Способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот
Владельцы патента RU 2420581:
Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) (RU)
Сичуаньский индустриальный институт антибиотиков, Синофарм (СИИА) (CN)
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает культивирование клеток Escherichia coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот. В качестве критериев выбора момента прекращения процесса биосинтеза фермента используют величину рН культуральной жидкости и константу распределения целевого фермента Красп=Абмк/Ар-р, где Абмк - ферментативная активность биомассы клеток (МЕ/г влажн.), а Ар-р - ферментативная активность надосадочной жидкости (МЕ/мл). Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот прекращают при Красп не менее 350 и значении рН 7,9÷8,2. Полученную биомассу клеток в концентрации 100÷150 мг сух./г полимеризационной смеси суспендируют в растворе акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида при весовом отношении 20:1. В течение 5÷30 мин осуществляют модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации 1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка. Процесс полимеризации инициируют солью надсерной кислоты. Способ позволяет получить биокатализатор, обладающий высокими целевой активностью и стабильностью и не содержащий вымываемых при эксплуатации белков, загрязняющих целевой продукт биокаталитической трансформации. Синтетазная активность биокатализатора составляет 750-950 МЕ/г сух. 3 табл.
Заявляемое изобретение относится к получению гетерогенных биокатализаторов (БК) на основе бактериальных клеток, а именно биокатализатора на основе клеток Esherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот.
Известен способ иммобилизации клеток E.coli, обладающих пенициллинацилазной активностью, состоящий во включении сшитых глутаровым альдегидом клеток со специально повышенной проницаемостью клеточных стенок в пористые сферические шарики полиакриламидного геля [1]. При получении шариков геля полимеризацию инициируют окислительно-восстановительной парой, в которой катализатором процесса служит N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин, а инициатором - персульфат аммония [2]. Получают биокатализатор, предназначенный для ферментативного гидролитического расщепления бензилпенициллина (БП) с целью производства 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). Его ферментативная активность по гидролизу БП очень низка - менее 8 МЕ/г1 (1 За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту).
Известен способ иммобилизации микробных клеток, в том числе клеток E.coli, путем их ковалентного присоединения к активным группам сшитых полимеров (гелей), получаемых путем сополимеризации различных мономеров, в основном акрилатной природы [3]. При этом клетки приводят в контакт либо с уже готовым полимером, либо с мономерами, которые затем подвергают полимеризации. До контакта с полимером или мономерами клетки могут быть обработаны полифункциональным сшивающим агентом, в том числе глутаровым альдегидом. Полимеризацию мономеров инициируют парой бета-диметиламинопропионитрил - персульфат аммония. Данный патент не содержит примеров получения биокатализатора на основе клеток E.coli, однако описаны способы иммобилизации клеток Proteus rettgeri, содержащих пенициллинацилазу, с целью получения биокатализаторов для получения 6-АПК ферментативным гидролизом БП. Даже лучший из описанных биокатализаторов обладает очень низкой операционной стабильностью, характеризующейся двукратным падением активности за 20 циклов использования в процессе гидролиза БП, что соответствует 60 часам.
Наиболее близким к заявляемому способу получения биокатализатора на основе иммобилизованных клеток E.coli является способ получения биокатализатора для гидролитического расщепления БП, осуществляемый путем включения в полиакриламидный гель клеток E.coli, содержащих пенициллинамидазу (пенициллинамидогидролазу) [4]. Согласно ближайшему аналогу процедура получения биокатализатора состоит в следующем. Глубинное культивирование штамма E.coli АТСС 9637 осуществляют при 30°C на среде, содержащей органические источники углерода и азота, а также неорганические соли. Процесс биосинтеза проводят в течение 24 часов; использование каких-либо специальных критериев для выбора момента остановки биосинтеза не описано. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля (акриламид и N,N'-метиленбисакриламид) и проводят процесс гелеобразования, добавляя в реакционную смесь катализатор полимеризации (бета-диметиламинопропионитрил) и ее инициатор (персульфат калия). Биомассу клеток используют в количестве, необходимом для создания ее концентрации в полимеризационной смеси (п.см) СБМК=33 мг сух./г п.см. Полученный гель измельчают и промывают.
