциях полифункциональной киНК, описываемых формулами MF-I или MF-II, включают химически модифицированные нуклеотиды, которые способны взаимодействовать с частью целевой последовательности нуклеиновой кислоты (например, с модифицированными аналогами оснований, которые могут формировать пары оснований соответствующих и не соответствующих правилу Уотсона-Крика).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, в молекуле полифункциональной киНК каждая цепь, например, в полифункциональной киНК, описываемой формулами MF-I-MF-V, независимо включает от примерно 15 до примерно 40 нуклеотидов (в частности, примерно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов). В одном варианте молекула полифункциональной киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько химических модификаций. В не ограничивающем примере введение в молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению химически модифицированных нуклеотидов и/или фрагментов ненуклеотидной природы обеспечивает мощный инструмент, позволяющий преодолеть потенциальные ограничения, свойственные молекулам немодифицированных РНК, которые доставляются экзогенно, применительно к их стабильности и биодоступности in vivo. Так, например, использование молекул химически модифицированной нуклеиновой кислоты позволяет снизить дозу конкретной молекулы нуклеиновой кислоты для достижения требуемого терапевтического эффекта, поскольку молекулы химически модифицированной нуклеиновой кислоты в основном имеют более длительный период пребывания в сыворотке или в клетках, или тканях. Кроме того, некоторые химические модификации могут повышать биодоступность и/или эффективность молекул нуклеиновой кислоты не только за счет повышения периода полувыведения их из организма, но также за счет того, что способствуют направленному воздействию молекул нуклеиновой кислоты на конкретные органы, клетки или ткани, и/или за счет повышения поступления молекул нуклеиновой кислоты в клетки. В этой связи, даже если активность молекулы химически модифицированной нуклеиновой кислоты снижена in vitro, в сравнении с молекулой нативной/немодифицированной нуклеиновой кислоты, например, при сравнении с молекулой немодифицированной РНК, то общая активность молекулы модифицированной нуклеиновой кислоты все равно будет выше, чем у молекулы нативной/немодифицированной нуклеиновой кислоты за счет повышенной стабильности, эффективности, длительности эффекта, биодоступности и/или более точной доставки молекул.

В другом варианте настоящее изобретение относится к полифункциональной киНК, где указанную полифункциональную киНК получают путем сборки из двух отдельных двухцепочечных киНК, с присоединением одного из концов каждой смысловой цепи к концу смысловой цепи другой молекулы киНК, так что две антисмысловые цепи киНК подвергаются отжигу до образования соответствующей смысловой цепи, в которой они соединены друг с другом по одному концу (см. фиг. 22). Соединяющие участки или линкеры могут представлять собой линкеры нуклеотидной природы или линкеры ненуклеотидной природы, известные в данной области и приведенные в настоящем описании.

В одном варианте настоящее изобретение относится к полифункциональной киНК, где указанную полифункциональную киНК получают путем сборки из двух отдельных двухцепочечных киНК, где 5'-конец одной антисмысловой цепи киНК присоединяют к 3'-концу антисмысловой цепи другой молекулы киНК, так что 5'-конец одной из смысловых цепей киНК отжигается до смысловой цепи, соответствующей данной антисмысловой цепи, в которой они присоединены друг к другу по одному концу, «лицом» к 3'-концу другой смысловой цепи (см. фиг. 22(G-H)). В одном варианте связь между 5'-концом первой антисмысловой цепи и 3'-концом второй антисмысловой цепи конструируется таким образом, чтобы она была легко расщепляемой (например, в случае биодеградируемого линкера), так чтобы 5'-конец каждой антисмысловой цепи в полифункциональной киНК имел свободный 5'-конец, подходящий для участия в расщеплении целевой РНК, опосредованном интерференцией РНК. Соединяющие группы или линкеры могут представлять собой линкеры нуклеотидной природы или линкеры ненуклеотидной природы, известные в данной области и приведенные в настоящем описании.

В одном варианте настоящее изобретение относится к полифункциональной киНК, где указанную полифункциональную киНК получают путем сборки из двух отдельных двухцепочечных киНК, где 5'-конец одной антисмысловой цепи киНК присоединяют к 5'-концу антисмысловой цепи другой молекулы киНК, так что 3'-конец одной из смысловых цепей киНК отжигается до смысловой цепи, соответствующей данной антисмысловой цепи, в которой они присоединены друг к другу по одному концу, «лицом» к 3'-концу другой смысловой цепи (см. фиг. 22(Е)). В одном варианте связь между 5'-концом первой антисмысловой цепи и 5'-концом второй антисмысловой цепи конструируется таким образом, чтобы она была легко расщепляемой (например, в случае биодеградируемого линкера), так чтобы 5'-конец каждой антисмысловой цепи в полифункциональной киНК имел свободный 5'-конец, подходящий для участия в расщеплении целевой РНК, опосредованном интерференцией РНК. Соединяющие группы или линкеры могут представлять собой линкеры нуклеотидной природы или линкеры ненуклеотидной природы, известные в данной области и приведенные в настоящем описании.

В одном варианте настоящее изобретение относится к полифункциональной киНК, где указанную полифункциональную киНК получают путем сборки из двух отдельных двухцепочечных киНК, где 3'-конец одной антисмысловой цепи киНК присоединяют к 3'-концу антисмысловой цепи другой молекулы киНК, так что 5'-конец одной из смысловых цепей киНК отжигается до смысловой цепи, соответствующей данной антисмысловой цепи, в которой они присоединены друг к другу по одному концу, «лицом» к 3'-концу другой смысловой цепи (см. фиг. 22(F)). В одном варианте связь между 5'-концом первой антисмысловой цепи и 5'-концом второй антисмысловой цепи конструируется таким образом, чтобы она была легко расщепляемой (например, в случае биодеградируемого линкера), так чтобы 5'-конец каждой антисмысловой цепи в полифункциональной киНК имел свободный 5'-конец, подходящий для участия в расщеплении целевой РНК, опосредованном интерференцией РНК. Соединяющие группы или линкеры могут представлять собой линкеры нуклеотидной природы или линкеры ненуклеотидной природы, известные в данной области и приведенные в настоящем описании.

В любом из описанных выше вариантов первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты или вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты могут независимо включать целевую РНК, ДНК или их часть. В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой целевую РНК, целевую ДНК или их часть, и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой целевую РНК, целевую ДНК или их часть. В одном варианте первая целевая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой целевую РНК, целевую ДНК или их часть, и вторая целевая последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой другую РНК, другую ДНК или их часть.

Синтез молекул нуклеиновой кислоты

Синтез нуклеиновых кислот, превышающих в длину 100 нуклеотидов, затруднен в варианте использования автоматизированных методов, так что стоимость таких молекул для терапевтического применения становится практически запретительной. В настоящем изобретении предпочтительно используются малые мотивы нуклеиновых кислот (термин «малый» относится к мотивам нуклеиновых кислот, не превышающих 100 нуклеотидов в длину, предпочтительно не более 80 нуклеотидов в длину и наиболее предпочтительно не более 50 нуклеотидов в длину, то есть это индивидуальные олигонуклеотидные последовательности киНК, синтезированные тандемно) для экзогенной доставки. Простая структура таких молекул повышает способность нуклеиновой кислоты проникать в целевые участки белка и/или структуру РНК. Репрезентативные молекулы согласно настоящему изобретению включают химически синтезированные молекулы, и другие их варианты могут быть синтезированы аналогичным образом.

Олигонуклеотиды (например, некоторые модифицированные олигонуклеотиды или части олигонуклеотидов, не содержащих рибонуклеотиды) синтезируют с использованием известных в данной области процедур, например, описанных в литературе (Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson et al., Международная PCT публикация № WO 99/54459, Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods. Mol. Bio., 74, 59, Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, и Brennan, патент США № 6001322). Все перечисленные работы включены в настоящее описание в качестве ссылки. Синтез олигонуклеотидов позволяет использовать обычные защитные и связывающие группы для нуклеиновых кислот, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'-конце. В не ограничивающем примере синтезы в лабораторном масштабе проводят в синтезаторе 394 Applied Biosystems, Inc. с использованием протокола на основе шкалы 0,2 мкмоль с проведением стадии связывания в течение 2,5 минут для 2'-О-метилированных нуклеотидов, и в течение 45 секунд проводят стадию связывания для 2'-дезоксинуклеотидов или 2'-дезокси-2'-фторнуклеотидов. В таблице III приведены данные по количествам реагентов и времени их контактирования в цикле синтеза. Альтернативно, синтез на основе шкалы 0,2 мкмоль может быть проведен в синтезаторе с использованием 96-ячеечного планшета, такого как поставляемый компанией Protogene (Palo Alto, CA) с введением в цикл минимальной модификации. Может быть использован 33-кратный избыток (60 мкл 0,11 М = 6,6 мкмоль) 2'-О-метил-фосфорамидита и 105-кратный избыток S-этилтетразола (60 мкл 0,25 М = 15 мкмоль) в каждом цикле связывания 2'-О-метильных остатков относительно полимер-связанного 5'-гидроксила. Может быть использован 22-кратный избыток (40 мкл 0,11 М = 4,4 мкмоль) дезоксифосфорамидита и 70-кратный избыток S-этилтетразола (40 мкл 0,25 М = 10 мкмоль) в каждом цикле связывания дезокси-остатков относительно полимер-связанного 5'-гидроксила. Средние показатели выхода в реакции связывания при использовании синтезатора 394 Applied Biosystems, Inc., определяемые при колориметрической количественной оценке тритильных фракций, в типичном случае составляет 97,5-99%. Другие реагенты, используемые при олигонуклеотидном синтезе в синтезаторе 394 Applied Biosystems, Inc., включают следующие: раствор для детритилирования, который представляет 3% TХУ в метиленхлориде (ABI); реакцию захвата проводят с использованием 16% N-метилимидазола в ТГФ (ABI) и смеси 10% уксусного ангидрида/10% 2,6-лютидина в ТГФ (ABI); и раствор окислителя представляет 16,9 мМ I₂, 49 мМ пиридина, 9% воды в ТГФ (PerSeptive Biosystems, Inc.). Ацетонитрил с чистотой, подходящей для синтеза (Burdick & Jackson Synthesis Grade), берут непосредственно из бутыли с реактивом. Раствор S-этилтетразола (0,25 М в ацетонитриле) получают из твердого материала, доступного от компании American International Chemical, Inc. Альтернативно, для введения фосфоротиоатных связей используют реактив Бекожа (Beaucage) (1,1-диоксид 3Н-1,2-бензодитиол-3-она, 0,05 М в ацетонитриле).

Удаление защитных групп от олигонуклеотидов на основе ДНК проводят следующим образом: связанный с полимером тритилированный олигорибонуклеотид переносят в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой на 4 мл и суспендируют в растворе 40% водного метиламина (1 мл) при температуре 65°С в течение 10 минут. После охлаждения до температуры -20°С супернатант отбирают от полимерной подложки. Указанную подложку промывают три раза с использованием 1,0 мл EtOH:MeCN:H₂O/3:1:1, перемешивают в вихревом смесителе и затем указанный супернатант добавляют к первому супернатанту. Объединенные супернатанты, содержащие олигорибонуклеотид, сушат с получением белого порошка. В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению синтезируют, подвергают депротекции и анализируют по методикам, описанным в патентах США 6995259, 6686463, 6673918, 6649751, 6989442 и USSN 10/190359, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

Способ синтеза, использованный для некоторых молекул киНК, включающих РНК, согласно настоящему изобретению, проводят по процедуре, описанной в литературе (Usman et al., 1987, J. Am. Chem. Soc., 109, 7845; Scaringe et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18, 5433; и Wincott et. al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al., 1997, Methods. Mol. Bio., 74, 59), которая позволяет использовать обычные для нуклеиновых кислот защитные и связывающие группы, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'-конце. В не ограничивающем примере проводят синтезы в лабораторном масштабе в синтезаторе 394 Applied Biosystems, Inc. по протоколу на шкале 0,2 мкмоль, с проведением стадии связывания в течение 7,5 минут для нуклеотидов с алкил-силильной защитой и проводят стадию связывания в течение 2,5 минут для 2'-О-метилированных нуклеотидов. В таблице III приведены данные по количествам реагентов и времени их в цикле синтеза. Альтернативно, синтез в масштабе 0,2 мкмоль может быть проведен в синтезаторе с использованием 96-ячеечного планшета, такого как синтезатор, поставляемый компанией Protogene (Palo Alto, CA) с минимальной модификацией цикла. Может быть использован 33-кратный избыток (60 мкл 0,11 М = 6,6 мкмоль) 2'-О-метил-фосфорамидита и 75-кратный избыток S-этилтетразола (60 мкл 0,25 М = 15 мкмоль) в каждом цикле связывания 2'-О-метильных остатков относительно полимер-связанного 5'-гидроксила. Может быть использован 66-кратный избыток (120 мкл 0,11 М = 13,2 мкмоль) фосфорамидита, защищенного алкилсилилом (для рибо-конфигурации), и 150-кратный избыток S-этилтетразола (120 мкл 0,25 М = 30 мкмоль) в каждом цикле связывания рибонуклеотидных остатков относительно полимер-связанного 5'-гидроксила. Средние показатели выхода в реакции связывания при использовании синтезатора 394 Applied Biosystems, Inc., определяемые при колориметрической количественной оценке тритильных фракций, в типичном случае составляет 97,5-99%. Другие реагенты, используемые при олигонуклеотидном синтезе в синтезаторе 394 Applied Biosystems, Inc., включают следующие: раствор для детритилирования, который представляет собой 3% TХУ в метиленхлориде (ABI); реакцию захвата проводят с использованием 16% N-метилимидазола в ТГФ (ABI) и смеси 10% уксусного ангидрида/10% 2,6-лютидина в ТГФ (ABI); и раствор окислителя представляет 16,9 мМ I₂, 49 мМ пиридина, 9% воды в ТГФ (PerSeptive Biosystems, Inc.). Ацетонитрил с чистотой, подходящей для синтеза (Burdick & Jackson Synthesis Grade), берут непосредственно из бутыли с реактивом. Раствор S-этилтетразола (0,25 М в ацетонитриле) получают из твердого материала, доступного от компании American International Chemical, Inc. Альтернативно, для введения фосфоротиоатных связей используют реактив Бекожа (Beaucage) (1,1-диоксид 3Н-1,2-бензодитиол-3-она, 0,05 М в ацетонитриле).

Снятие защиты с РНК проводят с использованием протокола, включающего использование либо двух резервуаров, либо одного, следующим образом (в рамках 2-х резервуаров): связанный с полимером тритилированный олигорибонуклеотид переносят в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой на 4 мл и суспендируют в растворе 40% водного метиламина (1 мл) при температуре 65°С в течение 10 минут. После охлаждения до температуры -20°С супернатант отбирают от полимерной подложки. Указанную подложку промывают три раза с использованием 1,0 мл EtOH:MeCN:H₂O/3:1:1, перемешивают в вихревом смесителе и затем указанный супернатант добавляют к первому супернатанту. Объединенные супернатанты, содержащие олигорибонуклеотид, сушат с получением белого порошка. Основной олигорибонуклеотид со снятой защитой ресуспендируют в растворе безводного TEA/HF/NMP (300 мкл раствора, включающего 1,5 мл N-метилпирролидинона, 750 мкл TEA и 1 мл TEA·3HF с достижением концентрации 1,4 М HF) и нагревают до температуры 65°С. Через 1,5 часа олигомер дезактивируют с использованием 1,5 М NH₄HCO₃. В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению синтезируют, подвергают депротекции и анализируют согласно методикам, описанным в патентах США 6995259, 6686463, 6673918, 6649751, 6989442 и USSN 10/190359, которые включены в настоящее полностью в качестве ссылок.

Альтернативно, при проведении протокола в рамках одного резервуара, полимер-связанный тритилированный олигорибонуклеотид переносят в стеклянный флакон с завинчивающейся крышкой на 4 мл и суспендируют в растворе 33% этанольного метиламина/ДМСО: 1/1 (0,8 мл) при температуре 65°С в течение 15 минут. Флакон переносят в условия комнатной температуры, добавляют TEA·3HF (0,1 мл) и флакон нагревают при температуре 65°С в течение 15 минут. Образец охлаждают до температуры -20°С и затем гасят добавлением 1,5 М NH₄HCO₃.

Для очистки тритилированных олигомеров, погашенный раствор NH₄HCO₃ вносят в С-18-содержащий картридж и проводят предварительную промывку ацетонитрилом с последующей промывкой 50 мМ TEAA. После промывки загруженного картриджа водой, РНК подвергают детритилированию с использованием 0,5% ТФУ в течение 13 минут. Далее картридж снова промывают водой, проводят обессоливание с использованием 1 M NaCl и снова промывают водой. После этого олигонуклеотид элюируют 30% ацетонитрилом.

Средние показатели выхода в реакции ступенчатого связывания составляют с типичном случае >98% (Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684). Специалистам в данной области понятно, что шкала синтеза может быть адаптирована для достижения более крупного или более мелкого масштаба синтеза, чем описано выше в примере, и что данный протокол синтеза не ограничивается форматом 96-ячеечного планшета.

Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы по отдельности и соединены после синтеза, например, путем лигирования (Moore et al., 1992, Science 256, 9923; Draper et al., Международная PCT публикация № WO 93/23569; Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19, 4247; Bellon et al., 1997, Bellon et al., 1997, Nucleosides & Nucleotides, 16, 951; Bellon et al., 1997, Bioconjugate Chem. 8, 204) или по методу гибридизации с проведением впоследствии синтеза и/или депротекции.

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению также могут быть синтезированы по методике тандемного синтеза согласно процедуре примера 1, где обе цепи киНК синтезируют в виде единого непрерывного олигонуклеотидного фрагмента или цепи, разделенной расщепляемым линкером, который впоследствии расщепляют с получением отдельных фрагментов киНК или цепей, которые могут быть гибридизованы, что позволяет провести очистку дуплекса киНК. Указанный линкер может представлять собой полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер. Приведенный в настоящем описании тандемный синтез киНК может быть легко адаптирован к платформам для проведения многоячеечного/многопланшетного синтеза, например, с использованием 96-ячеечных платформ, или в аналогичном варианте могут быть проведены синтезы на более крупных многоячеечных платформах. Приведенный в настоящем описании тандемный синтез киНК может быть также легко адаптирован для крупномасштабного синтеза с использованием соответствующих платформ, в которых используются периодические реакторы, колонки для синтеза и т.п.

Молекула киНК может быть получена путем сборки из двух разных цепей или фрагментов нуклеиновой кислоты, где один фрагмент включает смысловой участок и второй фрагмент включает антисмысловой участок молекулы РНК.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть существенно модифицированы для повышения стабильности посредством модификации устойчивыми к нуклеазе группами, такими как, например, 2'-амино, 2'-С-аллил, 2'-фтор, 2'-О-метил, 2'-Н (см. соответствующий обзор в работах: Usman and Cedergen, 1992, TIBS, 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163). Конструкции киНК могут быть подвергнуты очистке гель-электрофорезом с использованием основных методов проведения данной процедуры или могут быть очищены в рамках высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ; см., Wincott et al., выше, исчерпывающий перечень соответствующих работ представлен в настоящем описании в качестве ссылок) и впоследствии ресуспендированы в воде.

В другом аспекте осуществления настоящего изобретения рассматриваемые в нем молекулы киНК экспрессируют на основе единиц транскрипции, введенных в векторы на основе ДНК или РНК. Рекомбинантные векторы могут представлять собой ДНК-содержащие плазмиды или вирусные векторы. При этом киНК, экспрессирующие вирусные векторы, могут быть сконструированы на основе, например, без ограничения, адено-ассоциированного вируса, ретровируса, аденовируса или альфавируса. Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул киНК, могут доставляться согласно настоящему описанию, и далее они могут оставаться в целевых клетках. Альтернативно, могут использоваться вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул киНК.

Оптимизация активности молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению

Химически синтезированные молекулы нуклеиновой кислоты с модификациями (модификации по основанию, сахару и/или фосфату) могут препятствовать их деградации сывороточными рибонуклеазами, поскольку могут повышать их эффективность (см, например, Eckstein et al., Международная публикация № WO 92/07065; Perrault et al., 1990 Nature 344, 565; Pieken et al., Science 1991, 253, 314; Usman and Cedergen, 1992, Trends in Biochem. Sci. 17, 334; Usman et al., международная публикация № WO 93/15187; и Rossi et al., международная публикация № WO 91/03162; Sproat, патент США № 5334711; Gold et al., патент США № 6300074; и Burgin et al., выше; где все указанные публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки). Все приведенные выше публикации описывают различные химические модификации, которые могут быть введены в состав основания, фосфатного и/или сахарного фрагментов молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. При этом желательны модификации, которые повышают их эффективность в клетках, а также удаление оснований от молекул нуклеиновой кислоты для сокращения времени синтеза олигонуклеотида и снижения потребностей в химических манипуляциях.

Имеется несколько примеров в данной области, описывающих модификации на уровне сахара, основания и фосфата, которые могут быть встроены в молекулу нуклеиновой кислоты с достижением значительного повышения их стабильности к нуклеазе и, соответственно, эффективности. Например, олигонуклеотиды модифицируют в направлении повышения их стабильности и/или усиления биологической активности посредством модификации резистентными к нуклеазе группами, такими как, например, 2'-амино, 2'-С-аллил, 2'-фтор, 2'-О-метил, 2'-О-аллил, 2'-Н, используемыми для модификаций нуклеотидного основания (см. обзор Usman and Cedergren, 1992, TIBS, 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163; Burgin et al., 1996, Biochemistry, 35, 14090). Сахарные модификации молекул нуклеиновой кислоты широко описаны в литературе (см., Eckstein et al., Международная РСТ публикация № WO 92/07065; Perrault et al., 1990 Nature, 1990, 344, 565-568; Pieken et al., Science 1991, 253, 314-317; Usman and Cedergren, 1992, Trends in Biochem. Sci. 17, 334-339; Usman et al., Международная РСТ публикация № WO 93/15187; Sproat, патент США № 5334711 и Beigelman et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelman et al., Международная РСТ публикация № WO 97/26270; Bеigelman et al., патент США № 5716824; Usman et al., патент США № 5627053; Woolf et al., Международная РСТ публикация № 98/13526; Thompson et al., USSN 60/082404, опубликованная 20 апреля 1998 года; Karpeisky et al., 1998, Tetrahedron Lett., 39, 1131; Earnshaw and Gait, 1998, Biopolymers (Nucleic Acid Sciences), 48, 39-55; Verma and Eckstein, 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, 99-134; и Burlina et al., 1997, Bioorg. Med. Chem., 5, 1999-2010; все приведенные работы включены полностью в настоящее описание в качестве ссылки). Такого рода публикации описывают основные методы и стратегии, подходящие для определения локализации включения модификаций в сахарный фрагмент, в основание и/или в фосфат, а также аналогичных модификаций в составе молекул нуклеиновой кислоты, без модуляции каталитической способности, и все они включены в настоящее описание в качестве ссылки. В свете приведенного описания, аналогичные модификации могут использоваться для модификации молекул киНК согласно настоящему описанию, поскольку способность киНК ускорять РНКи в клетках существенно не ингибируется.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения молекулу нуклеиновой кислоты подвергают химической модификации согласно процедуре, описанной в US 20050020521, указанная работа включена в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

Несмотря на то что химическая модификация межнуклеотидных связей в олигонуклеотидах фосфоротиоатными, фосфородитиоатными и/или 5'-метилфосфонатными связями повышает стабильность, избыточный уровень модификации может вызвать некоторую токсичность или снижение активности. В этой связи, при разработке молекул нуклеиновой кислоты количество таких межнуклеотидных связей должно быть минимизировано. Снижение концентрации указанных связей будет способствовать снижению токсичности, что приводит в итоге к повышению эффективности и специфичности таких молекул.

В настоящем изобретении предлагаются молекулы короткой интерферирующей нуклеиновой кислоты (киНК), содержащие химические модификации, которые поддерживают или усиливают их активность. Такая нуклеиновая кислота в основном также более резистентна к нуклеазам, чем немодифицированная нуклеиновая кислота. Соответственно, активность in vitro и/или in vivo не должна быть существенно снижена. В тех случаях, когда такая модуляция является целью, доставляемые экзогенно молекулы терапевтической нуклеиновой кислоты должны обладать оптимальной стабильностью в клетках до того момента, когда, в ходе достаточно длительного процесса модуляции трансляции целевой РНК, будут снижены уровни нежелательного белка. Указанный период времени варьирует от нескольких часов до нескольких дней, в зависимости от степени заболевания. Усовершенствования в процессах химического синтеза РНК и ДНК (Wincott et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677; Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19) (данные работы включены в настоящее описание в качестве ссылки) позволили расширить рамки возможностей модификации молекул нуклеиновой кислоты посредством введения нуклеотидных модификаций с достижением повышения их стабильности к действию нуклеаз, как это было описано выше.

