Мышиная гибридома s148 - продуцент моноклонального антитела к белку ядрышка surf-6 млекопитающих

Клон мышиных гибридомных клеток, названный «S148», получают путем слияния лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной рекомбинантным белком SURF-6 человека, слитым с глутатион-S-трансферазой, экспрессированным и выделенным из клеток Е. coli, с клетками мышиной миеломы линии P3 X63-Ag8.653 в соотношении 3:1 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450. Полученная гибридома секретирует моноклональное антитело S148, специфичное к белку ядрышка SURF-6 человека, мыши и крысы, имеющему установленную аминокислотную последовательность. Моноклональное антитело S148 по изобретению позволяет выявлять белок ядрышка SURF-6 в клетках млекопитающих с использованием методов иммуноцитохимии, иммуноблоттирования и иммунопреципитации. 8 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления белка ядрышка SURF-6 методами иммунофлуоресценции, иммуноблотирования и иммунопреципитации у человека, мыши и крысы в научно-исследовательских и лабораторных целях.

Известно, что антитела являются мощным инструментом для изучения фундаментальных вопросов, направленных на выяснение функций белков человека в норме и при патологиях. Антитела к белкам, служащим биомаркерами пролиферативного состояния клеток, повсеместно применяются также для клинической оценки прогноза опухолевой прогрессии (Lea P., Ling M. "New molecular assays for cancer diagnosis and targeted therapy". Curr. Opin. Mol. Ther. 2008,10: 251-259).

Известно также, что активация клеток млекопитающих к пролиферации сопровождается повышением содержания некоторых белков ядрышка (Sirri et al. "Nucleolus: the fascinating nuclear body" Histochem. Cell Biol. 2008, 129: 13-31). Одним из них является эволюционно консервативный белок SURF-6, называемый также SURF6 или Surfeit6 (Polzikov et al. "Identification of an evolutionary conserved SURF-6 domain in a family of nucleolar proteins extending from human to yeast". Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 327: 143-149; Гурченков и др. "Свойства и функции нового белка ядрышка SURF-6 в клетках мыши 3Т3". Биоорганическая химия. 2005, 31: 578-585; Моралева и др. "Ранняя экспрессия белка ядрышка SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации in vitro". Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2009, 147: 507-511). Эти наблюдения позволяют отнести белок SURF-6 к активационным маркерам пролиферирующих клеток млекопитающих.

Для выявления SURF-6 у человека, мыши и крысы на сегодняшний день существует несколько антител. Одно антитело было получено в лабораторных условиях (Magoulas and Fried "The Surf-6 gene of the mouse surfeit locus encodes a novel nucleolar protein". DNA Cell Biol. 1996, 15: 305-316), другие антитела являются коммерческими. Однако все существующие на сегодняшний день антитела для выявления SURF-6 у человека, мыши и крысы являются поликлональными. Сведений о мышиных гибридомах - прототипах настоящего изобретения - нам обнаружить не удалось.

Задачей изобретения является получение мышиной гибридомы - продуцента моноклонального антитела к белку ядрышка SURF-6 для его выявления в клетках млекопитающих (человека, мыши и крысы) методами иммунофлуоресценции, иммуноблотирования и иммунопреципитации.

Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы S148 - продуцента моноклонального антитела к белку ядрышек SURF-6 для его выявления в клетках млекопитающих методами иммунофлуоресценции, иммуноблотирования и иммунопреципитации, полученной путем иммунизации мышей линии Balb/c SURF-6 человека, экспрессированным в Е. coli в виде рекомбинантного белка SURF-6-глутатион-S-трансфераза, и слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450.

Мышиную гибридому S148 получают следующим образом:

