Антивирусный препарат контактного действия на основе "бетадина" и эндонуклеазы
Владельцы патента RU 2423136:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина" (RU)
Филимонова Мария Николаевна (RU)
Изобретение относится к ветеринарии, сельскому хозяйству, медицине, биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых ДНК- и РНК-содержащими вирусами. Антивирусный комбинированный препарат контактного действия на основе средства «Бетадин» представляет собой смесь препарата «Бетадин» с раствором бактериальной эндонуклеазы - продукта гена nuc А (синоним nuc), в любом соотношении, при этом содержание повидон-йода в разбавленном средстве «Бетадин» составляет 0,005-0,000005%, а рН раствора бактериальной эндонуклеазы в буферном или солевом растворе, содержащем катионы магния, составляет 7-9. Охарактеризованный препарат обладает одновременно пониженным раздражающим эффектом и высокой вирулицидной активностью. 2 табл.
Заявленное техническое решение относится к ветеринарии, сельскому хозяйству, медицине, биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых ДНК - и РНК- содержащими вирусами.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению по совокупности совпадающих признаков и достигаемому техническому результату является лекарственное средство «Бетадин» - одно из немногих антисептических и дезинфицирующих средств для местного и наружного применения, характеризующееся отсутствием типо- и видоспецифичности в отношении микроорганизмов. Например, «Бетадин», содержащий 10% активного вещества (повидон-йода), оказывает быстрое бактерицидное действие на грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также эффективен в отношении грибов, простейших и вирусов [1-3], включая вирусы иммунодефицита человека [3]. Средство нетоксично и не вызывает мутагенного эффекта в отношении высших животных в силу особенностей их строения на клеточном уровне.
Недостатком «Бетадина» является то, что он может вызвать раздражение контактирующих с ним органов и тканей, что ограничивает сферы его применения. Например, «Бетадин» нежелательно применять при легочной астме, бронхите, заболеваниях слизистой оболочки глаз и повышенной чувствительности к йоду в целом [1, 2]. Между тем известно, что и микробоцидное действие, и раздражающий эффект «Бетадина» зависят от одного и того же показателя: содержания активного йода [3]. В связи с этим разбавление «Бетадина», снижающее его раздражающий эффект, одновременно приводит к уменьшению его микробоцидного эффекта, что сочетается с проявлением типо- и видоспецифичности. Например, снижение содержания активного вещества в 10-1000 раз не оказывало негативного влияния на уровень бактерицидной активности, при этом понижало его вирулицидную активность, особенно сильно в отношении вируса иммунодефицита человека [3]. Дальнейшее уменьшение содержания активного вещества понижало и его бактерицидный эффект [3].
Компенсировать снижение эффективности, вероятно, можно, дополнив действие одного препарата другим. Например, часто улучшения эффекта биологически активных веществ достигают комбинируя одно вещество с другим.
Однако «Бетадин», согласно его описанию [1], несовместим с другими средствами, особенно содержащими щелочи, ферменты и ртуть, из-за, по-видимому, ухудшения условий для проявления его активности под влиянием щелочи или снижения содержания активного йода под действием ртути или биологических катализаторов - ферментов. Вопреки этому, в ходе исследования, результат которого стал предметом заявленного технического решения, заявителю удалось успешно совместить «Бетадин» с ферментом - бактериальной эндонуклеазой - и получить комбинированный препарат с пониженным эффектом раздражения, вирулицидная активность которого была выше, чем вирулицидная активность многократно разведенного «Бетадина». Последнее стало возможным, очевидно, потому, что эндонуклеаза, сама обладающая антивирусной активностью [4, 5], не являлась биологическим катализатором по отношению к активному йоду.