Основными недостатками способа согласно ближайшему аналогу являются отсутствие ковалентной фиксации клеток при иммобилизации, влекущее за собой возможность загрязнения целевого продукта ферментативной трансформации примесями органической природы, в первую очередь белками, вымываемыми из биокатализатора, а также низкая активность иммобилизованных по этому способу клеток. Так, биокатализатор, получаемый согласно ближайшему аналогу, в отношении гидролиза БП имеет активность лишь 22 МЕ/г; его активность в отношении синтеза бета-лактамных антибиотиков, в частности в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, не контролировалась.
Воспроизведение способа иммобилизации клеток согласно ближайшему аналогу (Пример 3) с использованием штамма E.coli VKPM В-10182, продуцирующего синтетазу цефалоспоринов-кислот, позволило получить биокатализатор, обладающий активностью по синтезу цефазолина около 40 МЕ/г влажн. (300 МЕ/г сух.) при выходе активности процесса иммобилизации 50%. Низкая активность такого биокатализатора не позволяет использовать его для синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторе периодического действия с перемешиванием. Так, для процесса синтеза цефазолина в таком реакторе необходим биокатализатор с активностью не ниже 60 МЕ/г влажн., 330 МЕ/г сух. Стабильность биокатализатора, полученного согласно прототипу, тоже низка. В условиях ускоренной инактивации (40°C, рН 6,5) период его полуинактивации составляет всего 20 часов, что является результатом не только термической инактивации фермента, но и его физического вымывания из гелевой матрицы. Потери синтетазной активности при однократной промывке биокатализатора 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 в мягких условиях (1 г влажного БК в 3 мл буфера, 20°C, 1 час) составляют около 30%. Наблюдается вымывание белка в надосадочную жидкость в количестве 5 мг с 1 г БК. Неизбежное загрязнение целевого продукта процесса биокаталитической трансформации веществами белковой природы делает невозможным использование такого биокатализатора для производства антибиотиков.
Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа получения биокатализатора на основе клеток Escherichia coli, иммобилизованных в полиакриламидном геле, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, характеризующегося высокими активностью и стабильностью и не содержащего слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.
Поставленную задачу решают путем совокупного использования в процессе получения биокатализатора ряда приемов, осуществляемых в выбранных оптимизированных условиях.
Согласно заявляемому способу исходным материалом для получения биокатализатора служит штамм E.coli, продуцирующий фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот. Культивирование данного продуцента осуществляют на жидкой ферментационной среде, содержащей органические источники углерода и азота. В качестве критерия остановки процесса используют константу распределения целевого фермента между биомассой клеток (БМК) и внешним раствором Красп, характеризующую прочность связывания фермента с клеточными структурами. Выращенную биомассу клеток суспендируют в растворе мономеров полиакриламидного геля, модифицируют глутаровым альдегидом, а затем добавляют инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты. Внесение в реакционную смесь катализатора полимеризации не требуется. Полученный гель измельчают и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ (белки, мономеры).
Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот останавливают в фазе стационарного роста клеток E.coli при константе распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот Красп≥350 и значении рН культуральной жидкости 7,9÷8,2. Временные рамки наступления выбранного оптимального для иммобилизации состояния клеток могут сдвигаться в зависимости от используемого штамма E.coli, что влияет на продолжительность биосинтеза (см. Таблицу 1 в Примере 4). Получаемые в выбранных условиях клетки сочетают высокую активность по целевому ферменту (не менее 1600 МЕ/г сух.) и прочное связывание синтетазы цефалоспоринов-кислот клеточными структурами, остающимися в стационарной фазе интактными. Сохранение естественного клеточного микроокружения целевого фермента предохраняет его от неблагоприятных воздействий процессов иммобилизации и последующей эксплуатации биокатализатора, поэтому иммобилизация клеток E.coli с Kpaсп≥350 обеспечивает получение биокатализатора с высокой активностью по синтезу цефалоспоринов-кислот и хорошей стабильностью. При рН культуральной жидкости ниже 7,9 синтетаза цефалоспоринов-кислот прочно связана с клеточными структурами (Kрасп≥350), однако использование таких клеток для иммобилизации нецелесообразно из-за недостаточно высокой активности получаемой биомассы клеток. Использование для иммобилизации клеток со слабо связанным целевым ферментом (Красп<350, рН>8,2), находящихся в состоянии ограниченного цитолиза (разрушение цитоплазмы клеток) или следующего за ним автолиза (разрушение цитоплазмы и клеточных мембран), приводит к снижению стабильности биокатализатора, а также потерям активности в процессе иммобилизации (Пример 5).