Трем мышам линии Balb/c (весом 20 г) внутрибрюшинно инъецируют по 5 мкг белка, растворенного в 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда, а затем дважды - тоже количество белка, растворенного в неполном адъюванте Фрейнда. Интервал между иммунизациями составляет 7 суток. Сенсибилизацию (т.е. появление в сыворотке крови животных антител к SURF-6) проверяют в реакции непрямой иммунофлуоресценции и методом иммуноблотирования на клетках человека HeLa, как описано в Примерах 2 и 3. Лимфоциты селезенки мыши, в сыворотке крови которой присутствуют антитела к SURF-6, выделяют, как описано в Примере 4. Их сливают с культивируемыми клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 в соотношении 3:1, используя в качестве сливающего агента 50%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450, как описано в Примере 5. После завершения процедуры слияния клетки переносят в ячейки 96-луночных плоскодонных планшетов (0.2×10⁶ клеток на ячейку) в среде RPMI 1640 с селективными агентами (0.1 мМ гипоксантина, 0.4 мкМ аминоптерина и 0.016 мМ тимидина) (Пример 5). Через 7 суток производят скрининг культуральных жидкостей из лунок, давших рост гибридным клонам сначала методом ELISA, используя в качестве субстрата белок SURF-6-глутатион-S-трансферазу, выделенный из бактерий, как описано в Примере 1. Культуральную жидкость от ELISA-позитивных клонов затем тестируют методом иммунофлуоресценции на клетках человека HeLa, мыши NIH/3T3 и крысы С6, как описано в Примере 2, а также методом иммуноблотов, как описано в Примере 3. В результате отбирают клон S148, секретирующий моноклональное антитело, выявляющее SURF-6 в клетках HeLa (фиг.1а-в), мыши NIH/3T3 (фиг.1г-е) и крысы С6, зафиксированных обоими способами. Антитело S148 выявляет SURF-6 в лизатах тех же клеток на иммуноблотах (фиг. дорожки а'-в'). Клетки клона S148 четырехкратно клонируют методом лимитирующих разведении (Пример 6) и выводят в массовую культуру по стандартной методике.

Мышиная гибридома S148 - продуцент моноклонального антитела S148 - имеет следующие характеристики:

Морфологические признаки: Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.

Условия культивирования клеток гибридомы S148: Среда для культивирования - RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), 20% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США), 2 мМ L-глутамина, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина. Условия культивирования: 37°C, абсолютная влажность и 5% СО₂ в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10.

Способ криоконсервирования клеток гибридомы S148. Криозащитная среда: 55% среды DMEM («ПанЭко», Россия), 40% эмбриональной сыворотки теленка и 5% диметилсульфоксида. Криоампулы с клеточной взвесью помещают на сутки в холодильник на -70°, после чего переносят в жидкий азот (-196°C) для длительного хранения. Жизнеспособность после размораживания - 90%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3·10⁶ кл/мл.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.

Изотип моноклонального антитела S148: Моноклональное антитело, секретируемое гибридомой S148, относится к иммуноглобулинам класса IgG1.

Специфичность моноклонального антитела S148. Моноклональное антитело S148 выявляет SURF-6 в клетках человека линии HeLa, фибробластах мыши линии NIH/3T3 и крысы линии С6 (фиг.1). Антитело S148 также узнает SURF-6 в суммарных лизатах перечисленных выше типов клеток на иммуноблотах (фиг.2). Антитело S148 преципитирует SURF-6 из суммарных экстрактов клеток HeLa (фиг.3) в условиях, описанных в Примере 7.

Оптимальные титры антител S148, определяемые в культуральной жидкости на клетках методом непрямой иммунофлуоресценции, составляют 1:30, методом иммуноблотов - 1:300.

Моноклональное антитело S148, продуцируемое гибридомой S148, может быть использовано для изучения роли SURF-6 в метаболизме нормальных и опухолевых клеток млекопитающих - человека, мыши и крысы, а также для выявления белковых партнеров SURF-6 в клетках человека.

Изобретение иллюстрируют чертежи:

Фиг.1. Окрашивание клеток человека HeLa (а-в) и фибробластов мыши NIH/3T3 (г-е) моноклональным антителом S148.

(а, г) - фазово-контрастные изображения клеток; (б, д) - окраска антителом S148; (в, е) - окраска ядер красителем на хроматин DAPI. Масштабная линия, 10 мкм.

Фиг.2. Выявление белка SURF-6 в суммарных лизатах клеток человека HeLa (a, a'), фибробластов мыши NIH/3T3 (б, б') и клеток глиомы крысы С6 (в, в'). (а-в) - окраска геля красителем Coomassie blue G-250, (a'-в') - окраска мембраны антителом S148. Положение SURF-6 указано стрелкой.

Фиг.3. Состав и электрофоретическая подвижность белков, преципитируемых антителом S148 из экстрактов клеток человека HeLa.