Бактериальная эндонуклеаза - продукт структурного гена пис, исходно найденного в геноме бактерий S.marcescens и позднее клонированного и экспрессированного в клетках S.marcescens и E.coli [6], - представляет собой дезоксирибонуклеат (рибонуклеат) - 5'-нуклеотидогидролазу, благодаря чему не может проявлять каталитической активности по отношению к активному йоду. Бактериальная эндонуклеаза гидролизует нуклеиновые кислоты по эндонуклеолитическому механизму до моно-, ди-, три-, тетра- и олигонуклеотидов, с чем, вероятно, и связана ее антивирусная активность. Известно, что бактериальная эндонуклеаза ингибирует развитие РНК-геномных бактериофагов [4]. В составе препарата «Эндоглюкин» эндонуклеазу используют для лечения и профилактики вирусного паралича пчел [5]. Кроме этого, в качестве одного из активных компонентов бактериальная эндонуклеаза входит в состав антимикробного препарата, отличающегося широким спектром действия, включая антивирусный эффект без выраженной видо- и типоспецифичности [7]. Бактериальная эндонуклеаза нетоксична и безвредна для человека, животных и растений, так как она представляет собой фермент, то есть природный биологический катализатор, способный к самопроизвольной инактивации.
Задачей заявленного технического решения являлось создание нового препарата на основе средства «Бетадин», а именно препарата, обладающего одновременно пониженным раздражающим эффектом и высокой вирулицидной активностью.
Заявленная задача решена заявителем посредством применения широко известных из уровня техники, как таковых, препаратов «Бетадин» и бактериальной эндонуклеазы. Заявленное техническое решение обеспечивает возможность решения задачи (цели), которая не была разрешима в принципе для специалистов в заявленной области техники, так как полученные результаты не являются очевидными для специалистов, вследствие наличия противоречий, описанных в известном уровне техники [1-3].
Заявителем установлено, что время полуинактивации эндонуклеазы при контакте с «Бетадином» составляет 6 мин, в связи с чем для получения заявленного технического решения компоненты смешивают непосредственно перед использованием антивирусного препарата контактного действия с целью предотвращения уменьшения ферментативной активности эндонуклеазы за счет предварительного контакта с «Бетадином». Увеличение времени контакта с «Бетадином» ведет к дальнейшему снижению ферментативной активности эндонуклеазы, вплоть до полной ее утраты.
«Бетадин» - раствор для местного и наружного применения, содержащий 10% повидон-йода, а также вспомогательные вещества: глицерин, наноксинол 9, лимонную кислоту, динатрия гидрофосфат, едкий натр и очищенную воду [1].
«Бетадин» с пониженным содержанием активного вещества (повидон-йода) и, соответственно, вспомогательных веществ, получали разбавлением дистиллированной водой. Предварительно определили эффект разбавления на вирулицидную активность в отношении фага λ bII, результаты чего представлены в таблице 1. Для оценки содержания активного йода использовали опубликованные данные [3].
Препарат эндонуклеазы представляет собой раствор с активностью не менее 5000 ед./мл, содержащий 0,01-0,10 М Трис-HCl буфер, рН 7,0-9,0, или 0,5-0,8% NaCl, и не менее 0,01 моль/л катионов магния. Заявителем установлено, что использование препарата эндонуклеазы с активностью менее 5000 ед./мл также будет приводить к достижению результата заявленного технического решения. Но этот результат будет хуже, чем результаты, представленные в таблице 2.
Заявителю известно, что эндонуклеаза проявляет ферментативную активность при рН 7-10, с наилучшим эффектом при рН 8,5. Заявителем установлено, что при смешивании разбавленного «Бетадина» с равным объемом 0,5-0,8% NaCl или 0,10 М Трис-HCl буфера, рН 8,5, удается получить композицию с рН 7,3 или 7,9, что является достаточным для достижения сверхсуммарного эффекта заявленного технического решения, что видно из результатов, представленных в таблице 2. Уменьшение концентрации NaCl до 0,2% ухудшает результат заявленного технического решения за счет понижения рН среды. Повышение концентрации NaCl до 17,5% не снижает результат заявленного технического решения, однако выводит композицию заявленного технического решения за рамки физиологических значений по содержанию NaCl. Дальнейшее увеличение содержания NaCl нецелесообразно, во-первых, в силу отмеченной выше причины, во-вторых, потому, что это приводит к снижению ферментативной активности эндонуклеазы. 0,01-0,10 М концентрация Трис-HCl буфера является оптимальной для достижения результата заявленного технического решения. Увеличение или уменьшение концентрации буфера будет также приводить к достижению результата заявленного технического решения. Но этот результат будет хуже, чем результаты, представленные в таблице 2.