В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) G-сlamp нуклеотидов. G-clamp нуклеотид представляет собой модифицированный аналог цитозина, где указанные модификации придают водородной связи способность поддерживать комплементарное взаимодействие гуанина в составе дуплекса, соответствующем правилам Уотсона-Крика и Хугстена (Hoogsteen) (см, например, Lin and Matteucci, 1998, J. Am. Chem. Soc., 120, 8531-8532). Единичное замещение в G-clamp аналоге в составе олигонуклеотида может приводить к существенному повышению термостабильности спиральной структуры и к дискриминации, применительно к ошибочному спариванию, в случае гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами. Включение таких нуклеотидов в молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению приводит как к повышению аффинности, так и к повышению специфичности в отношении мишеней нуклеиновой кислоты, комплементарных последовательностей и матричных цепей. В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают один или несколько (в частности, примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов «закрытой нуклеиновой кислоты» LNA, такие как 2',4'-C-метиленбициклонуклеотид (см., например, Wengel et al., Международная PCT публикация № WO 00/66604 и WO 99/14226).

В другом варианте настоящее изобретение относится к конъюгатам и/или к комплексам молекул киНК согласно настоящему изобретению. Такие конъюгаты и/или комплексы могут использоваться для облегчения доставки молекул киНК в биологическую систему, такую как клетка. Указанные конъюгаты и комплексы согласно настоящему изобретению могут обладать терапевтической активностью, проявляемой при переносе терапевтических соединений через клеточные мембраны, за счет изменения фармакокинетики и/или модуляции локализации молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к разработке и синтезу новых конъюгатов и комплексов, используемых для доставки молекул, включающих, без ограничения, малые молекулы, липиды, холестерин, фосфолипиды, нуклеозиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, антитела, токсины, отрицательно заряженные полимеры и другие полимеры, например, белки, пептиды, гормоны, углеводы, полиэтиленгликоли или полиамины, осуществляемой через клеточные мембраны. В основном переносчики, приведенные в настоящем изобретении, разрабатываются для их последующего использования либо в индивидуальной форме, либо в составе поликомпонентной системы, при наличии в ней деградируемх линкеров или в их отсутствие. Как ожидается, указанные соединения будут повышать доставку и/или соответствующую локализацию молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению во множество типов клеток, происходящих из разных тканей, в присутствии сыворотки или без нее (см., Sullenger and Cech, патент США № 5854038). Конъюгаты молекул, приведенных в настоящем описании, могут быть присоединены к биологически активным молекулам через линкеры, которые являются биодеградируемыми, таким как молекулы биодеградируемого линкера для нуклеиновой кислоты.

Термин «биодеградируемый линкер» в контексте настоящего описания относится к молекуле линкера на основе нуклеиновой кислоты или отличного от нуклеиновой кислоты, который разрабатывается в качестве биодеградируемого линкера для соединения одной молекулы с другой молекулой, например, биологически активной молекулы с молекулой киНК согласно настоящему изобретению или смысловой или антисмысловой цепей киНК согласно настоящему изобретению. Биодеградируемый линкер разрабатывают таким образом, чтобы его стабильность могла модулироваться для достижения конкретной цели, такой как доставка в определенный тип ткани или в определенный тип клеток. Стабильность молекулы биодеградируемого линкера на основе нуклеиновой кислоты может подвергаться модуляции посредством использования различных химических структур, например, сочетаний рибонуклеотидов, дезоксирибонуклеотдиов и химически модифицированных нуклеотидов, таких как 2'-О-метил-, 2'-фтор-, 2'-амино-, 2'-О-амино-, 2'-С-аллил-, 2'-О-аллил- и другие 2'-модифицированные нуклеотиды или нуклеотиды с модифицированным основанием. Молекула биодеградируемого линкера на основе нуклеиновой кислоты может представлять димер, тример, тетрамер или молекулу более длинной нуклеиновой кислоты, например, олигонуклеотид с длиной примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, или может включать один нуклеотид с фосфор-содержащей связью, например, с фосфорамидатной или фосфодиэфирной связью. Молекула биодеградируемого линкера на основе нуклеиновой кислоты может также включать скелет нуклеиновой кислоты, сахарный фрагмент нуклеиновой кислоты или модификацию в основании нуклеиновой кислоты.

Термин «биодеградируемый» в контексте настоящего описания относится к деградации в биологической системе, например, к энзиматической деградации или к химической деградации.

Термин «биологически активная молекула» в контексте настоящего описания относится к соединениям или молекулам, которые способны проявлять или модифицировать биологический ответ в системе. Не ограничивающие примеры биологически активных молекул киНК, либо в индивидуальной форме, либо в сочетании с другими молекулами, включенными в рамки настоящего изобретения, охватывают терапевтически активные молекулы, такие как антитела, холестерин, гормоны, антивирусные соединения, пептиды, белки, химиотерапевтические соединения, малые молекулы, витамины, кофакторы, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты с энзиматической активностью, антисмысловые нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, формирующие триплекс, 2,5-А-химерные формы, киНК, дцРНК, аллозимы, аптамеры, соединения-ловушки и их аналоги. Биологически активные молекулы согласно настоящему изобретению также включают молекулы, способные модулировать фармакокинетику и/или фармакодинамику других биологически активных молекул, например, липидов и полимеров, таких как полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоль и другие полиэфиры.

Термин «фосфолипид» в контексте настоящего описания относится к гидрофобной молекуле, включающей по меньшей мере одну фосфорную группу. Так, например, фосфолипид может включать фосфорсодержащую группу и насыщенную или ненасыщенную алкильную группу, необязательно замещенную OH, COOH, оксогруппой, аминогруппой или замещенной или незамещенной арильными группами.

Молекулы терапевтической нуклеиновой кислоты (например, молекулы киНК), доставляемые экзогенно, представляют собой в оптимальном варианте стабильные в клетках молекулы, до достижения такого уровня модуляции в ходе длительного процесса обратной транскрипции РНК, которого будет достаточно для снижения уровня транскрипта РНК. Молекулы нуклеиновой кислоты обладают резистентностью к нуклеазам, с тем чтобы они могли функционировать в качестве эффективных внутриклеточных терапевтических агентов. Усовершенствования способов химического синтеза молекул нуклеиновой кислоты, описанные в настоящем изобретении, а также соответствующие данные, известные в данной области, позволяют расширить рамки возможностей по модификации молекул нуклеиновой кислоты за счет введения нуклеотидных модификаций с целью повышения их нуклеазной стабильности, как было описано выше.

В еще одном варианте настоящего изобретения предлагаются молекулы киНК, содержащие химические модификации, которые поддерживают или повышают ферментативную активность белков, вовлекаемых в РНКи. Такие нуклеиновые кислоты в основном также более устойчивы к действию нуклеаз, чем немодифицированные нуклеиновые кислоты. Таким образом, активность in vitro и/или in vivo не должна быть существенно снижена.

Использование молекул на основе нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению приводит к достижению более эффективного лечения за счет возможности осуществления сочетанных видов терапии (например, с использованием множества молекул киНК, направленно воздействующих на разные гены; молекул нуклеиновой кислоты, связанных с известными малыми молекулами-модуляторами; или с проведением перемежающегося лечения с использованием сочетания молекул, которые включают различные мотивы и/или другие химические или биологические молекулы). Лечение субъектов с использованием молекул киНК может также сочетать использование сочетаний молекул различных типов нуклеиновых кислот, таких как молекулы нуклеиновой кислоты, обладающие ферментативной активностью (рибозимы), аллозимы, антисмысловые нуклеиновые кислоты, 2,5-А-олигоаденилат, соединения-ловушки и аптамеры.

В другом аспекте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает одну или несколько 5'- и/или 3'-кэп-структур, например, только на смысловой цепи киНК, только на антисмысловой цепи киНК или на обеих цепях киНК.

Термин «кэп-структура» в контексте настоящего описания обозначает химические модификации, которые включаются на одном из концов олигонуклеотида (см., например, Adamic et al., патент США № 5998203, включенный в настоящее описание в качестве ссылки). Указанная внутренняя модификация защищает молекулу нуклеиновой кислоты от деградации экзонуклеазой и может способствовать доставке и/или соответствующей локализации в клетке. Указанный кэп-фрагмент может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или 3'-конце (3'-кэп) или может присутствовать на обоих концах. В не ограничивающих примерах 5'-фрагмент включает, без ограничения, глицерильный остаток; инвертированный дезокси-безосновный остаток (фрагмент); 4',5'-метиленовый нуклеотид; 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид; карбоциклический нуклеотид; 1,5-ангидрогекситоловый нуклеотид; L-нуклеотиды; альфа-нуклеотиды; нуклеотид с модифицированным основанием; фрагмент с фосфородитиоатной связью; трео-пентофуранозильный нуклеотид; ациклический 3',4'-секо-нуклеотид; ациклический 3,4-дигидроксибутиловый нуклеотид; ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид; 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент; 3'-3'-инвертированый безосновный фрагмент; 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент; 3'-2'-инвертированный безосновный фрагмент; 1,4-бутандиолфосфат; 3'-фосфорамидат; гексилфосфат; аминогексилфосфат; 3'-фосфат; 3'-фосфоротиоат; фосфородитиоат; или содержащий или не содержащий мостиковую связь метилфосфонатный фрагмент. Не ограничивающие примеры кэп-фрагментов проиллюстрированы на фиг. 10.

Не ограничивающие примеры 3'-кэп-фрагментов включают, без ограничения, глицерильный остаток, инвертированный дезокси-безосновный остаток (фрагмент); 4',5'-метиленовый нуклеотид; 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид; 4'-тионуклеотид; карбоциклический нуклеотид; 5'-аминоалкилфосфат; 1,3-диамино-2-пропилфосфат; 3-аминопропилфосфат; 6-аминогексилфосфат; 1,2-аминододецилфосфат; гидроксипропилфосфат; 1,5-ангидрогекситоловый нуклеотид; L-нуклеотид; альфа-нуклеотид; нуклеотид с модифицированным основанием; фосфородитиоат; трео-пентофуранозильный нуклеотид; ациклический 3',4'-секо-нуклеотид; 3,4-дигидроксибутиловый нуклеотид; 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид; 5'-5'-инвертированный нуклеотидный фрагмент; 5'-5'-инвертированый безосновный фрагмент; 5'-фосфорамидат; 5'-фосфоротиоат; 1,4-бутандиолфосфат; 5'-амино; содержащий и/или не содержащий мостиковую связь 5'-фосфорамидат; фосфоротиоат и/или фосфородитиоат, содержащие или не содержащие мостиковую связь метилфосфонатный и 5'-меркапто фрагменты (более подробно см. Beaucage and Iyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925, указанная работа включена в настоящее описание в качестве ссылки).

Термин «ненуклеотидной природы» обозначает любую группу или соединение, которые могут быть введены в состав цепи нуклеиновой кислоты вместо одной или нескольких нуклеотидных единиц, включая замещение по сахару и/или по фосфату, и которые при этом позволяют оставшимся основаниям проявлять свою ферментативную активность. Указанные группы или соединения являются безосновными, поскольку не содержат общепризнанного нуклеотидного основания, такого как аденозин, гуанин, цитозин, урацил или тимин, и, в этой связи, в 1'-положении у них отсутствует основание.

Термин «алкильный» применительно к группе относится к замещенному алифатическому углеводороду, включающему линейно-цепочечные, разветвленные и циклические алкильные группы. Предпочтительно, алкильные группы содержат от 1 до 12 атомов углерода. Более предпочтительно, это - низший алкил, включающий от 1 до 7 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. В том случае, когда замещается одна или несколько групп, то они представляют собой предпочтительно гидроксил, циано, алкокси, =О, =S, NO₂ или N(CH₃)₂, амино или SH группу. Указанный термин также включает алкенильные группы, которые представляют собой ненасыщенные углеводородные группы, содержащие по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, включая линейно-цепочечные, разветвленные и циклические группы. Предпочтительно, алкенильная группа содержит от 1 до 12 атомов углерода. Более предпочтительно, это - низший алкенил, содержащий от 1 до 7 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Алкенильная группа может быть замещенной или незамещенной. В том случае, когда замещается одна или несколько групп, то она представляет собой предпочтительно гидроксил, циано, алкокси, =О, =S, NO₂, галоген, N(CH₃)₂, амино или SH группу. Указанный термин «алкил» также включает алкинильные группы, которые представляют собой ненасыщенные углеводородные группы, содержащие по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, включая линейно-цепочечные, разветвленные и циклические группы. Предпочтительно, алкинильная группа содержит от 1 до 12 атомов углерода. Более предпочтительно, эта - низший алкинил, содержащий от 1 до 7 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 4 атомов углерода. Алкинильная группа может быть замещенной или незамещенной. В том случае, когда замещается одна или несколько групп, то она представляет собой предпочтительно гидроксил, циано, алкокси, =О, =S, NO₂ или N(CH₃)₂, амино или SH группу.

Такие алкильные группы могут также включать арильные, алкиларильные, карбоциклические арильные, гетероциклические арильные, амидные и сложноэфирные группы. Термин «арил» обозначает ароматическую группу, которая имеет по меньшей мере одно кольцо, содержащее конъюгированную пи-электронную систему, и включает карбоциклические арильные, гетероциклические арильные и биарильные группы, которые могут быть необязательно замещены. Один или несколько предпочтительных заместителей в арильных группах включают галоген, тригалогенметил, гидроксил, SH, OH, циано, алкокси, алкил, алкенил, алкинил и аминогруппы. Термин «алкиларильная» группа относится к алкильной группе (как указано выше), ковалентно присоединенный к арильной группе (указанной выше). Карбоциклические арильные группы представляют собой группы, в которых все атомы кольца на ароматическом кольце представляют собой атомы углерода. Атомы углерода могут быть необязательно замещены. Гетероциклические арильные группы представляют собой группы, содержащие от 1 до 3 гетероатомов, в качестве атомов кольца в ароматическом кольце, тогда как оставшиеся в кольце атомы представлены атомами углерода. Подходящие гетероатомы включают кислород, серу и азот, и указанные группы включают фуранил, тиенил, пиридил, пирролил, N-низший алкилпирроло, пиримидил, пиразинил, имидазолил и т.п., которые могут быть необязательно замещены. Термин «амид» относится к -C(O)-NH-R, где R обозначает алкил, арил, алкиларил или водород. Термин «сложный эфир» относится к -C(O)-OR', где R обозначает алкил, арил, алкиларил или водород.

Термин «нуклеотид» в тексте настоящего описания используется в общепринятом значении и включает природные основания (стандартные) и модифицированные основания, также хорошо известные в данной области. Такие основания в основном локализованы в 1'-положении сахарного фрагмента нуклеотида. Нуклеотиды в основном включают основания, сахарный фрагмент и фосфатную группу. Нуклеотиды могут быть немодифицированными или могут быть модифицированы по сахарному фрагменту, фосфату и/или основанию (которые также обозначаются взаимозаменяемо как нуклеотидные аналоги, модифицированные нуклеотиды, неприродные нуклеотиды, нестандартные нуклеотиды, и др.; см., например, Usman and McSwiggen, выше; Eckstein et al., Международная PCT публикация № WO 92/07065; Usman et al., Международная PCT публикация № WO 93/15187; Uhlman & Peyman, выше, все работы включены в настоящее описание в качестве ссылки). В данной области известно несколько примеров модифицированных оснований нуклеиновой кислоты, которые описаны в работе Линбаха с соавт.( Linbach et al., 1994, Nucleis Acids Res. 22, 2183). Некоторые не ограничивающие примеры модификаций оснований, которые могут быть встроены в молекулы нуклеиновой кислоты, включают инозин, пурин, пиридин-4-он, пиридин-2-он, фенил, псевдоурацил, 2,4,6-триметоксибензол, 3-метилурацил, дигидроуридин, нафтил, аминофенил, 5-алкилцитидины (например, 5-метилцитидин), 5-алкилуридины (например, риботимидин), 5-галогенуридин (например, 5-бромуридин) или 6-азапиримидины или 6-алкилпиримидины (например, 6-метилуридин), пропин и другие (Burgin et al., 1996, Biochemisrty, 35, 14090; Uhlman & Peyman, выше). Термин «модифицированные основания» в данном аспекте обозначает нуклеотидные основания, отличные от аденина, гуанина, цитозина и урацила в 1'-положении или их эквиваленты.

В одном варианте настоящее изобретение относится к молекулам модифицированной киНК, содержащим модификации фосфатного скелета, которые включают одну или несколько модификаций по типу фосфоротиоатных, фосфородитиоатных, метилфосфонатных, фосфотриэфирных, морфолино амидатных, карбаматных, карбоксиметильных, ацетамидатных, полиамидных, сульфонатных, сульфонамидных, сульфаматных, формацетальных, тиоформацетальных и/или алкилсилильных замещений. Обзор модификаций олигонуклеотидного скелета приведен в следующих работах: Hunziker and Leumann, 1995, Nucleic Acid Analogues: Synthesis and Properties, in Modern Synthetic Methods, VCH, 331-417, и Mesmaeker et al., 1994, Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides, in Carbohydrate Modifications in Antisense Research, ACS, 24-39.

Термин «безосновный» обозначает сахарные фрагменты, не содержащие нуклеотидного основания или содержащие атом водорода (H), или другие, отличные от нуклеотидного основания химические группы вместо нуклеотидного основания в 1'-положении сахарного фрагмента (см., например, Adamic et al., патент США № 5998203). В одном варианте безосновный фрагмент согласно настоящему изобретению представляет собой рибозу, дезоксирибозу или дидезоксирибозный сахар.

Термин «немодифицированный нуклеотид» обозначает одно или несколько оснований: аденин, цитозин, гуанин, тимин или урацил, присоединенных к 1'-углероду β-D-рибофуранозы.

Термин «модифицированный нуклеозид» обозначает любое нуклеотидное основание, которое содержит модификацию в химической структуре немодифицированного нуклеотидного основания, сахара и/или фосфата. Не ограничивающие примеры модифицированных нуклеотидов проиллюстрированы соединениями формул I-VII и/или в форме других модификаций, приведенных в настоящем описании.

Применительно к 2'-модифицированным нуклеотидам, в контексте настоящего описания, термин «амино» обозначает 2'-NH₂ или 2'-O-NH₂, где указанные фрагменты могут быть модифицированными или немодифицированными. Такие модифицированные группы были описаны, например, в работе Eckstein et al., патент США № 5672695 и Matulic-Adamic et al., патент США № 6248878, которые оба включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В структуру нуклеиновой кислоты киНК могут быть введены различные модификации, которые будут способствовать применимости этих молекул. Такие модификации будут способствовать увеличению срока хранения, периода полувыведения in vitro, повышению стабильности и легкости введения таких олигонуклеотидов в сайт-мишень, например, за счет усиления способности проникать через клеточные мембраны, а также для придания способности распознавать и связываться с целевыми клетками.

Введение молекул нуклеиновой кислоты

Молекула киНК согласно настоящему изобретению может быть адаптирована для использования, индивидуально или в сочетании с другими видами терапии, с целью предупреждения или лечения заболеваний, признаков, расстройств и/или состояний согласно настоящему изобретению или других, известных в данной области как связанные с экспрессией целевого гена или гена целевого пути и/или любых других признаков, заболеваний, расстройств или состояний, которые связаны с определенными уровнями целевых полинуклеотидов или белков, экспрессируемых на их основе в клетке или ткани, или являются ответом на такие уровни. В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению и их композиции или препараты на их основе могут вводиться в клетку, субъекту или в организм по процедурам согласно настоящему описанию или иным, известным в данной области.

В одном варианте композиция киНК согласно настоящему изобретению может включать применяемый для доставки наполнитель, который включает липосомы, для введения субъекту, а также носители или разбавители и их соли, и/или может быть представлена в виде фармацевтически приемлемых композиций. Способы доставки молекул нуклеиновой кислоты описаны в литературе (Akhtаr et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137, 165-192; и Lee et al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192, все указанные работы включены в настоящее описание в качестве ссылки). Бейгельман с соавт. и Салливан с соавт. (Beigelman et al., патент США № 6395713; и Sullivan et al., PCT WO 94/02595) также описывают основные способы доставки молекул нуклеиновой кислоты. Указанные протоколы могут быть использованы для доставки практически любой молекулы нуклеиновой кислоты. Молекулы нуклеиновой кислоты могут вводиться в клетки посредством множества способов, известных специалистам в данной области, которые включают, без ограничений, инкапсуляцию в липосомы, введение путем ионтофореза или за счет включения указанных молекул в другие наполнители, такие как биодеградируемые полимеры, гидрогели, циклодекстрины (см., например, Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074); Wang et al., Международные РСТ публикации №№ WO 03/47518 и WО 03/46185), микросферы на основе поли(молочной-когликолевой)кислоты (PLGA) и PLCA (см, например, патент США 6447796 и публикацию по заявке на патент США № 2002130430), биодеградируемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, или с помощью протеиноподобных векторов (O'Hare and Normand, Международная РСТ публикация № WO 00/53722). В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены или могут быть введены в состав комплекса с полиэтиленимином и его производными, такими как полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-N-ацетилгалактозамин (ПЭИ-ПЭГ-GAL) или полиэтиленимин-полиэтиленгликоль-три-N-ацетилгалактозамин (ПЭИ-ПЭГ-triGAL). В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению изготавливают в виде композиций, описанных в публикации по заявке на патент США № 20030077829, включенной в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции, описанной в предварительной заявке на патент США № 60/678531 и в родственной предварительной заявке на патент США № 60/703946, зарегистрированной 29 июля 2005 года, в предварительной заявке на патент США № 60/737024, зарегистрированной 15 ноября 2005 года, и в USSN 11/353630, зарегистрированной 14 февраля 2006 года (Vargeese et al.), все указанные документы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки. Такие композиции киНК в основном обозначаются как «липидные частицы с нуклеиновой кислотой» (LNP). В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции вместе с одной или несколькими LNP, описанными в таблице IV (см. USSN 11/353630, выше).

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению и их препараты или композиции вводят в ткани и клетки легкого, согласно описанию, приведенному в US 2006/0062758; US 2006/0014289 и US 2004/0077540.

В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению подвергают комплексообразованию с агентами, разрушающими мембрану, такими как агенты, описанные в публикации по заявке на патент США № 20010007666, включенной в настоящее описание в качестве ссылки полностью, вместе с содержащимися в ней чертежами. В другом варианте один или несколько агентов, разрушающих мембрану, и молекулы киНК вводят в состав комплекса с катионным липидом или хелперной липидной молекулой, такими как липиды, описанные в патенте США № 6235310, включенном в настоящее описание в качестве ссылки полностью, вместе с содержащимися в нем чертежами.

В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению подвергают комплексообразованию с системами доставки, описанными в публикации по заявке на патент США № 2003077829 и международных PCT публикациях №№ WO 00/03683 и WO 02/087541, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки полностью, вместе с содержащимися в них чертежами.

В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению подвергают комплексообразованию с системами доставки, которые в основном описаны в публикациях по заявкам на патент США №№ US-20050287551; US-20050164220; US-20050191627; US-20050118594; US-20050153919; US-20050085486 и US-20030158133, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки полностью, вместе с содержащимися в них чертежами.

В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению вводят в скелетные ткани (например, в кость, хрящ, сухожилие и связки) или метастазирующие опухоли кости посредством ателоколлагенового комплексообразования или конъюгации (см., например, Tаkeshita et al., 2005, PNAS, 102, 12177-12182). Соответственно, в одном варианте настоящее изобретение относится к молекулам одной или нескольких дц-киНК в виде композиции на основе комплекса с ателоколлагеном. В другом варианте, настоящее изобретение относится к молекулам одной или нескольких киНК, конъюгированных с ателоколлагеном через линкер по способу согласно настоящему описанию или в рамках иного способа, известного в данной области.

В одном варианте молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению и композиции на их основе (например, LNP композиции на основе молекул двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению) вводят путем легочной доставки, такой как аэрозольная ингаляция или распыление сухой композиции с помощью ингалятора или небулайзера, которая обеспечивает быстрое локальное поглощение молекул нуклеиновой кислоты в соответствующие ткани легкого. Твердые композиции из частиц, содержащие вдыхаемые сухие частицы микронизированных композиций нуклеиновой кислоты, могут быть получены путем измельчения высушенных или лиофилизированных композиций нуклеиновой кислоты с последующим пропусканием микронизированной композиции через сито с размером, например, 400 меш, для измельчения или отделения крупных агломератов. Твердая композиция из частиц, содержащая композиции на основе нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, может необязательно содержать диспергирующий агент, который облегчает образование аэрозоля, и, кроме того, в нее могут входить другие терапевтические соединения. Подходящим диспергирующим агентом является лактоза, которая может быть объединена с нуклеиновой кислотой в любом подходящем соотношении, таком как соотношение 1:1, по весу.