а - электрофорез белков, преципитируемых антителом S148 (стрелки); б - электрофорез белков в экстракте клеток HeLa, используемом для преципитации; в - проявление преципитата (в) и исходного экстракта клеток HeLa (г) кроличьими поликлональными антителами к SURF-6 мыши. Положение SURF6 на фиг. в и г указано стрелкой, звездочками обозначено положение тяжелых (вверху) и легких (внизу) цепей иммуноглобулинов.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры:

Пример 1. Экспрессия и выделение рекомбинантного белка SURF-6 из бактерий.

Для получения рекомбинантного белка SURF-6 человека, слитого с глутатион-S-трансферазой, используют вектор pGEX-2T ("AmershamPharmaciaBiotech", США). Ген SURF-6 человека амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии HeLa с использованием ген-специфических праймеров (5'-cgcggatccatggcctctctactcgccaa-3', 5'-cggaattctcagaccaggcctgcgcgct-3', встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI/EcoRI подчеркнуты). Амплифицированные фрагменты ДНК очищают и клонируют в вектор pGEX-2T по сайтам рестрикции эндонуклеазами BamHI и EcoRI. В результате получают плазмиду pGEX-Surf6, несущую ген белка SURF-6 человека, слитый с геном глутатион-S-трансферазы (GST) Schistosoma japonicum. Плазмиду тестируют на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК.

Компетентные клетки E. coli штамма BL21-Codon-Plus ("Stratagene", США) химически трансформируют плазмидой pGEX-Surf6, высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°C в течение 16 ч.

Для экспрессии рекомбинантного белка 5 мл среды LB инокулируют единичной колонией с LB-чашки и инкубируют при горизонтальном перемешивании (250 об/мин) 16 ч при 37°C. После окончания инкубации 250 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, инокулируют 5 мл ночной бактериальной культуры. При достижении суспензией оптической плотности 0.6 ед. (при λ=600 нм) индуцируют экспрессию плазмиды с помощью 0.1 мМ изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида, ИПТГ ("Aldrich", США). Наработку белков осуществляют при 37°C в течение 3 ч и постоянном горизонтальном перемешивании клеток в режиме 200 об/мин.

Бактерии осаждают при 5000 g в течение 10 мин (4°C), осадок ресуспендируют на льду в 15 мл буфера В, содержащего 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 мМ NaCl с добавлением 1 мМ PMSF и коктейля протеазных ингибиторов для бактерий ("Sigma"). Бактериальные клетки разрушают на льду с помощью ультразвукового дезинтегратора (20 импульсов по 1 мин каждый) и смешивают с Тритоном Х-100 до конечной концентрации 1%. Суспензию центрифугируют при 12000g 10 мин, к полученному супернатанту добавляют NaCl до конечной концентрации 0.5 М и 1 мл глутатион-сефарозы 4В, предварительно уравновешенной буфером В, содержащим 0.5 М NaCl и 1% Тритона Х-100, и инкубируют при интенсивном перемешивании 2 ч. Суспензию переносят в колонку и промывают 100 мл буфера В, содержащего 1 М NaCl и 1% Тритона Х-100, а затем - 100 мл буфера В, содержащего 1% Тритона Х-100. Все операции при работе с суспензией производят при 4°C. Сорбированный на глутатион-сефарозе рекомбинантный SURF-6, слитый с глутатион-S-трансферазой, элюируют с колонки буфером В, содержащим 1 М NaCl и 20 мМ L-глутатиона, и используют для иммунизации мышей.

Пример 2. Способы выявления SURF-6 в клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.

Клетки HeLa, NIH/3T3 и С9 выращивают на покровных стеклах в среде ДМЕМ («ПанЭко», Россия), содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка, глутамин и антибиотики в стандартных концентрациях до достижения 70% конфлуентности и фиксируют 2%-ным параформальдегидом на стандартном фосфатном буфере PBS (140 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 1,5 мМ KH₂PO₄ и 8,1 мМ Na₂HPO₄; рН 7.2-7.4) 20 мин при комнатной температуре, обрабатывают 0.1%-ным Тритоном Х-100 10 мин при 4°C и промывают в PBS 30 мин. Клетки инкубируют с антителом S148 (разведение супернатанта 1:20 в PBS) 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 ("Molecular Probes", США), 30 мин при комнатной температуре. Препараты заключают в Мовиол и изучают в микроскоп Axiovert 200 ("Carl Zeiss", Германия), сопряженный с монохромной 13-битной камерой CoolSnap_cf («Roper Scientific», США), используя объективы PlanNeoFluar ×40/ЧА 0.75 и PlanNeoFluar ×100/ЧА 1.25. Результаты показаны на фиг.1. На ней видно, что антитело S148 окрашивает ядрышки (стрелки) в обоих типах клеток. Структура хроматина в клетках HeLa и фибробластах мыши NIH/3T3 различается - у мыши присутствуют блоки центромерного гетерохроматина, дискретно окрашивающиеся красителем DAFI. Масштабная линия, 30 мкм.