Заявителю известно, что увеличение содержания катионов магния в заявленном техническом решении не окажет отрицательного действия на результат. Напротив, уменьшение содержания магния ухудшит результат вплоть до приближения к результату действия разбавленного «Бетадина». В отсутствии катионов магния достигаемый результат будет равен результату действия разбавленного «Бетадина» и обусловлен этим действием. Таким образом, заявителю удалось скомбинировать два препарата, относящихся к разным классам соединений, что в совокупности давало взаимное улучшение биологического эффекта - вирулицидной активности - и позволяло снизить раздражающее действие средства «Бетадин».
Заявленное техническое решение поясняется примерами и сведениями, приведенными в таблицах 1 и 2. В таблице 1 представлена вирулицидная активность «Бетадина», разбавленного дистиллированной водой в 10-1000000 раз, в отношении фага λ bII. В таблице 2 приведены результаты заявленного технического решения в сравнении с действием эндонуклеазы и разбавленного «Бетадина» в различных соотношениях.
Заявленное техническое решение реализуется следующим образом.
Антивирусный препарат контактного действия, который содержал 0,005-0,000005% повидон-йод, 5,0 ммоль/л катионов магния, 25 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,0, или 0,20% NaCl и бактериальную эндонуклеазу, готовили непосредственно перед использованием, смешивая в соотношении 1:1 «Бетадин» с пониженным содержанием повидон-йода и препарат эндонуклеазы (пример 1).
Антивирусное действие препарата контактного действия испытывали в непосредственном контакте с суспензией фага λ bII, смешивая их в соотношении 1:1 (пример 1) и инкубируя смесь при комнатной температуре в течение 6 мин. Аналогично и одновременно с антивирусным препаратом контактного действия испытывали вирулицидное действие раствора бактериальной эндонуклеазы, содержавшего 5,0 ммоль/л катионов магния, 25 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,0, или 0,20% NaCl, и «Бетадина» с пониженным содержанием повидон-йода, взятых по отдельности. Вирулицидную активность оценивали, контролируя изменение числа стерильных пятен, определенных по методу Грациа, используя в качестве тест-культуры E.coli BL21(DE3)pLysS. Увеличение времени инкубации улучшало результаты, представленные в таблице 2. В частности, инкубация в течение 6 часов улучшала результат действия разбавленного «Бетадина» в 4,5 раза, раствора бактериальной эндонуклеазы, содержавшего 5,0 ммоль/л катионов магния, 25 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,0, или 0,20% NaCl - в 3,5 раза, а антивирусного препарата контактного действия, который содержал 0,005-0,000005% повидон-йод, 5,0 ммоль/л катионов магния, 25 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,0, или 0,20% NaCl - в 8,5 раз. Инкубация в течение 24 часов позволяла достичь 100% эффекта. Уменьшение времени инкубации ухудшало результат. Так, инкубация в течение 4 мин приводила к ухудшению результата в 1,5 раза, а в течение 2 мин - в 1,87 раза.
Вирулицидная активность заявленного технического решения (антивирусный препарат контактного действия) и его активных составляющих представлена в таблице 2.
Из приведенных примеров в таблице 2 видно, что изменения соотношений «Бетадин: с пониженным содержанием повидон-йода: препарат Эндонуклеазы» в 5 и 500 раз, а также « препарата Эндонуклеазы к Бетадину с пониженным содержанием повидон-йода» в 5 и 500 раз практически не влияет на результат - снижение жизнеспособности, при условии, что содержание повидон-йода в разбавленном средстве «Бетадин» составляет 0,005-0,000005%, а рН раствора составляет 7-9.