Аэрозоли жидких частиц, содержащих композицию нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, могут быть получены с помощью любого подходящего способа, например, с помощью небулайзера (см., например, патент США 4501729). Небулайзеры представляют собой коммерчески доступные устройства, которые преобразуют растворы или суспензии активного ингредиента в терапевтически аэрозольную смесь либо за счет ускорения потока, создаваемого сжатым газом, в типичном случае воздухом или кислородом, при его пропускании через узкое отверстие, либо с помощью ультразвукового возбуждения. Подходящие композиции, которые могут использоваться в небулайзерах, включают активный ингредиент в жидком носителе, в количестве до 40 вес.%, предпочтительно менее чем 20 вес.% от композиции. Носитель представляет собой в типичном случае воду или разбавленный водно-спиртовой раствор, предпочтительно изотоничный к жидкостям организма, что создается добавлением, например, хлорида натрия или других подходящих солей. Необязательные добавки включают консерванты, если композицию не готовят как стерильную, например, метилгидроксибензоат, антиоксиданты, вкусовые вещества, летучие масла, забуферивающие агенты и эмульгаторы, а также другие поверхностно-активные вещества, используемые в композициях. Аэрозоли твердых частиц, включающих активную композицию и поверхностно-активное вещество, могут быть получены аналогичным способом с использованием любого генератора твердых аэрозольных частиц. Аэрозольные генераторы, используемые для введения твердых лекарственных веществ в аэрозольной форме субъекту, создают частицы, которые вдыхаются, как было описано выше, и создают объем аэрозоля, содержащий заданную отмеренную дозу терапевтической композиции, в количестве, подходящем для введения человеку.

В одном варианте генератор твердых аэрозольных частиц согласно настоящему изобретению представляет собой инсуффлятор. Подходящие композиции, используемые для введения с помощью инсуффлятора, включают тонкоизмельченные порошки, которые могут доставляться с помощью инсуффлятора. В инсуффляторе порошок, то есть отмеренная доза порошка, в количестве, эффективном для проведения лечения согласно настоящему изобретению, содержится в капсулах или картриджах, выполненных в типичном случае из желатина или пластика, которые либо имеют прокол или отверстие in situ, так что порошок доставляется потоком воздухом, проходящим через отверстие при ингаляции или с помощью насосного устройства, которым можно манипулировать вручную. Порошок, используемый в инсуффляторе, состоит либо только из активного ингредиента, либо из порошковой смеси, включающей активный ингредиент, подходящий разбавитель для используемого порошка, такой как лактоза, и необязательно поверхностно-активный компонент. Количество активного ингредиента составляет в типичном случае от 0,1 до 100 вес.% от веса всей композиции. Второй тип репрезентативного аэрозольного генератора включает ингалятор с отмеряемой дозой. Ингаляторы с отмеряемой дозой представляют собой аэрозольные диспенсеры под давлением, которые в типичном случае содержат суспензию или раствор композиции активного ингредиента в ожиженном пропелленте. В процессе использования указанные устройства высвобождают композицию через клапан, который позволяет доставлять отмеренный объем с образованием струи из мелких частиц, содержащих активный ингредиент. Подходящие пропелленты включают некоторые хлорфторуглеродные соединения, например, дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан и их смеси. Такая композиция может также содержать один или несколько дополнительных растворителей, например, этанол, эмульгаторы и другие поверхностно-активные вещества, используемые в композиции, такие как олеиновая кислота или сорбитантриолеат, антиоксиданты и подходящие вкусовые агенты. Другие способы легочной доставки описаны, например, в заявке на патент США № 20040037780 и в патентах США № 6592904; 6582728; 6565885, все указанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылок.

В одном варианте композиции и препараты на основе киНК и NPL согласно настоящему изобретению, используемые для легочной доставки, также включают одно или несколько поверхностно-активных веществ. Подходящие поверхностно-активные вещества или их компоненты, используемые для усиления поглощения композиции согласно настоящему изобретению, включают синтетические и натуральные вещества, а также полные и усеченные формы поверхностно-активного белка А, поверхностно-активного белка B, поверхностно-активного белка C, поверхностно-активного белка D и поверхностно-активного белка Е, двунасыщенный фосфатидилхолин (отличный от дипальмитоила), дипальмитоилфосфатидилхолин, фосфатидилхолин, фосфтидилглицерин, фосфатидилинозитол, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, убихиноны, лизофосфатидилэтаноламин, лизофосфатидилхолин, пальмитоиллизофосфатидилхолин, дигидроэпиандростерон, долихолы, сульфатидную кислоту, глицерин-3-фосфат, дигидроксиацетонфосфат, глицерин, глицеро-3-фосфохолин, дигидроксиацетон, пальмитат, цитидиндифосфат (ЦДФ)-диацилглицерол, ЦДФ-холин, холин, фосфат холина; а также природные и искусственные слоистые тела, которые представляют собой линейные носители, используемые в качестве наполнителей в компонентах поверхностно-активных веществ, омега-3 жирные кислоты, полиеновую кислоту, полиеноевую кислоту, лецитин, пальмитиновую кислоту, неионные блок-сополимеры этиленоксида или пропиленоксида, полиоксипропилен, мономерный и полимерный полиоксиэтилен, мономерный и полимерный поли(виниламин) с декстраном и/или алканоильными боковыми цепями, Бридж 35, Тритон-Х-100 и синтетические поверхностно-активные вещества ALEC, Exosurf, Survan и Atovaquone, а также другие. Указанные поверхностно-активные вещества могут использоваться либо индивидуально, либо как часть многокомпонентной композиции поверхностно-активных веществ, либо могут представлять собой добавки, присоединяемые к 5'- и/или 3'-концам нуклеиновой кислоты в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.

Композиция согласно настоящему изобретению может вводиться в дыхательную систему в виде препарата, включающего частицы вдыхаемого размера, например, частицы с размером, который является достаточно малым для их прохождения при ингаляции через нос, рот и гортань, а также через бронхи и альвеолы легких. В основном, вдыхаемые частицы варьируют по размеру примерно от 0,5 до 10 микрон. Частицы не вдыхаемого размера, которые также включаются в аэрозоль, служат для их осаждения в горле, которые позже проглатываются, так что количество не вдыхаемых частиц в аэрозоле минимизируется. Для назального введения используют частицы с размерами, варьирующими в диапазоне от 100 до 500 мкм, что предпочтительно, поскольку в этом случае частицы удерживаются в носовой полости.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению и препараты или их композиции на их основе вводят в печень согласно известным в данной области процедурам (см., например, Wen et al., 2004, World J Gastroenterol., 10, 244-9; Murao et al., 2002, Pharm. Res., 19, 1808-14; Liu et al., 203, Gene Ther., 10, 180-7; Hong et al., 2003, J. Pharm Pharmacol., 54, 51-8; Herrmаnn et al., 2004, Arch Virol., 149, 1611-7; и Matsuno et al., 2003, Gene Ther., 10, 1559-66).

В одном варианте настоящее изобретение относится к способам доставки молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в центральную нервную систему и в периферическую нервную систему. Проведенные эксперименты показали, что происходит эффективное поглощение нуклеиновых кислот нейронами при их введении in vivo. В качестве примера локального введения нуклеиновых кислот в нервные клетки Соммер с соавт. (Sommer et al., 1998, Antisense Nuc Acid Drug Dev., 8, 75) описывают исследование, в котором молекулу 15-мерной фосфоротиоатной антисмысловой нуклеиновой кислоты c-fos вводят крысам путем микроинъекции в мозг. Антисмысловые молекулы, меченные тетраметилродаминизотиоцианатом (TRITC) или флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), захватываются исключительно нейронами через тридцать минут после инъекции. В этих клетках отмечается диффузное окрашивание цитоплазмы и окрашивание ядер. В качестве примера системного введения нуклеиновой кислоты в нервные клетки, Эпа с соавт. (Epa et al., 2000, Antisense Nuc Acid Drug Dev., 10, 469) описывают исследования in vivo на мышах, в котором используют бета-цитодекстрин-адамантан-олигонуклеотидные конъюгаты для направленного введения p75 нейротропинового рецептора в нейронально дифференцированные клетки PC12. После двухнедельного курса в/б введения, отмечается выраженное поглощение антисмыслового нейротропинового рецептора p75 в клетках дорсального корневого ганглия (DRG). Кроме того, выраженная и неизменная отрицательная регуляция p75 наблюдается в DRG нейронах. Другие подходы направленного введения нуклеиновых кислот в нейроны также описаны в литературе (Broaddus et al., 1998, J. Neurosurg., 88(4), 734; Karle et al., 1997, Eur. J. Pharmacol., 340(2/3), 153; Bannai et al., 1998, Brain Research, 784(1,2), 304; Rajakumar et al., 1997, Synapse, 26(3), 199; Wu-pong et al., 1999, Biopharm, 12(1), 32; Bannai et al., 1998, Brain Res. Protocol, 3(1), 83; Simantov et al., 1996, Neuroscience, 74(1), 39). В этой связи можно полагать, что молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению подходят для доставки и поглощения клетками, которые экспрессируют аллельные варианты, с быстрой экспансией для модуляции экспрессии RE гена. Доставка молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, направленных на RE, обеспечивается множеством различных стратегий. Традиционные подходы к ЦНС доставке, которые могут при этом использоваться, включают, без ограничения, интратекальное и интрацеребровентрикулярное введения, имплантацию катетеров и насосных устройств, прямую инъекцию или перфузию в сайте поражения или повреждения, инъекцию в артериальную систему головного мозга или введение с помощью химического или осмотического открытия гематоэнцефалического барьера. Другие подходы могут включать использование различных транспортных систем и систем переносчиков, например, путем использования конъюгатов и биодеградируемых полимеров. Кроме того, стратегия генной терапии, описанная, например, в патентах Каплитта и Дэвидсона (Kaplitt et al., US 6180613 и Davidson, WO 04/013280), также могут использоваться для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты в ЦНС.

Доставка молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в ЦНС обеспечивается множеством различных стратегий. Традиционные или стандартные подходы к ЦНС доставке, которые могут использоваться, включают, без ограничения, интратекальное и интрацеребровентрикулярное введение, имплантацию катетеров и насосных устройств, прямую инъекцию или перфузию в сайте поражения или повреждения, инъекцию в артериальную систему головного мозга или за счет использования химического или осмотического открытия гематоэнцефалического барьера. Другие подходы могут включать использование различных транспортных систем и систем переносчиков, например, путем использования конъюгатов и биодеградируемых полимеров. Кроме того, могут использоваться методы генной терапии, описанные, например, в работах Каплитта с соавт. и Дэвидсона (Kaplitt et al., US 6180613 и Davidson, WO 04/013280), для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты в ЦНС.

В одном варианте соединение, молекулу или композицию для лечения состояний, связанных с системой зрения (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и т.п.), вводят субъекту внутриглазнично или с помощью внутриглазных способов введения. В другом варианте соединение, молекулу или композицию для лечения состояний, связанных с органами зрения (например, дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и т.п.), вводят субъекту окологлазнично или с помощью окологлазничных методов введения (см., например, Ahlheim et al., международная публикация PCT № WO 03/24420). В одном варианте молекулу киНК и/или препарат, или композицию на ее основе вводят субъекту внутриглазнично или с помощью внутриглазничных способов. В другом варианте молекулу киНК и/или препарат, или композицию на ее основе вводят субъекту окологлазнично или с помощью окологлазничных способов. В основном, окологлазничная доставка обеспечивает менее инвазивный подход к введению молекул киНК и/или препарата, или композиций на ее основе субъекту (см., например, Ahlheim et al., международная публикация PCT № WO 03/24420). Использование окологлазничного введения также минимизирует риск отслоения сетчатки, что позволяет осуществлять более частое введение дозы, и обеспечивает клинически релевантный способ введения в случае дегенерации желтого пятна и других состояний системы зрения, а также обеспечивает возможность использования резервуарных устройств для доставки лекарственных препаратов (например, имплантатов, насосов или других устройств). В одном варианте соединения и композиции на основе киНК согласно настоящему изобретению вводят локально, например, с помощью внутриглазничных или окологлазничных способов, таких как инъекция, ионтофорез (см., например, WO 03/043689 и WO 03/030989) или имплантат, примерно каждые 1-50 недель (например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 недель), индивидуально или в сочетании с другими соединениями и/или видами терапии согласно настоящему изобретению. В одном варианте соединения и композиции киНК согласно настоящему изобретению вводят системно (например, с помощью внутривенного, подкожного, внутримышечного введения, с помощью инфузии, с помощью насоса, имплантата и т.п.) примерно каждые 1-50 недель (например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 недель), индивидуально или в сочетании с другими соединениями и/или видами терапии согласно настоящему изобретению.

В одном варианте настоящее изобретение относится к использованию способов доставки молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в гематопоэтические клетки, включающие моноциты и лимфоциты. Указанные способы описаны детально в литературе (Hartmann et al., 1998, J. Pharmacol. Exp. Ther., 285(2), 920-928; Kronenwett et al., 1998, Blood, 91(3), 825-862; Filion and Phillips, 1997, Biochim. Biophys. Acta., 1329(2), 345-356; Mа and Wei, 1996, Leuk. Res., 29(11/12), 925-930; и Bongartz et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22(22), 4681-8). Такие методы включают использование свободного олигонуклеотида, катионных липидных композиций, липосомных композиций, которые включают pH-чувствительные липосомы и иммунолипосомы, а также конъюгаты, включающие олигонуклеотиды, конъюгированные с фузогенными пептидами, например, с целью трансфекции гематопоэтических клеток олигонуклеотидами.

В одном варианте молекулы и композиции киНК согласно настоящему изобретению вводят во внутреннее ухо путем контакта киНК с клетками, тканями и структурами внутреннего уха, такими как лабиринтная структура, в условиях, подходящих для введения. В одном варианте указанные введения включают способы и устройства, описанные в патентах США №№ 5421818, 5476446, 5474529, 6045528, 6440102, 6685697, 6120484 и 5572594, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок, а также описаны в работах: Silverstein, 1999, Ear Nose Throat J., 78, 598-8, 600; и Jackson and Silverstein, 2002, Otolaryngol Clin North Am., 35, 639-53, которые адаптированы для использования молекул киНК согласно настоящему изобретению.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению и препараты или композиции на их основе вводят непосредственно или местно (например, локально) в дерму или фолликулы, в соответствии с известными в данной области процедурами (см., например, Brand, 2001, Curr. Opin. Mol. Ther., 3, 244-8; Regnier et al., 1998, J. Drug Target, 5, 275-89; Kanikkannan, 2002, BioDrugs, 16, 339-47; Wraight et al., 2001, Pharmacol. Ther., 90, 89-104; и Preat and Dujardin, 2001, STP PharmaSciences, 11, 57-68). В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению и препараты или композиции на их основе вводят непосредственно или местно с использованием водно-спиртовой гелевой композиции, включающей спирт (например, этанол или изопропанол), воду и необязательно дополнительные агенты, такие как изопропилмиристат и карбомер 980.

В одном варианте молекулу киНК согласно настоящему изобретению вводят путем ионтофореза, например, в конкретный орган или часть органа (например, в глаз, глазную выстилку, в сердце, легкое, почку, мочевой пузырь, предстательную железу, опухоль, ЦНС и т.п.). Не ограничивающие примеры ионтофоретической доставки описаны, например, в WO 03/043689 и WО 03/030989, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

В одном варианте соединения и композиции на основе киНК согласно настоящему изобретению вводят либо системно, либо локально примерно каждые 1-50 недель (в частности, примерно каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 недель), индивидуально или в сочетании с другими соединениями и/или видами терапии согласно настоящему изобретению. В одном варианте соединения и композиции киНК согласно настоящему изобретению вводят системно (например, с помощью внутривенного, подкожного, внутримышечного введения, с помощью инфузии, с помощью насоса, имплантата и т.п.) примерно каждые 1-50 недель (например, каждые примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 недель), индивидуально или в сочетании с другими соединениями и/или видами терапии согласно настоящему изобретению и/или известными в данной области.

В одном варианте системы доставки согласно настоящему изобретению включают, например, водные и неводные гели, кремы, множественные эмульсии, микроэмульсии, липосомы, мази, водные и неводные растворы, лосьоны, аэрозоли, углеводородные основы и порошки и могут содержать эксципиенты, такие как солюбилизаторы, усилители проницаемости (например, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, жирные спирты и аминокислоты) и гидрофильные полимеры (например, поликарбофил и поливинилпирролидон). В одном варианте фармацевтически приемлемыми носителями являются липосомы или трансдермальный усилитель. Примеры липосом, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению, включают следующие: (1) CellFectin, 1:1,5 (M/M) липосомная композиция катионного липида N,NI,NII,NIII-тетраметил-N,NI,NII,NIII-тетрапальмитил-спермина и диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) (GIBCO BRL); (2) цитофектин GSV, 2:1 (M/M) липосомная композиция катионного липида DOPE (Glen Research); (3) DOTAP (N-[1-(2,3-диолеоилокси)-N,N,N-три-метил-аммонийметилсульфат) (Boehringer Manheim); и (4) липофектамин, 3:1 (M/M) липосомная композиция поликатионного липида DOSPA и нейтрального липида DOPE (GIBCO BRL).

В одном варианте системы доставки согласно настоящему изобретению включают пластыри, таблетки, суппозитории, пессарии, гели и кремы и могут содержать эксципиенты, такие как солюбилизаторы и усилители (например, пропиленгликоль, желчные соли и аминокислоты), и другие наполнители (например, полиэтиленгликоль, сложные эфиры жирной кислоты и их производные, а также гидрофильные полимеры, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза и гиалуроновая кислота).

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению вводят в состав композиции или комплекса с полиэтиленимином (например, линейным или разветвленным ПЭИ) и/или с производными полиэтиленимина, включая, например, сшитые ПЭИ, такие как галактоза-ПЭИ, холестерин-ПЭИ, дериватизированные ПЭИ с антителом и полиэтиленгликоль-ПЭИ (ПЭГ-ПЭИ) производные (см., например, Ogris et al., 2001, AAPA PharmaSci, 3, 1-11; Furgeson et al., 2003, Bioconjugate Chem., 14, 840-847; Kunath et al., 2002, Pharmaceutical Research, 19, 810-817; Choi et al., 2001, Bull. Korean Chem. Soc., 22, 46-52; Bettinger et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 558-561; Peterson et al., 2002, Bioconjugate Chem., 13, 845-854; Erbacher et al., 1999, Journal of Gene Medicine Preprint, 1, 1-18; Godbey et al., 1999, PNAS USA, 96, 5177-5181; Godbey et al., 1999, Journal of Controlled Release, 60, 149-160; Diebold et al., 1999, Journal of Biological Chemistry, 274, 19087-19094; Thomas and Klibanov, 2002, PNAS USA, 99, 14640-14645; и Sagara, US 6586524), включенные в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

В одном варианте молекула киНК согласно настоящему изобретению включает биоконъюгат, например, конъюгат нуклеиновой кислоты, описанный Vargeese et al. в USSN 10/427160, зарегистрированном 30 апреля 2003 года; US 6528631; US 6335434; US 6235886; US 6153737; US 5214136; US 5138045, все указанные работы включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей одну или несколько нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению в приемлемом носителе, таком как стабилизатор, буфер и т.п. Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут вводиться (например, РНК, ДНК или белок) и вводятся субъекту с использованием стандартных методик с помощью небулайзеров, буферов и т.п. или без них, с образованием фармацевтической композиции. В том случае, когда желательно использовать липосомный механизм доставки, могут быть применены стандартные процедуры для образования липосом. Композиции согласно настоящему изобретению могут также изготавливаться и использоваться далее в виде кремов, гелей, спреев, масел и других подходящих композиций, применяемых для местного, дермального или трансдермального введения, известных в данной области.

Настоящее изобретение также включает фармацевтически приемлемые композиции описанных соединений. Указанные композиции включают соли приведенных выше соединений, например, аддитивные соли кислоты, такие как соли хлористоводородной, бромистоводородной, уксусной кислоты и бензолсульфоновой кислоты.

Термин «фармакологическая композиция» или «фармакологический препарат» относится к композиции или препарату в форме, подходящей для введения, например, системного или локального введения в клетку или субъекту, включая, например, человека. Подходящие формы частично зависят от варианта использования или от способа введения, например, перорального, трансдермального введения или введения инъекцией. Такие формы не должны препятствовать достижению композицией или препаратом целевой клетки (то есть клетки, в которую желательно доставить отрицательно заряженную нуклеиновую кислоту). Так, например, фармакологические композиции, инъецируемые в кровоток, должны быть растворимыми. Другие факторы, известные в данной области, включают соображения относительно токсичности и тех форм, которые препятствуют композиции или препарату проявлять свойственный им эффект.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению вводят субъекту путем системного введения в фармацевтически приемлемой композиции или препарате. Термин «системное введение» обозначает системную абсорбцию или аккумуляцию in vivo лекарственных средств в кровотоке с последующим их распределением по всему организму. Способы введения, которые ведут к системной абсорбции, включают, без ограничения, внутримышечное, подкожное введение, введение в портальную вену, внутрибрюшинное введение, введение ингаляцией, пероральное введение, внутрилегочное и внутримышечное введение. Каждый из указанных способов введения позволяет доставить молекулу киНК согласно настоящему изобретению в доступные ткани, пораженные заболеванием (например, в легкое). Было показано, что уровень поступления лекарственного средства в кровоток является функцией его молекулярного веса или размера. Использование липосом или другого носителя для лекарственных средств, включающих соединения согласно настоящему изобретению, может позволить локализовать лекарственное средство, например, в некоторых типах тканях, в таких как ткани ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). Могут использоваться также липосомные композиции, которые облегчают ассоциацию лекарственного препарата с поверхностью клеток, таких как лимфоциты и макрофаги. Такой подход может обеспечивать повышенную доставку лекарственного препарата в целевые клетки за счет преимуществ, связанных со специфичностью макрофагального и лимфоцитарного распознавания аномальных клеток.

Фразы «фармацевтически приемлемый препарат» или «фармацевтически приемлемая композиция» обозначают препарат или композицию, которые позволяют осуществить эффективное распределение молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в физическом пространстве, которое является наиболее подходящим для проявления их желательной активности. Не ограничивающие примеры агентов, подходящих для создания препарата с молекулами нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, включают: ингибиторы P-гликопротеина (такие как Pluronic P85); биодеградируемые полимеры, такие как поли(DL-лактид-когликолид) микросферы для длительного высвобождения (Emerich, DF, et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58); а также наночастицы, такие как наночастицы, полученные из полибутилцианоакрилата. Другие не ограничивающие примеры стратегий доставки молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению включают следующие материалы: Boado et al., 1998, J. Pharm. Sci., 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; Pardridge et al., 1995, PNAS USA, 92, 5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15, 73-107; Aldrian-Herrada et al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; и Tyler et al., 1999, PNAS USA, 96, 7053-7058.

Настоящее изобретение также относится к использованию композиции, включающей липосомы с модифицированной поверхностью, содержащие поли(этиленгликолевые) липиды (ПЭГ-модифицированные или длительно циркулирующие липосомы, или покрытые липосомы) и молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Указанные композиции представляют способ повышения аккумуляции лекарственных средств (например, киНК) в целевых тканях. Данный класс носителей для лекарственных препаратов позволяет противостоять «опсоническому» влиянию иммунной сыворотки и элиминации мононуклеарной фагоцитарной системы (МФС или РЭС), что позволяет данным препаратам оставаться более продолжительное время в кровотоке и повышать длительность воздействия инкапсулированного средства на ткани (Lasic et al., Chem. Rev, 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull., 1995, 43, 1005-1011). Было показано, что такие липосомы селективно накапливаются в опухоли, преимущественно по механизму экстравазации, и захватываются нейроваскуляризирующимися целевыми тканями (Lasic et al., Chem. Rev, 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta., 1238, 86-90). Циркулирующие длительное время в кровотоке липосомы повышают фармакокинетику и фармакодинамику ДНК и РНК, в особенности в сравнении с традиционными катионными липосомами, которые, как известно, накапливаются в тканях MPS (Liu et al., J. Biol. Chem. 1995, 42, 24864-24870; Choi et al., международная PCT публикация № WO 96/10391; Ansell et al., международная PCT публикация № WO 96/10390; Holland et al., международная PCT публикация № WO 96/10392). Длительно циркулирующие в кровотоке липосомы также защищают, по всей видимости, лекарственные средства от нуклеазной деградации, в большей мере, чем катионные липосомы, в связи с их способностью избегать аккумуляции в метаболически агрессивных МФС тканях, таких как печень и селезенка.

