Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума
Владельцы патента RU 2422832:
ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к области медицинской микробиологии, и касается способа получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума. Сущность изобретения включает культивирование H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем находящиеся в среде культивирования антигены осаждают охлажденным до -20°С ацетоном и высушивают. На основе выделенного антигенного комплекса, общего для возбудителей гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза, получают эритроцитарный диагностикум. Преимущество изобретения заключается в повышении стабильности и воспроизводимости результатов в РНГА. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в реакции непрямой гемагглютинации.
Для определения антител к возбудителям особо опасных микозов известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином [1, 4], с последующей конъюгацией их с полисахаридным антигенным комплексом, выделенным из клеток микромицетов бета-нафтольным методом [2].
1. Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в статье Липницкого А.В. с соавт. [1] (прототип).
Однако известные препараты отличает относительно низкая стабильность, недостаточная воспроизводимость способа приготовления диагностикума, а также трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы грибов - возбудителей особо опасных микозов [2].
На сегодняшний день остается актуальным создание высокочувствительных эритроцитарных диагностикумов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций.
Цель изобретения - выделение антигенного комплекса, не требующего дополнительных этапов очистки, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, и создание на его основе антигенного эритроцитарного диагностикума, характеризующегося стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов.
Поставленная цель достигается за счет использования в качестве сенситина не полисахаридных антигенов, экстрагированных из клеточной массы грибов (см. прототип), а экстрацеллюлярного комплекса, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, способ выделения которого и сенсибилизация им эритроцитов характеризуются тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем осаждают находящиеся в среде культивирования антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона; полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют последний при получении эритроцитарного диагностикума.
Полученный антиген не требует лиофилизации, относительно легко поддается точному дозированию, не содержит остатков дезинфицирующих средств, длительно хранится без потери серологической активности и обеспечивает высокую воспроизводимость метода. Таким образом, единовременно приготовленный в достаточном количестве экстрацеллюлярный антигенный комплекс может обеспечить получение стандартного диагностикума со стабильными свойствами в течение ряда лет.
В качестве жидкой питательной среды культивирования используют синтетическую солевую среду Смита [3]. Такой бульон не содержит в своем составе белково-пептонных компонентов питательной среды, что позволяет получить экстрацеллюлярный антиген для его дальнейшего использования без дополнительных этапов очистки. Сухой антиген для сенсибилизации растворяют в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 5,9. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. Данные параметры оптимизируют сенсибилизацию эритроцитов, улучшают качество препарата и, в конечном итоге, повышают чувствительность РИГА.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Выделение антигенного комплекса из культурального фильтрата H.capsulatum G185P. Культивирование штамма проводят в синтетической солевой среде Смита, приготовленной по следующей прописи:
| 1. L-аспаргин | 7,0 г |
| 2. Хлористый аммоний | 7,0 г |
| 3. Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,31 г |
| 4. Цитрат натрия | 0,9 г |
| 5. Магний сернокислый | 1,5 г |
| 6. Железо лимоннокислое | 0,3 г |
| 7. Глюкоза | 10 г |
| 8. Глицерин | 25 г |
| 9. Вода | до 1 л |
Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 минут.
Приготовленную среду разливают по 600-800 мл в бактериологические матрацы, куда вносят культуру H.capsulatum G185P в мицелиальной фазе роста 5 мл в концентрации 5-10×106 м.т./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л.А.Тарасевича. Матрацы в горизонтальном положении инкубируют в термостате при 26-28°С в течение 3 месяцев. Биомассу отделяют от среды методом фильтрования через ватно-марлевый и мембранный стерилизующий фильтры. После проведения контроля стерильности комплекс антигенов осаждают из фильтрата путем добавления к последнему 2-3 объемов охлажденного до -20°С ацетона. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают в термостате при 37°С.
Полученный сухой антигенный комплекс используют при определении оптимальной сенсибилизирующей дозы антигена и получения диагностикума.
Пример 2. Приготовление диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного. Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса.
Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводят с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендируют в таком же объеме 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 5,9, в который добавлены навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5 об.% в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2, и используют в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РИГА с контрольной гистоплазмозной сывороткой серии 2-1 в титрах 1:20480 с четкими отрицательными контролями.
Приготовление рабочих серий диагностикума проводят по вышеописанной методике при больших объемах реагентов. При этом оптимальную сенсибилизирующую дозу увеличивают в 2 раза (до 200 мкг/мл). Полученный диагностикум расфасовывают в ампулы в виде суспензии 10 об.% в протективной среде высушивания и подвергают лиофилизации.