Использование высоких концентраций биомассы клеток (густоты клеточной суспензии) CБМК=100÷150 мг сух./г п.см. (в 3-5 раз выше, чем в методе согласно ближайшему аналогу) позволяет получать высокоактивный биокатализатор, благодаря введению в полимеризационную смесь большого количества активных клеток. Последующая модификация глутаровым альдегидом предотвращает их вымывание из геля в процессе получения и отмывки биокатализатора. Верхний предел густоты клеточной суспензии (150 мг сух./г п.см.) ограничен возможностью внесения в полимеризационную смесь влажной БМК с содержание сухих веществ 20-23% в количестве не более 70% от ее общего веса (Wп.см). Использование густоты суспензии менее 100 мг сух./г п.см. не обеспечивает получение биокатализатора с достаточно высокой активностью (см. Таблицу 2 в Примере 6).
Модификация клеток глутаровым альдегидом при осуществлении заявляемого способа имеет два положительных последствия. Во-первых, это приводит к необратимой фиксации в биокатализаторе белкового содержимого клеток, включая целевой фермент. Результатом являются повышение активности и стабильности иммобилизованных клеток, а также отсутствие вымывания белков из готового биокатализатора. Во-вторых, промежуточные продукты взаимодействия глутарового альдегида с белками выступают катализаторами процесса полимеризации мономеров полиакриламидного геля, что делает ненужным внесение в реакционную смесь обычно используемых для этой цели веществ (бета-диметиламинопропионитрил или N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин). Возможность такой замены была продемонстрирована ранее при иммобилизации свободных белков в акрилатных гелях [5]. Согласно заявляемому способу глутаровый альдегид используют в относительной концентрации СГА=1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, проводя модификацию в течение τмод=5÷30 мин. Использование модификатора в концентрации выше 9·10-3 ммоль/мг белка приводит к получению недостаточно активного биокатализатора, а при концентрации глутарового альдегида ниже 1·10-3 ммоль/мг белка и/или времени модификации меньше 5 мин снижается стабильность биокатализатора и возникает возможность вымывания из него белков. При времени модификации глутаровым альдегидом больше 30 мин в реакционной смеси снижается концентрация промежуточных продуктов взаимодействия белков с глутаровым альдегидом, являющихся катализаторами полимеризации акрилатных мономеров, поэтому последующий процесс гелеобразования протекает медленно, а механические свойства получаемого биокатализатора ухудшаются (см. Таблицу 3 в Примере 7).
Способ в общем виде
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот осуществляют путем культивирования штамма E.coli, продуцирующего соответствующий фермент, на жидкой ферментационной среде следующего состава (мас.%): кукурузный экстракт (2% по сухому весу) и тиофен-2-уксусная кислота (0,1%). Ферментацию останавливают при константе связывания целевого фермента Красп≥350 и значении рН культуральной жидкости в диапазоне 7,9÷8,2. Выращенную клеточную биомассу отделяют центрифугированием (5-8 тыс. об/мин), промывают 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5 и вновь отделяют центрифугированием в тех же условиях. Осадок, представляющий собой биомассу клеток (БМК), используют для иммобилизации путем включения модифицированных клеток в полиакриламидный гель, получаемый сополимеризацией акриламида (АА) и N.N'-метилен-бис-акриламида (БИС).
Биомассу клеток, взятую из расчета СБМК=100÷150 мг сух./г п.см., суспендируют в фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем мономеры полиакриламидного геля в весовом соотношении АА:БИС=20:1 при общей их концентрации в полимеризационной смеси Cмoн=9%. При постоянном перемешивании и охлаждении клеточной суспензии на ледяной бане проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации CГА=1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, содержащимся в клетках. Время модификации глутаровым альдегидом τмод=5÷30 мин. По окончании модификации в реакционную смесь вносят инициатор полимеризации - соль надсерной кислоты, например персульфат аммония или персульфат калия, в концентрации, необходимой для осуществления гелеобразования в течение 20-120 сек. Полученный блок геля выдерживают на холоду еще 20-30 мин, а затем измельчают, дважды продавливая сквозь металлическое сито с размером ячеек 0,5 мм, и отмывают от не связавшихся в процессе полимеризации веществ. Иммобилизованные клетки отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией на пористом стеклянном фильтре. Получают биокатализатор с активностью в отношении синтеза цефазолина не менее 100 МЕ/г влажн., 600 МЕ/г сух., периодом полуинактивации (τ1/2) не менее 800 часов (40°C и рН 6,5). Биокатализатор устойчив в отношении вымывания из него веществ белковой природы и может быть использован в процессах синтеза цефалоспоринов-кислот в реакторах периодического действия с перемешиванием.