В одном варианте липосомная композиция согласно настоящему изобретению включает молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (например, киНК), введенную в состав композиции или комплекс с соединениями и композициями, описанными в следующих документах: US 6858224; 6534484; 6287591, 6835395; 6586410; 6858225; 6815432; 6586001; 6120798; US 6977223; US 6998115; 5981501; 5976567; 5705385; US 2006/0019912; US 2006/0019258; US 2006/0008909; US 2005/0255153; US 2005/0079212; US 2005/0008689; US 2003/0077829, US2005/0064595; US 2005/0175682; US 2005/0118253; US 2004/0071654; US 2005/0244504; US 2005/0265961 и US 2003/0077829, все указанные работы включены в настоящее описание полностью в качестве ссылок.

Настоящее изобретение также включает композиции, изготовленные для хранения или введения, которые включают фармацевтически эффективное количество желательных соединений в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе. Приемлемые носители или разбавители для терапевтического использования хорошо известны в фармацевтике и описаны, например, в руководстве Ремингтона (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gаnnaro edit. 1985), которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. Так, например, в состав композиции могут вводиться консерванты, стабилизаторы, красители и вкусовые вещества. Указанные компоненты включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Кроме того, могут использоваться антиоксиданты и суспендирующие агенты.

Фармацевтически эффективная доза представляет собой такую дозу, которая необходима для предупреждения, ингибирования проявления или лечения (облегчения симптомов до некоторой степени, предпочтительно всех симптомов) болезненного состояния. Указанная фармацевтически эффективная доза зависит от типа заболевания, используемой композиции, способа введения, типа млекопитающего, который подлежит лечению, физических характеристик конкретного млекопитающего, подлежащего лечению, наличия дополнительных режимов лечения и других факторов, известных специалистам в данной области. В основном, указанное количество составляет от примерно 0,1 мг/кг до примерно 100 мг/кг веса тела/день активных ингредиентов, которые вводятся в зависимости от активности отрицательно заряженного полимера.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению и композиции на их основе могут вводиться перорально, местно, парентерально, путем ингаляции или распыления, а также ректально в виде стандартных дозированных композиций, содержащих традиционные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и/или наполнители. Термин «парентеральный» в контексте настоящего описания включает введение путем чрескожной, подкожной, внутрисосудистой (например, внутривенной), внутримышечной или интратекальной инъекции или инфузии и т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. При этом молекула одной или нескольких нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению могут присутствовать в ассоциации с одним или несколькими нетоксичными фармацевтически приемлемыми носителями и/или разбавителями, и/или адъювантами и, при желании, с другими активными ингредиентами. Фармацевтические композиции, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, могут иметь форму, подходящую для перорального использования, например, форму таблеток, пастилок, леденцов, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул, или сиропов или эликсиров.

Композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть получены в соответствии с любым методом, известным в данной области, применяемым при производстве фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или несколько подсластителей, вкусовых веществ, красителей или консервантов для создания фармацевтически элегантных и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые подходят для получения таблеток. Указанные эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие вещества, например, крахмал, желатин или аравийская камедь; и замасливатели, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или могут содержать покрывающую оболочку, нанесенную известными способами. В некоторых случаях такие покрытия могут быть получены с помощью известных методик для задержки разложения и абсорбции препарата в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечивают пролонгированное действие в течение длительного периода времени. Так, например, может использоваться задерживающий высвобождение материал, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.

Композиции для перорального использования могут быть также представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент перемешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или калия, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или минеральной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.

Водные суспензии содержат активные материалы в смеси с эксципиентами, пригодными для получения водных суспензий. Такие эксципиенты представляют собой суспензирующие агенты, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидропропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты могут быть представлены в виде природных фосфатидов, например, в виде лецитина или в виде продуктов конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, в виде полиоксиэтиленстеарата, или продуктов конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, в виде гептадекаэтиленоксицетанола, или продуктов конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситола, таких как полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат, или продуктов конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситола, например, полиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов, например, этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, одно или несколько вкусовых веществ и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.

Масляные суспензии могут быть изготовлены путем суспендирования активных ингредиентов в растительном масле, например, в арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подсластители и вкусовые вещества могут быть добавлены для улучшения вкусовых качеств пероральных препаратов. Указанные композиции могут содержать консерванты, функцию которых выполняет добавленный антиоксидант, такой как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для изготовления водной суспензии путем добавления воды, позволяют получить активный ингредиент в смеси с диспергирующим или смачивающим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Приемлемые диспергирующие или смачивающие агенты или суспендирующие агенты включают указанные выше агенты. Могут также присутствовать дополнительные эксципиенты, например, подсластители, вкусовые вещества и красители.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть также представлены в форме эмульсий типа масло-в-воде. Масляная фаза может быть представлена растительным маслом, минеральным маслом или их смесями. Подходящие эмульгирующие агенты могут представлять собой природные камеди, например, аравийскую камедь или трагакант, природные фосфатиды, например, соевый лецитин и сложные эфиры или частичные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и гекситола, ангидриды, например, сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Указанные эмульсии могут также содержать подсластители и вкусовые вещества.

Сиропы и эликсиры могут быть изготовлены с использованием подсластителей, например, глицерина, пропиленгликоля, сорбита, глюкозы или сахарозы. Такие композиции могут также содержать смягчитель, консервант, вкусовые вещества и красители. Фармацевтические композиции могут быть представлены в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии. Указанные суспензии могут быть изготовлены в соответствии с известными в данной области процедурами с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов, а также суспендирующих веществ, указанных выше. Стерильный инъецируемый препарат может быть также представлен в виде стерильного инъецируемого раствора или стерильной инъецируемой суспензии в нетоксичном парентерально приемлемом носителе или растворителе, например, в виде раствора 1,3-бутандиола. Среди приемлемых наполнителей и растворителей, которые могут быть использованы, можно указать воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, традиционно используются, в качестве растворителя или суспендирующей среды, стерильные жирные масла. Для этой цели может использоваться любое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при изготовлении инъецируемых форм могут найти применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут быть также введены в форме суппозиториев, например, суппозиториев для ректального введения лекарственного препарата. Указанные композиции могут быть приготовлены путем смешивания лекарственного вещества с подходящим нераздражающим эксципиентом, который представляет собой твердое вещество при обычных температурах, но разжижается при температуре в прямой кишке, и в этом случае размягчается в прямой кишке с высвобождением лекарственного вещества. Такие материалы включают какао-масло и полиэтиленгликоли.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут вводиться парентерально в стерильной среде. Лекарственное вещество, в зависимости от используемого наполнителя или его концентрации, может быть либо суспендировано, либо растворено в указанном носителе. С успехом могут применяться адъюванты, такие как местные анестетики, консерванты и забуферивающие агенты, которые могут быть растворены в наполнителе.

При лечении указанных выше состояний используются уровни дозировок в диапазоне от примерно 0,1 мг до примерно 140 мг на килограмм веса тела в день (от примерно 0,5 мг до примерно 7 г в расчете на субъекта в день). Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалами носителя с получением одной дозированной формы, варьирует, в зависимости от организма-хозяина, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Стандартные дозированные формы в основном содержат от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента.

Следует понимать, что конкретный уровень дозирования, подходящий для конкретного субъекта, зависит от множества факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, пищевые привычки, время введения, способ введения, скорость экскреции препарата, наличие сочетания с другими лекарственными средствами и тяжесть конкретного заболевания, подлежащего лечению.

Для введения животным, отличным от человека, в композицию может быть также добавлен корм для животных или питьевая вода. Обычно при изготовлении композиций для животных в их состав вводят корм и питьевую воду, так чтобы животное вместе с пищей принимало терапевтически приемлемое количество данной композиции. Принято также в этом случае изготавливать композицию в виде премикса, который впоследствии добавляют в корм или в питьевую воду.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению могут вводиться субъекту в сочетании с другими терапевтическими соединениями с целью повышения общего терапевтического эффекта. Использование множества соединений для лечения данного показания может повышать благоприятные эффекты, при сопутствующем снижении уровня полученных эффектов.

В одном варианте настоящее изобретение относится к композициям, подходящим для введения молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в конкретные типы клеток. Например, асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPr) (Wu and Wu, 1987, L. Biol. Chem., 262, 4429-4432) является уникальным для гепатоцитов и связывает разветвленные гликопротеины с галактозными концами, такие как асиалоорозомукоид (ASOR). Другой пример относится к тому, что во многих раковых клетках имеет место суперэкспрессия рецептора фолята. Связывание таких гликопротеинов, синтетических гликоконъюгатов или фолятов с рецептором происходит с аффинностью, которая строго зависит от степени разветвленности олигосахаридной цепи, например, триантенные структуры характеризуются большей аффинностью, чем биоантенные или моноантенные цепи (Baenziger and Fiete, 1980, Cell, 22, 611-620; Connoly et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). Ли и Ли (Lee and Lee, 1987, Glycoconjugate J., 4, 317-328) добились такой высокой специфичности при использовании N-ацетил-D-галактозамина в качестве углеводного фрагмента, который обладал большей аффинностью к рецептору, чем галактоза. Такой «кластерный эффект» также был описан для случая связывания и поглощения маннозил-терминальных гликопротеинов или гликоконъюгатов (Ponpipom et al., 1981, J. Med. Chem., 24, 1388-1395). Использование галактозы, галактозамина или конъюгатов на основе фолята для транспортировки экзогенных соединений через клеточные мембраны может обеспечивать целевую доставку, например, для лечения болезни печени, рака печени или других видов рака. Использование биоконъюгатов может также обеспечивать снижение требуемой дозы терапевтических соединений при лечении. Кроме того, терапевтическая биодоступность, фармакодинамика и фармакокинетические параметры могут модулироваться при использовании биоконъюгатов нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Не ограничивающие примеры таких конъюгатов описаны Варгезе с соавт. (Vergeese et al.,) в USSN 10/201394, зарегистрированном 13 августа 2001 года; и Матулич-Адамичем с соавт. (Matulic-Adamic et al.,) в USSN 60/362016, зарегистрированном 6 марта 2002 года).

Альтернативно, некоторые молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут экспрессироваться в клетках на основе эукариотических промоторов (см., например, Izant and Weintraub, 1985, Science, 229, 345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 399; Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol., 66, 1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol., 65, 5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Sarver et al, 1990, Science, 247, 1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Good et al., 1997, Gene Therapy 4, 45). Для специалистов в данной области очевидно, что любая нуклеиновая кислота может экспрессироваться в эукариотических клетках на основе подходящего вектора ДНК/РНК. Активность таких нуклеиновых кислот может быть повышена при их высвобождении из первичного транскрипта с помощью энзиматической нуклеиновой кислоты (Draper et al., PCT WO 93/23569 and Sullivan et al., PCT WO 94/02595; Ohkawa et al. 1992, Nucleic Acids Symp. Ser., 27, 15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19, 5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 25856).

В другом аспекте настоящего изобретения молекулы РНК могут быть экспрессированы из единиц транскрипции (см., например, Сouture et al., 1996, TIG., 19, 510), встроенных в ДНК или РНК векторы. Рекомбинантные векторы могут представлять собой ДНК плазмиды или вирусные векторы. киНК, экспрессирующие вирусные векторы, могут быть сконструированы на основе, например, без ограничения, аденоассоциированного вируса, ретровируса, аденовируса или альфавируса. В другом варианте используют конструкции на основе pol III для экспрессии молекул нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению (см., например, Thompson, патенты США №№ 5902880 и 6146886). Рекомбинантные векторы, способные к экспрессии молекул киНК, могут быть доставлены согласно приведенному выше описанию и могут длительно пребывать в целевых клетках. Альтернативно, могут использоваться вирусные векторы, которые обеспечивают временную экспрессию молекул нуклеиновой кислоты. Такие векторы могут быть повторно введены, при необходимости. При экспрессии молекула киНК взаимодействует с целевой мРНК и генерирует ответ по типу РНКи. Доставка векторов, экспрессирующих молекулу киНК, может быть системной, например, осуществляться с помощью внутривенного или внутримышечного введения, при введении целевых клеток, выделенных от субъекта с последующим повторным их введением субъекту, или с помощью любого другого способа, который позволит осуществить введение в желательную целевую клетку (обзор приведен в работе Сouture et al., 1996, TIG., 19, 510) .

В одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу киНК согласно настоящему изобретению. Вектор экспрессии может кодировать одну или обе цепи дуплекса киНК или одну самокомплементарную цепь, которая подвергается самогибридизации с образованием дуплекса киНК. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие молекулы киНК согласно настоящему изобретению, могут быть оперативно связаны таким образом, что позволяется экспрессия молекулы киНК (см., например, Paul et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology, 19, 497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology, 19, 500; и Novina et al., 2002, Nature Medicine, обновленная публикация online: doi:10.1038/нм725).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему: (а) участок инициации транскрипции (например, эукариотический участок инициации pol I, II или III); (b) участок терминации транскрипции (например, эукариотический участок терминации pol I, II или III) и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну из молекул киНК согласно настоящему изобретению, где указанная последовательность оперативно связана с указанным участком инициации и указанным участком терминации таким образом, что позволяется экспрессия и/или доставка молекулы киНК. Указанный вектор может необязательно включать открытую рамку считывания (ORF) для белка, оперативно связанного на 5'- стороне или на 3'- стороне последовательности, кодирующей киНК согласно настоящему изобретению; и/или интрон (интервенирующую последовательность).

Транскрипция последовательности молекулы киНК может быть осуществлена с использованием промотора для эукариотической РНК-полимеразы I (pol I), РНК-полимеразы II (pol II) или РНК-полимеразы III (pol III). Транскрипты на основе pol II или pol III промоторов экспрессируются на высоких уровнях во всех клетках; уровни, достигаемые под действием pol II промотора в каждом конкретном типе клеток, зависят от природы имеющихся рядом регуляторных последовательностей гена (энхансеры, молчащие последовательности и т.п.). Используются также прокариотические промоторы РНК-полимеразы, при условии, что фермент прокариотической РНК-полимеразы экспрессируется в соответствующих клетках (Elroy-Stein and Moss 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol., 217, 47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell Biol., 10, 4529-37). Некоторые исследователи показали, что молекулы нуклеиновой кислоты, экспрессируемые на основе таких промоторов, могут функционировать в клетках млекопитающих (например, Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res Dev., 2, 3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J., 11, 4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8000-4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res., 23, 2259; Sullenger & Cech, 1993, Science, 262, 1566). Более конкретно, единицы транскрипции, такие как единицы транскрипции, полученные из генов, кодирующих малую ядерную РНК U6 (мяРНК), транспортную РНК (тРНК) и РНК аденовируса VA, используются для достижения высоких концентраций желательных молекул РНК, таких как киНК, в клетках (Thompson et al., выше; Couture and Stinchcomb, 1996, выше; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acids Res., 22, 2830; Noonberg et al., патент США № 5624803; Good et al., 1997, Gene Ther., 4, 45; Beigelman et al., международная PCT публикация № WO 96/18736). Указанные выше единицы транскрипции киНК могут быть встроены во множество векторов для их введения в клетки млекопитающих, включающих, без ограничения, плазмидные ДНК-векторы, вирусные ДНК-векторы (такие как векторы на основе аденовируса или аденоассоциированного вируса) или векторы на основе вирусной РНК (такие как ретровирусные или альфавирусные векторы) (см. обзор Couture and Stinchcomb, 1996, выше).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, включающему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну из молекул киНК согласно настоящему изобретению таким образом, что разрешается экспрессия данной молекулы киНК. Указанный вектор экспрессии включает в одном варианте: (а) участок инициации транскрипции, (b) участок терминации транскрипции и (с) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну цепь молекулы киНК, где указанная последовательность оперативно связана с указанным участком инициации и указанным участком терминации транскрипции таким образом, что позволяется экспрессия и/или доставка молекулы киНК.

В другом варианте вектор экспрессии включает: (а) участок инициации транскрипции; (b) участок терминации транскрипции; (с) открытую рамку считывания и (d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну цепь молекулы киНК, где указанная последовательность оперативно связана с 3'-концом открытой рамки считывания и где указанная последовательность оперативно связана с участком инициации транскрипции, где открытая рамка считывания и участок терминации объединены таким образом, что позволяется экспрессия и/или доставка молекулы киНК. В еще одном варианте вектор экспрессии включает: (а) участок инициации транскрипции; (b) участок терминации транскрипции; (с) интрон; и (d) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну молекулу киНК, где указанная последовательность оперативно связана с участком инициации, интрон и участок терминации транскрипции связаны таким образом, что позволяется экспрессия и/или доставка молекулы нуклеиновой кислоты.

В другом варианте вектор экспрессии включает: (а) участок инициации транскрипции; (b) участок терминации транскрипции; (с) интрон; (d) открытую рамку считывания и (е) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну цепь молекулы киНК, где указанная последовательность оперативно связана с 3'-концом открытой рамки считывания и где указанная последовательность оперативно связана с участком инициации транскрипции, интроном, открытой рамкой считывания и участком терминации таким образом, что разрешается экспрессия и/или доставка молекулы киНК.

Примеры:

Ниже приведены не ограничивающие примеры, демонстрирующие отбор, выделение, синтез и активность нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению.

Пример 1: Тандемный синтез конструкций киНК

Репрезентативные молекулы киНК согласно настоящему изобретению синтезируют в тандеме с использованием расщепляемого линкера, например, сукцинил-содержащего линкера. Тандемный синтез, приведенный в настоящем описании, проводится в ходе одностадийного процесса очистки, который позволяет получать высокий выход молекул РНКи. Данный подход чрезвычайно удобен для синтеза киНК, поскольку позволяет проводить крупномасштабный скрининг РНКи и может быть легко адаптирован к многоколоночным или полиячеечным синтетическим платформам.

После завершения тандемного синтеза олигонуклеотидов киНК и соответствующего комплемента, где 5'-концевая диметокситритильная (5'-O-DMT) группа остается интактной (тритильный синтез), олигонуклеотиды подвергают депротекции согласно приведенному выше описанию. После депротекции последовательность цепей киНК спонтанно гибридизуется. Такого рода гибридизация приводит к образованию дуплекса, в котором одна цепь сохраняет 5'-O-DMT группу, тогда как комплементарная цепь включает концевой 5'-гидроксил. Вновь сформированный дуплекс ведет себя как одна молекула при проведении стандартной твердофазной экстракционной очистки (тритильная очистка), даже несмотря на то, что только одна молекула содержит диметокситритильную группу. Поскольку цепи образуют стабильный дуплекс, данная диметокситритильная группа (или эквивалентная группа, такая как другие тритильные группы или другие гидрофобные фрагменты) представляет собой все, что необходимо для очистки пары олигонуклеотидов, например, при использвоании C18 картриджа.

Используют метод стандартного фосфорамидитного химического синтеза до точки введения тандемного линкера, такого как инвертированный дезоксибезосновный сукцинатный или глицерилсукцинатный линкер (см. фиг. 1) или эквивалентный расщепляемый линкер. Не ограничивающий пример условий связывания линкера, которые могут при этом использоваться, включает наличие стерически закрытого основания, такого как диизопропилэтиламин (DIPA) и/или DMAP, в присутствии активатора, такого как бромтрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (PyBrOP). После связывания линкера используют стандартные методы химического синтеза для завершения синтеза второй последовательности, с интактным концевым 5'-O-DMT фрагментом. После синтеза полученный олигонуклеотид подвергают депротекции по процедурам согласно настоящему описанию и гасят реакцию подходящим буфером, например, с использованием 50 мМ NaOАc или 1,5М NH₄H₂CO₃.

Очистка дуплекса киНК может быть легко проведена с использованием твердофазной экстракции, например, с использованием картриджа Waters C18 SepPak (1 г) с 1 колоночным объемом (CV) ацетонитрила, 2 CV H₂O и 2 CV 50 мМ NaOAc. Вносят образец и затем промывают 1 CV H₂O или 50 мМ NaOAc. Не осевшие последовательности элюируют с использованием 1 CV 14% АCN (водный раствор, содержащий 50 мМ NaOAc и 50 мМ NаCl). Затем колонку промывают, например, 1 CV H₂O, с последующим детритилированием колонки, например, путем пропускания 1 CV 1% водной трифторуксусной кислоты (TФУ) через колонку, и затем добавляют второй CV 1% водной ТФУ к колонке и выдерживают в течение примерно 10 минут. Оставшийся раствор ТФУ удаляют, колонку промывают H₂O и затем с использованием 1 CV 1M NaCl и дополнительного количества воды. Дуплекс киНК элюируют, например, с использованием 1 CV 20% водной CAN.

На фиг. 2 проиллюстрирован пример масс-спектрометрического анализа по методу MALDI-TOF очищенной конструкции киНК, где каждый пик соответствует расчетной массе отдельной цепи киНК в дуплексе киНК. Одна очищенная киНК дает три пика при анализе методом капиллярного электрофореза (CGE), где один пик преимущественно соответствует дуплексу киНК и два пика преимущественно соответствуют отдельным цепям последовательности киНК. Ионообменный анализ в рамках процедуры ВЭЖХ одной и той же конструкции киНК дает лишь один пик. Анализ конструкции очищенной киНК с использованием люциферазного репортера в описанном ниже тесте показывает, что достигается та же активность РНКи, что и в случае конструкций киНК, полученных из отдельно синтезированных цепей олигонуклеотидной последовательности.

Пример 2: Идентификация потенциальных целевых сайтов киНК в любой последовательности РНК

Последовательность интересующей РНК-мишени, такой как транскрипт человеческой мРНК (например, любая из последовательностей, указанных в настоящем описании под соответствующим номером депонирования в GenBank), скринируется для выявления целевых сайтов, например, с использованием компьютерного алгоритма анализа структурирования. В не ограничивающем примере последовательность гена транскрипта РНК, полученного из базы данных, такой как GenBank, используют для создания мишеней киНК, характеризующихся комплементарностью к мишени. Такие последовательности могут быть получены из базы данных или могут быть определены экспериментально по известным методикам. Целевые сайты, которые известны, например, как целевые сайты, которые, по результатам определения, являются эффективными целевыми сайтами с молекулами других нуклеиновых кислот, например, с рибозимами или антисмысловыми последовательностями, или целевые сайты, которые, по известным данным, ассоциированы с заболеванием, признаком, или состоянием, например, как сайты, которые содержат мутации или делеции, могут использоваться для разработки молекул киНК, направленно воздействующих на такие сайты. Могут использоваться различные параметры для определения, какие сайты представляют собой наиболее подходящие целевые сайты в последовательности целевой РНК. Указанные параметры включают, без ограничения, вторичную или третичную структуру РНК, состав нуклеотидных оснований в целевой последовательности, степень гомологии между различными участками целевой последовательности или относительное положение целевой последовательности в транскрипте РНК. На основе такого рода определения, может быть выбрано любое число целевых сайтов в транскрипте РНК для скрининга молекул киНК на их эффективность, например, путем использования тестов на расщепление РНК in vitro, в клеточной культуре или на моделях животных. В не ограничивающем примере выбирают от 1 до 1000 целевых сайтов в транскрипте, на основе определения размера используемой конструкции киНК. Может быть разработан крупномасштабный тест для скрининга молекул киНК с использованием известных методик, таких как многоячеечный или многопланшетный тесты для определения эффективного снижения экспрессии целевого гена.

Пример 3: Выбор целевых сайтов молекулы киНК в РНК

Приведенные ниже не ограничивающие стадии могут использоваться в процедуре отбора киНК, направленно воздействующих на данную генную последовательность или на данный транскрипт.

1. Целевую последовательность вводят in silico в перечень всех фрагментов или подпоследовательностей, имеющих конкретную длину, например, фрагментов длиной в 23 нуклеотида, содержащихся в целевой последовательности. Обычно данную стадию проводят с использованием пользовательского пакета Perl script, но также могут использоваться коммерческие программы для анализа последовательностей, такие как Oligo, MacVector или GCG Wisconsin Package.

2. В некоторых случаях киНК соответствуют более чем одной целевой последовательности; такая ситуация имеет место в тех случаях, когда нужно направленное воздействие на разные транскрипты одного гена, направленное воздействие на разные транскрипты более чем одного гена или направленное воздействие и на человеческий ген, и на его гомолог в организме животного. В этом случае создают набор подпоследовательностей конкретной длины для каждой из мишеней и затем сравнивают наборы для выявления спаривающихся последовательностей в каждом наборе. Далее подпоследовательности ранжируют, в соответствии с числом целевых последовательностей, которые содержат данную подпоследовательность; целью такой манипуляции является поиск подпоследовательностей, которые присутствуют в большинстве или во всех целевых последовательностях. Альтернативно, в ходе ранжирования можно идентифицировать подпоследовательности, которые являются уникальными для целевой последовательности, такой как мутантная целевая последовательность. Такой подход будет позволять использовать киНК для направленного воздействия на конкретную мутантную последовательность, без воздействия на экспрессию нормальной последовательности.