Пример 3. Определение специфической активности диагностикума
Гистоплазмозные и кокцидиоидомикозные козьи иммунные сыворотки получали путем многоцикловой иммунизации продуцентов. Антигенами для иммунизации служили обеззараженные клетки мицелиальной фазы возбудителей H.capsulatum и C.immitis. При постановке РИГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1 об.% НКС и вносили одну каплю 2,5 об.% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Данные таблицы свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю гистоплазмоза (в титре до 1:40960), так и к возбудителю кокцидиоидомикоза (при некотором снижении титра).
Пример 4. Определение специфичности диагностикума
Для оценки специфичности были использованы иммунные сыворотки лабораторных животных (баранов, козлов, лошади), содержащие антитела к возбудителям сапа, мелиоидоза, чумы, а также сыворотки людей, больных микотическими инфекциями (кандидозом или инвазивным аспергиллезом), и нормальная сыворотка человека.
Гетерологичные сыворотки разводили 1:10 с помощью 0,15 М раствора натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл и использовали для постановки РИГА в макроварианте. Полученные результаты представлены в таблице 2 и свидетельствуют о том, что диагностикум, изготовленный по предложенному способу, способен выявлять группоспецифические антитела к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в титре от 1:160 и выше. Титры с более высокой концентрацией до 1:80 обусловлены перекрестно реагирующими антителами к гетерологичным антигенам, не имеющим диагностического значения.
Источники информации
1. Липницкий А.В., Валькова Е.Р., Вальков Б.Г. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при глубоких микозах. / Диагностика особо опасных инфекций. - Ростов на Дону. - 1968. - С.54-57 (прототип).
2. Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (Методическое пособие). - Ленинград, 1971, 33 с.
3. Smith CD. Nutritional factors that are requaired for the grows and sporulation of Histoplasma capsulatum. / In ′Histoplasmosis′. Proceeding of the Suond national conference / Ed. By A. Balows. - Springfild. - 1971. - P.64-70.
4. Валькова E.P., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах. // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1970. - №12. - С.55-59.
| Таблица 1 | ||||||
| Результаты определения специфической активности диагностикума | ||||||
| № п/п | № продуцента | Серия (цикл иммунизации) | Вид сыворотки | Серия диагностикума | Титр в РИГА | Контроль |
| 1 | 2 | 1 | Гистоплазмозная | 2 | 1:40960 | - |
| 3 | 1:20480 | - | ||||
| 4 | 1:20480 | - | ||||
| 2 | 2 | 3 | Гистоплазмозная | 2 | 1:5120 | - |
| 3 | 1:1280 | - | ||||
| 4 | 1:5120 | - | ||||
| 3 | 2 | 4 | Гистоплазмозная | 2 | 1:10240 | - |
| 3 | 1:5120 | - | ||||
| 4 | 1:10240 | - | ||||
| 4 | 16 | 1 | Гистоплазмозная | 2 | 1:2560 | - |
| 3 | 1:2560 | - | ||||
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| 5 | 16 | 2 | Гистоплазмозная | 2 | 1:10240 | - |
| 3 | 1:2560 | - | ||||
| 4 | 1:10240 | - | ||||
| 6 | 16 | 3 | Гистоплазмозная | 2 | 1:10240 | - |
| 3 | 1:5120 | - | ||||
| 4 | 1:10240 | - | ||||
| 7 | 18 | 1 | Гистоплазмозная | 2 | 1:5120 | - |
| 3 | 1:2560 | - | ||||
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| 8 | 18 | 3 | Гистоплазмозная | 2 | 1:40960 | - |
| 3 | 1:5120 | - | ||||
| 4 | 1:10240 | - | ||||
| 9 | 18 | 5 | Гистоплазмозная | 2 | 1:40960 | - |
| 3 | 1:20480 | - | ||||
| 4 | 1:20480 | - | ||||
| 10 | 20 | 1 | Гистоплазмозная | 2 | 1:1280 | - |
| 3 | 1:1280 | - | ||||
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| 20 | 2 | Гистоплазмозная | 2 | 1:5120 | - | |
| 11 | 3 | 1:1280 | - | |||
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| 12 | 20 | 3 | Гистоплазмозная | 2 | 1:1280 | - |
| 3 | 1:320 | - | ||||
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| 13 | 1 | 1 | Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:1280 | - |
| 3 | 1:320 | - | ||||
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| 14 | 1 | 3 | Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:640 | - |