Заявляемый способ получения биокатализатора на основе иммобилизованных в полиакриламидном геле клеток штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот (Примеры 1, 2, 6, 7), имеет ряд преимуществ по сравнению с контролем - способом, выполненным согласно ближайшему аналогу и осуществленным с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182 (Пример 3):
- повышение активности получаемого биокатализатора в отношении синтеза цефазолина в 2-3 раза (600÷950 МЕ/г сух. по заявляемому способу и 300 МЕ/г сух. согласно контролю);
- повышение стабильности получаемого биокатализатора в условиях ускоренной инактивации не менее чем в 40 раз (τ1/2=800-2000 час по заявляемому способу и τ1/2=20 час согласно контролю);
- отсутствие вымывания целевого фермента и других белков из биокатализатора, полученного согласно заявляемому способу, в отличие от биокатализатора, полученного согласно ближайшему аналогу.
Изобретение проиллюстрировано следующими примерами осуществления способа получения биокатализатора с использованием двух штаммов E.coli, продуцирующих синтетазу цефалоспоринов-кислот, а именно VKPM В-10182 из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) и CGMCC No.3508 из Китайской Коллекции Культур Микроорганизмов (CGMCC).
Во всех приведенных примерах приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалоспорина-кислоты цефазолина из 3-метил-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) и метилового эфира 1(Н)-теразолилуксусной кислоты (МЭТЗУК). Ее определяют по начальной скорости образования цефазолина в следующих условиях: рН 7,5, температура (30±1)°C, концентрации субстратов - (0,059±0,002) моль/л ММТД-7-АЦК и (0,23 6±0,004) моль/л МЭТЗУК. Содержание цефазолина в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Содержание сухих веществ в биомассе клеток и биокатализаторах определяют весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°C до постоянной массы.
Константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот (Красп) между биомассой клеток и внешним раствором определяют путем анализа ферментативной активности биомассы клеток (АБМК, МЕ/г влажн.) и надосадочной жидкости (Ар-р, МЕ/мл) после суспендирования 1 г влажной БМК в 5 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и рассчитывают по формуле: Красп=АБМК/Ар-р.
Содержание белка в биомассе клеток и растворах определяют методом Лоури [6]. За динамикой инактивации биокатализаторов следят, контролируя их остаточную активность после инкубации в течение различного времени в условиях ускоренной инактивации при 40°C и рН 6,5 в 0,1 М фосфатном буфере. Стабильность образцов характеризуют по времени их полуинактивации в данных условиях (τ1/2, час).
Потери белков и целевого фермента при промывке биокатализаторов контролируют путем определения содержание белков и определения синтетазной активности в надосадочной жидкости после суспендирования 1 г влажного биокатализатора в 3 мл 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,5 в течение 1 часа при 20°C.
Пример 1. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli VKPM В-10182 проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих по 100 мл ферментационной среды следующего состава:
- кукурузный экстракт - 2% (на сухой вес)
- тиофен-2-уксусная кислота - 0,1%
- вода водопроводная - до нужного объема.
рН после стерилизации 6,9-7,1.
Культивирование продуцента фермента ведут при температуре 25-26°C на круговой качалке со скоростью вращения 220-240 об/мин. Процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот проводят в течение 18 часов и останавливают при рН 8,1, Красп=380. Выращенную биомассу клеток отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге с охлаждением, промывают 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5 и повторно отделяют центрифугированием в тех же условиях.
С 3,70 л культуральной жидкости получают 46,6 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБМК) - 460 МЕ/г влажн.; 2009 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБМК) - 22,9%;
- содержание белка - 114 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм VKPM В-10182, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:
Wп. см=7,0 г; СБМК=37 мг сух./г п.см; СГА=1,7·10-3 ммоль/мг белка; τмод=15 мин; Смон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,2 г влажной биомассы клеток суспендируют в 1,4 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,32 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 30 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.