3. В некоторых случаях подпоследовательности киНК отсутствуют в одной или нескольких последовательностях, но присутствуют в желательной целевой последовательности; такая ситуация имеет место в том случае, когда мишенью киНК является ген с паралогичным представителем семейства, который остается незатронутым. Как в указанном выше пункте 2, создают набор подпоследовательностей конкретной длины для каждой из мишеней и затем сравнивают наборы для поиска последовательностей, которые присутствуют в целевом гене, но отсутствуют в незатронутом паралоге.

4. Ранжированные подпоследовательности киНК могут быть далее проанализированы и заново ранжированы в соответствии с содержанием GC пар. Предпочтение отдается сайтам, содержащим 30-70% GC, еще большее предпочтение дается сайтам, содержащим 40-60% GC.

5. Ранжированные подпоследовательности киНК могут быть далее проанализированы и ранжированы в соответствии со способностью к самоскладыванию и наличию внутренних шпилечных структур. Предпочтительна более слабая внутренняя складчатая структура; тогда как более сильные шпилечные структуры не берутся.

6. Ранжированные подпоследовательности киНК могут быть далее проанализированы и ранжированы заново, в соответствии с тем, что они имеют в своей последовательности GGG или CCC. Наличие GGG (или даже больше G) в любой цепи может сделать синтез олигонуклеотидов проблематичным и даже потенциально препятствовать активности РНКи, поэтому следует избегать таких последовательностей, если доступны лучшие последовательностей. В целевой последовательности выискивается последовательность CCC, поскольку в этом случае последовательность GGG будет находиться в антисмысловой цепи.

7. Ранжированные подпоследовательности киНК могут быть далее проанализированы и ранжированы, в соответствии с тем, имеют ли они динуклеотид UU (уридиндинуклеотид) на 3'-конце последовательности и/или AA на 5'-конце последовательности (с образованием 3'-UU в антисмысловой последовательности). Указанные последовательности позволяют разрабатывать последовательности молекул киНК с концевыми TT тимидиндинуклеотидами.

8. Выбирают четыре или пять целевых сайтов из ранжированного набора подпоследовательностей, как было описано выше. Например, в подпоследовательностях, содержащих 23 нуклеотида, правосторонние 21 нуклеотиды из каждой выбранной 23-мерной подпоследовательности конструируют и синтезируют с получением верхней (смысловой) цепи дуплекса киНК, а обратный левосторонний 21-нуклеотидный комплемент для каждой выбранной 23-мерной последовательности конструируют и синтезируют с получением нижней (антисмысловой) цепи дуплекса киНК (см, Таблица II). Если желательны концевые ТТ остатки для последовательности (как описано в пункте 7), то два 3'-концевых нуклеотида из смысловой и антисмысловой цепей замещают ТТ до синтеза олигонуклеотидов.

9. Молекулы киНК скринируют in vitro в культуре клеток или на модели животных для идентификации наиболее активных молекул киНК или наиболее предпочтительного целевого сайта в последовательности целевой РНК.

10. При выборе последовательности целевой нуклеиновой кислоты могут быть использованы другие соображения, описанные в литературе (см., например, Reynolds et al., 2004, Nature Biotechnology Advanced Online Publication, опубликованный 1 февраля 2004 года, doi:10.10380/nbt936 и Ui-Tei et al., Nucleic Acids Research, 32, doi:10.1093/nar/gkh247).

В рамках альтернативного подхода, совокупность конструкций киНК, специфичных для целевой последовательности, используют для скрининга целевых сайтов в клетках, экспрессирующих целевую РНК, таких как клетки Jurkat, HeLa, A549 или 293T. На фиг. 9 показана основная стратегия, используемая в данном подходе. Клетки, экспрессирующие целевую РНК, трансфицируют совокупностью конструкций киНК и отбирают клетки, которые демонстрируют фенотип, ассоциированный с целевым ингибированием. Совокупность конструкций киНК может быть экспрессирована на основе кассет транскрипции, встроенных в соответствующие векторы (см., например, фиг. 7 и фиг. 8). киНК из клеток, демонстрирующих позитивное изменение фенотипа (например, сниженную пролиферацию, сниженные уровни целевой мРНК или сниженную экспрессию целевого белка), секвенируют для определения наиболее подходящих одного или нескольких целевых сайтов в последовательности целевой РНК.

В одном варианте молекулы киНК согласно настоящему изобретению выбирают с использованием следующей методики. Приведенное ниже руководство позволяет предсказать гиперактивные киНК, которые содержат химические модификации согласно настоящему описанию. Указанные правила были получены в результате сравнительного анализа гиперактивных (более 75% выключения по уровням целевой мРНК) и неактивных (менее 70% выключения по уровням целевой мРНК) киНК против нескольких различных мишеней. Всего было проанализировано 242 последовательности киНК. Тридцать пять киНК из 242 киНК отбирают в группу гиперактивности, а оставшиеся киНК группируют к неактивной группе. Гиперактивные киНК демонстрируют явную преференцию к определенным основаниям в конкретных нуклеотидных положениях последовательности киНК. Например, нуклеотидные основания А или U широко представлены в положении 19 смысловой цепи в гиперактивных киНК, тогда как для неактивных справедлива обратная ситуация. Отмечалась та же картина А/U обогащения (3 из 5 оснований в виде A или U) между положениями 15 и 19, и обогащения G/C на участке между положениями 1-5 (3 из 5 оснований представляли собой G или С) в смысловой цепи в гиперактивных киНК. Как показано в таблице V, было идентифицировано 12 характерных особенностей для гиперактивных киНК. Следует отметить, что не каждая из указанных картин была представлена в каждой гиперактивной киНК. Таким образом, для разработки алгоритма предсказания гиперактивных киНК, каждой картине должен быть присвоен балльный показатель. В зависимости от того, как часто такие картины встречаются в гиперактивных киНК, в сравнении с неактивными киНК, каждому параметру был присвоен определенный балльный показатель, при наивысшем показателе 10. Если определенное нуклеотидное основание не присутствует в каком-то положении, то ему присваивается отрицательный балл. Так, например, в положениях 9 и 13 смысловой цепи, G нуклеотид не предпочтителен в гиперактивных киНК и, следовательно, ему был присвоен балльный показатель -3 (минус 3). Дифференциальные системы ранжирования для каждой картины приведены в таблице V. Картина #4 получила максимальный балльный показатель 100. Прежде всего, это отсекает любую последовательность, которая содержит тяж 4G или 4С, поскольку такой тяж будет в высшей степени не совместим с процедурой синтеза, открывая возможность самоагрегации последовательности, что сделает киНК неактивной. При использовании этого алгоритма, наибольший балл, возможный для любой киНК, составляет 66. Поскольку имеется множество возможных последовательностей киНК для любой данной мишени разумного размера (~1000 нуклеотидов), такой алгоритм будет полезен для создания гиперактивных киНК.

В одном варианте используется правило 1-11, показанное в таблице V, для создания молекул активных киНК согласно настоящему изобретению. В другом варианте используется правило 1-12, показанное в таблице V, для создания молекул активных киНК согласно настоящему изобретению.

Пример 4: Конструирование киНК

Целевые сайты для киНК отбирают при анализе последовательностей мишеней и необязательно выбираются приоритетные целевые сайты на основе правил, приведенных выше в примере 3, а также, альтернативно, с учетом наличия складчатой структуры (анализируется структура любой данной последовательности для определения доступности мишени для киНК) или на основе библиотеки молекул киНК, как описано в примере 3, или, альтернативно, при использовании системы киНк in vitro, согласно процедуре примера 6. Молекулы киНК конструируют таким образом, чтобы они могли связываться с каждой мишенью, выбирая с использованием указанного выше алгоритма, и необязательно по отдельности анализируют на наличие складчатой структуры с использованием компьютерной программы для оценки, может ли данная молекула киНК взаимодействовать с целевой последовательностью. Могут быть отобраны молекулы киНК варьирующей длины для оптимизации активности. В основном выбирают достаточное количество комплементарных нуклеотидных оснований для связывания или осуществления иного взаимодействия с целевой РНК, но степень комплементарности может модулироваться, для соответствия дуплексам, варьирующим по длине и составу оснований. В рамках указанных методик молекулы киНК могут разрабатываться таким образом, чтоб они могли воздействовать на сайты внутри любой известной последовательности РНК, например, последовательности РНК, соответствующей любому генному транскрипту.

Анализируют целевые последовательности для выявления мишеней, на основе которых могут быть разработаны двухцепочечные киНК (таблица II). При создании синтетических конструкций киНК используют алгоритм, описанный в примере 3, для отбора активных двухцепочечных конструкций и их химически модифицированных версий. Так, например, в таблице 2 приведена целевая последовательность, с указанием верхней (смысловой) цепи и нижней (антисмысловой) цепи дуплексом киНК. Полифункциональные киНК создают при поиске гомологичных сайтов между разными целевыми последовательностями (например, участками общей гомологии, включающими от примерно 5 до примерно 15 нуклеотидов) и разрешают при этом образование неканонических пар оснований (например, не строгое спаривание оснований G:U) или ошибочное спаривание оснований.

Создают химически модифицированные конструкции киНК согласно настоящему описанию (см., например, таблица I) для достижения нуклеазной стабильности при системном введении in vivo и/или для улучшения фармакокинетических условий, локализации и способности к доставке, при сохранении способности к проявлению РНКи активности. Химические модификации согласно настоящему описанию вводят в синтетические с использованием методов синтеза, описанных в настоящем изобретении и известных в данной области. Синтетические конструкции киРКН далее тестируют на наличие нуклеазной стабильности в сыворотке и/или в клеточных/тканевых экстрактах (например, в экстрактах печени). Синтетические конструкции киНК также тестируют параллельно на наличие РНКи активности в рамках соответствующего теста, такого как люциферазный репортерный тест, приведенный в настоящем описании, или другой подходящий тест, который может использоваться для количественной оценки активности РНКи. Синтетические конструкции киНК, которые обладают и нуклеазной стабильностью, и РНКи активностью, могут быть далее модифицированы и повторно протестированы с точки зрения их стабильности и активности в соответствующих тестах. Далее химические модификации стабилизированных конструкций активных киНК могут быть применены к любой последовательности киНК, направленно воздействующей на любую выбранную РНК, и использованы, например, при целевом скрининге для отбора ведущих киНК соединений, пригодных для дальнейшей разработки в качестве терапевтических средств (см., например, фиг. 11).

Пример 5: Химический синтез и очистка киНК

Молекулы киНК могут быть созданы таким образом, чтобы они взаимодействовали с различными сайтами матричной РНК, например, с целевыми последовательностями внутри последовательности РНК согласно настоящему описанию. Последовательность одной цепи одной или нескольких молекул киНК комплементарна последовательностям целевого сайта, описанным выше. Молекулы киНК могут быть химически синтезированы с использованием описанных методов. Неактивные молекулы киНК, которые используются в качестве контрольных последовательностей, могут быть синтезированы путем разбивки последовательности молекул киНК, так что она перестает быть комплементарной целевой последовательности. В основном конструкции киНК могут быть синтезированы с использованием твердофазного синтеза олигонуклеотидов, в соответствии с приведенными в настоящем описании методами (см., например, Usman et al., патенты США №№ 5804683; 5831071; 5998203; 6117657; 6353098; 6362323; 6437117; 6469158; Scaringe et al., патенты США №№ 6111086; 6008400; 6111086, все работы включены в настоящее описание в качестве ссылок).

В не ограничивающем примере олигонуклеотиды РНК синтезируют в ходе ступенчатого процесса с использованием методов фосфорамидитной химии, известных в данной области. Стандартные методы фосфорамидитной химии основаны на использовании нуклеозидов, включающих любые из следующих соединений: 5'-O-диметокситритильные, 2'-O-трет-бутилдиметилсилильные, 3'-O-2-цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидитные группы и экзоциклические защитные группы для аминогрупп (например, N6-бензоиладенозин, N4-ацетилцитидин и N2-изобутирилгуанозин). Альтернативно, 2'-O-силиловые эфиры могут быть использованы в сочетании с кислотолабильными 2'-O-ортоэфирными защитными группами в синтезе РНК, как было описано в работе Скаринжа (Scaringe, выше). Различные методы синтеза на основе 2'-групп требуют различных защитных групп, например, в случае 2'-дезокси-2'-аминонуклеозидов может использоваться N-фталоильная защита, описанная в патенте США № 5631360 (Usman et al.), который включен в настоящее описание полностью в качестве ссылки.

В ходе твердофазного синтеза каждый нуклеотид добавляют последовательно (в 3'-5'-направлении) к олигонуклеотиду, ковалентно присоединенному к твердой подложке. Первый нуклеозид на 3'-конце цепи ковалентно присоединяют к твердой подложке (например, к стеклу с контролируемым размером пор или к полистиролу) с использованием различных линкеров. Объединяют нуклеотидный предшественник, рибонуклеозид-фосфорамидит и активатор, что приводит к связыванию второго нуклеозид-фосфорамидита на 5'-конце первого нуклеозида. Затем подложку промывают и непрореагировавшие 5'-гидроксильные группы захватываются кэпинг-реагентом, таким как уксусный ангидрид, с образованием неактивных 5'-ацетильных фрагментов. Далее окисляют трехвалентную фосфорную связь с получением более стабильной фосфатной связи. В конце цикла добавления нуклеотидов, 5'-O-защитную группу расщепляют в подходящих условиях (например, в кислых условиях, для случая тритильных групп, и в присутствии флуорида, в случае силильных групп). Указанный цикл повторяют для каждого последующего нуклеотида.

Модификация условий синтеза может быть использована для оптимизации эффективности связывания, например, при использовании различного времени связывания, различных концентраций реагента/фосфорамидита, различного времени контактирования, различных твердых подложек и различных линкеров для твердой подложки, определяемых конкретным химическим составом синтезируемых киНК. Депротекция и очистка киНК может быть в основном проведена по методу, описанному в патентной литературе (Usman et al., US 5831071; US 6353098; US 6437117 и Bellon et al., US 6054576; US 6162989, US 6303773 или Scaringe et al., выше, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки). Дополнительно, условия депротекции могут быть модифицированы для обеспечения максимально достижимого выхода и наибольшей чистоты конструкций киНК. Например, заявитель обнаружил, что олигонуклеотиды, включающие 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды, могут деградировать в неподходящих для депротекции условиях. Такие олигонуклеотиды подвергают депротекции с использованием водного метиламина при температуре примерно 35°С в течение 30 минут. Если 2'-дезокси-2'-фтор-содержащий олигонуклеотид также включает рибонуклеотиды, после дерпотекции водным метиламином при температуре 35°С в течение 30 минут, добавляют TEA-HF и реакцию продолжают при температуре примерно 65°С еще в течение 15 минут. Одиночные цепи киНК со снятой защитой очищают анионообменной хроматографией с получением продуктов высокой чистоты и со все еще высоким выходом. Для формирования молекулы дуплекса киНК единичные цепи объединяют в эквимолярных соотношениях в солевом растворе с образованием дуплекса. Дуплекс киНК концентрируют и обессоливают тангенциальным фильтрованием перед лиофилизацией.

Пример 6: РНКи тест in vitro, используемый для оценки активности киНК

В бесклеточной системе in vitro проводят тест, в котором воспроизведены все условия процесса РНКи, для оценки конструкций киНК, направленно воздействующих на мишени РНК. Указанный тест включает систему, описанную в литературе (Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 и Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33), которая адаптирована для использования с целевой РНК. Используют экстракт дрозофилы, полученный из синцитиальной бластодермы, для восстановления активности РНКи in vitro. Получают целевую РНК путем транскрипции in vitro на основе соответствующей плазмиды, экспрессирующей нужную мишень, с использованием РНК-полимеразы Т7 или путем химического синтеза согласно настоящему описанию. Подвергают отжигу смысловую и антисмысловую цепи киНК (например, по 20 мкМ каждой) путем инкубации в буфере (таком как 100 мМ ацетат калия, 30 мМ HEPES-KOH при pH 7,4, 2 мМ ацетат магния) в течение 1 минуты при температуре 90°С и затем в течение 1 часа при температуре 37°С, после чего разбавляют лизирующим буфером (например, как 100 мМ ацетат калия, 30 мМ HEPES-KOH при pH 7,4, 2 мМ ацетат магния). Отжиг можно отслеживать при проведении гель-электрофореза на агарозном геле в TBE буфере с последующим окрашиванием этидиум-бромидом. Лизат дрозофилы получают с использованием эмбрионов от 0 до 2-х часового возраста от мух Oregon R, собранных на дрожжевом агаре, который подвергают дехлорированию и лизируют. Указанный лизат центрифугируют и отделяют супернатант. Данный тест включает реакционную смесь, которая содержит 50% лизата [объем/объем], РНК (конечная концентрация 10-50 пМ) и 10% [объем/объем] лизирующего буфера, содержащего киНК (конечная концентрация 10 нМ). Реакционная смесь также содержит 10 нМ креатинфосфата, 10 мг/мл креатинфосфокиназы, 100 мкМ GTP, 100 мкМ UTP, 100 мкМ CTP, 500 мкМ ATP, 5 мМ DTT, 0,1 Ед/мкл RNasin (Promega) и по 100 мкМ каждой аминокислоты. Конечную концентрацию ацетата калия доводят до 100 мМ. Реакционные смеси объединяют на льду и проводят предварительную инкубацию при температуре 25°С в течение 10 минут перед добавлением РНК, после чего проводят инкубацию при температуре 25°С в течение еще 60 минут. После этого реакцию гасят добавлением 4 объемов 1,25×лизирующего буфера (Passive Lysis Buffer (Promega)). Проводят тест на расщепление целевой РНК путем анализа в рамках ОТ-ПЦР или с использованием другого известного в данной области метода и далее сравнивают полученные результаты с результатами контрольных реакций, в которых реакционная смесь не содержит киНК.

Альтернативно, получают меченную по внутренним положениям целевую РНК для теста путем транскрипции in vitro в присутствии [альфа-³²P] CTP, пропускают через колонку с Сефадексом G50 в ходе спин-хроматографии и далее используют без дополнительной очистки в качестве целевой РНК. Необязательно, целевая РНК представляет собой 5'-³²P-концевую РНК, меченную с использованием полинуклеотидкиназы T4. Указанные тесты проводят согласно приведенному выше описанию, где целевую РНК и продукты специфического расщепления РНК, полученные в ходе РНКи, визуализируют при ауторадиографии геля. Процент расщепления определяют с помощью PHOSPHOR IMAGER® (ауторадиография) при подсчете полос, соответствующих интактным контрольным РНК или РНК, полученным в контрольных реакциях без добавления киНК, и продуктов расщепления, полученных в данном тесте.

В одном варианте указанный тест используют для определения целевых сайтов в мишени целевой РНК для киНК-опосредованного расщепления в рамках РНКи, где множество конструкций киНК скринируют на наличие РНКи-опосредованного расщепления мишени целевой РНК, например, путем анализа тест-реакции электрофорезом меченой целевой РНК или с помощью нозерн-блоттинга, а также других методик, известных в данной области.

Пример 7: Ингибирование нуклеиновой кислотой целевой РНК

Разрабатывают и синтезируют молекулы киНК, направленные на целевую РНК, согласно приведенному выше описанию. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты могут быть протестированы на наличие у них расщепляющей активности in vivo, например, с использованием приведенной ниже процедуры. Целевые последовательности и расположение нуклеотидов в целевой РНК показаны в таблице II.

Используют два формата для тестирования эффективности киНК по направленному воздействию на любую целевую последовательность. Вначале тестируют реагенты в клеточной культуре с использованием клеток HepG2, Jurkat, HeLa, A549 или 293Т, для определения уровня ингибирования РНК и белка. Реагенты киНК отбирают применительно к мишени согласно приведенной в настоящем описании процедуре. Ингибирование РНК определяют после доставки указанных реагентов подходящим агентом трансфекции, например, в клетках HepG2, Jurkat, HeLa, A549 или 293Т. Измеряют относительные количества целевой РНК против актина при проведении мониторинга амплификации ПЦР в масштабе реального времени (например, с использованием ABI 7700 TAQMAN®). Проводят сравнение со смесью олигонуклеотидных последовательностей, полученных для неродственных мишеней или рандомизированной контрольной киНК, имеющих такую же общую длину и химическую структуру, но со случайными замещениями по каждому положению. Первичные и вторичные лидирующие реагенты выбирают для конкретной цели и проводят оптимизацию. После выбора оптимальной концентрации агента трансфекции, проводят реакцию ингибирования РНК с использованием лидерной молекулы киНК. Дополнительно, может быть использован клеточно-планшетный формат для выявления ингибирования РНК.

Доставка киНК в клетки

Клетки (например, HepG2, Jurkat, HeLa, A549 или 293Т) высевают, например, с плотностью 1×10⁵ клеток на ячейку в 6-ячеечные планшеты в EGM-2 (Bio Whittaker) за день до трансфекции. Проводят комплексообразование киНК (в конечной концентрации, например, 20 нМ) и катионного липида (например, композиции LNP согласно настоящему описанию или другого подходящего липида, такого как липофектамин с конечной концентрацией 2 мкг/мл) в базальной среде EGM (Biowhittаker) при температуре 37°С в течение 30 минут в полистироловых пробирках. После перемешивания в вихревом смесителе добавляют комплекс с киНК к каждой ячейке и проводят инкубирование в течение указанного периода времени. При проведении сходных экспериментов по оптимизации, клетки высевают, например, с плотностью 1×10³ в 96-ячеечные планшеты и добавляют комплекс киНК согласно настоящему описанию. Определяют эффективность доставки киНК в клетки с использованием флуоресцентной киНК в комплексе с липидом. Клетки в 6-ячеечных планшетах инкубируют с киНК в течение 24 часов, промывают ФБР и фиксируют 2% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре. Визуализируют поглощение киНК с использованием флуоресцентного микроскопа.

Количественное определение мРНК по процедуре TAQMAN® (мониторинг амплификации по процедуре ПЦР в масштабе реального времени) и LightCycler

Получают суммарную РНК из клеток после доставки киНК, например, с использованием наборов для очистки РНК Qiagen в 6-ячеечном формате или наборов Rneasy для анализа с использованием 96-ячеечных планшетов. Для проведения TAQMAN® анализа (мониторинг амплификации по процедуре ПЦР в масштабе реального времени) синтезируют меченные двойной меткой пробы с использованием репортерного красителя, FAM или JOE, ковалентно присоединенного к 5'-концу, и с помощью гасящего красителя TAMRA, коъюгированного с 3'-концом. Проводят одностадийные реакции амплификации по процедуре ОТ-ПЦР, например, с использованием детектора ABI PRISM 7700 и с использованием реакционных смесей по 50 мкл, состоящих из 10 мкл суммарной РНК, 100 нМ прямого праймера, 900 нМ обратного праймера, 100 нМ зонда, реакционного буфера для ПЦР 1X TaqMan (PE-Applied Biosystems), 5,5 мМ MgCl₂, 300 мкМ каждого из dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 10 Ед ингибитора РНКазы (Promega), 1,25 Ед AMPLITAQ GOLD® (ДНК-полимераза) (PE-Applied Biosystems) и 10 Ед обратной транскриптазы M-MLV (Promega). Термические условия циклической обработки могут состоять из 30 минут обработки при температуре 48°С, 10 минут обработки при 95°С с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при 95°С и в течение 1 минуты при температуре 60°С. Количественное определение уровней мРНК проводят относительно стандартов, полученных из серийно разбавленной суммарной клеточной РНК (300, 100, 33, 11 нг/реакцию), и нормализуют до мРНК β-актина или GAPDH параллельными с реакциями TAQMAN® (мониторинг амплификации по процедуре ПЦР в масштабе реального времени). Для каждого интересующего гена разрабатывают верхний и нижний праймеры и флуоресцентно меченый зонд. Включение зеленого красителя I (SYBR Green I) в специфический продукт ПЦР может быть измерено в стеклянных капиллярных пробирках с использованием LightCyсler. Строят стандартную кривую для каждой пары праймеров с использованием контрольной кРНК. Полученные значения выражают в виде относительной экспрессии применительно к GAPDH в каждом образце.

Вестерн-блоттинг

Ядерные экстракты получают с использованием стандартной методики получения микропрепаратов (см., например, Andrews and Faller, 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2499). Белковые экстракты из супернатантов получают с использованием, например, методики осаждения ТХУ. Добавляют равный объем 20% ТХУ к клеточному супернатанту, инкубируют на льду в течение 1 часа и осаждают центрифугированием в течение 5 минут. Осадок промывают ацетоном, сушат и ресуспендируют в воде. Экстракты клеточного белка разгоняют на 10% Bis-Tris NuРage (ядерные экстракты) или 4-12% Трис-глицин (экстракты супернатанта) в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозные мембраны. Неспецифическое связывание может быть блокировано инкубацией, например, с 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа и затем с первичным антителом в течение 16 часов при температуре 4°С. После промывки вносят вторичное антитело, например, в течение 1 часа (разбавление 1:10000) при комнатной температуре и выявляют сигнал с использованием реагента SuperSignal (Pierce).