Пример 3. Получение суммарных лизатов клеток человека HeLa, мыши NIH/3T3 и крысы С9 и проведение электрофореза для выявления SURF-6 на иммуноблотах.

5×10⁶ клеток лизируют на льду в буфере А, содержащем 50 мM Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 мM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона X-100 и коктейль протеазных ингибиторов ("Sigma"). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Лоури (модификация Петерсона) с помощью набора Protein Assay Kit ("Sigma"), следуя рекомендациям производителя.

Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5х-ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% ДСН, 500 мМ β-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 100°C 5 мин. В каждый карман 12% ПААГ-SDS наносят лизаты, содержащие не менее 50 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков проводят 15 мин при 60 В и при 1.5 при 160 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Гель инкубируют в буфере для проведения полусухого электроблоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% додецилсульфата натрия (ДСН) и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, "Millipore", США) проводят при постоянном напряжении 20 В 30 мин. Мембрану инкубируют с антителом S148 (разведение 1:500), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:2000, "Sigma"). Оба антитела разводят в буфере TBST, содержащем 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus ("AmershamPharmaciaBiotech", Великобритания) согласно инструкции производителя. Проявитель рентгеновской пленки Hyperfilm ("AmershamPharmaciaBiotech") содержит 7% метола и 7% гидрохинона, фиксаж - 25% Na₂S₂O₃ и 2.5% Na₂SO₃. Результаты показаны на фиг.2.

Пример 4. Выделение сенсибилизированных лимфоцитов из селезенки мыши.

Селезенку мыши, в крови которой присутствуют антитела к SURF-6 человека, выделяют и помещают в стерильных условиях в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл среды RPMI 1640 («ПанЭко», Россия). Измельчают селезенку с помощью иглы (номер 19), закрепленной на шприце объемом 1 мл, до тех пор, пока большая часть лимфоцитов не перемещается в среду. Переносят лимфоциты вместе со средой в стерильную пробирку объемом 15 мл и оставляют взвесь на 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно удаляют супернатант и переносят взвесь лимфоцитов в новую стерильную пробирку. Осаждают лимфоциты при 500g 5 мин. В результате выделяют около 5х10⁷ лимфоцитов.

Пример 5. Слияние лимфоцитов селезенки с клетками миеломы мыши линии РЗХ63-Ag8.653 и культивирование гибридных клеток.

3×10⁷ выделенных лимфоцитов дважды промывают центрифугированием при 500g в теплой (37°C) среде RPMI 1640 в течение 5 мин. 10⁷ миеломных клеток линии РЗХ63-Ag8.653 суспендируют в 20 мл среды RPMI 1640 и промывают, как указано выше для лимфоцитов. Нагревают пробирку с 50%-ным стерильным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) молекулярной массы 1450 (Hybri-Max™, "Sigma-Aldrich", США) при 37°C в водяной бане. Осадки клеток ресуспендируют в 5 мл среде RPMI 1640 и сливают в одну пробирку, центрифугируют при 800g 5 мин. Супернатант удаляют и к осадку по каплям добавляют 0.5 мл ПЭГ при постоянном перемешивании клеток. Добавляют 10 мл среды RPMI 1640 и центрифугируют при 500g 5 мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 20 мл ростовой среды RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США), 2 мМ L-глутамина, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и селективные агенты - 0.1 мМ гипоксантина, 0.4 мкМ аминоптерина и 0.016 мМ тимидина. Клетки рассевают в ячейки 96-луночных плоскодонных планшетов из расчета 0.2×10⁶ клеток на ячейку. Появление клонов оценивают с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200, используя фазово-контрастный объектив 10×

Пример 6. Метод лимитирующих разведении.