Таким образом, результатами опытов, приведенных в материалах таблицы 2, подтверждается факт, что заявленное техническое решение может быть достигнуто при разных количественных соотношениях составляющих заявленного препарата.
Соотношение « Бетадин: с пониженным содержанием повидон-йода: препарат Эндонуклеазы» может варьироваться в широких пределах.
Поскольку эндонуклеаза является ингибитором РНК-геномных бактериофагов [4], а фаг λ bII относится к ДНК-геномным вирусам, антивирусный препарат контактного действия (заявленное техническое решение) эффективен в отношении ДНК- и РНК- содержащих вирусов.
Заявленное техническое решение (антивирусный препарат контактного действия) является принципиально новым препаратом и представляет собой нетоксичное экологически чистое вещество, проявляющее активность при мягких физиологических условиях. Таким образом, полученные данные показывают возможность применения препарата в качестве универсального средства защиты при инфекциях вирусной этиологии в различных областях народного хозяйства.
Заявленное техническое решение (антивирусный препарат контактного действия) соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью признаков.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как заявленное технические решение не следует явным образом из уровня техники для специалиста в данной области техники, более того заявителю удалось скомбинировать в одном препарате два препарата, относящихся к разным классам соединений, в принципе несовместимых, что известно из исследованного уровня техники, при этом заявителями получены результаты, не являющиеся очевидными для специалиста из известного уровня техники, что является дополнительным доказательством соответствия заявленного решения критерию «изобретательский уровень», так как полученные результаты в совокупности дали взаимное улучшение биологического эффекта - вирулицидной активности - и позволяли снизить раздражающее действие средства «Бетадин».
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», так как оно может быть реализовано в народном хозяйстве с помощью стандартного оборудования и средств.
| Таблица 1 | ||||
| Вирулицидный эффект «Бетадина» с различным содержанием повидон-йода | ||||
| Разбавление «Бетадина» | Содержание при контакте с вирусами | Число стерильных пятен** | Снижение жизнеспо-собности, % | |
| повидон йода, % | активного йода, мм* | |||
| Без разбавления | 5,0 | 0,010 | 0 | 100 |
| 101 | 0,5 | 0,065 | 0 | 100 |
| 102 | 0,05 | 0,074 | 75±0,25 | 70±0,9 |
| 103 | 0,005 | 0,013 | 125±0,75 | 50±0,7 |
| 104 | 0,0005 | Меньше 0,001 | 150±1,25 | 40±0,5 |
| 105 | 0,00005 | Меньше 0,001 | 187±0,5 | 25±0,8 |
| 106 | 0,000005 | Меньше 0,001 | 220±0,75 | 12±0,7 |
| *[3], **0% - 250 стерильных пятен |
| Таблица 2 | |||||
| Вирулицидный эффект антивирусного препарата контактного действия (заявленное техническое решение), полученный при разных соотношениях объемов «Бетадина» с пониженным содержанием повидон-йода и препарата эндонуклеазы | |||||
| Соотношение объемов «Бетадина» и препарата эндонуклеазы | Содержание в препарате | Содержание повидон-йода в препарате, % | Эндонуклеолитическая активность в препарате, ед./мл | Снижение жизнеспособности, % | |