Пример 8: Модели, используемые для оценки отрицательной регуляции экспрессии целевого гена

Оценка эффективности молекул киНК согласно настоящему описанию на моделях животных представляет собой очень важный параметр, учитываемый при проведении клинических испытаний на людях. Различные модели животных, включая модели рака, пролиферативных, воспалительных, аутоиммунных, неврологических, глазных, респираторных, метаболических, органов слуха, дерматологических и других заболеваний, состояний или расстройств, известных в данной области, могут быть адаптированы для использования в рамках доклинической оценки эффективности композиций нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению с точки зрения модуляции экспрессии целевого гена, в направлении их терапевтического, косметического или исследовательского применения.

Пример 9: РНКи-опосредованное ингибирование экспрессии целевого гена

In vitro киНК-опосредованное ингибирование целевой РНК

Конструкции РНК тестируют для оценки их эффективности по снижению экспрессии целевой РНК в клетках (например, HEKn/HEKa, HeLa, A549, А375). Клетки высевают примерно за 24 часа до трансфекции в 96-ячеечные планшеты по 5000-7500 клеток/ячейку, по 100 мкл/ячейку, так что ко времени трансфекции клетки сливаются на 70-90%. Для проведения трансфекции смешивают полученные после отжига киНК с реагентом для трансфекции (Lipofectamin 2000, Invitrogen) в объеме 50 мкл/ячейку и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре. Трансфицирующие смеси киНК добавляют к клеткам до конечной концентрации киНК, равной 25 нМ в объеме 150 мкл. Каждую трансфицирующую смесь киНК добавляют к 3 ячейкам в тройном повторе для оценки эффекта киНК. Клетки инкубируют при температуре 37°С в течение 24 часов при постоянном наличии трансфицирующей смеси киНК. Через 24 часа получают РНК в каждой ячейке с обработанными клетками. Вначале отбирают и отбрасывают супернатанты с трансфецирующими смесями, затем клетки лизируют и получают РНК из каждой ячейки. Оценивают экспрессию целевого гена после обработки по процедуре ОТ-ПЦР целевого гена и контрольного гена (36B4, субъединица РНК-полимеразы) для нормализации. Полученные в тройном повторе данные усредняют и определяют стандартное отклонение для каждой обработки. Строят график на основе нормализованных данных и определяют процент снижения уровня целевой мРНК активными киНК в сравнении с их соответствующими инвертированными контрольными киНК.

Пример 10: Эффективность стабилизированных конструкций киНК с одним или несколькими рибонуклеотидами в выбранных позициях

Получают химерные конструкции киНК (см. таблицу II), которые содержат 6-рибонуклеотидные блоки либо на смысловой цепи (цепь-«пассажир»), либо на антисмысловой цепи (ведущая цепь), при этом все другие нуклеотиды остаются химически модифицированными. Выключенную мутацию целевого HBV месенджера выявляют путем измерения уровней белка (HBsAg) вместо уровней мРНК. Наличие блока рибонуклеотидов на 5'- или 3'-конце смысловой цепи или ведущей цепи в киНК демонстрирует сильную активность по молчанию, как в случае конструкций киНК, в которых рибонуклеотидный блок на концах также содержит рибонуклеотидную часть на противоположной цепи. Данные для HBV сайта 262 конструкций киНК приведены на фиг. 30, сайта 263 конструкций киНК - на фиг. 31 и сайта 1583 конструкций киНК - на фиг. 32.

Определение показателей ИК50 в культуре тканей позволило выявить, что химерные киНК, содержащие блок из 6 рибонуклеотидов в концевых положениях киНК для сайтов 262, 263 и 1583 HBV (см, фиг. 33 и 34), сохраняют активность. Были исследованы другие конструкции, в которых содержание рибонуклеотидов было снижено до одного рибонуклеотидного остатка в 5'-концевом положении последовательности ведущей цепи, комплементарной к сайту 263 HBV, на их способность вовлекаться в процесс РНКи. Эксперименты in vitro позволили выявить, что единственный рибонуклеотидный остаток в 5'-концевом положении ведущей цепи сохраняет активность химически модифицированного дуплекса киНК (химические структуры 7/23, 7/24 и/или 7/28, см. фиг. 35). Поскольку дуплекс киНК, содержащий единственный рибонуклеотидный остаток в 5'-концевом нуклеотидном положении антисмысловой цепи, способен расщеплять целевую РНК в каталитическом режиме, может быть сделан вывод о том, что 2'-OH группа в составе молекулы киРНК не участвует непосредственно в каталитическом расщеплении целевой РНК. Были исследованы дополнительные конструкции киНК, созданные в виде Stab 7/23, 7/24, 7/25, 7/26, 7/27 и 7/28 стабилизационных структур (см. таблицу I), для оценки их способности вовлекаться в РНКи. Исследование сывороточной стабильности in vitro конструкции 7/25 киНК показало, что данная конструкции имеет период полувыведения из сыворотки человека >24 часов.

Заявитель провел тесты на расщепление РНКи in vitro с использованием лизата клеток HeLA в качестве источника белков RISC для оценки различных киНК на их способность индуцировать расщепление целевой РНК. Анти-HCV конструкций киНК, направленно воздействующие на сайт 304 в конфигурации киНК stab 7/8, исследовали в тесте на расщепление РНКи in vitro (см. таблицу II). Сайт-специфическое расщепление целевой РНК на участке, отстоящем на 10 нуклеотидов от 5'-конца последовательности ведущей цепи, является диагностическим признаком RISC-опосредованного расщепления. Фактически, сайт-специфическое расщепление целевой РНК в ожидаемом положении наблюдалось с анти-HCV киНК, направленно воздействующей на сайт 304 в конфигурации киРНК stab 7/8. Этот результат показывает, что полностью модифицированная киРНК функционирует по механизму РНКи и что присутствие 2'-OH группы в составе киНК не требуется для РНКи-опосредованного расщепления целевой РНК, и что 2'-OH группа в составе киНК не участвует в расщеплении целевой РНК.

Как указывалось выше, наличие рибонуклеотидных остатков в 5'-концевых положениях нуклеотидов ведущей цепи приводит к созданию киРНК с жесткой активностью. Оценивают активность конструкций киРНК, в которых первые три нуклеотида в ведущей цепи включают 2'-дезокси-2'-фторпиримидиновые и пуриновые рибонуклеотиды. Такая стабилизационная структура получила название stab 29 (таблица I). Указанные киНК функционируют одинаково хорошо как со структурой Stab 7/25, так и со структурой Stab 7/29 (см. фиг. 36). Таким образом, пуриновые остатки, при их наличии в 5'-концевых положениях нуклеотидов, могут сохраняться как рибонуклеотиды в ведущей цепи, а пиримидиновые нуклеотиды ведущей цепи могут быть химически модифицированы при сохранении жесткой активности РНКи. Для установления, что указанные киНК также действуют посредством RISC-опосредованной деградации специфической РНК, был использован тест на РНКи in vitro с использованием лизата клеток HeLa. Сайт-специфическое расщепление целевой РНК на участке, отстоящем на 10 нуклеотидов от 5'-конца ведущей цепи, является диагностическим признаком RISC-опосредованного расщепления. Фактически, сайт-специфическое расщепление целевой РНК в ожидаемом положении наблюдается со всеми тремя киНК, имеющими конфигурации Stab 7/25 и 7/25. Данный результат позволяет полагать, что указанные конструкции киНК действуют через механизм РНКи.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез и характеристика олигонуклеотидов

Олигонуклеотиды киНК синтезируют, подвергают депротекции и очищают согласно приведенным в данном описании процедурам. Целостность и чистоту конечных продуктов оценивают стандартными методами ВЭЖХ, CE и MALDI-TOF MS.

Процедура отжига киРНК

Цепи киНК (по 20 мкМ каждой цепи) подвергают отжигу в 100 мМ ацетате калия, 30 мМ HEPES-KOH при pH 7,4, 2 мМ ацетате магния. Среду для отжига вначале нагревают до температуры 90°С в течение 1 минуты и затем переносят в условия с температурой 37°С в течение 60 минут. Отжиг подтверждают проведением электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях и оценкой показателя Тпл. в 150 мМ NACl.

Тест на стабильность в сыворотке

Олигонуклеотиды разрабатывают таким образом, что стандартные методы лигирования дают полноразмерные смысловые или антисмысловые цепи. Перед лигированием используют стандартные методы киназной обработки с использованием [γ-32P]АТФ с получением внутренней метки ³²P. Лигированный материал очищают электрофорезом в денатурирующих условиях в ПААГ. К немеченому материалу добавляют следовые количества меченой по внутренним положениям смысловой и антисмысловой цепей с достижением конечной концентрации 20 мкМ. Немеченая комплементарная цепь присутствует в количестве 35 мкМ. Отжиг проводят по описанной выше процедуре. Образование дуплекса подтверждают проведением электрофореза в немодифицированном ПААГ с последующей визуализацией с использованием Molecular Dynamics (Sunnyvale. CA) Phosphoimager.

К человеческой сыворотке добавляют меченные по внутренним положениям дуплексы одноцепочечной киРНК до конечной концентрации 90% относительно сыворотки (Sigma, St. Louis, MO) и 2 мкМ дуплекса киРНК с 1,5 мкМ избытком немеченой одноцепочечной киРНК. Образцы инкубируют при температуре 37°С. В заданные временные точки отбирают аликвоты и гасят реакцию с использованием пяти стадий обработки протеиназой К (20 мкг) (Аmersham, Piscataway, NJ) в 50 мМ трис-HCl буфере при pH 7,8, 2,5 мМ ЭДТА, 2,5% ДСН и затем добавляют 6×объем формамидного буфера (90% формамида, 50 мМ ЭДТА, 0,015% ксилолцианола и бромфеноловый синий, 20 мкМ немеченого олигонуклеотида с той же последовательностью, что и радиоактивно меченая цепь). Образцы разделяют при проведении электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях и визуализируют на Molecular Dynamics Phosphoimager. Для количественного определения используют программное обеспечение ImageQuant (Molecular Dynamics).

Исследование клеточных культур

Клеточную линию человеческой гепатобластомы Hep G2 растят в минимальной эссенциальной среде Игла с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глютамина, 0,1 мМ не эссенциальных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 25 мМ Hepes. Репликацию компетентной кДНК проводят при вырезании с последующим лигированием геномных последовательностей HBV из вектора psHBV-1. Клетки Hep G2 высевают (3×10⁴ клеток/ячейку) в 96-ячеечные микротитрационные планшеты и инкубируют в течение ночи. Образуется катионный комплекс липид/ДНК/киРНК, содержащий (в конечных концентрациях) катионный липид (11-15 мкг/мл), повторно лигированный psHBV-1 (4,5 мкг/мл) и киРНК (25 нМ) в ростовой среде. После 15 минут инкубации при температуре 37°С добавляют 20 мкл комплекса к высеянным в чашки клеткам Hep G2 в 80 мкл ростовой среды без антибиотиков. Среду отделяют от клеток через 72 часа после трансфекции для анализа HBsAg. Все трансфекции проводят в тройном повторе.

ELISA тест на HBsAg

Определяют уровни HBsAg с использованием набора для анализа HBsAg методом ELISA (Genetic Systems/Bio-Rad (Richmond, VA)), в соответствии с инструкциями производителя. Абсорбцию клеток, не трансфицированных вектором HBV, используют в качестве фонового значения для теста и вычитают из экспериментальных значений, полученных для образца.

Пример 12: Эффективность полученных конструкций киНК с выступающими фрагментами разной химической структуры на модели хронической инфекции HBV

Для оценки активности химически стабилизированных наночастиц киНК (см. Vargeese et al/, предварительная заявка на патент № 60/678531 и родственная предварительная заявка на патент США № 60/703946, зарегистрированная 29 июля 2005 года, а также предварительная заявка на патент США № 60/737024, зарегистрированная 15 ноября 2005 года, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки), введенных в состав композиции против HBV, проводят системное введение изготовленной композиции киНК (композиция L-086 и L-061, см., таблицу IV и предварительную заявку на патент США № 60/737024, зарегистрированную 15 ноября 2005 года) после гидродинамической инъекции (HDI) HBV вектора мышам штамма NOD.CB17-Prkdcscid/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Используют 5-6-недельных самок мышей с весом примерно 20 грамм ко времени исследования. Используют HBV вектор pWTD, который представляет собой димер по типу «голова-хвост» полного генома HBV. В случае мышей весом 20 грамм проводят тотальную инъекцию 1,6 мл pWTD в солевом растворе в хвостовую вену в течение 5 секунд. Инъецируют в целом 0,3 мкг вектора HBV в расчете на мышь. Для восстановления печени от деструкции, вызванной HDI, введение доз изготовленных композиций киНК начинают через 6 дней после HDI. Инкапсулированные активные киРНК или киРНК, выполненные в виде отрицательного контроля, вводят в дозе 3 мг/кг/день в течение трех дней путем стандартной в/в инъекции. Животных умерщвляют через 10 дней после введения последней дозы и измеряют уровни сывороточной HBV ДНК. Титры HBV ДНК определяют по методу количественной ПЦР в масштабе реального времени и выражают в виде среднего значения log10 копий/мл (±СКО). Значительное снижение сывороточного уровня HBC ДНК (фиг. 37) наблюдается к моменту 10-дневной точки у животных в группе, которым вводилась активная композиция киНК, в сравнении с группами, которым вводили ФБР и отрицательный контроль.

Синтез и характеристика олигонуклеотидов

Все РНК синтезировали по приведенной в настоящем описании процедуре. Комплементарные цепи подвергают отжигу в ФБР, обессоливают и лиофилизируют. Последовательности активных киНК для сайта 263 HBV приведены ниже и соответствуют номерам соединения Sirna, как показано на фиг. 37. Модифицированные киНК, использованные in vivo, обозначены в соответствии с полученной композицией LNP, либо L-086, либо L-061 (см. таблицу IV и предварительную заявку на патент США 60/737024, зарегистрированную 15 ноября 2005 года).

Последовательности киНК для активных HBV киНК включают следующие:

смысловая цепь: 5' B GGAcuucucucAAuuuucuTT В 3' (SEQ ID NО: 60) соединение No. 33214

антисмысловая цепь: 5' AGA AAAuuGAGAGAAGuccUU 3' (SEQ ID NО: 61) соединение No. 38749

антисмысловая цепь: 5' AGA AAAuuGAGAGAAGuccAC 3' (SEQ ID NО: 62) соединение No. 47675

антисмысловая цепь: 5' AGA AAAuuGAGAGAAGuccTT 3' (SEQ ID NО: 63) соединение No. 37793

антисмысловая цепь: 5' AGA AAAuuGAGAGAAGuccTsT 3' (SEQ ID NО: 64) соединение No. 35092

Последовательности киНК для HBV инвертированного контроля имеют следующий вид:

смысловая цепь: 5' B ucuuuuAAcucucuucAGGTT B 3' (SEQ ID NО: 65) соединение No. 33578

антисмысловая цепь: 5' ccuGAAGAGAGuuAAA AGATsT 3' (SEQ ID NО: 66) соединение No. 46419

(где маленькие буквы обозначают 2'-дезокси-2'-фтор; большие буквы курсивом обозначают 2'-дезокси; большие буквы с подчеркиванием обозначают 2'-О-метил; большие буквы, выделенные жирным шрифтом, обозначают рибонуклеотид; Т = тимидин; B = инвертированный дезокси-безосновный фрагмент; и s = фосфоротиоат)

Анализ HBV ДНК

Экстрагируют вирусную ДНК из 50 мкл мышиной сыворотки с использованием набора для выделения ДНК из крови QIAmp 96 (Qiagen, Valencia, CA) в соответствии с инструкциями производителя. Уровни HBV ДНК анализируют с использованием детектора последовательностей ABI Prism 7000 (Аpplied Biosystems, Foster City, CA). Количественную ПЦР в масштабе реального времени проводят с использованием следующих праймерных и зондовых последовательностей: прямой праймер 5'-CCTGTATTCCCATCCCATCGT (SEQ ID NO: 69, нуклеотидный участок HBV 2006-2026), обратный праймер 5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG (SEQ ID NO: 70, нуклеотидный участок HBV 2063-2083) и зонд FAM 5'-TTCGСA AAATACCTАTGGGAGTGGGCC (SEQ ID NO: 71, нуклеотидный участок HBV 2035-2062). Вектор psHBV-1, содержащий полноразмерный геном HBV, используют в качестве стандарта для построения кривой, по которой вычисляют количество копий HBV на мл сыворотки.

Пример 13: Активность киНК HBV, изготовленной в составе LNP на модели мышей с HBV инфекцией

Разработка терапевтических киРНК (киНК), подходящих для системного введения, основывается как на химической модификации РНК с целью повышения физической стабильности препарата, так и на композициях, позволяющих осуществлять адекватное направленное воздействие на ткани и на поглощение клетками. В данном примере химически модифицированные киНК, направленно воздействующие на вирус гепатита B человека (HBV), были инкапсулированы в липидные наночастицы, тропные к печени, и было продемонстрировано 2,5-3,0 log10 снижение уровня циркулирующей HBV ДНК у мышей, реплицирующих HBV. Кроме того, уровни вирусной РНК в печени снижаются более чем на 90% вследствие RISC-опосредованного целевого расщепления, по результатам анализа RACE. Данный результат показывает, что химическая модификация анти-HBV киНК важна для выключения вирусной РНК, опосредованной агентами, отличными от цитокинов, даже в случае наночастичной доставки. Наночастичная композиция доставляет 65% от дозы киНК в печень и киНК выявляется в печени в течение 14 дней после введения одной дозы. Введение указанных композиций киНК мышам путем внутривенной инъекции в целом переносится хорошо, по данным клинических анализов, включая уровни AСT и AЛT. Эти результаты поддерживают стратегию разработки терапевтических средств на основе киНК, направленных против важных вирусных патогенов человека в печени, таких как HBV и HCV.

Как указывалось в приведенных выше примерах, было идентифицировано множество целевых сайтов активных киНК в геноме HBV в исследованиях на клеточных культурах, при этом было показано, что особенно эффективные киНК включают участок, начинающийся от 5'-нуклеотида 263 (HBV263M) в S-участке РНК HBV. Указанная молекула HBV263 киНК была описана в примере 12 и включает смысловую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 60, и антисмысловую цепь, состоящую из SEQ ID NO: 64.

смысловая цепь: 5' B GGAcuucucucAAuuuucuTT B 3' (SEQ ID NO: 60), соединение No. 33214

антисмысловая цепь: 5' AGA AAAuuGAGAGAAGuccTsT 3' (SEQ ID NО: 64) соединение No. 35092

Ниже приводится описание исследования, относящегося к использованию новой технологии доставки на основе липидных наночастиц (LNP), включающих киНК, которая приводит к улучшению доставки киНК в печень и резко повышает активность киНК и длительность анти-HBV активности in vivo, включая значительное снижение HBV РНК в печени. Кроме того, снижение уровней вирусной РНК, как было показано, является прямым следствием киНК-опосредованного расщепления мишени.

Композиция киНК

В приведенном ниже исследовании используемой композицией LNP является LNP-086 (см. таблица IV). Молекулы киНК включают в липидные наночастицы, обладающие высокой инкапсулирующей эффективностью, путем смешивания киНК в буфере со спиртовым раствором липидной смеси, с последующей ступенчатой диафильтрацией. Эффективность инкапсуляции определяют ортогональными методами с использованием ВЭЖХ (анионообменная хроматография и вытеснительная хроматография) и в тестах с использованием RiboGreen (измерение изменения флуоресценции при наличии детергента или в его отсутствии). Определение размера частиц и соответствующей плотности проводят с использованием прибора Brookhaven (Holtsville, NY) ZetaPal.

Тест на определение HBsAg методом ELISA

Определяют уровни HBsAg с использованием набора для анализа HBsAg методом ELISA (Genetic Systems/Bio-Rad (Richmond, VA)) в соответствии с инструкциями производителя. Абсорбцию клеток, не трансфицированных вектором HBV, используют в качестве фонового значения для данного теста и вычитают из экспериментальных значений, полученных для образца.

Модель на основе HBV вектора с использованием мышей

Для оценки активности химически стабилизированных киНК против HBV проводят системное введение дозы киНК после гидродинамической инъекции (HDI) вектора HBV мышам штамма NOD.CB17-Prkdc^scid/J (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). В данном исследовании используют 5-6-недельных самок мышей с весом примерно 20 граммов ко времени исследования. В качестве HBV вектора используют pWTD, который представляет собой димер по типу «голова-хвост» полного генома HBV. Для мыши весом 20 грамм проводят инъекцию дозы 1,6 мл pWTD в солевом растворе, в хвостовую вену в течение 5 секунд. Инъецируют в целом 0,3 мкг вектора HBV в расчете на мышь. Стандартные дозы при системном введении киНК составляют от 0,3 до 10 мг/кг/день. Для того чтобы печень восстановилась после деструкции, вызванной HDI, системное введение дозы начинают через 6 дней после HDI.

Анализ ДНК HBV

Экстрагируют вирусную ДНК из 50 мкл мышиной сыворотки с использованием набора для выделения ДНК из крови QIAmp 96 (Qiagen, Valencia, CA), в соответствии с инструкциями производителя. Уровни HBV ДНК анализируют с использованием детектора последовательностей ABI Prism 7000 (Аpplied Biosystems, Foster City, CA). Количественную ПЦР в масштабе реального времени проводят с использованием следующих праймерных и зондовых последовательностей: прямой праймер 5'-CCTGTATTCCCATCCCATCGT (SEQ ID NO: 69, нуклеотидный участок HBV 2006-2026), обратный праймер 5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG (SEQ ID NO: 70, нуклеотидный участок HBV 2063-2083) и зонд FAM 5'-TTCGСA AAATACCTATGGGAGTGGGCC (SEQ ID NO: 71, нуклеотидный участок HBV 2035-2062). Вектор psHBV-1, содержащий полноразмерный геном HBV, используют в качестве стандарта для построения кривой, по которой вычисляют количество копий HBV на мл сыворотки.

Анализ РНК HBV

Выделяют суммарную клеточную РНК примерно из 100 мг ткани печени мыши с использованием реагента Tri-Reagent (Sigma, St. Louis MO), в соответствии с инструкцией производителя. Уровни РНК HBV определяют количественно и нормализуют до уровня РНК GAPDH с использованием обратной транскрипции (ОТ)-ПЦР в масштабе реального времени в мультиплексной реакции. Относительное количество РНК HBV и GAPDH мыши вычисляют по стандартной кривой, построенной на основе суммарной печеночной РНК от мыши с инъецированным HBV (трехкратные серийные разведения от 300 до 1 нг РНК на реакцию). HBV праймеры и зонды описаны выше. Праймерные и зондовые последовательности для GAPDH мыши показаны ниже: прямой праймер 5'-GCATCTTGGGCTACAC TGAGG (SEQ ID NO: 72, mGAPDH нуклеотиды 855-875), обратный праймер 5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG (SEQ ID NO: 73, mGAPDH нуклеотиды 903-925) и зонд VIC 5'-ACCAGGTTGTCTCCTGCGACTTCAACAG (SEQ ID NO: 74, mGAPDH нуклеотиды 876-913). Уровни РНК HBV в печени выражают в виде соотношения РНК HBV и GAPDH.

5' RАCE тест на расщепление целевой ДНК

Анализ RACE проводят по протоколу производителя с использованием соответствующего набора GeneRacer (Invitrogen, Carlsbad, CA), за исключением того, что не проводят предварительную обработку суммарной РНК. Суммарную РНК печени (5 мкг), выделенную от животных, обрабатывают активными и контрольными киНК, лигированными с адапторной молекулой GenеRacer. Лигированную РНК подвергают обратной транскрипции с использованием HBV-специфического праймера (VSP1:5'-TGAGCCAAGAGAAACGGACTG, SEQ ID NO: 75). Далее проводят на его основе ПЦР амплификацию с использованием праймеров, комплементарных к адаптору (GR5'- 5'CGACTGGAGCACGAGGACACTGA, SEQ ID NO: 76) и HBV (VSP2: 5'-GCATGGTCCCGTACTGGTTGT, SEQ ID NO: 77). Размер расщепленного продукта (145 п.о.) далее подтверждают с помощью гнездовой ПЦР с использованием праймеров (GR5'гнездовой 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA, SEQ ID NO: 78) и (VSP3: 5'-CAGACACATCCAGCGATAACCAG, SEQ ID 79) и проводят электрофорез в нативном ПААГ. Амплифицированные продукты размером ~145 п.о. подврегают очистке в геле, клонируют и секвенируют для выявления сайта расщепления киНК.