В каждую из лунок 96 луночного плоскодонного планшета добавляют по 100 мкл ростовой селективной среды (см. Пример 5). Из ячейки с клоном, вырабатывающим антитела к SURF-6, отбирают 100 мкл суспензии, переносят в крайнюю верхнюю левую ячейку и пипетируют. Из ячейки отбирают 100 мкл суспензии и добавляют к ячейке, расположенной под ней. Повторяют операцию 6 раз, в результате чего все ячейки в первом левом ряду будут содержать клетки. Затем с помощью 8-канальной пипетки производят те же операции в направлении от крайнего ряда вдоль планшета вправо. Появление клонов анализируют с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200, используя фазово-контрастный объектив 10×. Через 7 суток отмечают плашки, в которых присутствует только один клон.

Пример 7. Получение экстрактов из клеток HeLa для выявления белковых партнеров SURF-6 в клетках HeLa.

8×10⁶ клеток HeLa ресуспендируют в 8 мл ледяного буфера А (10 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 10 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0.05% Игепала СА-630, 0,5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF и комплексный протеазный ингибитор фирмы ("Sigma"). Прогоняют суспензию через иглу диаметром 0.4 мм 5 раз. Центрифугируют полученную взвесь при 700g 10 мин 4°C, супернатант, содержащий цитоплазматическую фракцию, отбрасывают. Осажденные ядра ресуспендируют в 0.5 мл буфера В (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0.5% Igepal СА-630, 10% глицерина, 100 мкг/мл РНКазы А, 0.5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF, комплексный протеазный ингибитор фирмы ("Sigma"), инкубируют 30 мин при 4°C при постоянном перемешивании. Доводят концентрацию NaCl до 0.4 М и инкубируют 30 мин при 4°C при постоянном перемешивании. Центрифугируют взвесь при 16000g 10 мин при 4°C. Отбирают супернатант, содержащий ядерный экстракт, разбавляют его буфером В до конечной концентрации NaCl 135 мМ, добавляют MgCl₂ до концентрации 2 мМ и ДНКазу I до концентрации 50 ед./мл. Добавляют 25 мкл Protein G сефарозы и инкубируют 30 мин при 4°C при перемешивании. Осаждают Protein G сефарозу центрифугированием при 500g 5 мин при 4°C, отбирают супернатант в другую пробирку. Всего получают около 700 мкг суммарного белка. Для иммунопреципитации к экстракту добавляют 10 мкг антитела S148 и инкубируют в 2 ч при 4°C при постоянном перемешивании. Затем к смеси добавляют 25 мкл Protein G сефарозы и инкубируют 1 час при 4°C при постоянном перемешивании. Осаждают Protein G сефарозу центрифугированием при 500 g 5 мин при 4°C, супернатант отбрасывают, к осадку добавляют 1 мл ледяного буфера С (50 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 135 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0.5% Igepal СА-630, 0.5 мМ ДТТ, 1 мМ PMSF и комплексный протеазный ингибитор фирмы ("Sigma"), аккуратно ресуспендируют и инкубируют на льду 5 мин. Осаждают Protein G сефарозу центрифугированием при 500g 5 мин при 4°C, супернатант отбрасывают. Повторяют промывку еще 4 раза. После последней промывки удаляют супернатант, осадок ресуспендируют в 50 мкл 2-кратного буфера Лэммли (100 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 200 мМ β-меркаптоэтанол, 2% ДСН, 20% глицерин, 0.5% бромфенолового синего), нагревают 5 мин при 100°C и используют для электроблотинга. Мембрану проявляют кроличьими поликлональными антителами к SURF-6, описанными ранее (Гурченков и др. "Свойства и функции нового белка ядрышка SURF-6 в клетках мыши 3Т3". Биоорганическая химия. 2005, 31: 578-585). Результаты иммунопреципитации антителом S148 из экстрактов клеток HeLa показаны на фиг.3.

Мышиная гибридома S148 - продуцент моноклонального антитела к белку ядрышек SURF-6 для его выявления в клетках млекопитающих (человека, крысы и мыши) методами иммунофлуоресценции, иммуноблотирования и иммунопреципитации, полученная путем иммунизации мышей линии Balb/c SURF-6 человека, экспрессированным в Е. coli в виде рекомбинантного белка SURF-6-глутатион-S-трансфераза, и слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450.