Получают 7,01 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБК) - 165 МЕ/г влажн.; 900 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБК) - 18,3%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 1200 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 59,9%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием культуры Е. соli, штамм CGMCC No.3508
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм CGMCC No.3508, осуществляют, как описано в примере 1 для штамма E.coli VKPM В-10182, с той лишь разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 16 часов и останавливают при рН 8,05, Красп=370. Выращенную биомассу клеток отделяют и отмывают в соответствии с описанием, приведенным в примере 1.
С 1,2 л культуральной жидкости получают 13,1 г влажной биомассы клеток E.coli, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБМК) - 380 ME/г влажн.; 1820 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБМК) - 23,0%;
- содержание белка - 90 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток E.coli, штамм CGMCC No.3508, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель.
Иммобилизацию проводят в следующих условиях:
Wп.cм=7,0 г; СБМК=145 мг сух./г п.см; СГА=5,0·10-3 ммоль/мг белка; τмод=10 мин; Смон=9%; инициатор полимеризации персульфат аммония - 0,2%.
Процедуру проводят в стеклянном стакане, помещенном на магнитную мешалку в ледяную баню. 4,4 г влажной биомассы клеток суспендируют в 0,7 мл 0,3 М фосфатного буфера с рН 7,5, затем добавляют 1,05 мл 60% водного раствора мономеров акриламидного геля (АА:БИС=20:1). После получения однородной суспензии в нее вносят 0,79 мл 25% водного раствора глутарового альдегида и осуществляют модификацию белков сшивающим агентом в течение 10 мин при постоянном перемешивании. Затем к полимеризационной смеси при интенсивном перемешивании добавляют 0,06 мл (60 мкл) 25% водного раствора персульфата аммония и останавливают мешалку. Через 20 секунд образуется гель, который выдерживают на ледяной бане 20 мин, измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают дистиллированной водой и 1 М водным раствором хлористого натра. Биокатализатор отделяют от промывных вод вакуумной фильтрацией.
Получают 6,95 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБК) - 150 МЕ/г влажн.; 840 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБК) - 17,8%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 1250 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 62,4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 3. Осуществление способа получения биокатализатора согласно ближайшему аналогу с использованием культуры E.coli, штамм VKPM В-10182, (контроль)
Биосинтез синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli, штамм VKPM В-10182, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1. Полученную биомассу клеток, охарактеризованную в примере 1, используют для иммобилизации путем включения в полиакриламидный гель согласно процедуре, описанной в ближайшем аналоге.
Иммобилизацию биомассы клеток осуществляют в следующих условиях:
Wп.см=7,0 г; СБМК=33 мг сух./г п.см; Смон=12,7%; катализатор полимеризации бета-диметиламинопропионитрил - 0,36%; инициатор полимеризации персульфат калия - 0,07%.
1,0 г влажной биомассы клеток суспендируют в 4,0 мл 0,9% раствора хлористого натра, затем растворяют в этой суспензии 0,75 г акриламида и 0,40 г N,N'-метилен-бис-акриламида (АА:БИС=18:1). Последовательно вносят по 0,5 мл 5% раствора бета-диметиламинопропионитрила и 1% раствора персульфата калия. Образовавшийся гель выдерживают 20 минут, затем измельчают последовательным двукратным продавливанием через металлическое сито с размером ячеек 0,50 мм и отмывают 0,9% раствора хлористого натра.
Получают 6,20 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБК) - 38 МЕ/г влажн.; 300 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБК) - 12,7%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 20 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 51,4%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- смыв синтетазной активности - 11 ME с 1 г БК (29% от исходной активности БК)
- смыв белка - 5 мг белка с 1 г БК.