Анализ иммуностимуляции

5-6-недельным самцам мышей CD-1 (Charles River, Wilmington, MA) инъецируют одну дозу 3 мг/кг HBV263M-LNP или ФБР контроль путем стандартной внутривенной инъекции в латеральную хвостовую вену. Далее животных подвергают эвтаназии путем ингаляции CO₂, после чего сразу же выпускают кровь, через 2,5 и 8 часов после введения дозы (n=5 для каждой временной точки). Кровь отбирают через полую вену и обрабатывают с получением сыворотки для анализа. Проводят количественный анализ цитокинов с использованием наборов для анализа ELISA по методу «сэндвич» в соответствии с инструкциями производителя. Для анализа были взяты мышиные IL-6, TNF-альфа, IFN-гамма и IFN-альфа (все получены от компании R&D Systems, Minneapolis, MN).

Фармакокинетика

Самцов мышей CD-1 получают от компании Charles River (Wilmington, MA) с весом примерно 30 г к моменту исследования. HBV263M-LNP вводят путем стандартного в/в болюса (100-120 мкл) в дозе примерно 3 мг/кг в латеральную хвостовую вену. Далее животных подвергают эвтаназии в заданные временные точки (2 и 15 минут; 1, 3 и 6 часов; и 1, 5, 10 и 14 дней после введения дозы) путем ингаляции CO₂, после чего сразу же выпускают кровь. Кровь собирают кардиопункцией и хранят в пробирках Microtainer®, содержащих ЭДТА, и собирают плазму. После обескровливания животных подвергают перфузии стерильным солевым раствором для ветеринарного использования через сердце. Печень взвешивают и образец (примерно 100 мг) помещают в предварительно взвешенную пробирку для гомогенизации и замораживают на сухом льду.

Количественное определение киНК в плазме и в образцах печени проводят с использованием сэндвич-гибридизации в рабочем диапазоне концентрации 0,026-6,815 нг/мл для цепи-«пассажира» и 0,027-6,945 нг/мл для ведущей цепи. Образцы печени получают в концентрации 100 мг/мл в буфере для гомогенизации ткани (3 М изотиоцианат гуанидина, 0,5 NaCl, 0,1 M Трис при pH 7,5, 10 мМ ЭДТА). Указанную смесь гомогенизируют в гомогенизаторе Bio-101 (Savant, Carlsbad, CA) cо скоростью, установленной на 6,0, в течение 10 секунд. Растворы для гомогенизации печени разбавляют до концентрации 10 мг/мл с использованием 1 М буфера GIТC (1 М изотиоцианат гуанидина, 0,5 NaCl, 0,1 M Трис, pH 7,5, 10 мМ ЭДТА) и затем используют в тесте в соответствующих разбавлениях (от 1:2 до 1:10). Плазменные образцы разбавляют ≥25 раз в 1 М буфере GITC. Концентрации суммарной киНК вычисляют при складывании концентраций цепи-«пассажир» и ведущей цепи. Используют программное обеспечение WinNonLin Professional (версия 3.3) для проведения некомпартментального фармакокинетического анализа полученных данных по концентрации-времени.

Оценка токсичности

Двадцати мышам CD-1 вводят HBV263M-LNP в виде однократной в/в инъекции болюсом в дозе 3 мг/кг (n=10) или ФБР (n=10). Вес тела измеряют до исследований и перед отбором образцов в 1 или 14 дни после дозирования. В соответствующие временные точки мышей подвергают эвтаназии ингаляцией CO₂ с последующим немедленным обескровливанием животных (n=5/временная точки) и кровь отбирают для проведения химического анализа сыворотки. Кроме того, взвешивают печень и селезенку и вычисляют соотношение веса органа ко всему весу тела.

Результаты

LNP композиции HBV киНК

Была использована композиция LNP-086 (см. таблицу IV) для инкапсулирования активной киНК HBV263M со смысловой цепью, состоящей из SEQ ID NO: 60, и антисмысловой цепью, состоящей из SEQ ID NO: 64, и соответствующая инвертированная контрольная композиция HBV263invM со смысловой цепью, состоящей из SEQ ID NO: 65, и антисмысловой цепью, состоящей из SEQ ID NO: 66.

смысловая цепь: 5'-B ucuuuuAAcucucuucAGGTT B 3' (SEQ ID NO: 65) соединение No. 33578

антисмысловая цепь: 5' ccuGAAGAGAGuuAAA AGATsT 3' (SEQ ID NO: 66) соединение No. 46419

Был разработан способ, подходящий для включения киНК в липидные наночастицы с высокой эффективностью посредством одновременного перемешивания липидного и киНК растворов, с последующей ступенчатой диафильтрацией. В рамках данного процесса HBV263M и контрольные HBV263Minv киНК инкапсулируют в композицию LNP-086. Среднее значение эффективности инкапсулирования киНК составляет 84±2%, при определении методом ВЭЖХ и в тесте с RiboGreen. Среднее значение размера частиц составляет 167±10 нм, и полидисперсность составляет 0,15±0,05. LNP характеризуется небольшой положительной поверхностной плотностью заряда 30±2 мВ.

Химически модифицированные HBV263M киНК, инкапсулированные в композицию LNP, вначале оценивают на активность в системе клеточной культуры HBV. Однократная обработка клеток Hep G2, реплицирующих HBV, c использованием HBV263M-LNP приводит к зависимому от дозы снижению уровней HBsAg со значением ИК50, равным 1 нМ (данные не показаны).

Активность in vivo инкапсулированного в LNP HBV263M

Для оценки активности in vivo LNP-инкапсулированной киНК, используют мышиную модель репликации HBV, в рамках которой гидродинамическая инъекция (HDI) компетентного по репликации вируса HBV проводит к вирусной репликации в гепатоцитах. В рамках данной модели HBV реплицируется в печени мышей со слабым иммунитетом до 80 дней, что приводит к выявляемым уровням HBV РНК и антигенов в печени, а также к появлению титров HBV ДНК и антигенов в сыворотке, которые аналогичны уровням, выявляемым у хронически инфицированных пациентов.

Для оценки in vivo активности и специфичности HBV263M-LNP-086, его активность сравнивают с контрольной киНК HBV263invM-LNP-086. Мышам, реплицирующим HBV, вводят дозы 0,3, 1 или 3 мг/кг/день в течение трех дней и определяют уровни сывороточной ДНК HBV и HBsAg через 3 дня после введения последней дозы. Отмечается зависимое от дозы снижение сывороточных уровней HBV ДНК и HBsAg. Снижение сывороточных титров HBV ДНК (фиг. 38А) составляет 3,0, 2,3 и 1,1 log10 (р<0,0001), и снижение сывороточных уровней HBsAg (фиг. 38B), составляющее 2,4, 2,2 и 1,5 log10 (p<0,0001), наблюдается в группах введения 3, 1 и 0,3 мг/кг, соответственно, в сравнении с группами введения контрольной киНК и ФБР. Уровни сывороточных HBV ДНК или HBsAg были эквивалентны таковым в группе введения контрольной киНК и в группе введения ФБР, что демонстрирует специфичность по последовательности анти-HBV активности и отсутствие неспецифических липидных эффектов.

Длительность киНК-опосредованного снижения уровней HBV исследовали на модели мышей. Мышам, реплицирующим HBV, вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Minv-LNP-086 в дозах 0,3 мг/кг/день в течение трех дней и затем проводят анализ сывороточных титров HBV в дни 3, 7 и 14 после введения последней дозы. Анти-HBV активность была персистентной, при этом значительная активность все еще наблюдалась в 7 день (снижение 2,0 log10) и день 14 (снижение 1,5 log10) (фиг. 39). Длительное персистирование киНК активности против HBV дает основание предполагать, что даже нечастое введение соединения может быть эффективным. Указанная модель мышей с HBV была использована для оценки эффекта еженедельного введения дозы. Мышам вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Minv-LNP-086 в дозах 3 мг/кг/день в дни 1 и 4 в первую неделю и затем один раз в неделю в течение еще 3 недель. Определяют сывороточные титры HBV ДНК в дни 7, 14, 21 и 28. В группах животных, получавших HBV263M-LNP-086, отмечалось снижение сывороточных уровней HBV в сравнении с животными в группе лечения ФБР, которое составляло 1,7, 1,7, 1,8 и 1,3 log10 в дни 7, 14, 21 и 28, соответственно (фиг. 40). Эти результаты позволяют полагать, что снижение титров HBV может поддерживаться при еженедельном введении дозы HBV263M-LNP-086.

Специфическое киНК-опосредованное расщепление РНК HBV в печени

Для изучения специфического расщепления РНК HBV в печени, которое опосредовано активной композицией HBV263M-LNP-086, мышам, которые реплицируют HBV, вводят дозы HBV263M-LNP-086, равные 0,3, 1, 3, 10 мг/кг/день, или контрольный препарат HBV263Minv-LNP в дозе 10 мг/кг/день в течение трех дней, и через 3 дня после последнего введения дозы определяют уровни печеночной HBV РНК. Наблюдается зависимое от дозы снижение уровня РНК HBV в печени (фиг. 41), где снижение на 90%, 66,5%, 18% и 4% отмечается у животных в группах введения HBV263M-LNP в дозах 10, 3, 1 и 0,3 мг/кг/день, соответственно, в сравнении с группой введения контрольного препарата HBV263Minv-LNP-086 в дозе 10 мг/кг.

Для того чтобы продемонстрировать, что снижение уровня печеночной HBV, наблюдаемой на модели мышей, связано именно с РНКи-опосредованным расщеплением HBV РНК, проводят 5'-быструю амплификацию концов кДНК (анализ RACE) для выявления расщепления РНК HBV в заданном сайте. Мышам, реплицирующим HBV, вводят HBV263M-LNP-086 или HBV263Minv-LNP-086 в дозе 3 мг/кг/день в течение 3 дней. Животных умерщвляют через 3, 7 или 14 дней после последнего введения дозы и выделяют суммарную печеночную РНК. Как ожидалось, лигирование адапторной последовательности со свободными 5'-концами популяции РНК и последующее проведение ОТ-ПЦР с адапторными и HBV-специфическими праймерами приведет к получению ПЦР продукта размером 145 п.о., если РНК HBV была расщеплена в заданном целевом сайте. Как показано на фиг. 42, ожидаемый продукт амплификации наблюдается в каждой временной точке в образцах, обработанных HBV263 активными киНК, но не в HBV263 контрольных образцах. Продукты ПЦР далее подвергают клонированию и секвенированию, для подтверждения корректного соединения между адапторной последовательностью и заданным сайтом расщепления в HBV263 киНК. Это результат показывает, что снижение уровня HBV РНК, наблюдаемое в печени, связано со специфическим РНКи-опосредованным расщеплением РНК HBV в печени. Кроме того, выявление специфических продуктов расщепления РНК HBV в точках 7 и 14 дней демонстрирует тот факт, что длительная активность киНК против HBV связана с продолжающимся расщеплением РНК HBV.

Анализ иммуностимуляции, индуцированной киНК

Было показано, что немодифицированные синтетические киНК, изготовленные для доставки in vivo, индуцируют синтез воспалительных цитокинов и интерферонов, зависимый от конкретной последовательности, как in vitro в мононуклеарных клетках периферической крови человека (МНПК), так и in vivo у мышей. Был исследован потенциал химически модифицированных HBV263M-LNP-086 киНК по проявлению данного типа иммунного ответа в сравнении с немодифицированной версией (HBV263R-LNP-086).

смысловая цепь: 5' B GGACUUCUCUCAAUUUUCUTT 3' В (SEQ ID NO: 67) соединение No. 34526

антисмысловая цепь: 5' AGAAAAUUGAGAGAAGUCCTT 3' (SEQ ID NO: 68) соединение No. 34527

Мышам СD-1 инъецируют однократную дозу 3 мг/кг; HBV263M-LNP-086 или HBV263R-LNP-086. Животных умерщвляют через 2,5 или 8 часов после последнего введения дозы и собирают кровь. Для выявления пиковых уровней крови измеряют количества IL-6 и TNF-α в точке 2,5 часа, тогда как уровни IFN-γ и IFN-α анализируют через 8 часов после инъекции. У животных в группе введения HBV263M-LNP-086 среднее значение уровня IL-6 составляет 33±21 пг/мл, то есть существенно не отличается от показателя в контрольной группе введения ФБР, где указанное значение равно 33±4 (таблица VII). Кроме того, у животных в группе введения HBV263M-LNP-086 не отмечается индукции TNF-α, IFN-α или IFN-γ. И наоборот, отмечается выраженная индукция всех четырех цитокинов у животных в группе введения HBV263R-LNP-086 (таблица VI). Эти результаты показывают, что модифицированные HBV263M-LNP-086 киНК не индуцируют цитокинов у мышей, в сравнении с очень сильным ответом, проявляемым немодифицированными HBV263R-LNP-086 киНК. Отсутствие индукции цитокинов под действием HBV263M-LNP-086 также указывает на то, что анти-HBV активность, наблюдаемая на модели мышей, связана со специфическим киНК-опосредованным молчанием генной экспрессии HBV.

Фармакокинетика LNP препаратов киНК

Фармакокинетические свойства HBV263M-LNP-086 определяют у мышей после однократного введения дозы 3 мг/кг. Был использован метод гибридизации для выявления HBV263M киНК в плазме и печени с течением времени (фиг. 43). HBV263M быстро элиминируется из плазмы со значением периода полувыведения Т_1/2, равным примерно 1,7 часа. Однако HBV263M выявляется в печени в течение 14-дневного периода отбора образцов, и в этом случае период полувыведения Т_1/2 равен 4 дням. Максимальная концентрация 31,3±17,8 нг/мг (среднее значение ± стандартное отклонение) наблюдается в печени через 1 час и соответствует 65±32% от дозы киНК. К 14 дню в печени остается в интактном виде 1,4±0,7% дозы. Пролонгированная киНК-опосредованная анти-HBV активность, наблюдаемая на модели мышей, хорошо коррелирует с данным длительным сроком пребывания киНК в печени.

Оценка токсичности HBV263M-LNP

Проводят исследование результатов введения однократной дозы для определения возможных токсических эффектов HBV263M-LNP-086. Введение HBV263M-LNP-086 хорошо переносится животными, при этом не отмечается ни заболеваемости животных, ни смертности. Не было выявлено изменений в весе тела или в соотношении веса органа к весу тела для печени и селезенки при анализе через 1 или 14 дней после введения дозы HBV263M-LNP (таблица VII). Не отмечается также видимых морфологических изменений в печени и селезенке. Кроме того, не выявлено изменений в данных химического анализа сыворотки, которые можно было бы связать с введением HBV263M-LNP-086 (таблица VIII). В целом, HBV263M киНК, инкапсулированная в LNP-086, хорошо переносится в выбранной дозе, приводя к существенному снижению вирусных титров на мышиной модели HBV.

В данном исследовании описывается использование новой липидной композиции для доставки киНК, где было продемонстрировано существенное улучшение доставки киНК в печень, что приводит к повышению активности и длительному снижению титров HBV на мышиной модели инфекции HBV. Наблюдается прекрасная корреляция между фармакокинетическими характеристиками композиции LNP и потенциалом и длительностью киНК активности in vivo. Три дозы HBV263M-LNP-086 по 3 мг/кг/день снижают сывороточный уровень HBV ДНК на 2,5-3,0 lоg10 относительно контрольной киНК. Введение для лечения HBV263M-LNP-086 приводит к существенному пролонгированию анти-HBV активности со снижением 2,0 log10 сывороточных уровней HBV ДНК на 7 день и со снижением, равным 1,3 log10, на 14 день.

В данном исследовании также было показано, что использованием химически модифицированных киНК, инкапсулированных в LNP-препарат, устраняет киРНК-опосредованную индукцию цитокинов in vivo. Взятые вместе, благоприятные фармакокинетические свойства и эффективный профиль HBV263M-LNP-086 киРНК создают потенциально терапевтически значимое антивирусное соединение. Данная композиция эффективно доставляет киРНК в печень и может использоваться для выключения эндогенных мишеней в печени, ассоциированных с заболеванием.

Пример 14: Показания

Конкретные состояния и заболевания, которые ассоциированы с модуляцией генной экспрессии, включают, без ограничения, рак, пролиферативные, воспалительные, аутоиммунные, неврологические, глазные, респираторные, метаболические, дерматологические, системы органов слуха, печени, почек, инфекционные и т.п. заболевания, состояния или расстройства, приведенные в настоящем описании или иные, известные в данной области, и любые другие заболевания, состояния или расстройства, которые связаны с уровнями мишеней или отвечают на уровни мишеней (например, целевого белка или целевого полинуклеотида) в клетке или ткани, индивидуально или в сочетании с другими видами терапии.

Пример 15: Ингибирование полифункциональной киНК экспрессии целевой РНК

Разработка полифункцинальных киНК

После идентификации целевых сайтов для конструкций полифункциональных киНК, создают каждую цепь киНК с комплементарным участком, имеющим длину, например, от примерно 18 до примерно 28 нуклеотидов, который комплементарен последовательности другой целевой нуклеиновой кислоты. Каждый комплементарный участок конструируется в сочетании с прилегающим фланкирующим участком, включающим от примерно 4 до примерно 22 нуклеотидов, который не является комплементарным к целевой последовательности, но который обладает комплементарностью к комплементарному участку другой последовательности (см., например, фиг. 16). Аналогично могут быть разработаны шпилечные конструкции (см., например, фиг. 17). Идентификация комплементарных, палиндромных или повторяющихся последовательностей, которые имеют общность среди последовательностей разных целевых нуклеиновых кислот, может способствовать сокращению общей длины конструкций полифункциональных киНК (см., например, фиг. 18 и 19).

В не ограничивающем примере представлены еще три категории дополнительных вариантов архитектуры полифункциональных киНК, которые позволяют с помощью одной молекулы киНК достигать молчания множественных мишеней. В первом методе используются линкеры, которые непосредственно соединяют киНК (или полифункциональных киНК). В рамках данной методики возможно объединить наиболее активные киНК, но без образования длинного непрерывного тяжа РНК, который обладает потенциалом запускать интерфероновый ответ. Второй способ включает дендримерное расширение перекрывающихся или связанных полифункциональных вариантов; или, альтернативно, организацию киНК в супрамолекулярном формате. В третьем методе используются спиральные структуры с длиной, превышающей 30 пар оснований. Процессинг таких киНК с помощью дайсера открывает новые активные 5'-концы антисмысловой цепи. В этой связи длинные киНК могут направленно воздействовать на сайты, определяемые исходными 5'-концами, и сайты, определяемые новыми концами, которые были созданы при процессинге дайсером. Данный подход, используемый в сочетании с традиционными полифункциональными киНК (где смысловая и антисмысловая цепи, каждая, определяют мишень), может применяться, например, для воздействия на 4 или более сайта.

I. Бифункциональная киНК с присоединенными фрагментами

Основная идея нового подхода в разработке полифункциональных киНК заключается в том, что антисмысловые цепи киНК подвергают отжигу до получения одной смысловой цепи. Указанная смысловая цепь олигонуклеотида содержит линкер (например, ненуклеотидный линкер согласно настоящему описанию) и два сегмента, которые подвергают отжигу до получения антисмысловых цепей киНК (см. фиг.22). Указанные линкеры могут также необязательно включать линкеры нуклеотидной природы. Данный подход включает несколько возможных указанных ниже преимуществ и вариаций, но не ограничивается приведенным перечнем:

1. Две антисмысловые киНК являются независимыми. В этой связи, выбор целевых сайтов не ограничивается требованием сохранения последовательности между двумя сайтами. Любые две высокоактивные киНК могут быть объединены с образованием полифункциональной киНК.

2. При использовании киНК в рамках данного подхода, включающего целевые сайты, обладающие гомологией, и позволяющего воздействовать на последовательность, присутствующую в двух генах (например, разные формы), их архитектура может использоваться для воздействия более чем на два сайта. Одна полифункциональная киНК может быть, например, использована для направленного воздействия на РНК двух разных целевых РНК.

3. Полифункциональные киНК, в которых используются смысловая и антисмысловая цепи для воздействия на ген, могут также быть включены в полифункциональную архитектуру на участке присоединяемого фрагмента. При этом может быть создана возможность воздействия на 6 или более сайтов с использованием одного комплекса.

4. Открывается возможность провести отжиг более чем двух антисмысловых цепей киНК, с образованием одной смысловой цепи с присоединенным фрагментом.

5. Указанная архитектура не содержит длинных непрерывных тяжей дцРНК. В этой связи маловероятна инициация интерферонового ответа.

6. Линкер (или присоединенные к нему модификации, такие как конъюгаты согласно настоящему описания) может улучшить фармакокинетические свойства комплекса или способствовать его включению в липосомы. Модификации, вводимые в линкер, не должны влиять на активность киНК в той же степени, как если бы они были непосредственно присоединены к киНК (см., например, фиг. 27 и 28).

7. Смысловая цепь может быть расширена за пределы полученных после отжига антисмысловых цепей с обеспечением дополнительных сайтов для присоединения конъюгатов.

8. Полярность комплекса может стать такой, что оба антисмысловых 3'-конца становятся смежными к линкеру, а 5'-концы становятся дистальными к линкеру, или имеет место их сочетание.

Дендримерные и супрамолекулярные киНК

В рамках дендримерной стратегии манипуляции с киНК, синтез киНК инициируют синтезом вначале дендримерной матрицы, с последующим присоединением различных функциональных киНК. Различные конструкции показаны на фиг. 23. Число функциональных киНК, которые могут быть присоединены, ограничено лишь размерами используемого дендримера.

Супрамолекулярный подход к созданию полифункциональных киНК

Супрамолекулярный формат упрощает дендримерный синтез. В рамках данного формата, цепи киНК синтезируют с использованием стандартной химии РНК, после чего проводят отжиг различных комплементарных цепей. Синтез индивидуальной цепи основан на включении последовательности антисмысловой цепи одной киНК на 5'-конце, за которой следует линкер для нуклеиновой кислоты или синтетический линкер, такой как гексаэтиленглиол, за которым, в свою очередь, следует смысловая цепь другой киНК в 5'-, 3'- направлении. Таким образом, синтез цепей киНК может проводиться в стандартном 3'-, 5'-направлении. Репрезентативные примеры трифункциональной и тетрафункциональной киНК показаны на фиг. 24. На основе простого принципа могут быть разработаны конструкции киНК с более высоким числом функциональностей, при условии достижения эффективного отжига различных цепей.

Полифункциональная киНК, создаваемая с помощью дайсера

При использовании биоинформационного анализа множественных сайтов, могут быть идентифицированы тяжи идентичных последовательностей, имеющих общность среди различных целевых последовательностей, длина которых варьирует от примерно двух до примерно четырнадцати нуклеотидов. Указанные идентичные участки могут быть сгруппированы с получением расширенных спиральных структур киНК (например, содержащих >30 пар оснований), так что процессинг дайсером открывает вторичный функциональный 5'-антисмысловой сайт (см., например, фиг. 25). Например, когда первые 17 нуклеотидов антисмысловой цепи киНК (например, 21- нуклеотидные цепи в дуплексе с 3'-ТТ выступающими фрагментами) комплементарны целевой РНК, то жесткий вариант молчания наблюдается при 25 нМ. При этом 80%-ный уровень молчания наблюдается при наличии комплементарности лишь 16 нуклеотидов в том же формате.

Включение указанного свойства в архитектуру киНК, включающих от примерно 30 до 40 или более пар оснований, приводит к созданию дополнительных конструкций полифункциональных киНК. Пример, приведенный на фиг. 25, иллюстрирует, как дуплекс из 30 пар оснований может направленно воздействовать на три разные последовательности после проведения процессинга дайсер-РНКазойIII; указанные последовательности могут находиться в одной и той же мРНК или в разных РНК, таких как вирусные и хозяйские мессенджеры, или во множестве точек на данном пути (например, в каскадах воспалительной реакции). Кроме того, дуплекс из 40 пар оснований может объединять бифункциональный вариант в тандеме, с обеспечением одного дуплекса, направленно воздействующего на четыре целевые последовательности. Еще более широкий подход может включать использование гомологичных последовательностей, которое позволяет воздействовать на пять или шесть мишеней и сделать их молчащими, за счет одного полифункционального дуплекса. Так, например, на фиг. 25 показано, как это может быть достигнуто. Дуплекс из 30 пар оснований расщепляют дайсером на продукты из 22 и 8 пар оснований с каждого конца (фрагменты из 8 п.о. не показаны). Для легкости иллюстрации выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но могут быть добавлены, при необходимости. Показаны три направленные последовательности. Требуемое перекрывание последовательностей по идентичности показано в виде серых прямоугольников. Символы N' в родительской киНК длиной 30 п.о. представляют собой предполагаемые сайты 2'-OH положений, в которых происходит расщепление дайсером, если тестирование проводится в стабилизированной структуре. Следует отметить, что процессинг 30-мерного дуплекса дайсером-РНКазойIII не дает точного расщепления 22+8, но, скорее, образует серию близкородственных продуктов (где продукт 22+8 представляет собой основной сайт). В этой связи процессинг дайсером приводит к образованию серии активных киНК. Другой не ограничивающий пример показан на фиг. 26. Дуплекс из 40 пар оснований расщепляют дайсером на продукты по 20 пар оснований с каждого конца. Для легкости иллюстрации выступающие фрагменты, созданные дайсером, не показаны, но могут быть добавлены, при запросе. Четыре целевые последовательности показаны четырьмя цветами: синим, голубым, красным и оранжевым. Требуемое перекрывание последовательности по идентичности показано в виде серых прямоугольников. Формат данного дизайна может быть расширен до более крупных РНК. Если химически стабилизированные киНК связываются дайсером, то стратегически расположенные рибонуклеотидные связи могут позволять расщепление с созданием продуктов, имеющих полифункциональную архитектуру в более широком диапазоне. Так, например, продукты расщепления не ограничиваются стандартными для дайсера 22 нуклеотидами, но могут включать конструкции полифункциональных киНК с перекрыванием по идентичности к целевой последовательности, варьирующей, например, от примерно 3 до примерно 15 нуклеотидов.