| 3 | 1:320 | - | ||||
| 4 | 1:640 | - |
| Продолжение таблицы 1 | ||||||
| № п/п | № продуцента | Серия(цикл иммунизации) | Вид сыворотки | Серия диагностикума | Титр в РНГА | Контроль |
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:320 | - | |||
| 15 | 1 | 4 | 3 | 1:160 | - | |
| 4 | 1:320 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:10240 | - | |||
| 16 | 9 | 1 | 3 | 1:5120 | - | |
| 4 | 1:5120 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:5120 | - | |||
| 17 | 9 | 5 | 3 | 1:2560 | - | |
| 4 | 1:5120 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 18 | 9 | 10 | 3 | 1:640 | - | |
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:640 | ||||
| 19 | 9 | 15 | 3 | 1:320 | - | |
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 20 | 9 | 20 | 3 | 1:640 | - | |
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 21 | 17 | 1 | 3 | 1:640 | - | |
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 22 | 17 | 3 | 3 | 1:1280 | - | |
| 4 | 1:2560 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 23 | 17 | 6 | 3 | 1:640 | - | |
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| Кокцидиоидомикозная | 2 | 1:2560 | - | |||
| 24 | 19 | 1 | 3 | 1:640 | - | |
| 4 | 1:1280 | - | ||||
| Условные обозначения: - отрицательный результат РИГА. | ||||||
| Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого», ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г. |
| Таблица 2 | ||||||
| Результаты определения специфичности диагностикума | ||||||
| № п/п | № продуцента | Серия (цикл иммунизации) | Вид сыворотки | Серия диагностикума | Титр в РНГА | Контроль |
| 5574 (козел) | Мелиоидозная | 2 | 1:80 | - | ||
| 1 | 2 | 3 | 1:40 | - | ||
| 4 | 1:80 | - | ||||
| 5 (козел) | Мелиоидозная | 2 | 1:40 | - | ||
| 2 | 14 | 3 | 1:20 | - | ||
| 4 | 1:40 | - | ||||
| 7 (козел) | Мелиоидозная | 2 | 1:20 | - | ||
| 3 | 21 | 3 | - | - | ||
| 4 | 1:20 | - | ||||
| 6518 (баран) | Сапная | 2 | - | - | ||
| 4 | 4 | 3 | - | - | ||
| 4 | - | - | ||||
| 6518 (баран) | Сапная | 2 | - | - | ||
| 5 | 12 | 3 | - | - | ||
| 4 | - | - | ||||
| 2801 (козел) | Сапная | 2 | - | - | ||
| 6 | 9 | 3 | - | - | ||
| 4 | - | - | ||||
| 10 (баран) | Чумная | 2 | 1:40 | - | ||
| 7 | 4 | 3 | 1:20 | - | ||
| 4 | 1:40 | - | ||||
| 10 (баран) | Чумная | 2 | - | - | ||
| 8 | 9 | 3 | - | - | ||
| 4 | - | - | ||||
| Кокетка (лошадь) | коммерческая | Чумная | 2 | 1:20 | - | |
| 9 | 3 | - | - | |||
| 4 | - | - | ||||
| Сыворотка больного | Клинич. диагноз: кандидоз | 2 | 40 | - | ||
| 10 | 3 | 20 | - | |||
| 4 | 40 | - | ||||
| Сыворотка больного | Клинич. диагноз: кандидоз | 2 | 40 | - | ||
| 11 | 3 | 1:20 | - | |||
| 4 | 1:40 | - | ||||
| Сыворотка больного | Клинич. диагноз: кандидоз | 2 | 1:20 | - | ||
| 12 | 3 | 1:20 | - | |||
| 4 | 1:20 | - | ||||
| Сыворотка больного | Клинич. диагноз: аспергиллез | 2 | 1:20 | - | ||
| 13 | 3 | 1:20 | - | |||
| 4 | 1:20 | - | ||||
| Нормальная сыворотка человека | - | 2 | 1:20 | - | ||
| 14 | 3 | - | - | |||
| 4 | 1:20 | - | ||||
| Условные обозначения: - отрицательный результат РНГА. | ||||||
| Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого» ФГЗУ Волгоград НИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г. |
1. Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума, включающий выделение антигенного комплекса и сенсибилизацию им эритроцитов, отличающийся тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 мес., после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры, стерилизуют через мембранные фильтры, после чего осуществляют контроль стерильности и затем осаждают находящиеся в среде культивирования экстрацеллюлярные антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют его для получения эритроцитарного диагностикума.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят в 0,01 М фосфатно-буферном растворе рН 5,9 при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч с последующей фиксацией путем добавления в реакционную смесь 1 об.% формалина с инкубацией в течение 30 мин.