Пример 4. Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот культурой E.coli
Культивирования продуцента E.coli, штамм VKPM В-10182 или CGMCC No.3508, осуществляют в колбах Эрленмейера в условиях согласно примеру 1. По ходу процесса выводят из опыта по две колбы, объединяют содержащуюся в них культуральную жидкость, контролируют в ней значение рН, а затем отделяют биомассу клеток центрифугированием и промывают ее 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,5, используемым в количестве 5 мл на 1 г БМК. Анализируют промывные воды и полученную биомассу клеток и рассчитывают константу распределения синтетазы цефалоспоринов-кислот Красп. Полученные данные о взаимосвязи рН культуральной жидкости, Красп и активности получаемой биомассы клеток (АБМК, МЕ/г сух.) представлены в Таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||
| Динамика биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот | ||||||
| Время, час | E.coli VKPM B-10182 | E.coli CGMCC No.3508 | ||||
| pH | АБМК, МЕ/г сух. | Красп | pH | АБМК, МЕ/г сух. | Красп | |
| 10 | 7,61 | 1490 | 350 | 7,55 | 1250 | 390 |
| 12 | 7,75 | 1640 | 360 | 7,65 | 1360 | 380 |
| 14 | 7,80 | 1770 | 370 | 7,95 | 1620 | 410 |
| 16 | 7,92 | 2140 | 350 | 8,05 | 1840 | 370 |
| 17 | 8,04 | 2180 | 360 | 8,10 | 1670 | 360 |
| 18 | 8,11 | 2000 | 380 | 8,18 | 1700 | 400 |
| 19 | 8,13 | 2060 | 420 | 8,28 | 1650 | 340 |
| 20 | 8,17 | 1980 | 420 | 8,38 | 1590 | 320 |
| 21 | 8,25 | 1990 | 340 | |||
| 22 | 8,32 | 1980 | 330 | |||
| 23 | 8,46 | 1855 | 300 | |||
| 24 | 8,58 | 1666 | 290 | |||
| 25 | 8,70 | 1600 | 270 | |||
| 26 | 8,95 | 1540 | 190 |
Пример 5. Использование для иммобилизации клеток со слабосвязанным целевым ферментом
Культивирование продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот, отделение и отмывку биомассы клеток осуществляют согласно примеру 1, с той разницей, что процесс биосинтеза фермента проводят в течение 22,5 часов и останавливают при pH 8,38, Kpacп=320.
С 0,70 л культуральной жидкости получают 8,1 г влажной биомассы клеток E.coli VKPM В-10182, содержащей синтетазу цефалоспоринов-кислот и характеризующейся следующими показателями качества:
- синтетазная активность - 440 МЕ/г влажн.; 1900 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ - 23,2%;
- содержание белка - 95 мг/г влажн.
Полученную биомассу клеток используют для иммобилизации в полиакриламидном геле, осуществляемой в условиях согласно Примеру 1.
Получают 6,91 г влажного биокатализатора, характеризующегося следующими показателями качества:
- синтетазная активность (АБК) - 113 МЕ/г влажн.; 750 МЕ/г сух.;
- содержание сухих веществ (βБК) - 15,1%;
- время полуинактивации при 40°C, рН 6,5 (τ1/2) - 750 час.
Выход активности процесса иммобилизации - 42,2%.
Потери при промывке готового биокатализатора буфером:
- синтетазная активность - не обнаружено
- белок - не обнаружено.
Пример 6. Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя содержание биомассы клеток в полимеризационной смеси (густоту клеточной суспензии) при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера. Для инициирования полимеризации используют различные соли надсерной кислоты. Свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 2.
| Таблица 2 | ||||||
| Влияние густоты клеточной суспензии на свойства получаемого биокатализатора | ||||||
| № | СБМК, мг сух./г п.см. | Инициатор полимеризации | βБК, % | АБК | τ1/2, час | |
| МЕ/г влажн. | МЕ/г сух. | |||||
| 1 | 75 | (NH4)2S2O8 | 13,0 | 63 | 485 | - |
| 2 | 100 | K2S2O8 | 16,1 | 108 | 670 | 1100 |
| 3 (Пример 1) | 137 | (NH4)2S2O8 | 18,3 | 165 | 900 | 1200 |
| 4 | 150 | Na2S2O8 | 19,4 | 185 | 950 | 1340 |
Пример 7. Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора
Для иммобилизации используют биомассу клеток E.coli VKPM В-10182, полученную согласно Примеру 1. Процедуру иммобилизации осуществляют в условиях согласно Примеру 1, варьируя время модификации клеток глутаровым альдегидом, а также его относительную концентрацию (при сохранении суммарного объема полимеризационной смеси за счет соответствующего изменения вносимого объема буфера). Времена гелеобразования (полимеризации, τполим, сек) и свойства полученных биокатализаторов представлены в Таблице 3.