Пример 14: Использование с диагностической целью

Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться в варианте большого числа диагностических применений, таких как идентификация молекулярных мишеней (например, РНК), во множестве направлений применений, например, в клиническом, промышленном, экологическом, сельскохозяйственном и/или научном направлении использования. Такое диагностическое использование молекул киНК вовлекает применение восстановленных систем РНКи, например, с использованием клеточных лизатов или частично очищенных клеточных лизатов. Молекулы киНК согласно настоящему изобретению могут использоваться в качестве диагностических инструментов для изучения генетического дрейфа и мутаций в пораженных заболеванием клетках или для выявления наличия эндогенной или экзогенной, например, вирусной РНК в клетке. Тесная связь между активностью киНК и структурой целевой РНК позволяет выявить мутации в любом участке молекулы, которые меняют спаривание по основаниям и трехмерную структуру целевой РНК. При использовании множественных молекул киНК, описанных в настоящем изобретении, можно картировать нуклеотидные изменения, которые важны для структуры и функции РНК in vitro, а также в клетках и тканях. Расщепление целевых РНК молекулами киНК может использоваться для ингибирования генной экспрессии и для определения роли конкретных генных продуктов в развитии заболевания или инфекции. В этом случае могут быть определены другие генетические мишени как важные медиаторы заболевания. Указанные эксперименты позволяют усовершенствовать способы лечения прогрессирующего заболевания за счет разработки комбинированной терапии (например, за счет использования молекул множественных киНК, направленных на разные гены, молекул киНК, связанных с известными ингибиторами малых молекул, или при проведении курсового лечения сочетаниями молекул киНК и/или другими химическими или биологическими молекулами). Другие варианты использования in vitro молекул киНК согласно настоящему изобретению хорошо известны в данной области и включают выявление мРНК, ассоциированной с заболеванием, инфекцией или родственным состоянием. Такие РНК выявляются путем обнаружения продукта расщепления после обработки киНК с использованием стандартных методик, например, резонансной флуоресцентной эмиссии (FRET).

В конкретном примере описывается использование в тесте молекул киНК, которые расщепляют целевую РНК только дикого типа или только мутантную форму. Молекулы первого типа киНК (то есть молекулы, которые расщепляют целевую РНК только дикого типа) используют для идентификации РНК дикого типа, присутствующую в образце, а молекулы второго типа киНК (то есть молекулы, которые расщепляют только мутантные формы целевой РНК) используют для идентификации мутантных РНК в образце. В качестве контроля для данной реакции, синтетические субстраты и дикого типа, и мутантной РНК расщепляют обеими молекулами киНК, для демонстрации относительной эффективности киНК в данных реакциях и отсутствия расщепления «нецелевых» видов РНК. Продукты расщепления синтетических субстратов также служат для создания маркеров по размеру для проведения анализа РНК дикого типа и мутантных РНК в популяции образцов. Таким образом, для каждого анализа требуется наличие двух молекул киНК, двух субстратов и одного неизвестного образца, объединенных в шесть реакционных смесей. Наличие продуктов расщепления определяют с использованием тестов на защиту от РНКазы, так что полноразмерная РНК и фрагменты расщепления РНК могут быть анализированы в одной линии в полиакриламидном геле. При этом абсолютно не требуется количественно выражать результат, для того чтобы оценить экспрессию мутантных РНК и предполагаемый риск соответствующих фенотипических изменений в целевых клетках. Экспрессия мРНК, белковый продукт которой вовлекается в развитие данного фенотипа (например, фенотипа, связанного с заболеванием или инфекцией), является вполне адекватным показателем для установления степени риска. Если используют зонды со сравнимой удельной активностью для обоих транскриптов, то качественное сравнение уровней РНК является вполне адекватным и снижает стоимость первоначальной диагностики. Более высокие соотношения мутантной формы к дикой форме коррелируют с более высоким риском, независимо от того, как происходит сравнение уровней РНК, качественно или количественно.

Все патенты и публикации, указанные в настоящем описании, являются показательными для уровня достигнутой техники в той области, к которой относится настоящее изобретение. Все цитированные ссылки в настоящем описании включены в той мере, в которой каждая отдельная ссылка была бы включена независимо как цитированная работа.

Для специалистов в данной области понятно, что настоящее изобретение может быть хорошо адаптировано для осуществления всех заявленных объектов или достижения всех заявленных целей и преимуществ, а также других свойственных ему характеристик. Способы и композиции, приведенные в настоящем описании, как предпочтительные варианты его осуществления в данном контексте, являются репрезентативными и не ограничивают каким-либо образом область настоящего изобретения. Указанные изменения, а также другие виды использования, очевидные для специалистов, которые вытекают из принципов настоящего изобретения, определяются областью формулы изобретения.

Для специалистов в данной области также очевидно, что в настоящее изобретение могут быть введены различные замещения и модификации без отступления от его области и принципов. Соответственно, такие дополнительные варианты входят в область настоящего изобретения и предлагаемой формулы изобретения. Настоящее изобретение содержит описание, позволяющее специалистам в данной области тестировать различные сочетания и/или замещения химических модификаций, согласно настоящему описанию, с целью создания конструкций нуклеиновых кислот с повышенной активностью в направлении их участия в процессе РНКи. Такая повышенная активность может включать повышенную стабильность, повышенную биодоступность и/или повышенную активацию клеточных ответов, вовлекаемых в РНКи. В этой связи конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, приведенные в данном тексте, не являются ограничивающими, и любой специалист в данной области понимает, что конкретные сочетания модификаций, приведенных в настоящем описании, могут быть протестированы без проведения трудоемких экспериментов с целью идентификации молекул киНК с улучшенной активностью РНКи.

Настоящее изобретение, приведенное в данном описании с соответствующими иллюстрирующими примерами, может быть осуществлено в отсутствие любого одного или нескольких элементов, одного или нескольких ограничений, которые специфически в данном тексте не указаны. Таким образом, например, в каждом случае любой из терминов «включающий», «состоящий по существу из» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов. Термины и выражения, которые использовались в настоящем тексте, применяются с целью обозначения, но не ограничения, без намерений использовать какие-либо термины и выражения, как исключающие любые эквиваленты описанных и продемонстрированных свойств или их частей, но следует понимать, что возможно вводить различные модификации в область заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было конкретно представлено с помощью предпочтительных вариантов его осуществления, необязательные особенности, модификации и вариации изложенных в данном описании принципов могут быть перегруппированы специалистами, и такие модификации и вариации будут рассматриваться как входящие в область настоящего изобретения, которая определяется описанием и прилагаемой формулой изобретения.

Кроме того, в тех случаях, когда особенности или аспекты настоящего изобретения описываются в терминах групп Маркуша или других групп или альтернатив, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что настоящее изобретение также может быть описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы, включающей представителей группы Маркуши или другой группы.

Таблица I
Не ограничивающие примеры стабилизационных химических структур конструкций химически модифицированных киНК
Химическая структура	Пиримидин	Пурин	кэп-фрагмент	p=S	Цепь
«Stab 00»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	ТТ на 3'-концы		S/AS
«Stab 1»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	-	5 на 5'-конце 1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 2»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	-	все связи	обычно AS
«Stab 3»	2'-фтор	рибонуклеотид	-	4 на 5'-конце 4 на 3'-конце	обычно S
«Stab 4»	2'-фтор	рибонуклеотид	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 5»	2'-фтор	рибонуклеотид	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 6»	2'-О-метил	рибонуклеотид	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 7»	2'-фтор	2'-дезокси	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 8»	2'-фтор	2'-О-метил	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 9»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 10»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 11»	2'-фтор	2'-дезокси	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 12»	2'-фтор	LNA	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 13»	2'-фтор	LNA	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 14»	2'-фтор	2'-дезокси	-	2 на 5'-конце 1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 15»	2'-дезокси	2'-дезокси	-	2 на 5'-конце 1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 16»	рибонуклеотид	2'-О-метил	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 17»	2'-О-метил	2'-О-метил	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 18»	2'-фтор	2'-О-метил	3'-конец		обычно S
«Stab 19»	2'-фтор	2'-О-метил	5' и 3'-концы		S/AS
«Stab 20»	2'-фтор	2'-дезокси	3'-конец		обычно AS
«Stab 21»	2'-фтор	рибонуклеотид	3'-конец		обычно AS
«Stab 22»	рибонуклеотид	рибонуклеотид	3'-конец		обычно AS
«Stab 23»	2'-фтор*	2'-дезокси*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 24»	2'-фтор*	2'-О-метил*	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 25»	2'-фтор*	2'-О-метил*	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 26»	2'-фтор*	2'-О-метил*	-		S/AS
«Stab 27»	2'-фтор*	2'-О-метил*	3'-конец		S/AS
«Stab 28»	2'-фтор*	2'-О-метил*	3'-конец		S/AS
«Stab 29»	2'-фтор*	2'-О-метил*		1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 30»	2'-фтор*	2'-О-метил*			S/AS
«Stab 31»	2'-фтор*	2'-О-метил*	3'-конец		S/AS
«Stab 32»	2'-фтор	2'-О-метил			S/AS
«Stab 33»	2'-фтор	2'-дезокси*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 34»	2'-фтор	2'-О-метил*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 35»	2'-фтор**	2'-О-метил**			обычно AS
«Stab 36»	2'-фтор**	2'-О-метил**			обычно AS
«Stab 3F»	2'-OCF3	рибонуклеотид	-	4 на 5'-конце 4 на 3'-конце	обычно S
«Stab 4F»	2'-OCF3	рибонуклеотид	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 5F»	2'-OCF3	рибонуклеотид	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 7F»	2'-OCF3	2'-дезокси	5' и 3'-концы	-	обычно S
«Stab 8F»	2'-OCF3	2'-О-метил	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 11F»	2'-OCF3	2'-дезокси	-	1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 12F»	2'-OCF3	LNA	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 13F»	2'-OCF3	LNA		1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 14F»	2'-OCF3	2'-дезокси		2 на 5'-конце 1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 15F»	2'-OCF3	2'-дезокси		2 на 5'-конце 1 на 3'-конце	обычно AS
«Stab 18F»	2'-OCF3	2'-О-метил	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 19F»	2'-OCF3	2'-О-метил	3'-конец		S/AS
«Stab 20F»	2'-OCF3	2'-дезокси	3'-конец		обычно AS
«Stab 21F»	2'-OCF3	рибонуклеотид	3'-конец		обычно AS
«Stab 23F»	2'-OCF3*	2'-дезокси*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 24F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 25F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	-	1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 26F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	-		S/AS
«Stab 27F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	3'-конeц		S/AS
«Stab 28F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	3'-конeц		S/AS
«Stab 29F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*		1 на 3'-конце	S/AS
«Stab 30F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*			S/AS
«Stab 31F»	2'-OCF3*	2'-О-метил*	3'-конец		S/AS
«Stab 32F»	2'-OCF3	2'-О-метил			S/AS
«Stab 33F»	2'-OCF3	2'-дезокси*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 34F»	2'-OCF3	2'-О-метил*	5' и 3'-концы		обычно S
«Stab 35F»	2'-OCF3*†	2'-О-метил*†			обычно AS
«Stab 36F»	2'-OCF3*†	2'-О-метил*†			обычно AS

CAP = любой концевой кэп-фрагмент, см., например, фиг. 10.

Все Stab 00-34 химические структуры могут включать 3'-концевые тимидиновые (ТТ) остатки.

Все Stab 00-34 химические структуры в типичном случае включают примерно 21 нуклеотид, но могут варьировать согласно настоящему описанию.

Все Stab 00-36 химические структуры могут также включать 1 рибонуклеотид в смысловой или цепи-«пассажире» в 11 положении спаренного основания в двухцепочечном дуплексе нуклеиновой кислоты, определяемом от 5'-конца антисмысловой или ведущей цепи (см. фиг. 6С).

S = смысловая цепь

АS = антисмысловая цепь

*Stab 23 содержит один рибонуклеотид, смежный с 3'-CAP.

*Stab 24 и Stab 28 содержат один рибонуклеотид на 5'-конце.

*Stab 25, Stab 26, Stab 27, Stab 35 и Stab 36 содержат три рибонуклеотида на 5'-конце.

*Stab 29, Stab 30, Stab 31, Stab 33, Stab 34 - любой пурин в первых трех нуклеотидных положениях от 5'-конца представляет рибонуклеотид.

p = фосфоротиоатная связь

†Stab 35 содержит 2'-О-метил U на 3'-выступающих фрагментах и три рибонуклеотида на 5'-конце.

†Stab 36 содержит 2'-О-метильные выступающие фрагменты, которые комплементарны к целевой последовательности (природные выступающие фрагменты) и три рибонуклеотида на 5'-конце.

Таблица III
А. Цикл синтеза 2,5 мкмоль в ABI 394 Instrument
Реактив	Эквиваленты	Количество	Время ожидания* ДНК	Время ожидания* 2'-О-метил	Время ожидания* РНК
Фосфорамидиты	6,5	163 мкл	45 сек	2,5 мин	7,5 мин
S-этилтетразол	23,8	238 мкл	45 сек	2,5 мин	7,5 мин
Уксусный ангидрид	100	233 мкл	5 сек	5 сек	5 сек
N-метилимидазол	186	233 мкл	5 сек	5 сек	5 сек
ТХУ	176	2,3 мкл	21 сек	21 сек	21 сек
Йод	11, 2	1,7 мкл	45 сек	45 сек	45 сек
Реактив Бекож	12,9	645 мкл	100 сек	300 сек	300 сек
Ацетонитрил	NA	6,67 мкл	NA	NA	NA

B. Цикл синтеза 0,2 мкмоль в ABI 394 Instrument
Реактив	Эквиваленты	Количество	Время ожидания* ДНК	Время ожидания* 2'-О-метил	Время ожидания* РНК
Фосфорамидиты	15	31 мкл	45 сек	233 сек	465 сек
S-этилтетразол	38,7	31 мкл	45 сек	233 мин	465 сек
Уксусный ангидрид	655	124 мкл	5 сек	5 сек	5 сек
N-метилимидазол	1245	124 мкл	5 сек	5 сек	5 сек
ТХУ	700	732 мкл	10 сек	10 сек	10 сек
Йод	20,6	244 мкл	15 сек	15 сек	15 сек
Реактив Бекож	7,7	232 мкл	100 сек	300 сек	300 сек
Ацетонитрил	NA	2,64 мкл	NA	NA	NA

С. Цикл синтеза 0,2 мкмоль в 96-ячеечных планшетах
Реактив	Эквиваленты: ДНК/2'-О-метил/рибо	Количество: ДНК/2'-О-метил/рибо	Время ожидания* ДНК	Время ожидания* 2'-О-метил	Время ожидания* РНК
Фосфорамидиты	22/33/66	40/60/120 мкл	60 сек	180 сек	360 сек
S-этилтетразол	70/105/210	40/60/120 мкл	60 сек	180 мин	360 сек
Уксусный ангидрид	265/265/265	50/50/50 мкл	10 сек	10 сек	10 сек
N-метилимида-зол	502/502/502	50/50/50 мкл	10 сек	10 сек	10 сек
ТХУ	238/475/475	250/500/500 мкл	15 сек	15 сек	15 сек
Йод	6,8/6,8/6,8	80/80/80 мкл	30 сек	30 сек	30 сек
Реактив Бекож	34/51/51	80/120/120 мкл	100 сек	200 сек	200 сек
Ацетонитрил	NA	1150/1150/1150 мкл	NA	NA	NA
* - время ожидания не включает время контакта в ходе доставки * - в тандемном синтезе используется двойное связывание линкерной молекулы

Таблица IV

Липидные наночастичные композиции(LNP)

Таблица V
Алгоритм Сирны, описывающий характер структур путем присвоения им относительного балльного показателя с целью предсказания гиперактивных киНК. Все приведенные положения даны для смысловой цепи 19-мерной киНК.
Описание картины	Картина No	Балльный показатель
G или C в положении 1	1	5
A или U в положении 19	2	10
A/U обогащенный участок между положениями 15-19	3	10
Тяж из 4 G или 4 C (не предпочтительно)	4	-100
G/C обогащенный участок между положениями 1-5	5	10
A или U в положении 18	6	5
A или U в положении 10	7	10
G в положении 13 (не предпочтительно)	8	-3
A в положении 13	9	3
G в положении 9 (не предпочтительно)	10	-3
A в положении 9	11	3
A или U в положении 14	12	10

Таблица VI
Иммуностимуляция CD-1 мышей, после однократной инъекции 3 мг/кг киРНК в препарате LNP. Уровни IL-6 и TNF-α измеряют через 2,5 часа после инъекции, а уровни IFN-γ и IFN-α определяют через 8 часов после инъекции. Приведенные показатели даны в виде среднего значения ± стандартное отклонение, n=5.
киРНК	IL-6 (пг/мл)	TNF-α (пг/мл)	IFN-γ (пг/мл)	IFN-α (пг/мл)
ФБР	13±4	BLOD^a	BLOQ^b	BLOD
HBV263M-LNP-086	33±21	BLOD	BLOQ	BLOD
HBV263R-LNP-086	2035±378	169±61	756±345	41822±11321
^aBLOD - ниже предела выявления ^bBLOQ - ниже предела количественного определения

Таблица VII
Вес тела и органов через 1 и 14 дней после введения 3 мг/кг HBV263-LNP-086 или ФБР мышам. В группы по оценке каждой дозы включают по пять животных, которых подвергают эвтаназии в заданные временные точки. Определяют вес тела животных перед эвтаназией. Приведенные данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение.
Доза	Дни после введения дозы	Вес тела (г)	Вес печени (г)	Вес печени: вес тела (г/г)	Вес селезенки (г)	соотношение веса селезенки и веса тела (г/)
ФБР	1	34,5±3,3^а	2,119±0,178	0,057±0,002	0,125±0,022	0,003±0,001
14	36,5±3,5	1,991±0,275	0,055±0,002	0,110±0,034	0,003±0,001
HBV 263-LNP-086 3 мг/кг	1	33,6±2,8^а	1,970±0,119	0,055±0,003	0,106±0,017	0,003±0,001
14	35,1±1,2	1,944±0,101	0,055±0,001	0,112±0,025	0,033±0,001
^an = 10 для оценки веса тела в первый день после введения дозы

1. Молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая опосредует активность РНК-мишени путем интерференции РНК, включающая смысловую цепь и антисмысловую цепь:
;
,
где верхняя цепь представляет собой смысловую цепь и нижняя цепь представляет собой антисмысловую цепь молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты; указанная антисмысловая цепь включает последовательность, комплементарную указанной РНК-мишени; каждый N обозначает нуклеотид; каждый В обозначает концевой кэп-фрагмент, который может присутствовать или отсутствовать; (N) обозначает не спаренные по основаниям или выступающие нуклеотиды, которые могут быть не модифицированы или могут быть химически модифицированы; [N] обозначает нуклеотидные положения, которые представлены рибонуклеотидами; X1 и Х2 обозначают целые числа от 0 до 4; Х3 обозначает целое число от 9 до 30; Х4 обозначает целое число от 11 до 30 при условии, что сумма Х4 и Х5 составляет 17-36; Х5 обозначает целое число от 1 до 6; и
(а) любые пиримидиновые нуклеотиды N, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2′-дезокси-2′-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды N, присутствующие в антисмысловой цепи, представляют собой 2′-О-метилнуклеотиды;
(b) любые пиримидиновые нуклеотиды N, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой 2'-дезокси-2'-фторнуклеотиды; любые пуриновые нуклеотиды N, присутствующие в смысловой цепи, представляют собой дезоксирибонуклеотиды; и
(c) любые нуклеотиды (N) представляют собой необязательно 2′-O-метил-, 2′-дезокси-2′-фтор- или дезоксирибонуклеотиды.

2. Молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты по п.1, где Х5=1, 2 или 3; каждый X1 и Х2=1 или 2; Х3=12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, и Х4=15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30.

3. Молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты по п.1, где В присутствует на 3′- и 5′-концах смысловой цепи.

4. Молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты по п.1, включающая одну или несколько фосфоротиоатных межнуклеотидных связей на первом концевом (N) на 3′-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или обеих, смысловой и антисмысловой, цепей молекулы киНК.

5. Композиция для опосредования активности РНК-мишени путем интерференции РНК, включающая молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты по п.1 в фармацевтически приемлемом носителе или разбавителе.

Новая эндо-(1-4)- -d-ксиланаза из penicillium canescens (варианты), фрагмент днк, кодирующий секретируемую эндо-(1-4)- -d-ксиланазу из penicillium canescens (варианты), и способ ее получения // 2412246

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новые эндо-(1-4)- -D-ксиланазы мицелиального гриба Penicillium canescens. .

Новый вирус растений // 2411290

Изобретение относится к выделенному вирусу растений, названному вирус томата торрадо (ToTV), и его компонентам, а также к способам получения устойчивых к ToTV растений. .

Модифицированные днк аптамеры, ингибирующие активность тромбина // 2410432

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к прямым ингибиторам тромбина. .

Днк-конструкции для специфического ингибирования экспрессии генов посредством рнк-интерференции // 2410431

Изобретение относится к области генетической инженерии и может быть использовано в практических целях для ингибирования в клетках продукции целевых белков. .

Способы и композиции для ингибирования экспрессии рецептора p2х7 // 2410430

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной терапии. .

Конструкции слияния и их применение для получения антител с повышенными аффинностью связывания fc-рецептора и эффекторной функцией // 2407796

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к области модификации гликозилирования белков. .

Патоген-индуцируемый синтетический промотор // 2406761

Полипептиды, обладающие противомикробным действием, и кодирующие их полинуклеотиды // 2403260

Аптамерный олигонуклеотид - прямой ингибитор тромбина // 2401306

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к прямым ингибиторам тромбина, и может быть использовано в медицине. .

Средство, обладающее иммуностимулирующим и гемостимулирующим действием // 2414223

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, влияющих на иммунную и кроветворную системы. .

Олигонуклеотиды или их функциональные гомологи, содержащая их композиция и способ лечения в-клеточной опухоли // 2413519

Средство для ингибирования фермента поли(адф-рибозо)полимеразы-1 человека // 2411948

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющему собой производные нуклеозидов общей формулы (I), где Х - Н или OR1; один или два из заместителей R1, R 2, R3 - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в - или -положении.

Олигонуклеотид или его функциональный гомолог, содержащая его композиция и способ лечения b-клеточной опухоли // 2409672

Изобретение относится к олигонуклеотиду с последовательностью SEQ ID NO:1 или к его функциональному гомологу (нуклеотидная последовательность раскрыта в тексте описания).

Аптамерные терапевтические средства, применимые для лечения связанных с комплементом расстройств // 2406507

Изобретение относится к аптамерам, которые описаны в таблице 1 ниже. .

Идентификация варианта днк, связанного с гиполактазией взрослого типа // 2391404

Изобретение относится к области биотехнологии и касается варианта ДНК, связанного с гиполактазией взрослого типа. .

Ингибиторы передачи сигнала трансформирующих факторов роста (tgf-r) для лечения расстройств цнс // 2385933

Изобретение относится к биотехнологии. .

Способ пролиферации кардиомиоцитов // 2378375

Изобретение относится к биотехнологии. .

Олигомерное соединение, понижающее экспрессию человеческого гена bcl-2, конъюгат, фармацевтическая композиция и применение олигомерного соединения для лечения рака // 2377301

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к олигомерному соединению, длиной 10-30 нуклеиновых оснований, и может быть использовано в медицине. .

Лечение пролиферативных заболеваний с использованием антисмыслового олигомера iap и химиотерапевтического препарата // 2376018

Изобретение относится к области медицины и касается лечения пролиферативных заболеваний с использованием антисмыслового олигомера IAP и химиотерапевтического препарата.

Оптимизированная композиция для инъекции рнк // 2418593

Изобретение относится к области медицины и касается оптимизированной композиции для инъекции РНК