| Опыт | Контроль | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Пример 1 | |||||
| 1:1 | 25 мМ Трис-HCl буфер или | 0,005 | 40000 | 64±0,3 | 0 |
| 0,0005 | 40000 | 52±0,1 | 0 | ||
| 0,00005 | 40000 | 32±0,2 | 0 | ||
| 0,000005 | 40000 | 44±0,3 | 0 | ||
| 0,00005 | 5000 | 51±0,6 | 0 | ||
| 0,00005 | 80000 | 70±0,3 | 0 | ||
| 0.2% NaCl | 0,00005 | 80000 | 50±0,4 | 0 | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| Пример 2 | |||||
| 5:1 | 15 мМ Трис-HCl буфер или | 0,005 | 40000 | 60±0,4 | 0 |
| 0,0005 | 40000 | 50±0,7 | 0 | ||
| 0,00005 | 40000 | 31±0,7 | 0 | ||
| 0,000005 | 40000 | 39±0,5 | 0 | ||
| 0,00005 | 5000 | 49±0,7 | 0 | ||
| 0,00005 | 80000 | 68±0,2 | 0 | ||
| 0.1% NaCl | 0,00005 | 80000 | 46±0,7 | 0 | |
| Пример 3 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1:5 | 25 мМ Трис-HCl буфер или | 0,005 | 40000 | 66±0,7 | 0 |
| 0,0005 | 40000 | 57±0,1 | 0 | ||
| 0,00005 | 40000 | 33±0,4 | 0 | ||
| 0,000005 | 40000 | 46±0,4 | 0 | ||
| 0,00005 | 5000 | 53±0,4 | 0 | ||
| 0,00005 | 80000 | 71±0,5 | 0 | ||
| 0.2% NaCl | 0,00005 | 80000 | 51±0,3 | 0 | |
| Пример 4 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 500:1 | 0.2 мМ Трис-HCl буфер или | 0,005 | 40000 | 54±0,3 | 0 |
| 0,0005 | 40000 | 45±0,4 | 0 | ||
| 0,00005 | 40000 | 27±0,3 | 0 | ||
| 0,000005 | 40000 | 15±0,6 | 0 | ||
| 0,00005 | 5000 | 25±0,6 | 0 | ||
| 0,00005 | 80000 | 28±0,8 | 0 | ||
| 0.0016% NaCl | 0,00005 | 80000 | 26±0,5 | 0 | |
| Пример 5 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 1:500 | 25 мМ Трис-HCl буфер или | 0,005 | 40000 | 68±0,8 | 0 |
| 0,0005 | 40000 | 57±0,5 | 0 | ||
| 0,00005 | 40000 | 34±0,1 | 0 | ||
| 0,000005 | 40000 | 49±0,2 | 0 | ||
| 0,00005 | 5000 | 56±0,24 | 0 | ||
| 0,00005 | 80000 | 72±0,7 | 0 | ||
| 0.2% | 0,00005 | 80000 | 53±0,2 | 0 | |
| NaCl |
Источники информации
1. Инструкция к применению «Бетадина».
2. Material Safety Data Sheet / 14-July-2005 // Purdue Products L.P.
3. PVP-iodine (Povidone iodine antiseptic agent) / International speciality product, 2004.
4. Лещинская И.Б., Шарипова Ф.Р., Филимонова M.H., Штенц Э., Рокштро А., Клуге З. Ингибитор РНК-геномных бактериофагов. / Патент 1781295 Al, SU, С12N 9/14.
5. Детиненко Л.Д., Клименко В.П., Подгорный В.Ф., Аликин Ю.С., Масычева В.И., Гробов О.Ф., Батуев Ю.М. /Патент РФ №2038776.
6. Ball Т.К., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli. // Gene. - 1987. - V.57. - P.183-192.
7. Филимонова M.H., Ершова E.В., Сафин Ю.И., Тойменцева А.А., Шабаева Ю.Д., Сусарова А.Н., Валеев А.Р., Угрюмова В.С, Равилов А.З., Каримуллина И.Г., Фаткуллова А.А., Шишко А.А., Каримов М.З. Антимикробный препарат. / Патент РФ №2337139.
Антивирусный комбинированный препарат контактного действия на основе средства «Бетадин», представляющий собой смесь препарата «Бетадин» с раствором бактериальной эндонуклеазы - продукта гена nucA (синоним nuc) в любом соотношении, при этом содержание повидон-йода в разбавленном средстве «Бетадин» составляет 0,005-0,000005%, а рН раствора бактериальной эндонуклеазы в буферном или солевом растворе, содержащем катионы магния, составляет 7-9.