| Таблица 3 | |||||||||
| Влияние концентрации глутарового альдегида и времени модификации на свойства получаемого биокатализатора | |||||||||
| № | СГА, ммоль/мг белка | τмод, мин | τполим, сек | βБК, % | АБК | τ1/2, час | Смыв с 1 г БК | ||
| МЕ/г влажн. | МЕ/г сух. | ME | мг белка | ||||||
| 1 | 0,5·10-3 | 15 | 60 | 14,1 | 121 | 870 | 500 | 0,26 | 0,15 |
| 2 | 1,0·10-3 | 30 | 120 | 17,0 | 150 | 880 | 810 | нет | нет |
| 3 | 1,7·10-3 | 1 | 45 | 13,8 | 130 | 950 | 620 | 0,2 | 0,1 |
| 4 (Пример 1) | 1,7·10-3 | 15 | 30 | 18,3 | 165 | 900 | 1200 | нет | нет |
| 5 | 1,7·10-3 | 45 | 600 (слабый гель) | 6,8 | 52 | 760 | - | - | - |
| 6 | 9,0·10-3 | 5 | 90 | 19,1 | 118 | 620 | 2000 | нет | нет |
| 7 | 14,0·10-3 | 15 | 60 | 18,7 | 95 | 510 | 2200 | нет | нет |
Таким образом, разработан способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, на основе клеток E.coli, иммобилизованных в полиакриламиднрм геле. Способ позволяет получать стабильный биокатализатор с активностью не менее 600 МЕ/г сух., не содержащий слабо связанных белков, способных загрязнять целевой продукт биокаталитической трансформации.
Особенностями способа являются:
- использование штаммов культуры E.coli, продуцирующих фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот;
- выбор момента остановки культивирования продуцента при Красп не менее 350 и значении рН в диапазоне 7,9÷8,2;
- проведение модификации клеток, суспендированных в растворе мономеров полиакриламидного геля, глутаровым альдегидом в оптимизированных условиях, обеспечивающих фиксацию клеточных белков в биокатализаторе, а также участие промежуточных продуктов взаимодействия глутарового альдегида с белками в процессе гелеобразования в качестве катализатора полимеризации мономеров.
Источники информации
1. Prubhune A.A., Rao B.S., Pandle A.V., SivaRaman H.: Immobilization of permeabilized Escherochia coli cells with penicillin acylase activity. Enzyme Microb Technol. 14: 161-163 (1992).
2. Pandle A., Prubhune A., SivaRaman H.: Immobilization of Saccharomyces uvarum cells in porous beads of polyacrylamide gel for ethanolic fermentation. Appi Microbiol Biotechnol 29:426-429 (1988).
3. US3957580 "Immobilized microbial cells"; SU608495 «Способ иммобилизации микробных клеток».
4. Sato Т., Tosa Т., Chibata I.: Continous production of 6-Aminopenicillanic acid from Penicillin by immobilized microbial cells. European J Appi Microbiol 2:153-160 (1976).
5. RU 1389296 «Способ получения биологически активных веществ, иммобилизованных в акрилатных гелях».
6. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price С.: Review. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appi Biochem 29: 99-108 (1999).
Способ получения биокатализатора на основе бактериальных клеток Escherichia coli, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот, включающий культивирование продуцента и иммобилизацию выращенной биомассы клеток, содержащих целевой внутриклеточный фермент, путем ее суспендирования в растворе мономеров полиакриламидного геля с последующим гелеобразованием под действием катализатора и инициатора полимеризации, отличающийся тем, что используют культуру Escherichia coli, продуцирующую фермент синтетазу цефалоспоринов-кислот, в качестве критериев выбора момента прекращения процесса биосинтеза фермента используют константу распределения целевого фермента Красп=Абмк/Ар-р,
где Абмк - ферментативная активность биомассы клеток (МЕ/г влажн.);
Ар-р - ферментативная активность надосадочной жидкости (МЕ/мл);
и величину рН культуральной жидкости, прекращая процесс биосинтеза синтетазы цефалоспоринов-кислот при Красп не менее 350 и значении рН 7,9÷8,2, биомассу клеток в концентрации 100÷150 мг сух./г полимеризационной смеси суспендируют в растворе акриламида и N,N'-метилен-бис-акриламида при весовом отношении 20:1, в течение 5÷30 мин проводят модификацию клеток глутаровым альдегидом, взятым в относительной концентрации 1·10-3÷9·10-3 ммоль/мг белка, в качестве инициатора процесса полимеризации используют соль надсерной кислоты.
